Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Undersöker de skyddande effekterna av Platycodin D på alkoholfri fettleversjukdom i en palmitinsyrainducerad in vitro-modell

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64816
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 2
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll undersöker de skyddande effekterna av platycodin D på alkoholfri fettleversjukdom i en palmitinsyrainducerad in vitro-modell .

Abstract

Förekomsten av alkoholfri fettlever (NAFLD) har ökat i en alarmerande takt över hela världen. Platycodon grandiflorum används ofta som en traditionell etnomedicin för behandling av olika sjukdomar och är en typisk funktionell mat som kan införlivas i den dagliga kosten. Studier har föreslagit att platycodin D (PD), en av de viktigaste aktiva ingredienserna i Platycodon grandiflorum, har hög biotillgänglighet och avsevärt mildrar utvecklingen av NAFLD, men den underliggande mekanismen för detta är fortfarande oklart. Denna studie syftar till att undersöka den terapeutiska effekten av PD mot NAFLD in vitro. AML-12-celler förbehandlades med 300 μM palmitinsyra (PA) i 24 timmar för att modellera NAFLD in vitro. Därefter behandlades cellerna antingen med PD eller fick ingen PD-behandling under 24 timmar. Nivåerna av reaktiva syreradikaler (ROS) analyserades med 2′,7′-diklor-dihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA) färgning, och mitokondriell membranpotential bestämdes med JC-1-färgningsmetoden. Dessutom analyserades proteinuttrycksnivåerna av LC3-II / LC3-I och p62 / SQSTM1 i celllysaterna med western blotting. PD visade sig signifikant minska ROS och mitokondriella membranpotentialnivåer i den PA-behandlade gruppen jämfört med kontrollgruppen. Samtidigt ökade PD LC3-II / LC3-I-nivåerna och minskade p62 / SQSTM1-nivåerna i den PA-behandlade gruppen jämfört med kontrollgruppen. Resultaten indikerade att PD förbättrade NAFLD in vitro genom att minska oxidativ stress och stimulera autofagi. Denna in vitro-modell är ett användbart verktyg för att studera PD: s roll i NAFLD.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), som är den torkade roten av Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., används i traditionell kinesisk medicin (TCM). Det produceras främst i nordöstra, norra, östra, centrala och sydvästra regionerna i Kina1. PG-komponenterna innefattar triterpenoidsaponiner, polysackarider, flavonoider, polyfenoler, polyetylenglykoler, flyktiga oljor och mineraler2. PG har en lång historia av att användas som ett livsmedel och en örtmedicin i Asien. Traditionellt användes denna ört för att göra medicin mot lungsjukdomar. Modern farmakologi ger också bevis på effekten av PG för behandling av andra sjukdomar. Studier har visat att PG har en terapeutisk effekt på en mängd olika läkemedelsinducerade leverskademodeller. Kosttillskottet av PG eller platycodin extrakt kan lindra fettrik diet-inducerad fetma och dess relaterade metaboliska sjukdomar 3,4,5. Polysackarider från PG kan användas för behandling av akut leverskada orsakad av LPS/D-GalN hos möss6. Dessutom förbättrar saponiner från rötterna av PG fettrik dietinducerad alkoholfri steatohepatit (NASH)7. Dessutom kan platycodin D (PD), en av de viktigaste terapeutiska komponenterna i PG, förbättra lågdensitetslipoproteinreceptoruttryck och lågdensitetslipoproteinupptag i humant hepatocellulärt karcinom (HepG2) celler8. Dessutom kan PD också inducera apoptos och hämma vidhäftning, migration och invasion i HepG2-celler 9,10. I denna studie används således AML-12-celler från mösshepatom för in vitro-modellkonstruktion och för att ytterligare studera de farmakologiska effekterna och underliggande mekanismer för PD i denna modell.

Termen alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD) avser en grupp leversjukdomar som inkluderar enkel steatos, NASH, cirros och hepatocellulärt karcinom11. Även om patogenesen av NAFLD är ofullständigt förstådd, från den klassiska "two-hit" -teorin till den nuvarande "multiple-hit" -teorin, anses insulinresistens vara central i patogenesen av NAFLD12,13,14. Studier har visat att insulinresistens i hepatocyter kan leda till ökade fria fettsyror, som bildar triglycerider som deponeras i levern och får levern att bli fet15,16. Ansamling av fett kan leda till lipotoxicitet, oxidativ stressinducerad mitokondriell dysfunktion, endoplasmatisk retikulumstress och inflammatorisk cytokinfrisättning, vilket resulterar i patogenesen och progressionen av NAFLD17,18. Dessutom spelar autofagi också en roll i patogenesen av NAFLD, eftersom den är involverad i reglering av cellulär insulinkänslighet, cellulär lipidmetabolism, hepatocytskada och medfödd immunitet 19,20,21.

