Summary
Dit protocol onderzoekt de beschermende effecten van platycodine D op niet-alcoholische leververvetting in een palmitinezuur-geïnduceerd in vitro model.
Abstract
Het voorkomen van niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) is wereldwijd in een alarmerend tempo toegenomen. Platycodon grandiflorum wordt veel gebruikt als een traditionele etnogeneeskunde voor de behandeling van verschillende ziekten en is een typisch functioneel voedsel dat kan worden opgenomen in het dagelijkse dieet. Studies hebben gesuggereerd dat platycodine D (PD), een van de belangrijkste actieve ingrediënten in Platycodon grandiflorum, een hoge biologische beschikbaarheid heeft en de voortgang van NAFLD aanzienlijk vermindert, maar het onderliggende mechanisme hiervan is nog steeds onduidelijk. Deze studie heeft tot doel het therapeutisch effect van PD tegen NAFLD in vitro te onderzoeken. AML-12-cellen werden gedurende 24 uur voorbehandeld met 300 μM palmitinezuur (PA) om NAFLD in vitro te modelleren. Vervolgens werden de cellen behandeld met PD of kregen ze gedurende 24 uur geen PD-behandeling. De niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) werden geanalyseerd met behulp van 2′,7′-dichloor-dihydro-fluoresceïnediacetaat (DCFH-DA) kleuring en de mitochondriale membraanpotentiaal werd bepaald door de JC-1-kleuringsmethode. Bovendien werden de eiwitexpressieniveaus van LC3-II/LC3-I en p62/SQSTM1 in de cellysaten geanalyseerd door western blotting. PD bleek de ROS- en mitochondriale membraanpotentiaalniveaus in de met PA behandelde groep significant te verlagen in vergelijking met de controlegroep. Ondertussen verhoogde PD de LC3-II/LC3-I-niveaus en verlaagde de p62/SQSTM1-niveaus in de met PA behandelde groep in vergelijking met de controlegroep. De resultaten gaven aan dat PD NAFLD in vitro verbeterde door oxidatieve stress te verminderen en autofagie te stimuleren. Dit in vitro model is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van de rol van PD in NAFLD.
Introduction
Platycodon grandiflorus (PG), de gedroogde wortel van Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., wordt gebruikt in de traditionele Chinese geneeskunde (TCM). Het wordt voornamelijk geproduceerd in de noordoostelijke, noordelijke, oostelijke, centrale en zuidwestelijke regio's van China1. De PG-componenten omvatten triterpenoïde saponinen, polysacchariden, flavonoïden, polyfenolen, polyethyleenglycolen, vluchtige oliën en mineralen2. PG heeft een lange geschiedenis van gebruik als voedsel en kruidengeneesmiddel in Azië. Traditioneel werd dit kruid gebruikt om medicijnen tegen longziekten te maken. Moderne farmacologie levert ook bewijs van de werkzaamheid van PG voor de behandeling van andere ziekten. Studies hebben aangetoond dat PG een therapeutisch effect heeft op een verscheidenheid aan door geneesmiddelen geïnduceerde leverbeschadigingsmodellen. De voedingssuppletie van PG- of platycodinextracten kan vetrijke door voeding veroorzaakte obesitas en de bijbehorende metabole ziekten verbeteren 3,4,5. Polysacchariden van PG kunnen worden gebruikt voor de behandeling van acute leverbeschadiging veroorzaakt door LPS / D-GalN bij muizen6. Bovendien verbeteren saponinen uit de wortels van PG vetrijke dieet-geïnduceerde niet-alcoholische steatohepatitis (NASH)7. Bovendien kan platycodine D (PD), een van de belangrijkste therapeutische componenten van PG, de expressie van lipoproteïnereceptoren met lage dichtheid en de opname van lipoproteïne met lage dichtheid in cellen van menselijk hepatocellulair carcinoom (HepG2) verbeteren8. Bovendien kan PD ook apoptose induceren en adhesie, migratie en invasie in HepG2-cellen remmen 9,10. In deze studie worden muis hepatoom AML-12-cellen dus gebruikt voor in vitro modelconstructie en om de farmacologische effecten en onderliggende mechanismen van PD in dit model verder te bestuderen.
De term niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) verwijst naar een groep leverziekten die eenvoudige steatose, NASH, cirrose en hepatocellulair carcinoomomvat 11. Hoewel de pathogenese van NAFLD onvolledig wordt begrepen, van de klassieke "two-hit" theorie tot de huidige "multiple-hit" theorie, wordt insulineresistentie beschouwd als centraal in de pathogenese van NAFLD12,13,14. Studies hebben aangetoond dat insulineresistentie in hepatocyten kan leiden tot verhoogde vrije vetzuren, die triglyceriden vormen die in de lever worden afgezet en ervoor zorgen dat de lever vet wordt15,16. De ophoping van vet kan leiden tot lipotoxiciteit, oxidatieve stress-geïnduceerde mitochondriale disfunctie, endoplasmatische reticulumstress en inflammatoire cytokine-afgifte, resulterend in de pathogenese en progressie van NAFLD17,18. Bovendien speelt autofagie ook een rol bij de pathogenese van NAFLD, omdat het betrokken is bij het reguleren van cellulaire insulinegevoeligheid, cellulair lipidenmetabolisme, hepatocytenbeschadiging en aangeboren immuniteit 19,20,21.
