Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

توليد المتصورة المعدلة وراثيا بيرغي سبوروزويتات

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64992
Automatic Translation
1, 1,2
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

Summary

تنتقل الملاريا عن طريق تلقيح مرحلة sporozoite من البلازموديوم بواسطة البعوض المصاب. لقد سمحت لنا البلازموديوم المعدلة وراثيا بفهم بيولوجيا الملاريا بشكل أفضل وساهمت بشكل مباشر في جهود تطوير لقاح الملاريا. هنا ، نصف منهجية مبسطة لتوليد المتصورة المعدلة وراثيا Sporozoites المعدلة وراثيا.

Abstract

الملاريا مرض قاتل يسببه طفيلي البلازموديوم وينتقل عن طريق لدغة أنثى بعوض الأنوفيلة . تخضع مرحلة sporozoite من Plasmodium التي يرسبها البعوض في جلد مضيفات الفقاريات لمرحلة من التطور الإلزامي في الكبد قبل بدء الملاريا السريرية. نحن نعرف القليل عن بيولوجيا تطور البلازموديوم في الكبد. يعد الوصول إلى مرحلة sporozoite والقدرة على تعديل هذه الأسبوروزويتات وراثيا من الأدوات الحاسمة لدراسة طبيعة عدوى المتصورة والاستجابة المناعية الناتجة في الكبد. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لتوليد المتصورة المعدلة وراثيا Sporozoites المعدلة وراثيا. نقوم بتعديل مرحلة الدم وراثيا P. berghei ونستخدم هذا النموذج لإصابة بعوض الأنوفيليس عندما يتناولون وجبة دم. بعد أن تخضع الطفيليات المعدلة وراثيا للتطور في البعوض ، نقوم بعزل مرحلة sporozoite من الطفيلي من الغدد اللعابية للبعوض لإجراء تجارب في الجسم الحي وفي المختبر . لقد أثبتنا صحة البروتوكول من خلال توليد sporozoites من سلالة جديدة من P. berghei تعبر عن الوحدة الفرعية 11 من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) (GFP11) ، ونوضح كيف يمكن استخدامها للتحقيق في بيولوجيا الملاريا في مرحلة الكبد.

Introduction

وعلى الرغم من التقدم المحرز في تطوير الأدوية والبحوث في مجال الوقاية من الملاريا وعلاجها، لا يزال عبء الملاريا العالمي مرتفعا. يموت أكثر من نصف مليون شخص بسبب الملاريا كل عام، مع أعلى مستويات الوفيات بين الأطفال الذين يعيشون في المناطق الموبوءة بالملاريا، مثل أفريقيا جنوب الصحراءالكبرى 1. تحدث الملاريا بسبب طفيلي البلازموديوم ، الذي ينتقل إلى البشر من خلال لدغة أنثى بعوض الأنوفيليس التي تحمل الطفيلي في الغدد اللعابية. تترسب المرحلة المعدية من المتصورة - sporozoites - في جلد مضيفات الفقاريات أثناء تناول وجبة الدم وتنتقل عبر مجرى الدم لإصابة خلايا الكبد ، حيث تخضع لتطور إلزامي (تشكل الملاريا قبل كرات الدم الحمراء) قبل إصابة كريات الدم الحمراء. تبدأ عدوى كريات الدم الحمراء مرحلة الدم من الملاريا وهي مسؤولة عن مجمل المراضة والوفيات المرتبطة بالمرض 2,3.

جعلت الطبيعة الإلزامية لتطور البلازموديوم قبل كريات الدم الحمراء هدفا جذابا لجهود تطوير اللقاح والأدويةالوقائية 4. شرط أساسي لدراسة بيولوجيا الملاريا قبل كريات الدم الحمراء ، وكذلك تطوير اللقاحات أو الأدوية التي تستهدف مرحلة الكبد ، هو الوصول إلى Plasmodium sporozoites. علاوة على ذلك ، كانت قدرتنا على توليد Plasmodium sporozoites المعدلة وراثيا مفيدة في نجاح هذه المساعي البحثية5،6،7،8،9. سمحت لنا خطوط البلازموديوم المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتينات مراسل الفلورسنت أو الإنارة بتتبع تطورها في الجسم الحي وفي المختبر10,11. الطفيليات الموهنة وراثيا (GAPs) ، الناتجة عن حذف جينات متعددة في البلازموديوم ، هي أيضا بعض من أكثر اللقاحات الواعدةالمرشحة 12,13.