En mängd olika djurmodeller och cellulära modeller har upprättats för att ge en grund för att utforska patogenesen och potentiella terapeutiska mål för NAFLD22,23. Enstaka djurmodeller kan emellertid inte helt efterlikna alla patologiska processer i NAFLD24. Individuella skillnader mellan djur leder till olika patologiska egenskaper. Användning av levercellinjer eller primära hepatocyter i in vitro-studier av NAFLD säkerställer maximal konsistens under experimentella förhållanden. Nedsatt lipidmetabolism dysregulering kan leda till högre nivåer av hepatocytlipiddroppackumulering i NAFLD25. Fria fettsyror som oljesyra och palmolja har använts i in vitro-modellen för att efterlikna NAFLD orsakad av en fettrik diet26,27. Den humana hepatoblastomcellinjen HepG2 används ofta vid konstruktion av NAFLD-modeller in vitro, men som en tumörcellinje skiljer sig metabolismen av HepG2-celler signifikant från leverceller under normala fysiologiska förhållanden28. Därför är det mer fördelaktigt att använda primära hepatocyter eller primära hepatocyter hos mus för att konstruera in vitro NAFLD-modellen för läkemedelsscreening än att använda tumörcellinjer. Att jämföra den synergistiska undersökningen av läkemedelseffekter och terapeutiska mål i både djurmodeller och in vitro-hepatocytmodeller verkar det som att användning av mushepatocyter för att konstruera in vitro NAFLD-modellen har bättre applikationspotential.

Fria fettsyror som kommer in i levern oxideras för att producera energi eller lagras som triglycerider. Signifikant, fria fettsyror har en viss lipotoxicitet och kan inducera cellulär dysfunktion och apoptos12. Palmitinsyra (PA) är den vanligaste mättade fettsyran i human plasma29. När celler i icke-fettvävnad utsätts för höga koncentrationer av PA under lång tid stimulerar detta produktionen av reaktiva syreradikaler (ROS) och orsakar oxidativ stress, lipidackumulering och till och med apoptos30. Därför använder många forskare PA som en inducerare för att stimulera leverceller att producera ROS och därmed konstruera in vitro-fettleversjukdomsmodellen och utvärdera de skyddande effekterna av vissa aktiva substanser på celler31,32,33,34. Denna studie introducerar ett protokoll för att undersöka de skyddande effekterna av PD på en cellmodell av NAFLD inducerad av PA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

AML-12-celler (en normal mushepatocytcellinje) används för de cellbaserade studierna. Cellerna erhålls från en kommersiell källa (se Materialförteckning).

1. Förbehandling av AML-12-cellerna för att modellera NAFLD in vitro

  1. Behåll cellerna i normala cellodlingsmedier (DMEM plus Hams F12 [1:1] innehållande 0,005 mg/ml insulin, 5 ng/ml selen, 0,005 mg/ml transferrin, 40 ng/ml dexametason och 10 % fetalt bovint serum [FBS], se materialtabell) vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5 %CO2.
  2. Frö cellerna i 12-brunnsplattor (1 ml / brunn) med en densitet av 2,8 x 105 celler / brunn.
    OBS: Alla cellsmältnings- och mediumutbytesoperationer utförs i ett biosäkerhetsskåp för att undvika att förorena cellerna.
  3. Ta bort cellernas odlingsmedium efter inkubationen över natten (~ 10 timmar) och tvätta sedan cellerna två gånger med 1 ml serumfritt medium (per brunn).
  4. Dela upp cellplattan med 12 brunnar i fyra olika behandlingsgrupper från vänster till höger, inklusive (1) kontrollgruppen, (2) den PD-behandlade gruppen, (3) den PA-behandlade gruppen och (4) den PA + PD-behandlade gruppen.
    OBS: Tre replikat av varje experimentell behandlingsgrupp är anordnade från topp till botten på samma 12-brunns cellplatta.
  5. Tillsätt det normala cellodlingsmediet (1 ml/brunn) till kontrollgruppen och den PD-behandlade gruppen och tillsätt det normala cellodlingsmediet (1 ml/brunn) kompletterat med 300 μM PA till den PA-behandlade och PA + PD-behandlade gruppen.
  6. Ta bort cellernas odlingsmedium efter 24 timmars inkubation och tvätta sedan cellerna med 1 ml serumfritt medium (per brunn) två gånger.
  7. Tillsätt normala cellodlingsmedier (1 ml/brunn) kompletterat med en vehikel (dimetylsulfoxid, DMSO, 0,1 % v/v) till kontrollgruppen. tillföra normala cellodlingsmedier (1 ml/brunn) kompletterat med 1 μM PD till den PD-behandlade gruppen, tillföra normala cellodlingssubstrat (1 ml/brunn) kompletterat med 300 μM PA till den PA-behandlade gruppen, tillsätt normala cellodlingsmedier (1 ml/brunn) kompletterat med 300 μM PA och 1 μM PD till PA + PD-behandlade gruppen.
  8. Efter inkubation i ytterligare 24 timmar, undersök de skyddande effekterna av PD på celler med 2′,7′-diklor-dihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA) färgning (steg 2), JC-1-färgning (steg 3) och western blotting (steg 4).
    OBS: Alla inkubationsoperationer utförs vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5%CO2.

2. Mätning av förändringen i ROS-tillverkningen

OBS: De intracellulära ROS-nivåerna i cellerna bedöms baserat på DCFH-DA-färgningsanalysen.