Een verscheidenheid aan diermodellen en cellulaire modellen zijn vastgesteld om een basis te bieden voor het verkennen van de pathogenese en potentiële therapeutische doelen van NAFLD22,23. Afzonderlijke diermodellen kunnen echter niet alle pathologische processen van NAFLD24 volledig nabootsen. Individuele verschillen tussen dieren leiden tot verschillende pathologische kenmerken. Het gebruik van levercellijnen of primaire hepatocyten in in vitro studies van NAFLD zorgt voor maximale consistentie in de experimentele omstandigheden. Ontregeling van het lipidenmetabolisme in de lever kan leiden tot hogere niveaus van accumulatie van hepatocytenlipidedruppels in NAFLD25. Vrije vetzuren zoals oliezuur en palmolie zijn gebruikt in het in vitro model om NAFLD na te bootsen veroorzaakt door een vetrijk dieet26,27. De menselijke hepatoblastoomcellijn HepG2 wordt vaak gebruikt bij de constructie van NAFLD-modellen in vitro, maar als tumorcellijn verschilt het metabolisme van HepG2-cellen aanzienlijk van dat van levercellen onder normale fysiologische omstandigheden28. Daarom is het gebruik van primaire hepatocyten of primaire hepatocyten van muizen om het in vitro NAFLD-model voor geneesmiddelenscreening te construeren voordeliger dan het gebruik van tumorcellijnen. Bij vergelijking van het synergetisch onderzoek van geneesmiddeleffecten en therapeutische doelen in zowel diermodellen als in vitro hepatocytenmodellen, lijkt het erop dat het gebruik van muishepatocyten om het in vitro NAFLD-model te construeren een beter toepassingspotentieel heeft.
Vrije vetzuren die de lever binnenkomen, worden geoxideerd om energie te produceren of opgeslagen als triglyceriden. Significant is dat vrije vetzuren een bepaalde lipotoxiciteit hebben en cellulaire disfunctie en apoptose kunnen veroorzaken12. Palmitinezuur (PA) is het meest voorkomende verzadigde vetzuur in menselijk plasma29. Wanneer cellen in niet-vetweefsel lange tijd worden blootgesteld aan hoge concentraties PA, stimuleert dit de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en veroorzaakt oxidatieve stress, lipideaccumulatie en zelfs apoptose30. Daarom gebruiken veel onderzoekers PA als een inductor om levercellen te stimuleren om ROS te produceren en zo het in vitro leververvettingsmodel te construeren en de beschermende effecten van bepaalde werkzame stoffen op cellen te evalueren31,32,33,34. Deze studie introduceert een protocol voor het onderzoeken van de beschermende effecten van PD op een celmodel van NAFLD geïnduceerd door PA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
AML-12-cellen (een normale hepatocytencellijn van muizen) worden gebruikt voor de celgebaseerde studies. De cellen worden verkregen uit een commerciële bron (zie tabel met materialen).
1. Voorbehandeling van de AML-12-cellen om NAFLD in vitro te modelleren
- Houd de cellen in normale celkweekmedia (DMEM plus Ham's F12 [1:1] met 0,005 mg/ml insuline, 5 ng/ml selenium, 0,005 mg/ml transferrine, 40 ng/ml dexamethason en 10% foetaal runderserum [FBS], zie materiaaltabel) bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
- Zaai de cellen in 12-well platen (1 ml / put) met een dichtheid van 2,8 x 105 cellen / put.
OPMERKING: Alle celverterings- en mediumuitwisselingsbewerkingen worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast om besmetting van de cellen te voorkomen. - Verwijder het kweekmedium van de cellen na de nachtelijke incubatie (~ 10 uur) en was de cellen vervolgens twee keer met 1 ml serumvrije media (per putje).
- Verdeel de 12-well celplaat in vier verschillende behandelingsgroepen van links naar rechts, waaronder (1) de controlegroep, (2) de PD-behandelde groep, (3) de PA-behandelde groep en (4) de PA + PD-behandelde groep.
OPMERKING: Drie replica's van elke experimentele behandelingsgroep zijn van boven naar beneden gerangschikt op dezelfde 12-well celplaat. - Voeg de normale celkweekmedia (1 ml/put) toe aan de controlegroep en de met PD behandelde groep en voeg de normale celkweekmedia (1 ml/put) aangevuld met 300 μM PA toe aan de met PA behandelde en met PA + PD behandelde groep.
- Verwijder het kweekmedium van de cellen na 24 uur incubatie en was de cellen vervolgens twee keer met 1 ml serumvrije media (per put).
- Voeg normale celkweekmedia (1 ml/put) aangevuld met een medium (dimethylsulfoxide, DMSO, 0,1% v/v) toe aan de controlegroep; voeg normale celkweekmedia (1 ml/put) aangevuld met 1 μM PD toe aan de met PD behandelde groep; voeg normale celkweekmedia (1 ml/put) aangevuld met 300 μM PA toe aan de met PA behandelde groep; voeg normale celkweekmedia (1 ml/put) aangevuld met 300 μM PA en 1 μM PD toe aan de met PA + PD behandelde groep.