ساعدتنا نماذج ملاريا الرئيسيات القوارض وغير البشرية على فهم آليات التفاعلات بين الطفيليات المضيفة في الملاريا البشرية بسبب أوجه التشابه في علم الأحياء ودورة الحياة بين أنواع المتصورة 14. يسمح استخدام أنواع البلازموديوم التي تصيب القوارض ، ولكن ليس البشر (على سبيل المثال ، P. berghei) بالحفاظ على دورة حياة الطفيليات الكاملة وتوليد sporozoites المعدية لدراسة الملاريا في مرحلة الكبد في بيئة خاضعة للرقابة من مستوى السلامة البيولوجية 1. توجد بالفعل مجموعة متنوعة من البروتوكولات المنفصلة لتوليد طفيليات البلازموديوم في مرحلة الدم المعدلة وراثيا 15 ، وعدوى البعوض16 ، وعزل sporozoites17. هنا ، نحدد بروتوكولا شاملا يجمع بين هذه المنهجيات من أجل توليد وعزل P. berghei sporozoites المعدلة وراثيا ، باستخدام السلالة المعدلة وراثيا الجديدة PbGFP11 كمثال. يتاجر PbGFP 11 بالشريط الحادي عشر β من بروتين الفلورسنت الأخضر فائق المجلد (GFP) ، GFP11 ، في الفجوة الطفيلية (PV) المتولدة في خلايا الكبد المضيفة. يستخدم PbGFP 11 جنبا إلى جنب مع خلايا الكبد المعدلة وراثيا (خلفية Hepa1-6) التي تعبر عن المخلفات التي تشكل جزء GFP 1-10 (GFP 1-10) في السيتوبلازم (خلايا Hepa GFP 1-10). يبلغ PbGFP11 عن تحلل PV في خلايا الكبد المضيفة من خلال التكامل الذاتي وإصلاح GFP الوظيفي وإشارة التألق الخضراء18. وتجدر الإشارة إلى أن GFP 11 مشفر كسلسلة من سبعة تسلسلات ترادفية في PbGFP11 لتعزيز إشارة التألق الناتجة. عند تلطيخ PbGFP11 sporozoites مع صبغة السيتوبلازم CellTrace Violet (CTV) ، يمكننا تتبع الطفيليات. يؤدي تحلل هذه الطفيليات داخل الخلايا الملطخة ب CTV نفسها إلى تسرب CTV إلى سيتوبلازم الخلية المضيفة وتلطيخ الخلية المضيفة. بالإضافة إلى تصور وتمييز تحلل Plasmodium PV و / أو الطفيلي في خلايا الكبد المضيفة ، يمكن استخدام هذا النظام بشكل موثوق لدراسة المسارات المناعية المسؤولة عن أي من هذه العمليات ، من خلال الاضطراب الجيني أو العلاجي للمكونات الجزيئية لهذه المسارات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء جميع الأبحاث التي شملت الحيوانات الفقارية في مختبرنا وفقا لإرشادات وبروتوكولات استخدام الحيوانات بجامعة جورجيا.