  1. Vid slutet av behandlingsperioden (steg 1.8), tvätta cellerna med 1 ml fosfatbuffrad saltlösning per brunn (1x PBS, pH 7,4) tre gånger och färga sedan cellerna med 100 μL 10 μM DCFH-DA per brunn (se materialtabell). Inkubera cellerna i mörkret i 30 minuter.
    OBS: Om ingen uppenbar grön fluorescens observeras efter 30 minuters inkubation kan sondens och cellernas inkubationstid ökas på lämpligt sätt (30-60 min). Om överexponering av det gröna fluorescensvärdet observeras efter 30 minuters inkubation kan sondens och cellernas inkubationstid minskas på lämpligt sätt (15-30 min).
  2. Tvätta cellerna med 1x PBS (1 ml / brunn) tre gånger. Tillsätt 1 ml 1x PBS till varje brunn.
  3. Placera plattan med 12 brunnar på mikroskopsteget (se Materialförteckning) och använd sedan ett 20x-mål för att observera cellernas morfologi (förstoring: 200x).
  4. Ta tre representativa fluorescensbilder (förstoring: 200x) för varje brunn i fluorescensmikroskopet med hjälp av den gröna fluorescerande kanalen med en excitationsvåglängd på 480 nm och en emissionsvåglängd på 530 nm.
    OBS: Den gröna fluorescerande kanalen med en excitationsvåglängd på 480 nm och en emissionsvåglängd på 530 nm rekommenderas för att detektera DCFH-DA. Dessutom kan DCFH-DA detekteras med parameterinställningarna för GFP och FITC i fluorescensmikroskopet35,36.
  5. Slutligen bearbeta bilderna med bildinsamlingsprogram (se Materialförteckning) och använd sedan ImageJ-programvaran för att beräkna den genomsnittliga fluorescensintensiteten för varje grupp eller förhållandena för de olika grupperna.
    OBS: De tekniska detaljerna för fluorescensmikroskopet och Image J-programvaran som används för bildarbetet har beskrivits tidigare37,38.

3. Mätning av förändringen i mitokondriell membranpotential

OBS: Förändringarna i mitokondriell membranpotential övervakas av JC-1-färgningsanalysen.

  1. Vid slutet av behandlingsperioden (steg 1.8), tvätta cellerna med 1 ml 1x PBS per brunn tre gånger och färga sedan cellerna med 100 μL 5 μg/ml JC-1 arbetslösning (se materialtabell) i 30 minuter vid 37 °C i mörker.
    OBS: Om ingen uppenbar grön fluorescens observeras efter 30 minuters inkubation kan sondens och cellernas inkubationstid ökas på lämpligt sätt (30-60 min). Om överexponering av det gröna fluorescensvärdet observeras efter 30 minuters inkubation kan sondens och cellernas inkubationstid minskas på lämpligt sätt (15-30 min).
  2. Tvätta cellerna med 1x PBS (1 ml / brunn) tre gånger. Tillsätt 1 ml 1x PBS till varje brunn.
  3. Placera plattan med 12 brunnar på mikroskopsteget och använd sedan ett 20x-mål för att observera cellernas morfologi (förstoring: 200x).
  4. Ta tre representativa fluorescensbilder (förstoring: 200x) för varje brunn i fluorescensmikroskopet med hjälp av den gröna fluorescerande kanalen med excitations- och emissionsvåglängder på 485 nm respektive 535 nm och den röda fluorescerande kanalen med excitations- och emissionsvåglängder på 550 nm respektive 600 nm.
    OBS: Den gröna fluorescerande kanalen med en excitationsvåglängd på 485 nm och en emissionsvåglängd på 535 nm används för att detektera JC-1-monomeren, som behandlas som depolariserade mitokondrier 39,40,41, och den röda fluorescerande kanalen med en excitationsvåglängd på 550 nm och en emissionsvåglängd på 600 nm används för att detektera JC-1-dimeren. som behandlas som polariserade mitokondrier 39,40,41.
  5. Slutligen bearbeta bilderna med bildförvärvsprogramvara och använd sedan Image J-programvaran för att beräkna den genomsnittliga fluorescensintensiteten för varje grupp eller förhållandena för de olika grupperna.
    OBS: De tekniska detaljerna för fluorescensmikroskopet och Image J-programvaran som används för bildarbetet har beskrivits tidigare37,38.