- Onderzoek na incubatie gedurende nog eens 24 uur de beschermende effecten van PD op cellen met behulp van 2′,7′-dichloordihydro-fluoresceïnediacetaat (DCFH-DA) kleuring (stap 2), JC-1-kleuring (stap 3) en western blotting (stap 4).
OPMERKING: Alle incubatiebewerkingen worden uitgevoerd bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
2. Meting van de verandering in ros-productie
OPMERKING: De intracellulaire ROS-niveaus in de cellen worden beoordeeld op basis van de DCFH-DA-kleuringstest.
- Was aan het einde van de behandelingsperiode (stap 1.8) de cellen drie keer met 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing per put (1x PBS, pH 7,4) en kleurt de cellen vervolgens met 100 μL 10 μM DCFH-DA per put (zie materiaaltabel). Incubeer de cellen in het donker gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Als er na 30 minuten incubatie geen duidelijke groene fluorescentie wordt waargenomen, kan de incubatietijd van de sonde en cellen op de juiste manier worden verhoogd (30-60 minuten). Als overbelichting van de groene fluorescentiewaarde wordt waargenomen na 30 minuten incubatie, kan de incubatietijd van de sonde en cellen op passende wijze worden verminderd (15-30 minuten). - Was de cellen drie keer met 1x PBS (1 ml/put). Voeg 1 ml 1x PBS toe aan elk putje.
- Plaats de 12-well plaat op het microscoopstadium (zie Tabel van Materialen) en gebruik vervolgens een 20x objectief om de morfologie van de cellen te observeren (vergroting: 200x).
- Leg drie representatieve fluorescentiebeelden (vergroting: 200x) vast voor elke put op de fluorescentiemicroscoop met behulp van het groene fluorescerende kanaal met een excitatiegolflengte van 480 nm en een emissiegolflengte van 530 nm.
OPMERKING: Het groene fluorescerende kanaal met een excitatiegolflengte van 480 nm en een emissiegolflengte van 530 nm wordt aanbevolen om de DCFH-DA te detecteren. Bovendien kan DCFH-DA worden gedetecteerd met de parameterinstellingen voor GFP en FITC in de fluorescentiemicroscoop35,36. - Verwerk ten slotte de afbeeldingen met beeldacquisitiesoftware (zie Materiaaltabel) en gebruik vervolgens ImageJ-software om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elke groep of de verhoudingen van de verschillende groepen te berekenen.
OPMERKING: De technische details van de fluorescentiemicroscoop en afbeelding J-software die voor het beeldvormingswerk worden gebruikt, zijn eerder beschreven37,38.
3. Meting van de verandering in mitochondriaal membraanpotentiaal
OPMERKING: De veranderingen in mitochondriaal membraanpotentiaal worden gecontroleerd door de JC-1-kleuringstest.
- Was aan het einde van de behandelingsperiode (stap 1.8) de cellen driemaal met 1 ml 1x PBS per put en kleurt de cellen vervolgens met 100 μL 5 μg/ml JC-1-werkoplossing (zie materiaaltabel) gedurende 30 minuten bij 37 °C in het donker.
OPMERKING: Als er na 30 minuten incubatie geen duidelijke groene fluorescentie wordt waargenomen, kan de incubatietijd van de sonde en cellen op de juiste manier worden verhoogd (30-60 minuten). Als overbelichting van de groene fluorescentiewaarde wordt waargenomen na 30 minuten incubatie, kan de incubatietijd van de sonde en cellen op passende wijze worden verminderd (15-30 minuten). - Was de cellen drie keer met 1x PBS (1 ml/put). Voeg 1 ml 1x PBS toe aan elk putje.
- Plaats de 12-well plaat op het microscoopstadium en gebruik vervolgens een 20x-objectief om de morfologie van de cellen te observeren (vergroting: 200x).
- Leg drie representatieve fluorescentiebeelden (vergroting: 200x) vast voor elke put op de fluorescentiemicroscoop met behulp van het groene fluorescerende kanaal met excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 485 nm en 535 nm, en het rode fluorescerende kanaal met excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 550 nm en 600 nm.
OPMERKING: Het groene fluorescerende kanaal met een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 535 nm wordt gebruikt om het JC-1-monomeer te detecteren, dat wordt behandeld als gedepolariseerde mitochondriën 39,40,41, en het rode fluorescerende kanaal met een excitatiegolflengte van 550 nm en een emissiegolflengte van 600 nm wordt gebruikt om het JC-1-dimeer te detecteren, die wordt behandeld als gepolariseerde mitochondriën 39,40,41. - Verwerk ten slotte de afbeeldingen met beeldacquisitiesoftware en gebruik vervolgens Image J-software om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elke groep of de verhoudingen van de verschillende groepen te berekenen.
OPMERKING: De technische details van de fluorescentiemicroscoop en afbeelding J-software die voor het beeldvormingswerk worden gebruikt, zijn eerder beschreven37,38.
4. Meting van de eiwitexpressieniveaus van LC3-II/LC3-I en p62/SQSTM1
- Was de cellen na de behandeling (stap 1.8) driemaal met 1x PBS (1 ml/put) dat is voorgekoeld bij 4 °C.
- Voeg de RIPA-lysisbuffer (100 μL/put) aangevuld met protease en een fosfataseremmercocktail (1x) (zie Materiaaltabel) toe aan de 12-well-plaat en lyseer gedurende 5 minuten op ijs.