1. جيل من الفئران المصابة ب P. berghei

  1. بدء عدوى مرحلة الدم في ذكور أو إناث ، الفئران C57BL / 6 (B6) البالغة من العمر 6-8 أسابيع باستخدام طفيليات P. berghei من النوع البري. للقيام بذلك ، قم بنقل الدم المصاب ب P. berghei المحفوظ بالتبريد (2 × 105 كرات الدم الحمراء المصابة) ، المعاد تشكيله في 400 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، إلى واحد أو اثنين من الفئران المانحة داخل الصفاق (i.p.).
  2. نقل الدم الطازج الذي تم جمعه من خلال النزيف الحجاجي الخلفي من الفئران المانحة في 5 أيام بعد الإصابة (d.p.i.) إلى فأرين ساذجين من B6. للقيام بذلك ، اجمع 200 ميكرولتر من الدم ، وأعد تكوينه باستخدام 300 ميكرولتر من PBS ، وحقن 200 ميكرولتر i.p. في الفئران المتلقية. تأكد من أن الطفيليات في المتبرعين في هذه المرحلة الزمنية هي 2٪ -5٪ 19،20.
  3. مراقبة الطفيليات كما هو موضح سابقا19،20 ، بدءا من 2 d.p.i. في المتلقين. عندما يتراوح الطفيلي من 3٪ -5٪ (حوالي 5 d.p.i.) ، القتل الرحيم للفئران المتلقية ثم جمع الدم من خلال ثقب القلب أو النزيف خلف الحجاج. القتل الرحيم للفئران باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون متبوعا بخلع عنق الرحم ، أو وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
    ملاحظة: بمجرد أن يتجاوز الطفيلي 5٪ ، قد تنخفض كفاءة النقل بسبب زيادة انتشار كرات الدم الحمراء المصابة بالضرب.

2. جيل الفصام في الثقافة

  1. اجمع الدم من الفئران المصابة في الخطوة 1.3 (حوالي 2 مل في المجموع من فأرين) إلى 5 مل من محلول Alsever (انظر جدول المواد) في بيئة معقمة. قم بتنفيذ الخطوات من 2.1 إلى 3.12 في ظل ظروف معقمة.
    ملاحظة: تشمل الظروف المعقمة ارتداء القفازات ، ومسح القفازات والأسطح بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واستخدام المواد الاستهلاكية والمواد المعقمة ، والعمل داخل خزانة السلامة البيولوجية.
  2. جهاز طرد مركزي الدم لمدة 8 دقائق عند 450 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT). تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من وسائط RPMI الكاملة (RPMI 1640 مع 20٪ مصل بقري جنيني [FBS] و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين ، v / v).
  3. جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 450 × جم في RT. أعد تعليق الحبيبات في 25 مل من وسائط RPMI الكاملة وانقلها إلى دورق ثقافة T75 بغطاء مرشح.
  4. ضعه في حاضنة عند 36.5 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، مع رجه برفق لإبقاء الخلايا معلقة لمدة 16 ساعة.
  5. عند النقطة الزمنية 16 ساعة ، تحقق من تطور schizont. للقيام بذلك ، اجمع 500 ميكرولتر من العينة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 450 × جم لمدة 8 دقائق ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 ميكرولتر من وسائط RPMI الكاملة ، وقم بإعداد مسحة دم رقيقة. تلطيخ لطاخة الدم مع صبغة Giemsa19 (انظر جدول المواد) وتحديد وتيرة الفصام (الشكل 1).
  6. لتحقيق الكفاءة المثلى للتنقل ، يجب أن يكون 60٪ -70٪ من الطفيليات في مرحلة الفصام. إذا تم تحديد أقل من هذا الحد ، فاستمر في الزراعة كما في الخطوة 2.4 وتحقق كل ساعة للتأكد من تجاوز العتبة المذكورة أعلاه قبل المتابعة.