4. Mätning av proteinuttrycksnivåerna för LC3-II/LC3-I och p62/SQSTM1

  1. Efter behandling (steg 1.8), tvätta cellerna tre gånger med 1x PBS (1 ml/brunn) som har förkylts vid 4 °C.
  2. Tillsätt RIPA-lysbuffert (100 μl/brunn) kompletterad med proteas och en fosfatasinhibitorcocktail (1x) (se materialtabell) till plattan med 12 brunnar och lysera på is i 5 minuter.
  3. Samla upp celllysatet i 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera vid 12 000 x g i 20 minuter vid 4 °C. Bestäm supernatanternas proteinkoncentration med BCA-metoden enligt standardprocedurerna42.
  4. Lägg till SDS-PAGE provladdningsbuffert (5x, se materialförteckning) till celllysatsupernatanterna (volymförhållande = 1: 4).
  5. Blanda genom virvling (med hög hastighet i ~ 15 sekunder) och värm de blandade proverna vid 100 ° C i 5 minuter för att denaturera proteinet.
  6. Sätt den 12-väl förberedda 12% SDS-PAGE-gelen i elektroforestanken och tillsätt sedan SDS-uppprovbufferten (1x) utspädd med ultrarent vatten till höjdgränsläget.
    OBS: SDS-PAGE-gelen framställs med hjälp av ett kommersiellt kit (se materialförteckning) enligt tillverkarens instruktioner.
  7. Tillsätt proteinmarkören (5 μl/brunn) och prover (20 μg/brunn) i olika brunnar i SDS-PAGE-gelen.
  8. Ställ in det stabila spänningsläget på 100 V och utför elektroforesen i 80 minuter.
  9. Efter SDS-PAGE-elektroforesen, utför elektroöverföringen av proteinerna till ett polyvinylidenfluoridmembran (PVDF) (0,45 μM, se materialförteckning) efter tidigare publicerade rapporter43,44.
  10. Efter elektroöverföringen av proteinerna, tvätta PVDF-membranet med 10 ml TBST (1x TBS, 0,1% Tween 20) två gånger (5 min / tid) i en shaker vid rumstemperatur.
  11. Blockera PVDF-membranet med 5 ml bovint serumalbumin (BSA, 5%) i en shaker vid rumstemperatur i 1 timme.
  12. Tvätta PVDF-membranet med 10 ml TBST tre gånger (10 min/gång). Inkubera sedan PVDF-membranet i 5 ml av de specifika primära antikropparna utspädda i blockerande buffert för LC3 (mus mAb, 1:2 000), p62/SQSTM1 (nedan kallad p62, mus mAb, 1:2 000) och β-aktin (mus mAb, 1:2 000) (se Materialförteckning) över natten vid 4 °C.
  13. Tvätta PVDF-membranet med 10 ml TBST tre gånger (10 min/gång) vid rumstemperatur. Inkubera sedan PVDF-membranet med kanin anti-mus IgG (HRP) sekundär antikropp utspädd i blockerande buffert (1:10 000) (se materialtabell) vid rumstemperatur och skyddad från ljus i 2 timmar.
  14. Tvätta PVDF-membranet med 10 ml TBST tre gånger (10 min/gång) vid rumstemperatur. Placera sedan PVDF-membranet på plastfolien, tillsätt en lämplig mängd ECL-arbetslösning (200 μl/membran) (se materialtabell) och inkubera i 2 minuter.
  15. Efter inkubation, avlägsna ECL-arbetslösningen och exponera PVDF-membranet i bildsystemet för bildutveckling. Slutligen, använd Image J-programvaran för att analysera gråvärdena för varje band.
    OBS: De tekniska detaljerna för western blotting och Image J-programvaran som används för bildarbetet har beskrivits tidigare45,46.

5. Statistisk analys

  1. Presentera data från experimenten som medelvärde ± standardavvikelse (SD).
  2. Utför analysen av signifikans med det statistiska programvaruverktyget som beskrivits tidigare47.
  3. Beräkna de statistiska skillnaderna mellan de två grupperna med hjälp av ett t-test. Ett P-värde under 0,05 anses vara statistiskt signifikant: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Intracellulär ROS i cellerna
AML-12-celler inducerades med 300 μM PA under 24 timmar och en NAFLD-cellmodell etablerades. Därefter behandlades cellerna med PD i 24 timmar. Cellerna märktes med en DCFH-DA fluorescerande sond, och ROS-produktion observerades under ett fluorescensmikroskop. Resultaten av DCFH-DA-färgning av intracellulär ROS i cellerna visas i figur 1. Resultaten visade att PD signifikant kunde minska nivån av intracellulär ROS i cellerna inkuberade med 300 μM PA (P < 0,01), vilket indikerar att PD kan minska cellulär oxidativ stress.

Cellernas mitokondriella membranpotential
Mitokondrien är den centrala organellen som styrs av den inneboende apoptosvägen48,49,50. Därför observerades mitokondriell membranpotential (MMP) hos AML-12-celler som hade inkuberats med PD i 24 timmar under ett fluorescensmikroskop efter JC-1-färgning. Som visas i figur 2 var den gröna fluorescensen (JC-1-monomerer, behandlade som depolariserade mitokondrier 39,40,41) i de PA-behandlade cellerna högre än i de obehandlade cellerna. Å andra sidan var den röda fluorescensen (JC-1-dimerer, behandlade som polariserade mitokondrier 39,40,41) i de PA-behandlade cellerna lägre än i de obehandlade cellerna, vilket indikerar PA-inducerad MMP-depolarisering i cellerna. Dessutom, jämfört med modellgruppen, minskade förhållandet mellan JC-1-monomerer:dimerer i PD-behandlingsgruppen (P < 0,01), vilket indikerar att PD kan förbättra PA-inducerad MMP-depolarisering.