- Verzamel het cellysaat in microcentrifugebuizen van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 4 °C bij 12.000 x g . Bepaal de eiwitconcentratie van de supernatanten volgens de BCA-methode volgens de standaardprocedures42.
- Voeg SDS-PAGE sample loading buffer (5x, zie Tabel of Materials) toe aan de cell lysate supernatants (volume ratio = 1:4).
- Meng door vortexing (met hoge snelheid gedurende ~ 15 s) en verwarm de gemengde monsters gedurende 5 minuten op 100 °C om het eiwit te denatureren.
- Doe de 12-goed voorbereide 12% SDS-PAGE-gel in de elektroforesetank en voeg vervolgens de SDS-up-samplebuffer (1x) verdund met ultrazuiver water toe aan de hoogtelimietpositie.
OPMERKING: De SDS-PAGE-gel wordt bereid met behulp van een commerciële kit (zie materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant. - Voeg de eiwitmarker (5 μL/put) en monsters (20 μg/put) toe aan verschillende putjes van de SDS-PAGE-gel.
- Stel de stabiele spanningsmodus in op 100 V en voer de elektroforese gedurende 80 minuten uit.
- Voer na de SDS-PAGE-elektroforese de elektrooverdracht van de eiwitten uit naar een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan (0,45 μM, zie materiaaltabel) naar aanleiding van eerder gepubliceerde rapporten43,44.
- Na de elektrooverdracht van de eiwitten, was het PVDF-membraan met 10 ml TBST (1x TBS, 0,1% Tween 20) twee keer (5 min / tijd) in een shaker op kamertemperatuur.
- Blokkeer het PVDF-membraan met 5 ml runderserumalbumine (BSA, 5%) in een shaker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Was het PVDF-membraan driemaal met 10 ml TBST (10 min/keer). Incubeer vervolgens het PVDF-membraan in 5 ml van de specifieke primaire antilichamen verdund in blokkeringsbuffer voor LC3 (muis mAb, 1:2.000), p62/SQSTM1 (hierna p62, muis mAb, 1:2.000) en β-actine (muis mAb, 1:2.000) (zie Tabel van Materialen) 's nachts bij 4 °C.
- Was het PVDF-membraan driemaal (10 min/tijd) met 10 ml TBST op kamertemperatuur. Incubeer vervolgens het PVDF-membraan met konijn anti-muis IgG (HRP) secundair antilichaam verdund in blokkerende buffer (1:10.000) (zie Materiaaltabel) bij kamertemperatuur en beschut tegen licht gedurende 2 uur.
- Was het PVDF-membraan driemaal (10 min/tijd) met 10 ml TBST op kamertemperatuur. Plaats vervolgens het PVDF-membraan op de plasticfolie, voeg een geschikte hoeveelheid ECL-werkoplossing (200 μL / membraan) toe (zie materiaaltabel) en incubeer gedurende 2 minuten.
- Verwijder na incubatie de ECL-werkoplossing en stel het PVDF-membraan in het beeldvormingssysteem bloot voor beeldontwikkeling. Gebruik ten slotte de Image J-software om de grijswaarden van elke band te analyseren.
OPMERKING: De technische details van de western blotting- en Image J-software die voor het beeldvormingswerk wordt gebruikt, zijn eerder beschreven45,46.
5. Statistische analyse
- Presenteer de gegevens van de experimenten als de gemiddelde ± standaarddeviatie (SD).
- Voer de analyse van significantie uit met de eerder beschreven statistische softwaretool47.
- Bereken de statistische verschillen tussen de twee groepen met behulp van een t-test. Een P-waarde lager dan 0,05 wordt als statistisch significant beschouwd: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intracellulaire ROS in de cellen
AML-12-cellen werden geïnduceerd met 300 μM PA gedurende 24 uur en er werd een NAFLD-celmodel vastgesteld. Vervolgens werden de cellen gedurende 24 uur behandeld met PD. De cellen werden gelabeld met een DCFH-DA fluorescerende sonde en de ROS-productie werd waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop. De resultaten van de DCFH-DA-kleuring van intracellulaire ROS in de cellen zijn weergegeven in figuur 1. De resultaten toonden aan dat PD het niveau van intracellulaire ROS in de cellen geïncubeerd met 300 μM PA (P < 0,01) aanzienlijk kon verminderen, wat aangeeft dat PD cellulaire oxidatieve stress kan verminderen.
Mitochondriaal membraanpotentiaal van de cellen
Het mitochondrion is het centrale organel dat wordt bestuurd door de intrinsieke apoptoseroute48,49,50. Daarom werd de mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) van AML-12-cellen die gedurende 24 uur met PD waren geïncubeerd, waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop na JC-1-kleuring. Zoals weergegeven in figuur 2, was de groene fluorescentie (JC-1-monomeren, behandeld als gedepolariseerde mitochondriën 39,40,41) in de met PA behandelde cellen hoger dan in de onbehandelde cellen. Aan de andere kant was de rode fluorescentie (JC-1-dimeren, behandeld als gepolariseerde mitochondriën 39,40,41) in de met PA behandelde cellen lager dan in de onbehandelde cellen, wat wijst op PA-geïnduceerde MMP-depolarisatie in de cellen. Bovendien nam in vergelijking met de modelgroep de verhouding van JC-1-monomeren:dimeren af in de PD-behandelingsgroep (P < 0,01), wat aangeeft dat PD PA-geïnduceerde MMP-depolarisatie zou kunnen verbeteren.