3. نقل شيزونتس البلازموديوم

  1. قم بإعداد مخزن مؤقت للطرد المركزي متدرج عن طريق إعادة تكوين 13 مل من وسط مخزون تدرج الكثافة (انظر جدول المواد) مع 1.44 مل من 1.5 M NaCl و 5.6 مل من 0.15 M NaCl في أنبوب طرد مركزي 50 mL.
  2. نقل 25 مل من مزرعة الدم إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل. ضع بعناية 20 مل من المخزن المؤقت للطرد المركزي المتدرج في قاع أنبوب الطرد المركزي باستخدام ماصة زجاجية ضيقة لإنشاء عمود متدرج. احرص على عدم إزعاج طبقات السائل والواجهات وتأكد من وجود فصل واضح بين المخزن المؤقت والوسائط.
  3. جهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند 450 × جم بدون فرامل في RT. باستخدام ماصة باستور ، قم بإزالة طبقة schizont15 الموجودة في واجهة وسائط الثقافة ومخزن الطرد المركزي المتدرج بعناية ، وضعها في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل.
  4. أعد تعليق schizonts المعزولة في وسائط RPMI كاملة وارفع الحجم الإجمالي إلى 40 مل. أجهزة الطرد المركزي في 450 × ز لمدة 8 دقائق في RT والتخلص من المادة الطافية.
  5. أعد تعليق schizonts في 10 مل من وسائط RPMI الكاملة. بعد ذلك ، قم بنقل 1 مل من هذا المحلول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل لكل عملية نقل ، وأجهزة طرد مركزي عند 16000 × جم لمدة 5 ثوان لتكوير كرات الدم الحمراء المصابة. يمكن استخدام كرات الدم الحمراء المصابة المشتقة من فأرين بالطريقة المذكورة أعلاه لما يصل إلى 10 عمليات نقل منفصلة.
  6. اجمع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي (محلول nucleofector من مجموعة التثقيب الكهربائي ؛ انظر جدول المواد) في RT مع 5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد المستهدف الدائري أو الخطي (بحد أقصى 10 ميكرولتر) ، حسب الاقتضاء لكل نقل في أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة سعة 1.5 مل. يجب تضمين عينة "بدون بلازميد" كعنصر تحكم في الانتقال واختيار المضادات الحيوية.
  7. قم بإزالة المادة الطافية بعد الطرد المركزي من الخطوة 3.5 وأعد تعليق كرات الدم الحمراء المصابة بعناية في محلول nucleofector المحضر + الحمض النووي البلازميد (من الخطوة 3.6).
  8. انقل المعلق (محلول nucleofector + بلازميد + شيزونت ؛ 110 ميكرولتر كحد أقصى) إلى كوفيت التثقيب الكهربائي. Transfect باستخدام برنامج nucleofector مناسب (U-033 ، انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تأكد من تنفيذ الخطوات من 3.8 إلى 3.10 في RT.
  9. أضف 100 ميكرولتر من وسائط RPMI الكاملة إلى كوفيت وانقل المحلول بالكامل (الآن الحجم الإجمالي 200 ميكرولتر) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل واحتفظ به في RT.
  10. حقن محلول 200 ميكرولتر من الطفيليات المنقولة في الفئران عن طريق الوريد (IV) ، والعمل على تقليل الوقت بين النقل والحقن النهائي في الفئران.
    ملاحظة: يتم حقن الفصاميات المنقولة في الفئران بعد أقل من 5 دقائق من التثقيب الكهربائي لزيادة كفاءة البروتوكول إلى أقصى حد.

4. اختيار الطفيليات المنقولة

  1. تحقق من مستويات الطفيليات في الفئران الملقحة بالفصام المنقولة يوميا من 2 d.p.i. للتحقق من العدوى.
  2. بمجرد التحقق من العدوى ، ابدأ في اختيار الدواء باستخدام تناول الدواء عن طريق الفم في مياه الشرب ، المقدمة حسب الطلب.
    ملاحظة: تم استخدام بيريميثامين كعلامة دواء قابلة للاختيار للبلازميد. في هذه الحالة ، تمت إضافة 17.5 ملغ من البيريميثامين إلى 250 مل من الماء النظيف (التركيز النهائي 70 ملغ / لتر). بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة 10 غرام من السكر إلى هذا الماء لتشجيع الاستهلاك الكافي للمياه المحتوية على البيريميثامين من قبل الفئران.
  3. مراقبة الطفيليات كل يومين باستخدام مسحات الدم المصنوعة من 5 ميكرولتر من الدم ، بدءا من 6 أيام بعد بدء علاج البيريميثامين. يشير عدم وجود طفيليات يمكن اكتشافها بعد 15 يوما إلى فشل عملية النقل. في هذه الحالة، أعد بدء العملية من الخطوة 1.1 لمحاولة جديدة.
  4. عندما يصل الطفيلي إلى 1٪ على الأقل ، قم بنقل الطفيليات إلى فئران B6 الساذجة لإنشاء مخزون طفيلي في مرحلة الدم. استمر في الانتقاء في الفئران المصابة حديثا حتى يصل الطفيلي إلى 2٪ -5٪ ، وعند هذه النقطة يولد مخزونا ويحفظها بالتبريد21.