Proteinuttrycksnivåerna för LC3-II/LC3-I och p62
Denna studie undersökte också den potentiella rollen av PD på autofagivägen genom att undersöka proteinuttrycksnivåerna av autofagirelaterade proteiner LC3 och p62 i cellerna genom western blotting. Som visas i figur 3 minskade förhållandet mellan LC3-II: LC3-I signifikant (P < 0,005) och proteinuttrycksnivån för p62 ökade efter behandling med PA i 48 timmar (P < 0,01). Å andra sidan kan PD signifikant minska proteinuttrycksnivån för p62 (P < 0,01) och öka förhållandet mellan LC3-II: LC3-I (P < 0,05), vilket indikerar att PD kan återställa det autofagiska flödet som hämmas av PA.

Figure 1
Figur 1: Effekter av PD på intracellulär ROS i cellerna bedömda genom DCFH-DA-färgning . (A) ROS-generering detekterades genom fluorescensmikroskopi, 200x. Skalstapel: 20 μm. (B) Relativa vikförändringar i ROS-nivåerna i olika grupper. Varje kolumn representerar medelvärdet ± SD (n = 3). **P < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Effekter av PD på MMP-depolarisering i cellerna enligt bedömning genom JC-1-färgning. (A) MMP-depolarisering detekterades genom fluorescensmikroskopi, 200x. Skalstapel: 20 μm. (B) Relativa förändringar i förhållandet JC-1-monomerer:dimerer i de olika grupperna. Varje kolumn representerar medelvärdet ± SD (n = 3). **P < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Effekter av PD på proteinuttrycksnivåerna av LC3-II/LC3-I och p62 i cellerna enligt bedömning med western blotting. (A) Proteinnivåerna av LC3, p62 och β-aktin detekterades genom western blotting. (B) Relativa förändringar i LC3-II:LC3-I-förhållandet i de olika grupperna. (C) Relativa veckförändringar i uttrycket av p62 i de olika grupperna. Varje kolumn representerar medelvärdet ± SD (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Studier har belyst det faktum att NAFLD är ett kliniskt patologiskt syndrom, allt från fettlever till NASH, som kan utvecklas till cirros och levercancer51. En fettrik kost och en inaktiv livsstil är typiska riskfaktorer för NAFLD. Både icke-läkemedelsbehandlingar och läkemedelsbehandlingar för NAFLD-behandling har undersökts51,52,53. Patogenesen av NAFLD har emellertid inte helt klarlagts. Metoden som beskrivs här innefattar en in vitro-modell av NAFLD etablerad av PA-stimulerade AML-12-celler. Vi undersökte de skyddande effekterna av PD mot NAFLD i denna modell, och vi fann att PD dämpade den PA-inducerade ökningen av ROS. Dessutom förbättrade PD också PA-inducerad MMP-depolarisering. Vidare kan PD signifikant minska proteinuttrycksnivån för p62 och öka förhållandet mellan LC3-II: LC3-I. Dessa experimentella resultat kan ge en grund för tillämpning av PD som en aktiv farmaceutisk ingrediens för NAFLD-behandling.

Som en viktig intracellulär nedbrytningsväg realiserar autofagi den fysiologiska processen att återvinna och återanvända näringsråvaror genom att bryta ner överflödiga komponenter i cellerna19,54. Autofagi är också en viktig reparationsmekanism för kroppen för att upprätthålla "yin-yang-balans", och det är den mikroskopiska utföringsformen av "qi-transformation" i TCM55,56,57. I det nuvarande protokollet, förutom att detektera förändringarna i ROS-produktion och MMP-depolarisering, undersöktes PD: s potentiella roll på autofagivägen genom att detektera proteinuttrycksnivåerna av autofagirelaterade proteiner LC-3 och p62 genom western blotting. Efter behandling av PA-inducerade celler med PD minskade förhållandet mellan LC3-II: LC3-I och ackumuleringen av p62 ökade, vilket indikerar att nivån av autofagi minskade. De experimentella resultaten överensstämmer med andra litteraturrapporter 20,34,58,59. Denna in vitro-cellmodell kan bidra till att förbättra förståelsen av den biologiska funktionen av PD och hjälpa till att studera användningen av andra aktiva TCM-substanser för behandling av NAFLD.

Det finns några kritiska steg i experimentprocessen. För att avgöra om in vitro NAFLD-modellen framgångsrikt etableras kan lipiddroppavlagringarna jämföras i de normala kontroll- och PA-behandlade gruppcellerna genom Oil Red O-färgning, som beskrivits tidigare60,61. Efter DCFH-DA-färgning eller JC-1-färgning måste de återstående sonderna som inte kommer in i cellerna tvättas bort; Annars kommer detta att orsaka en hög bakgrund när du tar fluorescensbilderna. Dessutom måste tiden (förutom inkubationstiden) mellan belastning och mätning av lysrörssonderna (DCFH-DA eller JC-1) förkortas för att minska risken för experimentella fel. Dessutom kan arbetskoncentrationerna hos de fluorescerande sonderna (DCFH-DA eller JC-1) justeras efter behov om fluorescensvärdet för cellerna i den negativa kontrollgruppen är relativt högt. Alternativt kan inkubationstiden för JC-1-arbetslösningen och cellerna justeras på lämpligt sätt inom en tidsram på 15-60 min enligt de faktiska experimentella betingelserna.