De eiwitexpressieniveaus van LC3-II/LC3-I en p62
Deze studie onderzocht ook de potentiële rol van PD op de autofagieroute door de eiwitexpressieniveaus van autofagie-gerelateerde eiwitten LC3 en p62 in de cellen te onderzoeken door western blotting. Zoals te zien is in figuur 3, nam de verhouding LC3-II:LC3-I significant af (P < 0,005) en nam het eiwitexpressieniveau van p62 toe na behandeling met PA gedurende 48 uur (P < 0,01). Aan de andere kant kan PD het eiwitexpressieniveau van p62 (P < 0,01) aanzienlijk verlagen en de verhouding van LC3-II: LC3-I (P < 0,05) verhogen, wat aangeeft dat PD de door PA geremde autofagische flux kan herstellen.
Figuur 1: Effecten van PD op intracellulaire ROS in de cellen zoals beoordeeld door DCFH-DA-kleuring . (A) ROS-generatie werd gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie, 200x. Schaalbalk: 20 μm. (B) Relatieve vouwveranderingen in de ROS-niveaus in verschillende groepen. Elke kolom vertegenwoordigt het gemiddelde ± SD (n = 3). **P < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Effecten van PD op MMP-depolarisatie in de cellen zoals beoordeeld door JC-1-kleuring. (A) MMP-depolarisatie werd gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie, 200x. Schaalbalk: 20 μm. (B) Relatieve veranderingen in de verhouding JC-1 monomeren:dimeren in de verschillende groepen. Elke kolom vertegenwoordigt het gemiddelde ± SD (n = 3). **P < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Effecten van PD op de eiwitexpressieniveaus van LC3-II/LC3-I en p62 in de cellen zoals beoordeeld door western blotting. (A) De eiwitniveaus van LC3, p62 en β-actine werden gedetecteerd door western blotting. (B) Relatieve veranderingen in de verhouding LC3-II:LC3-I in de verschillende groepen. (C) Relatieve vouwveranderingen in de expressie van p62 in de verschillende groepen. Elke kolom vertegenwoordigt het gemiddelde ± SD (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studies hebben het feit benadrukt dat NAFLD een clinicopathologisch syndroom is, variërend van leververvetting tot NASH, dat zich kan ontwikkelen tot cirrose en leverkanker51. Een vetrijk dieet en een inactieve levensstijl zijn typische risicofactoren voor NAFLD. Zowel niet-medicamenteuze therapieën als medicamenteuze therapieën voor NAFLD-behandeling zijn onderzocht51,52,53. De pathogenese van NAFLD is echter niet volledig opgehelderd. De hier beschreven methode omvat een in vitro model van NAFLD vastgesteld door PA-gestimuleerde AML-12 cellen. We onderzochten de beschermende effecten van PD tegen NAFLD in dit model en we ontdekten dat PD de door PA geïnduceerde toename van ROS verzwakte. Bovendien verbeterde PD ook PA-geïnduceerde MMP-depolarisatie. Bovendien zou PD het eiwitexpressieniveau van p62 aanzienlijk kunnen verlagen en de verhouding van LC3-II: LC3-I kunnen verhogen. Deze experimentele resultaten kunnen een basis vormen voor de toepassing van PD als een actief farmaceutisch ingrediënt voor NAFLD-behandeling.
Als een belangrijke intracellulaire afbraakroute realiseert autofagie het fysiologische proces van recycling en hergebruik van voedingsgrondstoffen door overtollige componenten in cellen af te breken19,54. Autofagie is ook een belangrijk reparatiemechanisme voor het lichaam om de "yin-yang-balans" te behouden, en het is de microscopische belichaming van "qi-transformatie" in TCM55,56,57. In het huidige protocol werd, naast het detecteren van de veranderingen in ROS-productie en MMP-depolarisatie, de potentiële rol van PD op de autofagieroute onderzocht door de eiwitexpressieniveaus van autofagie-gerelateerde eiwitten LC-3 en p62 te detecteren door western blotting. Na de behandeling van PA-geïnduceerde cellen met PD nam de verhouding LC3-II: LC3-I af en nam de accumulatie van p62 toe, wat aangeeft dat het niveau van autofagie afnam. De experimentele resultaten komen overeen met andere literatuurrapporten 20,34,58,59. Dit in vitro celmodel kan helpen het begrip van de biologische functie van PD te verbeteren en het gebruik van andere actieve TCM-stoffen voor de behandeling van NAFLD te bestuderen.