5. إصابة البعوض بالخطوط المعدلة وراثيا

  1. تصيب الفئران B6 ب 200 ميكرولتر من الدم تحتوي على الطفيليات المختارة (2 × 105 كرات الدم الحمراء / الفئران المصابة ، أي IV.). تحديد الطفيليات في هذه الفئران في يوم تغذية البعوض والعدوى. الطفيليات بين 2 ٪ -5 ٪ هو الأمثل لعدوى البعوض. بمجرد التحقق ، قم بنقل العدوى على الفور إلى أنثى البعوض Anopheles stephensi وفقا للخطوات 5.2-5.4).
    ملاحظة: يجب الحفاظ على الحاضنات التي تحتوي على البعوض للعدوى عند 20.5 درجة مئوية ، عند رطوبة 80٪ ، وفي دورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة (تضيء الأضواء بين الساعة 07:00 صباحا و 07:00 مساء).
  2. في اليوم السابق لإصابة البعوض ، افصل أنثى البعوض عن طريق وضع مصدر حرارة فوق القفص يحتوي على كل من البعوض الذكور والإناث ، مثل المثانة البلاستيكية الرقيقة أو القفاز المملوء بالماء الساخن إلى 37 درجة مئوية. قم بإزالة البعوض الأنثوي ، الذي ينجذب إلى مصدر الحرارة ، باستخدام شفاط الحشرات ونقله إلى قفص منفصل أصغر للعدوى.
    ملاحظة: يمكن تمييز ذكور البعوض عن إناث البعوض من خلال انخفاض حجم جسمها قليلا وهوائيات البرقوق.
  3. حقن الفئران المصابة بمخدر عام (على سبيل المثال ، 2٪ ثلاثي برومو إيثانول / أفيرتين). تأكد من التخدير الكامل عن طريق الضغط بقوة على وسادة القدم لكل ماوس. إذا لم تتفاعل ، فهي مخدرة بما فيه الكفاية وجاهزة لنقل العدوى إلى البعوض.
  4. ضع الفئران المخدرة فوق أنثى البعوض المحبوسة (من الخطوة 5.2) تحت راقد القص. انشر الأرجل الأمامية والخلفية يدويا لتوفير أكبر مساحة سطح لتغذية البعوض. اترك الفئران المصابة فوق كل قفص لمدة 15 دقيقة ، وتحقق كل 5 دقائق للتأكد من أن الفئران ليست مستيقظة. بمجرد اكتمال التغذية ، قم بالقتل الرحيم للفئران باستخدام خلع عنق الرحم ، أو وفقا لبروتوكول استخدام الحيوانات المؤسسي ، وتخلص منها بأمان.