Det finns också vissa begränsningar i denna in vitro-cellmodell. Celler såsom leverparenkymala celler, leverstellatceller, Kupffer-celler och vaskulära endotelceller finns i levervävnader62. Därför kan experiment endast på hepatiska parenkymala celler inte vara tillräckliga för att förklara effekterna av läkemedel. Andra cellmodeller måste också användas vid upptäckt av anti-NAFLD-läkemedel. Dessutom har tredimensionella (3D) cellodlingssystem använts för att konstruera levermodeller och testa levertoxicitet63,64. Framtida studier kommer att fokusera på att utveckla in vitro-modeller med hjälp av samkultur och 3D-cellodlingstekniker för potentiell anti-NAFLD-läkemedelsscreening.

Som en multisystemsjukdom spelar många faktorer en roll i utvecklingen och progressionen av NAFLD, vilket innebär att en enda djurmodell eller cellmodell inte helt kan efterlikna alla patologiska processer av denna sjukdom65. Övertro på användningen av djurmodeller ökar bördan av terapeutisk läkemedelsutveckling. Att använda in vitro-cellmodeller i de tidiga stadierna av anti-NAFLD-läkemedelsutveckling är mer praktiskt och kostnadseffektivt. I denna studie användes en normal mushepatocytcellinje AML-12 för att konstruera in vitro-modellen av NAFLD, och den terapeutiska effekten av PD validerades i denna modell. I synnerhet ger resultaten av denna studie en grund för ytterligare forskning om anti-NAFLD-effekterna av PD hos möss hepatocyt och primära hepatocytmodeller.