Er zijn enkele cruciale stappen in het experimentele proces. Om te bepalen of het in vitro NAFLD-model met succes is vastgesteld, kunnen de lipidedruppelafzettingen in de normale controle- en PA-behandelde groepscellen worden vergeleken door Oil Red O-kleuring, zoals eerder beschreven60,61. Na DCFH-DA-kleuring of JC-1-kleuring moeten de resterende sondes die de cellen niet binnenkomen, worden afgewassen; Anders zal dit een hoge achtergrond veroorzaken bij het maken van de fluorescentiebeelden. Bovendien moet de tijd (met uitzondering van de incubatietijd) tussen de belasting en meting van de fluorescerende sondes (DCFH-DA of JC-1) worden verkort om de kans op experimentele fouten te verminderen. Bovendien kunnen de werkconcentraties van de fluorescerende sondes (DCFH-DA of JC-1) naar behoefte worden aangepast als de fluorescentiewaarde van de cellen in de negatieve controlegroep relatief hoog is. Als alternatief kan de incubatietijd van de JC-1-werkoplossing en de cellen binnen een tijdsbestek van 15-60 minuten op de juiste manier worden aangepast aan de werkelijke experimentele omstandigheden.
Er zijn ook enkele beperkingen in dit in vitro celmodel. Cellen zoals hepatische parenchymale cellen, hepatische stellaatcellen, Kupffer-cellen en vasculaire endotheelcellen zijn aanwezig in leverweefsels62. Daarom zijn experimenten alleen op leverparenchymale cellen mogelijk niet voldoende om de effecten van geneesmiddelen te verklaren. Andere celmodellen moeten ook worden gebruikt bij de ontdekking van anti-NAFLD-geneesmiddelen. Daarnaast zijn driedimensionale (3D) celkweeksystemen gebruikt om levermodellen te construeren en hepatotoxiciteit63,64 te testen. Toekomstige studies zullen zich richten op het ontwikkelen van in vitro modellen met behulp van co-cultuur en 3D-celkweektechnieken voor potentiële anti-NAFLD-geneesmiddelenscreening.
Als een multi-systeemziekte spelen veel factoren een rol bij de ontwikkeling en progressie van NAFLD, wat betekent dat een enkel diermodel of celmodel niet alle pathologische processen van deze ziekte volledig kan nabootsen65. Overmatige afhankelijkheid van het gebruik van diermodellen verhoogt de last van de ontwikkeling van therapeutische geneesmiddelen. Het gebruik van in vitro celmodellen in de vroege stadia van de ontwikkeling van anti-NAFLD-geneesmiddelen is praktischer en kosteneffectiever. In deze studie werd een normale muis hepatocyt cellijn AML-12 gebruikt om het in vitro model van NAFLD te construeren, en het therapeutische effect van PD werd gevalideerd in dit model. Met name de resultaten van deze studie bieden een basis voor verder onderzoek naar de anti-NAFLD-effecten van PD in hepatocyten- en primaire hepatocytenmodellen van muizen.
Tot slot wordt hier een in vitro model gepresenteerd om de beschermende effecten van PD tegen NAFLD te bestuderen. Dit zou ook een nuttig in vitro model kunnen zijn voor het onderzoeken van de werkzaamheid van andere werkzame stoffen van TCM voor de behandeling van NAFLD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Chongqing Science and Technology Commission (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 en jbky20210029) en de China Postdoctoral Science Foundation (nr. 2021MD703919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% BSA Blocking Buffer | Solarbio, Beijing, China | SW3015 | |
| AML12 (alpha mouse liver 12) cell line | Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China | AML12 | |
| Beyo ECL Plus | Beyotime, Shanghai, China | P0018S | |
| Bio-safety cabinet | Esco Micro Pte Ltd, Singapore | AC2-5S1 A2 | |
| cellSens | Olympus, Tokyo, Japan | 1.8 | |
| Culture CO2 Incubator | Esco Micro Pte Ltd, Singapore | CCL-170B-8 | |
| Dexamethasone | Beyotime, Shanghai, China | ST125 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio, Beijing, China | D8371 | |
| DMEM/F12 | Hyclone, Logan, UT, USA | SH30023.01 | |
| Foetal Bovine Serum | Hyclone, Tauranga, New Zealand | SH30406.05 | |
| Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 8.0 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | ABclonal, Wuhan, China | AS003 | |
| Hydrophobic PVDF Transfer Membrane | Merck, Darmstadt, Germany | IPFL00010 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× | Beyotime, Shanghai, China | C0341 | |
| MAP LC3β Antibody | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-376404 | |
| Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 | Solarbio, Beijing, China | M8650 | |
| Olympus Inverted Microscope IX53 | Olympus, Tokyo, Japan | IX53 | |
| Palmitic Acid | Sigma, Germany | P0500 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | Hyclone, Logan, UT, USA | SV30010 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Beyotime, Shanghai, China | ST506 | |
| Phosphate Buffered Solution | Hyclone, Logan, UT, USA | BL302A | |
| Platycodin D | Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China | CSA: 58479-68-8 | |
| Protease inhibitor cocktail for general use, 100x | Beyotime, Shanghai, China | P1005 | |
| Protein Marker | Solarbio, Beijing, China | PR1910 | |
| Reactive Oxygen Species Assay Kit | Solarbio, Beijing, China | CA1410 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime, Shanghai, China | P0013E | |
| SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit | Beyotime, Shanghai, China | P0012AC | |
| SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x | Beyotime, Shanghai, China | P0015 | |
| Sigma Centrifuge | Sigma, Germany | 3K15 | |
| SQSTM1/p62 Antibody | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-28359 | |
| Tecan Infinite 200 PRO | Tecan Austria GmbH, Austria | 1510002987 | |
| WB Transfer Buffer,10x | Solarbio, Beijing, China | D1060 | |
| β-Actin Mouse mAb | ABclonal, Wuhan, China | AC004 |
References
- Xunyan, X. Y., Fang, X. M. The effect of Platycodon grandiflorum and its historical change in the clinical application of Platycodonis radix. Zhonghua Yi Shi Za Shi. 51 (3), 167-176 (2021).