6. مجموعة من sporozoites

  1. افحص الأمعاء الوسطى للبعوض بحثا عن البويضات عند حوالي 10 d.p.i. للتحقق من نجاح العدوى وتطور البلازموديوم داخل البعوض. عزل البعوض midguts من البطن عن طريق إزالة الجزء البطني النهائي باستخدام ملقط. تصور الأمعاء الوسطى تحت الضوء المستقطب لوجود البويضات22.
  2. من المتوقع أن تكون sporozoites من النوع البري موجودة في الغدد اللعابية للبعوض بعد 18-21 يوما من التغذية على الفئران المصابة. في اليوم 18 ، تشريح 5-10 البعوض لتقييم أعداد sporozoite.
    ملاحظة: يتم غسل البعوض وقتله في الإيثانول. بعد ذلك ، يتم غسل البعوض الميت مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة الحطام قبل التشريح.
  3. لعزل وعدد sporozoites ، قم بإزالة رأس البعوض بعناية أثناء الضغط على صدر البعوض باستخدام ملقط أو إبرة تشريح دقيقة. تظل الغدد اللعابية متصلة بالرأس الذي تمت إزالته (الشكل 2).
  4. قم بإزالة أي حطام إضافي للبعوض من الغدد اللعابية وضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 400 ميكرولتر من وسائط تشريح البعوض (وسط Ealge المعدل من Dulbecco [DMEM] مع مصل فأر 1٪ ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ؛ انظر جدول المواد).
  5. تعطيل الغدد اللعابية المعزولة عن طريق المرور عبر حقنة إبرة 30 غرام 15-20 مرة. ضع 10 ميكرولتر من الغدد اللعابية المعطلة في وسائط تشريح البعوض في مقياس الدم والعد. إعادة التعليق في التركيز المطلوب لوسائط تشريح البعوض أو PBS للحقن في الفئران ، أو التلقيح في مزارع الخلايا ، أو الحفظ بالتبريد على المدىالطويل 23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يعد تحديد تواتر وتطور الفصام أمرا بالغ الأهمية لضمان وجود ما يكفي من الطفيليات القابلة للحياة في المرحلة المثلى للنقل. يمكن تمييز الفصاميات غير الناضجة عن الفصاميات الناضجة تماما من خلال وجود عدد أقل من الميروزويتات التي لا تملأ المساحة داخل الخلايا بالكامل لكرات الدم الحمراء (الشكل 1 ب). من المهم ملاحظة أنه عند إجراء مسحات الدم من الدم المزروع ، قد تنفتح كرات الدم الحمراء المصابة ، مما يؤدي إلى ملاحظة الميروزويتات الحرة خارج الخلية في لطاخة الدم (الشكل 1). لا يتم احتساب هذه الميروزويتات في تقييم تواتر الفصام في الخطوة 2.5.

يمكن أن تكون إزالة الغدد اللعابية من البعوض صعبة إذا لم يكن المستخدم على دراية بفسيولوجيا البعوض أو التشريح على نطاق صغير. أثناء عزل الغدد اللعابية عن البعوض ، لاحظ أنه يمكن استخدام شفافية الغدد لتمييزها عن حطام البعوض غير الشفاف (الشكل 2). يكون عد الأسبوروزويتات بعد تعطيل الغدد أكثر كفاءة عند تكبير 400x ، ويسمح استخدام تباين الطور بالتعرف بسهولة على الأسبوروزويتات داخل غرفة العد.

لقد أظهرنا أن أكثر من 90٪ من البلازموديوم في خلايا الكبد يمكن التخلص منها من خلال آليات المناعة الجوهرية الخلوية23. لذلك ، نتوقع أن تخضع الطفيليات في عدد كبير من خلايا الكبد للتحلل. كأداة لتحديد تحلل المتصورة أو PV في خلايا الكبد المضيفة ، قمنا بتوليد خلايا كبدية معدلة وراثيا تعبر عن الوحدة الفرعية GFP 1-10 (Hepa-GFP1-10) و P. berghei المعدلة وراثيا التي تعبر عن الوحدة الفرعية GFP 11 وتنقلها إلى PV (Pb-GFP 11). جزء GFP 1-10 ، الذي يحتوي على المخلفات التي تشكل كروموفور GFP ، غير فلوري في حد ذاته ولا يتألق إلا عند الارتباط ب GFP 11 ، ربما من خلال التكامل الذاتي. بالإضافة إلى التحقق من صحة الجينات المحورة وظيفيا في البلازموديوم ، أشار توليد إشارة مضان خضراء في الخلايا المضيفة المصابة بفيروس Hepa-GFP11 المصابة ب Pb-GFP 1-10 إلى تحلل PV (الشكل 3). فشلت خلايا Hepa-GFP 1-10 المصابة ب P. berghei من النوع البري أو خلايا Hepa1-6 من النوع البري المصابة ب Pb-GFP11 في توليد أي إشارة مضان خضراء (البيانات غير معروضة). نحن نعتبر تحلل الكهروضوئية خطوة رئيسية سابقة في تدمير مرحلة الكبد Plasmodium. كما تم تلطيخ الأسبوروزويتات Pb-GFP11 ب CTV لتصور الطفيليات في خلايا الكبد. من المتوقع أن يتسرب CTV إلى الخلية المضيفة فقط عند تحلل الطفيلي نفسه (الشكل 3). من المحتمل أن تشير إشارة CTV المشتتة التي لوحظت في خلية الكبد المضيفة إلى تحلل الطفيلي داخل خلية الكبد. من المتوقع حدوث تداخل وثيق بين إشارات CTV و GFP مع التحلل المصاحب لكل من PV والطفيلي. يسمح لنا هذا النظام بالاستعلام عن المساهمات المميزة للجزيئات المضيفة الفردية في المسارات المناعية الفطرية والخلوية في تعديل تحلل البلازموديوم أو PV.