Sammanfattningsvis presenteras här en in vitro-modell för att studera de skyddande effekterna av PD mot NAFLD. Detta kan också vara en användbar in vitro-modell för att undersöka effekten av andra aktiva substanser i TCM för behandling av NAFLD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av bidrag från Chongqing Science and Technology Commission (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 och jbky20210029) och China Postdoctoral Science Foundation (nr 2021MD703919).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% BSA Blocking Buffer Solarbio, Beijing, China SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China AML12
Beyo ECL Plus Beyotime, Shanghai, China P0018S
Bio-safety cabinet Esco Micro Pte Ltd, Singapore AC2-5S1 A2 
cellSens Olympus, Tokyo, Japan 1.8
Culture CO2 Incubator Esco Micro Pte Ltd, Singapore CCL-170B-8
Dexamethasone Beyotime, Shanghai, China ST125
Dimethyl sulfoxide Solarbio, Beijing, China D8371
DMEM/F12 Hyclone, Logan, UT, USA SH30023.01
Foetal Bovine Serum Hyclone, Tauranga, New Zealand SH30406.05
Graphpad software GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA 8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) ABclonal, Wuhan, China AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane Merck, Darmstadt, Germany IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× Beyotime, Shanghai, China C0341
MAP LC3β Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 Solarbio, Beijing, China M8650
Olympus Inverted Microscope IX53 Olympus, Tokyo, Japan IX53
Palmitic Acid Sigma, Germany P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) Hyclone, Logan, UT, USA SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride Beyotime, Shanghai, China ST506
Phosphate Buffered Solution Hyclone, Logan, UT, USA BL302A
Platycodin D Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x Beyotime, Shanghai, China P1005
Protein Marker Solarbio, Beijing, China PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit Solarbio, Beijing, China CA1410
RIPA Lysis Buffer Beyotime, Shanghai, China P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit Beyotime, Shanghai, China P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x Beyotime, Shanghai, China P0015
Sigma Centrifuge Sigma, Germany 3K15
SQSTM1/p62 Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
WB Transfer Buffer,10x Solarbio, Beijing, China D1060
β-Actin Mouse mAb ABclonal, Wuhan, China AC004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xunyan, X. Y., Fang, X. M. The effect of Platycodon grandiflorum and its historical change in the clinical application of Platycodonis radix. Zhonghua Yi Shi Za Shi. 51 (3), 167-176 (2021).
  2. Ma, X., et al. Platycodon grandiflorum extract: Chemical composition and whitening, antioxidant, and anti-inflammatory effects. RSC Advances. 11 (18), 10814-10826 (2021).
  3. Ke, W., et al. Dietary Platycodon grandiflorus attenuates hepatic insulin resistance and oxidative stress in high-fat-diet induced non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 12 (2), 480 (2020).
  4. Kim, Y. J., et al. Platycodon grandiflorus root extract attenuates body fat mass, hepatic steatosis and insulin resistance through the interplay between the liver and adipose tissue. Nutrients. 8 (9), 532 (2016).
  5. Park, H. M., et al. Mass spectrometry-based metabolomic and lipidomic analyses of the effects of dietary Platycodon grandiflorum on liver and serum of obese mice under a high-fat diet. Nutrients. 9 (1), 71 (2017).
  6. Qi, C., et al. Platycodon grandiflorus polysaccharide with anti-apoptosis, anti-oxidant and anti-inflammatory activity against LPS/D-GalN induced acute liver injury in mice. Journal of Polymers and the Environment. 29 (12), 4088-4097 (2021).
  7. Choi, J. H., et al. Saponins from the roots of Platycodon grandiflorum ameliorate high fat diet-induced non-alcoholic steatohepatitis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 86, 205-212 (2017).
  8. Choi, Y. J., et al. Platycodin D enhances LDLR expression and LDL uptake via down-regulation of IDOL mRNA in hepatic cells. Scientific Reports. 10, 19834 (2020).
  9. Li, T., et al. Platycodin D triggers autophagy through activation of extracellular signal-regulated kinase in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. European Journal of Pharmacology. 749, 81-88 (2015).
  10. Lu, J. -J., et al. Proteomic analysis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells treated with platycodin D. Chinese Journal of Natural Medicines. 13 (9), 673-679 (2015).
  11. Neuschwander-Tetri, B. A. Therapeutic landscape for NAFLD in 2020. Gastroenterology. 158 (7), 1984-1998 (2020).
  12. Friedman, S. L., Neuschwander-Tetri, B. A., Rinella, M., Sanyal, A. J. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nature Medicine. 24 (7), 908-922 (2018).
  13. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (1), 99-128 (2019).
  14. Buzzetti, E., Pinzani, M., Tsochatzis, E. A. The multiple-hit pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Metabolism. 65 (8), 1038-1048 (2016).
  15. Watt, M. J., Miotto, P. M., De Nardo, W., Montgomery, M. K. The liver as an endocrine organ-Linking NAFLD and insulin resistance. Endocrine Reviews. 40 (5), 1367-1393 (2019).
  16. Khan, R. S., Bril, F., Cusi, K., Newsome, P. N. Modulation of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 70 (2), 711-724 (2019).
  17. Karkucinska-Wieckowska, A., et al. Mitochondria, oxidative stress and nonalcoholic fatty liver disease: A complex relationship. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), 13622 (2022).
  18. Tilg, H., Adolph, T. E., Dudek, M., Knolle, P. Non-alcoholic fatty liver disease: The interplay between metabolism, microbes and immunity. Nature Metabolism. 3 (12), 1596-1607 (2021).
  19. Qian, H., et al. Autophagy in liver diseases: A review. Molecular Aspects of Medicine. 82, 100973 (2021).
  20. Du, J., Ji, Y., Qiao, L., Liu, Y., Lin, J. Cellular endo-lysosomal dysfunction in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Liver International. 40 (2), 271-280 (2020).
  21. Allaire, M., Rautou, P. E., Codogno, P., Lotersztajn, S. Autophagy in liver diseases: Time for translation. Journal of Hepatology. 70 (5), 985-998 (2019).
  22. Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11963-11980 (2013).
  23. Lau, J. K., Zhang, X., Yu, J. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease: Current perspectives and recent advances. The Journal of Pathology. 241 (1), 36-44 (2017).
  24. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: Lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  25. Carpino, G., et al. Increased liver localization of lipopolysaccharides in human and experimental NAFLD. Hepatology. 72 (2), 470-485 (2020).
  26. Vergani, L. Fatty acids and effects on in vitro and in vivo models of liver steatosis. Current Medicinal Chemistry. 26 (19), 3439-3456 (2019).