- Ma, X., et al. Platycodon grandiflorum extract: Chemical composition and whitening, antioxidant, and anti-inflammatory effects. RSC Advances. 11 (18), 10814-10826 (2021).
- Ke, W., et al. Dietary Platycodon grandiflorus attenuates hepatic insulin resistance and oxidative stress in high-fat-diet induced non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 12 (2), 480 (2020).
- Kim, Y. J., et al. Platycodon grandiflorus root extract attenuates body fat mass, hepatic steatosis and insulin resistance through the interplay between the liver and adipose tissue. Nutrients. 8 (9), 532 (2016).
- Park, H. M., et al. Mass spectrometry-based metabolomic and lipidomic analyses of the effects of dietary Platycodon grandiflorum on liver and serum of obese mice under a high-fat diet. Nutrients. 9 (1), 71 (2017).
- Qi, C., et al. Platycodon grandiflorus polysaccharide with anti-apoptosis, anti-oxidant and anti-inflammatory activity against LPS/D-GalN induced acute liver injury in mice. Journal of Polymers and the Environment. 29 (12), 4088-4097 (2021).
- Choi, J. H., et al. Saponins from the roots of Platycodon grandiflorum ameliorate high fat diet-induced non-alcoholic steatohepatitis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 86, 205-212 (2017).
- Choi, Y. J., et al. Platycodin D enhances LDLR expression and LDL uptake via down-regulation of IDOL mRNA in hepatic cells. Scientific Reports. 10, 19834 (2020).
- Li, T., et al. Platycodin D triggers autophagy through activation of extracellular signal-regulated kinase in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. European Journal of Pharmacology. 749, 81-88 (2015).
- Lu, J. -J., et al. Proteomic analysis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells treated with platycodin D. Chinese Journal of Natural Medicines. 13 (9), 673-679 (2015).
- Neuschwander-Tetri, B. A. Therapeutic landscape for NAFLD in 2020. Gastroenterology. 158 (7), 1984-1998 (2020).
- Friedman, S. L., Neuschwander-Tetri, B. A., Rinella, M., Sanyal, A. J. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nature Medicine. 24 (7), 908-922 (2018).
- Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (1), 99-128 (2019).
- Buzzetti, E., Pinzani, M., Tsochatzis, E. A. The multiple-hit pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Metabolism. 65 (8), 1038-1048 (2016).
- Watt, M. J., Miotto, P. M., De Nardo, W., Montgomery, M. K. The liver as an endocrine organ-Linking NAFLD and insulin resistance. Endocrine Reviews. 40 (5), 1367-1393 (2019).
- Khan, R. S., Bril, F., Cusi, K., Newsome, P. N. Modulation of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 70 (2), 711-724 (2019).
- Karkucinska-Wieckowska, A., et al. Mitochondria, oxidative stress and nonalcoholic fatty liver disease: A complex relationship. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), 13622 (2022).
- Tilg, H., Adolph, T. E., Dudek, M., Knolle, P. Non-alcoholic fatty liver disease: The interplay between metabolism, microbes and immunity. Nature Metabolism. 3 (12), 1596-1607 (2021).
- Qian, H., et al. Autophagy in liver diseases: A review. Molecular Aspects of Medicine. 82, 100973 (2021).
- Du, J., Ji, Y., Qiao, L., Liu, Y., Lin, J. Cellular endo-lysosomal dysfunction in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Liver International. 40 (2), 271-280 (2020).
- Allaire, M., Rautou, P. E., Codogno, P., Lotersztajn, S. Autophagy in liver diseases: Time for translation. Journal of Hepatology. 70 (5), 985-998 (2019).
- Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11963-11980 (2013).
- Lau, J. K., Zhang, X., Yu, J. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease: Current perspectives and recent advances. The Journal of Pathology. 241 (1), 36-44 (2017).
- Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: Lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
- Carpino, G., et al. Increased liver localization of lipopolysaccharides in human and experimental NAFLD. Hepatology. 72 (2), 470-485 (2020).
- Vergani, L. Fatty acids and effects on in vitro and in vivo models of liver steatosis. Current Medicinal Chemistry. 26 (19), 3439-3456 (2019).
- Scorletti, E., Carr, R. M. A new perspective on NAFLD: Focusing on lipid droplets. Journal of Hepatology. 76 (4), 934-945 (2022).
- Green, C. J., Pramfalk, C., Morten, K. J., Hodson, L. From whole body to cellular models of hepatic triglyceride metabolism: Man has got to know his limitations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (1), 1-20 (2015).
- Gambino, R., et al. Different serum free fatty acid profiles in NAFLD subjects and healthy controls after oral fat load. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 479 (2016).
- Marra, F., Svegliati-Baroni, G. Lipotoxicity and the gut-liver axis in NASH pathogenesis. Journal of Hepatology. 68 (2), 280-295 (2018).