Figure 1
الشكل 1: فصام المتصورة بيرغي . صور مجهرية ضوئية تمثيلية تصور P. berghei schizonts في مزرعة دم الفأر المتطفلة (16 ساعة) ملطخة بصبغة Giemsa. تشير الأسهم إلى الفصام الناضجة تماما (A) أو غير الناضجة (B). قضبان المقياس: 5 ميكرومتر . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الغدد اللعابية للبعوض والسبوروزويتات. صور مجهرية ضوئية تصور الغدد اللعابية المعزولة من أنثى بعوض الأنوفيليس المصابة ب Pb-GFP11. (أ) صورة لرأس بعوضة مع الغدد اللعابية (السهم) لا تزال سليمة أثناء التشريح ، قبل إزالتها ومعالجتها (شريط المقياس: 1 مم). (ب، ج) صور تمثيلية للغدد اللعابية عند التكبير السفلي (B) والأعلى (C) (قضبان المقياس: 0.1 مم و 0.04 مم على التوالي). يمكن رؤية Sporozoites داخل وخارج الغدة (السهم). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الكشف عن تحلل المتصورة والفجوة العصارية الطفيلية في الخلايا الكبدية المضيفة. تباين التداخل التفاضلي (DIC) وصور التألق المناعي شبه الملونة مع تراكب يصور خلايا الكبد Hepa-GFP 1-10 المصابة ب Pb-GFP11 sporozoites. تم تلطيخ Sporozoites ب CTV قبل الإصابة (شريط المقياس: 10 ميكرومتر). تم طلاء ما مجموعه 1 × 106 خلايا كبدية Hepa-GFP 1-10 في طبق استزراع زجاجي القاع 35/10 مم وتم تلقيحها ب 3 × 10 5PbGFP11 sporozoites بعد 4 ساعات من الطلاء. تم التقاط الصور بمجهر فلوري مقلوب عند تكبير 600x وعند 16 ساعة بعد الإصابة. الاختصارات: DIC = تباين التداخل التفاضلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد استخدمنا البروتوكول أعلاه في مختبرنا لإنشاء عدة خطوط من طفيليات P. berghei المعدلة وراثيا. على الرغم من أنه تم تحسينه ل P. berghei ، فقد استخدمنا هذا البروتوكول بنجاح لتوليد P. yoelii sporozoites المعدلة وراثيا. بعد حقن الفصاميات المنقولة في الفئران ، يمكن اكتشاف الطفيليات عادة في موعد لا يتجاوز 3 d.p.i. في جميع المجموعات ، بما في ذلك عدم التحكم في البلازميد. يبدأ الانتقاء فقط بمجرد اكتشاف الطفيليات لضمان صلاحية الطفيليات بعد التثقيب الكهربائي. بالإضافة إلى ذلك ، عند التحضير لاختيار الدواء ، قد يكون تحمض الماء بحمض الهيدروكلوريك ، وخفض درجة الحموضة إلى 4 ، ضروريا لإذابة البيريميثامين تماما. نتوقع إزالة كاملة للطفيليات من مجموعة التحكم في عدم وجود بلازميد ، بينما تظل الفئران الملقحة بالمواد المنقولة مصابة. يحدث التخليص في الفئران الضابطة عادة بعد 5-8 أيام من بدء علاج البيريميثامين. وتجدر الإشارة إلى أن الفئران B6 المصابة ب P. berghei قد تظهر علامات الملاريا الدماغية التجريبية وتستسلم حتى الموت (تتبع نقاط النهاية الإنسانية وفقا للإرشادات المؤسسية لاستخدام الحيوانات) ، عادة في الفترة الفاصلة من 6-12 d.p.i. يمكن تجنب ذلك عن طريق إجراء اختيار الدواء للناقلات في الفئرانTCRaKO 25 ، أو عن طريق نقل الطفيليات التي تخضع للانتقاء عند 5 d.p.i. إلى متلقي B6 الجدد واستمرار الانتقاء في الأخير. يمكن التحقق من الجينات المحورة في البلازموديوم باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب ، مثل الفحوصات الجينية ، أو تقييم النمط الظاهري ، أو اكتساب أو فقدان وظائف محددة.