  27. Scorletti, E., Carr, R. M. A new perspective on NAFLD: Focusing on lipid droplets. Journal of Hepatology. 76 (4), 934-945 (2022).
  28. Green, C. J., Pramfalk, C., Morten, K. J., Hodson, L. From whole body to cellular models of hepatic triglyceride metabolism: Man has got to know his limitations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (1), 1-20 (2015).
  29. Gambino, R., et al. Different serum free fatty acid profiles in NAFLD subjects and healthy controls after oral fat load. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 479 (2016).
  30. Marra, F., Svegliati-Baroni, G. Lipotoxicity and the gut-liver axis in NASH pathogenesis. Journal of Hepatology. 68 (2), 280-295 (2018).
  31. Zhang, J., Zhang, H., Deng, X., Zhang, Y., Xu, K. Baicalin protects AML-12 cells from lipotoxicity via the suppression of ER stress and TXNIP/NLRP3 inflammasome activation. Chemico-Biological Interactions. 278, 189-196 (2017).
  32. Liang, Y., et al. γ-Linolenic acid prevents lipid metabolism disorder in palmitic acid-treated alpha mouse liver-12 cells by balancing autophagy and apoptosis via the LKB1-AMPK-mTOR pathway. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (29), 8257-8267 (2021).
  33. Peng, Z., et al. Nobiletin alleviates palmitic acid-induced NLRP3 inflammasome activation in a sirtuin 1dependent manner in AML12 cells. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5815-5822 (2018).
  34. Xu, T., et al. Ferulic acid alleviates lipotoxicity-induced hepatocellular death through the SIRT1-regulated autophagy pathway and independently of AMPK and Akt in AML-12 hepatocytes. Nutrition & Metabolism. 18 (1), 13 (2021).
  35. Aranda, A., et al. Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay: A quantitative method for oxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells. Toxicology in Vitro. 27 (2), 954-963 (2013).
  36. Eruslanov, E., Kusmartsev, S. Identification of ROS using oxidized DCFDA and flow-cytometry. Methods in Molecular Biology. 594, 57-72 (2010).
  37. Bankhead, P. Analyzing Fluorescence Microscopy Images with ImageJ. , Queen's University Belfast. Belfast, Ireland. (2014).
  38. Wiesmann, V., et al. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
  39. Lugli, E., Troiano, L., Cossarizza, A. Polychromatic analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 7, Unit 7.32 (2007).
  40. Sivandzade, F., Bhalerao, A., Cucullo, L. Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a sensitive fluorescent probe. Bio-protocol. 9 (1), 3128 (2019).
  41. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  42. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).
  43. Goldman, A., Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current Protocols in Protein Science. 82, 1-16 (2015).
  44. Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Proteins from polyacrylamide gels onto PVDF membranes. Current Research in Protein Chemistry. , 87 (2012).
  45. Davarinejad, H. Quantifications of western blots with ImageJ. University of York. , Available from: http://www.yourku.ca/yisheng/internal/Protocols/Imagej.pdf (2015).
  46. Taylor, S. C., Posch, A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Research International. 2014, 361590 (2014).
  47. Motulsky, H. J. Graphpad Statistics Guide. Options for multiple t tests. Graphpad. , (2020).
  48. Poltorak, A. Cell death: All roads lead to mitochondria. Current Biology. 32 (16), 891-894 (2022).
  49. Dadsena, S., Jenner, A., García-Sáez, A. J. Mitochondrial outer membrane permeabilization at the single molecule level. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3777-3790 (2021).
  50. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305 (5684), 626-629 (2004).
  51. Lange, N. F., Radu, P., Dufour, J. F. Prevention of NAFLD-associated HCC: Role of lifestyle and chemoprevention. Journal of Hepatology. 75 (5), 1217-1227 (2021).
  52. Liu, X., Zhang, Y., Ma, C., Lin, J., Du, J. Alternate-day fasting alleviates high fat diet induced non-alcoholic fatty liver disease through controlling PPARalpha/Fgf21 signaling. Molecular Biology Reports. 49 (4), 3113-3122 (2022).
  53. Romero-Gomez, M., Zelber-Sagi, S., Trenell, M. Treatment of NAFLD with diet, physical activity and exercise. Journal of Hepatology. 67 (4), 829-846 (2017).
  54. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  55. Cui, B., Yu, J. M. Autophagy: A new pathway for traditional Chinese medicine. Journal of Asian Natural Products Research. 20 (1), 14-26 (2018).
  56. Law, B. Y., et al. New potential pharmacological functions of Chinese herbal medicines via regulation of autophagy. Molecules. 21 (3), 359 (2016).
  57. Zhou, H., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine monomer for treatment of non-alcoholic fatty liver disease. European Journal of Pharmacology. 898, 173976 (2021).
  58. Zhang, L., Yao, Z., Ji, G. Herbal extracts and natural products in alleviating non-alcoholic fatty liver disease via activating autophagy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1459 (2018).
  59. Zhang, X., et al. C-X-C motif chemokine 10 impairs autophagy and autolysosome formation in non-alcoholic steatohepatitis. Theranostics. 7 (11), 2822-2836 (2017).
  60. Li, C. X., et al. Allyl isothiocyanate ameliorates lipid accumulation and inflammation in nonalcoholic fatty liver disease via the Sirt1/AMPK and NF-kappaB signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 25 (34), 5120-5133 (2019).
  61. Li, S., et al. Sirtuin 3 acts as a negative regulator of autophagy dictating hepatocyte susceptibility to lipotoxicity. Hepatology. 66 (3), 936-952 (2017).
  62. Farrell, G. C., Teoh, N. C., McCuskey, R. S. Hepatic microcirculation in fatty liver disease. The Anatomical Record. 291 (6), 684-692 (2008).
  63. Milner, E., et al. Emerging three-dimensional hepatic models in relation to traditional two-dimensional in vitro assays for evaluating drug metabolism and hepatoxicity. Medicine in Drug Discovery. 8, 100060 (2020).
  64. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: State of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  65. Bilson, J., Sethi, J. K., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A multi-system disease influenced by ageing and sex, and affected by adipose tissue and intestinal function. Proceedings of the Nutrition Society. 81 (2), 146-161 (2022).

Tags

Denna månad i JoVE Platycodin D palmitinsyra reaktiva syreradikaler mitokondriell membranpotential autofagi
Undersöker de skyddande effekterna av Platycodin D på alkoholfri fettleversjukdom i en palmitinsyrainducerad <em>in vitro-modell</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., … More

Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., Chen, Y., Xing, Y., Li, N., Wang, G. Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model. J. Vis. Exp. (190), e64816, doi:10.3791/64816 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter