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Immunology and Infection

Generación de esporozoítos de Plasmodium berghei modificados genéticamente

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64992
Automatic Translation
1, 1,2
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

Summary

La malaria se transmite a través de la inoculación de la etapa de esporozoíto de Plasmodium por mosquitos infectados. El Plasmodium transgénico nos ha permitido comprender mejor la biología de la malaria y ha contribuido directamente a los esfuerzos de desarrollo de vacunas contra la malaria. En este trabajo se describe una metodología simplificada para generar esporozoítos transgénicos de Plasmodium berghei .

Abstract

La malaria es una enfermedad mortal causada por el parásito Plasmodium y se transmite a través de la picadura de mosquitos Anopheles hembra. La etapa de esporozoíto de Plasmodium depositada por los mosquitos en la piel de los huéspedes vertebrados pasa por una fase de desarrollo obligatorio en el hígado antes de iniciar la malaria clínica. Sabemos poco sobre la biología del desarrollo de Plasmodium en el hígado; El acceso a la etapa de esporozoíto y la capacidad de modificar genéticamente dichos esporozoítos son herramientas críticas para estudiar la naturaleza de la infección por Plasmodium y la respuesta inmunitaria resultante en el hígado. Aquí, presentamos un protocolo integral para la generación de esporozoítos transgénicos de Plasmodium berghei . Modificamos genéticamente el estadio sanguíneo de P. berghei y usamos esta forma para infectar a los mosquitos Anopheles cuando se alimentan de sangre. Después de que los parásitos transgénicos experimentan el desarrollo en los mosquitos, aislamos la etapa de esporozoíto del parásito de las glándulas salivales del mosquito para la experimentación in vivo e in vitro . Demostramos la validez del protocolo mediante la generación de esporozoítos de una nueva cepa de P. berghei que expresa la subunidad 11 de la proteína verde fluorescente (GFP) (GFP11), y mostramos cómo podría usarse para investigar la biología de la malaria en etapa hepática.

Introduction

A pesar de los avances en el desarrollo de medicamentos y la investigación sobre la prevención y el tratamiento del paludismo, la carga mundial de morbilidad del paludismo sigue siendo alta. Más de medio millón de personas mueren de malaria cada año, y los niveles más altos de mortalidad se observan entre los niños que viven en regiones donde la malaria es endémica, como el África subsahariana1. La malaria es causada por el parásito Plasmodium, que se transmite a los humanos a través de la picadura de mosquitos Anopheles hembra que portan el parásito en sus glándulas salivales. La etapa infecciosa de Plasmodium, los esporozoítos, se depositan en la piel de los huéspedes vertebrados durante una ingesta de sangre y viajan a través del torrente sanguíneo para infectar las células hepáticas, donde experimentan un desarrollo obligatorio (constituyendo malaria preeritrocítica) antes de infectar a los eritrocitos. La infección de los eritrocitos inicia el estadio sanguíneo de la malaria y es responsable de la totalidad de la morbilidad y mortalidad asociada a la enfermedad 2,3.

La naturaleza obligada del desarrollo preeritrocitario de Plasmodium lo ha convertido en un objetivo atractivo para los esfuerzos de desarrollo de vacunas y fármacos profilácticos4. Un requisito previo para estudiar la biología de la malaria preeritrocítica, así como para el desarrollo de vacunas o fármacos dirigidos a la etapa hepática, es el acceso a los esporozoítos de Plasmodium. Además, nuestra capacidad para generar esporozoítos de Plasmodium modificados genéticamente ha sido fundamental para el éxito de tales esfuerzos de investigación 5,6,7,8,9. Las líneas transgénicas de Plasmodium que expresan proteínas reporteras fluorescentes o luminiscentes nos han permitido rastrear su desarrollo in vivo e in vitro10,11. Los parásitos genéticamente atenuados (GAPs, por sus siglas en inglés), generados a través de la deleción de múltiples genes en Plasmodium, son también algunos de los candidatos vacunales más prometedores12,13.