- Zhang, J., Zhang, H., Deng, X., Zhang, Y., Xu, K. Baicalin protects AML-12 cells from lipotoxicity via the suppression of ER stress and TXNIP/NLRP3 inflammasome activation. Chemico-Biological Interactions. 278, 189-196 (2017).
- Liang, Y., et al. γ-Linolenic acid prevents lipid metabolism disorder in palmitic acid-treated alpha mouse liver-12 cells by balancing autophagy and apoptosis via the LKB1-AMPK-mTOR pathway. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (29), 8257-8267 (2021).
- Peng, Z., et al. Nobiletin alleviates palmitic acid-induced NLRP3 inflammasome activation in a sirtuin 1dependent manner in AML12 cells. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5815-5822 (2018).
- Xu, T., et al. Ferulic acid alleviates lipotoxicity-induced hepatocellular death through the SIRT1-regulated autophagy pathway and independently of AMPK and Akt in AML-12 hepatocytes. Nutrition & Metabolism. 18 (1), 13 (2021).
- Aranda, A., et al. Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay: A quantitative method for oxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells. Toxicology in Vitro. 27 (2), 954-963 (2013).
- Eruslanov, E., Kusmartsev, S. Identification of ROS using oxidized DCFDA and flow-cytometry. Methods in Molecular Biology. 594, 57-72 (2010).
- Bankhead, P. Analyzing Fluorescence Microscopy Images with ImageJ. , Queen's University Belfast. Belfast, Ireland. (2014).
- Wiesmann, V., et al. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
- Lugli, E., Troiano, L., Cossarizza, A. Polychromatic analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 7, Unit 7.32 (2007).
- Sivandzade, F., Bhalerao, A., Cucullo, L. Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a sensitive fluorescent probe. Bio-protocol. 9 (1), 3128 (2019).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).
- Goldman, A., Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current Protocols in Protein Science. 82, 1-16 (2015).
- Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Proteins from polyacrylamide gels onto PVDF membranes. Current Research in Protein Chemistry. , 87 (2012).
- Davarinejad, H. Quantifications of western blots with ImageJ. University of York. , Available from: http://www.yourku.ca/yisheng/internal/Protocols/Imagej.pdf (2015).
- Taylor, S. C., Posch, A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Research International. 2014, 361590 (2014).
- Motulsky, H. J. Graphpad Statistics Guide. Options for multiple t tests. Graphpad. , (2020).
- Poltorak, A. Cell death: All roads lead to mitochondria. Current Biology. 32 (16), 891-894 (2022).
- Dadsena, S., Jenner, A., García-Sáez, A. J. Mitochondrial outer membrane permeabilization at the single molecule level. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3777-3790 (2021).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305 (5684), 626-629 (2004).
- Lange, N. F., Radu, P., Dufour, J. F. Prevention of NAFLD-associated HCC: Role of lifestyle and chemoprevention. Journal of Hepatology. 75 (5), 1217-1227 (2021).
- Liu, X., Zhang, Y., Ma, C., Lin, J., Du, J. Alternate-day fasting alleviates high fat diet induced non-alcoholic fatty liver disease through controlling PPARalpha/Fgf21 signaling. Molecular Biology Reports. 49 (4), 3113-3122 (2022).
- Romero-Gomez, M., Zelber-Sagi, S., Trenell, M. Treatment of NAFLD with diet, physical activity and exercise. Journal of Hepatology. 67 (4), 829-846 (2017).
- Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
- Cui, B., Yu, J. M. Autophagy: A new pathway for traditional Chinese medicine. Journal of Asian Natural Products Research. 20 (1), 14-26 (2018).
- Law, B. Y., et al. New potential pharmacological functions of Chinese herbal medicines via regulation of autophagy. Molecules. 21 (3), 359 (2016).
- Zhou, H., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine monomer for treatment of non-alcoholic fatty liver disease. European Journal of Pharmacology. 898, 173976 (2021).
- Zhang, L., Yao, Z., Ji, G. Herbal extracts and natural products in alleviating non-alcoholic fatty liver disease via activating autophagy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1459 (2018).
- Zhang, X., et al. C-X-C motif chemokine 10 impairs autophagy and autolysosome formation in non-alcoholic steatohepatitis. Theranostics. 7 (11), 2822-2836 (2017).
- Li, C. X., et al. Allyl isothiocyanate ameliorates lipid accumulation and inflammation in nonalcoholic fatty liver disease via the Sirt1/AMPK and NF-kappaB signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 25 (34), 5120-5133 (2019).
- Li, S., et al. Sirtuin 3 acts as a negative regulator of autophagy dictating hepatocyte susceptibility to lipotoxicity. Hepatology. 66 (3), 936-952 (2017).
- Farrell, G. C., Teoh, N. C., McCuskey, R. S. Hepatic microcirculation in fatty liver disease. The Anatomical Record. 291 (6), 684-692 (2008).
- Milner, E., et al. Emerging three-dimensional hepatic models in relation to traditional two-dimensional in vitro assays for evaluating drug metabolism and hepatoxicity. Medicine in Drug Discovery. 8, 100060 (2020).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: State of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Bilson, J., Sethi, J. K., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A multi-system disease influenced by ageing and sex, and affected by adipose tissue and intestinal function. Proceedings of the Nutrition Society. 81 (2), 146-161 (2022).