Los modelos de malaria en roedores y primates no humanos nos han ayudado a comprender los mecanismos de las interacciones huésped-parásito en la malaria humana debido a las similitudes en la biología y el ciclo de vida entre las especies de Plasmodium 14. El uso de especies de Plasmodium que infectan a los roedores, pero no a los humanos (por ejemplo, P. berghei) permite mantener el ciclo de vida completo del parásito y la generación de esporozoítos infecciosos para estudiar la malaria en etapa hepática en un entorno controlado de nivel 1 de bioseguridad. Ya existe una variedad de protocolos separados para la generación de parásitos transgénicos de Plasmodium en estadio sanguíneo 15, la infección de mosquitos16 y el aislamiento de esporozoítos17. Aquí, describimos un protocolo integral que combina estas metodologías para generar y aislar esporozoítos transgénicos de P. berghei, utilizando la nueva cepa transgénica PbGFP11 como ejemplo. PbGFP 11 transporta la 11ª cadena de β de la proteína fluorescente verde (GFP) de supercarpeta, GFP11, a la vacuola parasitófora (PV) generada en los hepatocitos del huésped. La PbGFP11 se utiliza junto con hepatocitos transgénicos (Hepa1-6 de fondo) que expresan residuos que constituyen el fragmento de GFP 1-10 (GFP 1-10) en el citoplasma (células Hepa GFP 1-10). La PbGFP11 reporta la lisis de PV en los hepatocitos del huésped a través de la autocomplementación y la reformación de la GFP funcional y la señal de fluorescencia verde18. Cabe destacar que GFP 11 se codifica como una serie de siete secuencias en tándem en PbGFP11 para mejorar la señal de fluorescencia resultante. Al teñir los esporozoítos de PbGFP11 con el colorante citoplasmático CellTrace Violet (CTV), podemos rastrear los parásitos. La lisis de estos parásitos intracelulares teñidos con CTV da lugar a la fuga de CTV en el citoplasma de la célula huésped y a la tinción de la célula huésped. Además de visualizar y distinguir la lisis de Plasmodium PV y/o del parásito en los hepatocitos del huésped, este sistema puede utilizarse de forma fiable para estudiar las vías inmunes responsables de cualquiera de estos procesos, a través de la perturbación genética o terapéutica de los componentes moleculares de dichas vías.

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Protocol

Todas las investigaciones con animales vertebrados en nuestro laboratorio se realizaron de acuerdo con las pautas y protocolos de uso de animales de la Universidad de Georgia.

1. Generación de ratones infectados por P. berghei

  1. Iniciar la infección en la etapa sanguínea en ratones C57BL/6 (B6) machos o hembras de 6 a 8 semanas de edad utilizando parásitos de P. berghei de tipo salvaje. Para ello, se transfiere sangre criopreservada infectada con P. berghei (2 x 105 glóbulos rojos infectados), reconstituida en 400 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), a uno o dos ratones donantes por vía intraperitoneal (i.p.).
  2. Transferir sangre fresca recolectada a través de sangrado retroorbitario de los ratones donantes a los 5 días después de la infección (d.p.i.) a dos ratones B6 naïve. Para ello, se recogen 200 μL de sangre, se reconstituyen con 300 μL de PBS y se inyectan 200 μL i.p. en los ratones receptores. Asegurar que la parasitemia en los donantes en este momento sea del 2%-5%19,20.
  3. Monitorizar la parasitemia como se ha descrito anteriormente19,20, a partir de 2 d.p.i. en los receptores. Cuando la parasitemia oscila entre el 3% y el 5% (alrededor de 5 d.p.i.), se sacrifica a los ratones receptores y luego se recolecta sangre mediante punción cardíaca o sangrado retroorbitario. Aplicar la eutanasia a los ratones mediante inhalación de dióxido de carbono seguida de dislocación cervical, o de acuerdo con las pautas institucionales.
    NOTA: Una vez que la parasitemia supera el 5%, la eficiencia de la transfección puede reducirse debido al aumento de la prevalencia de glóbulos rojos infectados múltiplemente.

2. Generación de esquizontes en cultivo

  1. Recolectar sangre de los ratones infectados en el paso 1.3 (aproximadamente 2 ml en total de dos ratones) en 5 ml de solución de Alsever (ver Tabla de materiales) en un ambiente estéril. Realice los pasos 2.1 a 3.12 en condiciones estériles.
    NOTA: Las condiciones estériles incluyen el uso de guantes, la limpieza de guantes y superficies con etanol al 70%, el empleo de consumibles y materiales estériles y el trabajo dentro de un gabinete de bioseguridad.
  2. Centrifugar la sangre durante 8 min a 450 x g a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 10 mL de medio RPMI completo (RPMI 1640 con 20% de suero fetal bovino [FBS] y 1% de penicilina-estreptomicina, v/v).
  3. Centrifugar durante 8 min a 450 x g a RT. Vuelva a suspender el gránulo en 25 ml de medio RPMI completo y transfiéralo a un matraz de cultivo T75 con tapón filtrante.
  4. Colocar en una incubadora a 36,5 °C y 5% de CO2, agitando suavemente para mantener las células en suspensión durante 16 h.
  5. En el punto de tiempo de 16 h, verifique el desarrollo de esquizontes. Para ello, recoja 500 μL de la muestra, centrifugue a 450 x g durante 8 min, vuelva a suspender el gránulo en 10 μL de medio RPMI completo y prepare un frotis de sangre fino. Teñir el frotis de sangre con la tinción de Giemsa19 (ver Tabla de Materiales) y determinar la frecuencia de esquizontes (Figura 1).
  6. Para una eficiencia óptima de la transfección, el 60%-70% de los parásitos deben estar en la etapa de esquizonte. Si se determina menos de este umbral, continúe cultivando como en el paso 2.4 y verifique cada hora para asegurarse de que se haya cruzado el umbral anterior antes de continuar.

3. Transfección de Plasmodium schizonts

  1. Prepare un tampón de centrifugación en gradiente reconstituyendo 13 mL de medio madre de gradiente de densidad (ver Tabla de Materiales) con 1,44 mL de NaCl 1,5 M y 5,6 mL de NaCl 0,15 M en un tubo de centrifugación de 50 mL.
  2. Transfiera 25 ml de hemocultivo a un tubo de centrifugación nuevo de 50 ml. Aplique con cuidado 20 ml de tampón de centrifugación de gradiente en el fondo del tubo de centrifugación con una pipeta de vidrio estrecha para crear una columna de gradiente. Tenga cuidado de no alterar las capas líquidas y las interfaces y asegúrese de una división clara entre el tampón y el medio.
  3. Centrifugar durante 20 min a 450 x g sin freno en RT. Con una pipeta Pasteur, retire con cuidado la capa15 de esquizonte situada en la interfaz del medio de cultivo y el tampón de centrifugación en gradiente, y colóquela en un nuevo tubo de centrifugación de 50 ml.
  4. Vuelva a suspender los esquizontes aislados en medios RPMI completos y aumente el volumen total a 40 ml. Centrifugar a 450 x g durante 8 min a RT y desechar el sobrenadante.
  5. Vuelva a suspender los esquizontes en 10 ml de medio RPMI completo. A continuación, transfiera 1 ml de esta solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada transfección y centrifugue a 16.000 x g durante 5 s para granular los glóbulos rojos infectados. Los glóbulos rojos infectados derivados de dos ratones de la manera anterior se pueden utilizar para hasta 10 transfecciones separadas.
  6. Combine 100 μL del tampón de electroporación (solución nucleofectora del kit de electroporación; ver Tabla de Materiales) a RT con 5 μg de ADN plasmídico diana circular o linealizado (en un volumen máximo de 10 μL), según corresponda para cada transfección en tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mL. Se debe incluir una muestra "sin plásmido" como control para la transfección y la selección de antibióticos.
  7. Retire el sobrenadante después de la centrifugación del paso 3.5 y vuelva a suspender cuidadosamente los glóbulos rojos infectados en la solución nucleofectora preparada + ADN plasmídico (del paso 3.6).
  8. Transferir la suspensión (solución nucleofectora + plásmido + esquizontes; 110 μL máximo) a cubetas de electroporación. Transfectar utilizando un programa nucleofector adecuado (U-033, ver Tabla de Materiales).
    NOTA: Asegúrese de que los pasos 3.8 a 3.10 se realicen en RT.
  9. Agregue 100 μL de medio RPMI completo a la cubeta y transfiera toda la solución (ahora 200 μL de volumen total) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y manténgalo en RT.
  10. Inyectar la solución de 200 μL de parásitos transfectados en ratones por vía intravenosa (i.v.), trabajando para minimizar el tiempo entre la transfección y la inyección final en ratones.
    NOTA: Los esquizontes transfectados se inyectan en ratones menos de 5 minutos después de la electroporación para maximizar la eficiencia del protocolo.

4. Selección de los parásitos transfectados

  1. Comprobar los niveles de parasitemia en los ratones inoculados con los esquizontes transfectados diariamente a partir de 2 d.p.i. para verificar la infección.
  2. Una vez verificada la infección, se debe iniciar la selección del fármaco mediante la administración oral del fármaco en agua de bebida, ofrecida ad libitum.
    NOTA: La pirimetamina se empleó como marcador de fármaco seleccionable para el plásmido. En este caso, se añadieron 17,5 mg de pirimetamina a 250 mL de agua limpia (concentración final de 70 mg/L). Además, se añadieron 10 g de azúcar a esta agua para fomentar el consumo adecuado del agua que contiene pirimetamina por parte de los ratones.
  3. Monitorizar la parasitemia cada dos días mediante frotis de sangre realizados con 5 μl de sangre, a partir de los 6 días posteriores al inicio del tratamiento con pirimetamina. La falta de parásitos detectables después de 15 días indica una transfección fallida; En este caso, reinicie el proceso desde el paso 1.1 para un nuevo intento.
  4. Cuando la parasitemia alcanza al menos el 1%, transfiere los parásitos a ratones B6 ingenuos para la creación de reservas de parásitos en estadio sanguíneo. Continuar la selección en los ratones recién infectados hasta que la parasitemia alcance el 2%-5%, momento en el que generar existencias y criopreservarlas21.

5. Infección de mosquitos con las líneas transgénicas

  1. Infectar ratones B6 con 200 μL de sangre que contenga los parásitos seleccionados (2 x 105 glóbulos rojos infectados/ratón, i.v.). Determinar la parasitemia en estos ratones el día de la alimentación y la infección del mosquito. La parasitemia entre el 2% y el 5% es óptima para la infección de mosquitos. Una vez verificada, transfiera inmediatamente la infección a los mosquitos hembra de Anopheles stephensi de acuerdo con los pasos 5.2-5.4).
    NOTA: Las incubadoras que contengan mosquitos infecciosos deben mantenerse a 20,5 °C, al 80% de humedad y en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h (luces encendidas entre las 07:00 a.m. y las 07:00 p.m.).
  2. El día antes de la infección por mosquitos, separe a los mosquitos hembra colocando una fuente de calor en la parte superior de la jaula que contenga mosquitos machos y hembras, como una vejiga de plástico delgada o un guante lleno de agua calentada a 37 ° C. Retire los mosquitos hembra, que se sienten atraídos por la fuente de calor, usando un aspirador de insectos y transfiéralos a una jaula separada y más pequeña para la infección.
    NOTA: Los mosquitos machos se pueden distinguir de los mosquitos hembra por su tamaño corporal ligeramente reducido y sus antenas plumosas.
  3. Inyecte a los ratones infectados un anestésico general (p. ej., tribromoetanol/avertina al 2%). Asegúrese de que la anestesia sea completa pellizcando firmemente la almohadilla para los pies de cada ratón. Si no reaccionan, están lo suficientemente sedados y listos para transferir la infección a los mosquitos.
  4. Coloque los ratones anestesiados encima de los mosquitos hembra enjaulados (del paso 5.2) en decúbito esternal. Separe manualmente las patas delanteras y traseras para proporcionar la mayor superficie para la alimentación de los mosquitos. Deje a los ratones infectados sobre cada jaula durante un total de 15 minutos, revisando cada 5 minutos para asegurarse de que los ratones no estén despiertos. Una vez que se complete la alimentación, eutanasiar a los ratones utilizando la dislocación cervical, o según el protocolo institucional de uso de animales, y deséchelos de manera segura.

6. Recolección de esporozoítos

  1. Revise el intestino medio de los mosquitos en busca de ooquistes a aproximadamente 10 d.p.i. para verificar la infección exitosa y el desarrollo de Plasmodium dentro de los mosquitos. Aísle el intestino medio del mosquito del abdomen extirpando el segmento abdominal terminal con fórceps. Visualizar el intestino medio bajo luz polarizada para detectar la presencia de ooquistes22.
  2. Se espera que los esporozoítos de tipo salvaje estén presentes en las glándulas salivales de los mosquitos entre 18 y 21 días después de alimentarse de ratones infectados. En el día 18, diseccione de 5 a 10 mosquitos para evaluar el número de esporozoítos.
    NOTA: Los mosquitos se lavan y se matan con etanol. Posteriormente, los mosquitos muertos se lavan dos veces con PBS para eliminar los desechos antes de la disección.
  3. Para aislar y contar los esporozoítos, retire con cuidado la cabeza del mosquito mientras aplica presión sobre el tórax del mosquito con fórceps o una aguja fina de disección. Las glándulas salivales permanecen adheridas a la cabeza extirpada (Figura 2).
  4. Retire cualquier resto adicional de mosquitos de las glándulas salivales y colóquelo en un tubo de microcentrífuga que contenga 400 μL de medios de disección de mosquitos (medio Ealge modificado de Dulbecco [DMEM] con suero de ratón al 1%, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina; consulte la Tabla de materiales).
  5. Interrumpa las glándulas salivales aisladas pasando a través de una jeringa agujereada de 30 G 15-20 veces. Coloque 10 μL de las glándulas salivales alteradas en un medio de disección de mosquitos en un hemocitómetro y cuente. Resuspender en la concentración deseada de medios de disección de mosquitos o PBS para inyección en ratones, inoculación en cultivos celulares o criopreservación a largo plazo23,24.

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Representative Results

Determinar la frecuencia y el desarrollo de los esquizontes es fundamental para asegurar que suficientes parásitos viables estén en la etapa óptima para la transfección. Los esquizontes inmaduros se pueden diferenciar de los esquizontes completamente maduros por la presencia de menos merozoítos que no llenan todo el espacio intracelular de los glóbulos rojos (Figura 1B). Es importante tener en cuenta que al hacer frotis de sangre a partir de sangre cultivada, los glóbulos rojos infectados pueden romperse, lo que resulta en la observación de merozoítos extracelulares libres en el frotis de sangre (Figura 1). Tales merozoítos no cuentan para la evaluación de la frecuencia de esquizontes en el paso 2.5.

La eliminación de las glándulas salivales de los mosquitos puede ser un desafío si el usuario no está familiarizado con la fisiología de los mosquitos o las disecciones a pequeña escala. Durante el aislamiento de las glándulas salivales de los mosquitos, tenga en cuenta que la translucidez de las glándulas se puede utilizar para diferenciarlas de los restos opacos de mosquitos (Figura 2). El recuento de esporozoítos después de la interrupción de las glándulas es más eficiente con un aumento de 400x, y el uso del contraste de fase permite una identificación más fácil de los esporozoítos dentro de la cámara de recuento.

Hemos demostrado que más del 90% de los Plasmodium en los hepatocitos son posiblemente eliminados a través de mecanismos inmunes intrínsecos a las células23. Por lo tanto, esperamos que los parásitos en un número considerable de hepatocitos se sometan a lisis. Como herramienta para determinar la lisis de Plasmodium o su PV en los hepatocitos del hospedador, generamos hepatocitos transgénicos que expresan la subunidad GFP 1-10 (Hepa-GFP 1-10) y transgénicos P. berghei que expresan y trafican la subunidad GFP 11 a su PV (Pb-GFP 11). El fragmento GFP 1-10, que contiene los residuos que constituyen el cromóforo GFP, no es fluorescente por sí mismo y emite fluorescencia solo al asociarse con GFP 11, potencialmente a través de la autocomplementación. Además de validar funcionalmente la transgénesis en Plasmodium, la generación de una señal de fluorescencia verde en las células huésped Hepa-GFP 1-10 infectadas con Pb-GFP 11 indicó la lisis de la PV (Figura 3). Las células Hepa-GFP 1-10 de tipo salvaje infectadas con P. berghei o las células Hepa1-6 de tipo salvaje infectadas con Pb-GFP 11 no generaron ninguna señal de fluorescencia verde (datos no mostrados). Consideramos que la lisis de la PV es un paso previo clave en la destrucción de Plasmodium en etapa hepática. Los esporozoítos de Pb-GFP11 también se tiñeron con CTV para visualizar los parásitos en los hepatocitos. Se espera que el CTV se filtre en la célula huésped solo después de la lisis del propio parásito (Figura 3). La señal de CTV dispersa observada en el hepatocito huésped probablemente indica la lisis del parásito dentro del hepatocito. Se espera una estrecha superposición entre las señales CTV y GFP con la lisis concomitante tanto de la PV como del parásito. Este sistema nos permite consultar las distintas contribuciones de las moléculas individuales del huésped en las vías inmunitarias innatas e intrínsecas celulares en la modulación de la lisis de Plasmodium o su PV.

Figure 1
Figura 1: Schizontes de Plasmodium berghei . Imágenes representativas de microscopía óptica que muestran esquizontes de P. berghei en hemocultivo de ratón parasitado (16 h) teñido con tinción de Giemsa. Las flechas indican esquizontes completamente maduros (A) o inmaduros (B). Barras de escala: 5 μm . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Glándulas salivales de mosquitos y esporozoítos. Imágenes de microscopía óptica que muestran glándulas salivales aisladas de mosquitos Anopheles hembra infectados con Pb-GFP11. (A) Imagen de la cabeza de un mosquito con las glándulas salivales (flecha) aún intactas durante la disección, antes de su extracción y posterior procesamiento (barra de escala: 1 mm). (B,C) Imágenes representativas de glándulas salivales con aumentos más bajos (B) y más altos (C) (barras de escala: 0,1 mm y 0,04 mm, respectivamente). Los esporozoítos se pueden ver tanto dentro como fuera de la glándula (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Detección de la lisis de Plasmodium y su vacuola parasitófora en hepatocitos del huésped. Contraste de interferencia diferencial (DIC) e imágenes de inmunofluorescencia pseudocoloreada con superposición que representan hepatocitos Hepa-GFP1-10 infectados con esporozoítos Pb-GFP11. Los esporozoítos se tiñeron con CTV antes de la infección (barra de escala: 10 μm). Un total de 1 x 106 hepa-GFP 1-10 hepatocitos se sembraron en una placa de cultivo con fondo de vidrio de 35/10 mm y se inocularon con 3 x 10 5PbGFP11 esporozoítos 4 h después de la siembra. Las imágenes se tomaron con un microscopio fluorescente invertido con un aumento de 600x y a las 16 h post-infección. Abreviaturas: DIC = contraste de interferencia diferencial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

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Discussion

Hemos utilizado el protocolo anterior en nuestro laboratorio para crear varias líneas de parásitos transgénicos de P. berghei. Aunque optimizado para P. berghei, también hemos utilizado con éxito este protocolo para generar esporozoítos transgénicos de P. yoelii. Después de inyectar los esquizontes transfectados en ratones, los parásitos son detectables típicamente a más tardar 3 d.p.i. en todos los grupos, incluido el control sin plásmido. La selección se inicia solo una vez que se ha detectado la parasitemia para garantizar la viabilidad de los parásitos después de la electroporación. Además, cuando se prepara para la selección de fármacos, puede ser necesaria la acidificación del agua con ácido clorhídrico, bajando el pH a 4, para que la pirimetamina se disuelva por completo. Esperamos la eliminación completa de los parásitos del grupo control sin plásmidos, mientras que los ratones inoculados con los transfectantes permanecen infectados. El aclaramiento en los ratones de control suele producirse entre 5 y 8 días después del inicio del tratamiento con pirimetamina. Cabe destacar que los ratones B6 infectados con P. berghei pueden mostrar signos de malaria cerebral experimental y sucumbir a la muerte (siguiendo los criterios de valoración humanitarios de acuerdo con las pautas institucionales de uso de animales), generalmente en el intervalo de 6-12 d.p.i. Esto puede evitarse realizando la selección de fármacos de los transfectantes en ratones TCRaKO25, o transfiriendo los parásitos sometidos a selección a 5 d.p.i. a nuevos receptores de B6 y continuando la selección en estos últimos. La transgénesis en Plasmodium se puede verificar utilizando una variedad de enfoques, como cribados genéticos, evaluación fenotípica o ganancia o pérdida de funciones específicas.

Es importante tener en cuenta que la selección de un plásmido adecuado es crucial para el éxito de la transfección y retención del ADN introducido en el parásito. Los plásmidos también pueden mostrar una eficacia limitada para lograr la transgénesis en diferentes especies de Plasmodium. Por ejemplo, el plásmido pSKspGFP11 (basado en PL0017; BEI) que utilizamos para generar PbGFP11 también se puede utilizar para generar P. yoelli transgénico, pero no P. chabaudi. Para generar pSKspGFP11, reemplazamos la secuencia del mutante3 de GFP en el plásmido padre pL0017 (recursos BEI) con siete secuencias en tándem de la 11ª cadena de β de GFP supercarpeta, GFP 11 (GFP11-7X)18. Aunque la linealización de los plásmidos antes de la transfección permite una mejor integración genómica, tanto los plásmidos lineales como los circulares muestran eficiencias de transfección similares utilizando nuestro protocolo. Las líneas de Plasmodium generadas por transfección con plásmidos circulares también parecen mantener sus propiedades transgénicas en el transcurso de la generación de esporozoítos en los mosquitos.

En particular, solo los mosquitos hembra pueden albergar y transmitir Plasmodium. Después del aislamiento de los mosquitos, se recomienda no proporcionar a los mosquitos aislados una fuente de agua azucarada en esta etapa. Privarlos de esta manera aumentaría la posibilidad de que los mosquitos machos que puedan haber sido transferidos inadvertidamente mueran, y que las hembras se alimenten de la sangre de manera más eficiente de los ratones infectados. Por lo general, devolvemos el agua azucarada 1 día después de transferir la infección de ratones a mosquitos. Cabe destacar que el período de tiempo para el desarrollo y la maduración del esporozoíto en los mosquitos puede variar entre las líneas transgénicas de Plasmodium . Por lo tanto, es importante evaluar el número de esporozoítos en las glándulas salivales en múltiples momentos después de la infección antes de establecer un protocolo específico para cada línea transgénica.

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Disclosures

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la subvención de los Institutos Nacionales de Salud AI168307 a SPK.  Agradecemos al núcleo de citometría de flujo CTEGD de la UGA y al núcleo de microscopía CTEGD de la UGA. También reconocemos las contribuciones de Ash Pathak, Anne Elliot y el personal de UGA Sporocore en la optimización del protocolo. Queremos agradecer al Dr. Daichi Kamiyama por sus valiosas ideas, discusiones y los plásmidos padres que contienen GFP11 y GFP 1-10. También nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Kurup por su constante apoyo, paciencia y aliento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 G x 1/2" Syringe needle Exel international 26437
Alsever's solution Sigma-Aldritch A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 Lonza VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) TCI America T1420
Blood collection tubes BD bioscience 365967 for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer INCYTO DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish Greiner Bio-One 627860
Centrifuge 5425 Eppendorf 5405000107
Centrifuge 5910R Eppendorf 5910R For gradient centrifugation
Delta Vision II - Inverted microscope system Olympus IX-71
Dimethyl Sulfoxide Sigma D5879-500ml
Fetal bovine serum GenClone 25-525
GFP11 plasmid Kurup Lab pSKspGFP11 Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain Sigma-Aldritch 48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells Kurup Lab Hepa GFP1-10 Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum Used for mosquito dissection media
NaCl Millipore-Sigma SX0420-5 1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II Amaxa Biosystems (Lonza) Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette VWR 14673-043
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldritch P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium) Cytivia 17-0891-02 Details in protocol
PL0017 Plasmid BEI Resources MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration) Sigma 46706 Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640 Corning 15-040-CV
SoftWoRx microscopy software Applied Precision v6.1.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  2. Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
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Esporozoítos de Plasmodium berghei modificados genéticamente Malaria parásito Plasmodium Mosquitos Anopheles Desarrollo en etapa hepática Malaria clínica Respuesta inmunitaria Parásitos transgénicos Etapa sanguínea P. Berghei Glándulas salivales de mosquitos Experimentación in vivo Experimentación in vitro Proteína verde fluorescente (GFP) Malaria en etapa hepática
Generación de esporozoítos de <em>Plasmodium berghei</em> modificados genéticamente
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Bowers, C., Kurup, S. P. Generating… More

Bowers, C., Kurup, S. P. Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites. J. Vis. Exp. (195), e64992, doi:10.3791/64992 (2023).

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