من المهم أن نلاحظ أن اختيار البلازميد المناسب أمر بالغ الأهمية لنجاح نقل الحمض النووي المدخلة في الطفيلي والاحتفاظ به. قد تظهر البلازميدات أيضا فعالية محدودة في تحقيق الجينات المحورة عبر أنواع البلازموديوم المختلفة. على سبيل المثال ، البلازميد pSKspGFP11 (استنادا إلى PL0017; موارد BEI) التي استخدمناها لتوليد PbGFP11 يمكن استخدامها لتوليد P. yoelli المعدلة وراثيا بكفاءة أيضا ، ولكن ليس P. chabaudi. لإنشاء pSKspGFP11 ، استبدلنا تسلسل GFP mutant3 في البلازميد pL0017 الأصلي (موارد BEI) بسبعة تسلسلات ترادفية من الشريط الحادي عشر β من المجلد الفائق GFP ، GFP 11 (GFP11-7X) 18. على الرغم من أن الخطية للبلازميدات قبل النقل تسمح بتكامل جينومي أفضل ، إلا أن كل من البلازميدات الخطية والدائرية تظهر كفاءات نقل مماثلة باستخدام بروتوكولنا. كما يبدو أن خطوط البلازموديوم الناتجة عن النقل مع البلازميدات الدائرية تحافظ على خصائصها المحورة وراثيا على مدار توليد الأسبوروزويتات في البعوض.

والجدير بالذكر أن إناث البعوض فقط هي التي يمكنها إيواء البلازموديوم ونقلها. بعد عزل البعوض ، يوصى بعدم تزويد البعوض المعزول بمصدر لمياه السكر في هذه المرحلة. إن تجويعهم بهذه الطريقة من شأنه أن يزيد من فرصة موت أي بعوض ذكر ربما تم نقله عن غير قصد ، والإناث تغذي الدم بشكل أكثر كفاءة من الفئران المصابة. عادة ما نعيد ماء السكر بعد يوم واحد من نقل العدوى من الفئران إلى البعوض. من الجدير بالذكر أن الإطار الزمني لتطوير ونضج sporozoite في البعوض قد يختلف بين خطوط البلازموديوم المعدلة وراثيا. لذلك ، من المهم تقييم أعداد sporozoite في الغدد اللعابية في نقاط زمنية متعددة بعد الإصابة قبل إنشاء بروتوكول محدد لكل خط معدل وراثيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة AI168307 إلى SPK.  نشكر نواة قياس التدفق الخلوي UGA CTEGD ونواة الفحص المجهري UGA CTEGD. كما نعترف بمساهمات آش باثاك وآن إليوت وموظفي UGA Sporocore في تحسين البروتوكول. نود أن نشكر الدكتور دايتشي كامياما على الأفكار القيمة والمناقشة والبلازميدات الأم التي تحتوي على GFP11 و GFP 1-10. نود أيضا أن نشكر أعضاء مختبر Kurup على دعمهم المستمر وصبرهم وتشجيعهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 G x 1/2" Syringe needle Exel international 26437
Alsever's solution Sigma-Aldritch A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 Lonza VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) TCI America T1420
Blood collection tubes BD bioscience 365967 for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer INCYTO DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish Greiner Bio-One 627860
Centrifuge 5425 Eppendorf 5405000107
Centrifuge 5910R Eppendorf 5910R For gradient centrifugation
Delta Vision II - Inverted microscope system Olympus IX-71
Dimethyl Sulfoxide Sigma D5879-500ml
Fetal bovine serum GenClone 25-525
GFP11 plasmid Kurup Lab pSKspGFP11 Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain Sigma-Aldritch 48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells Kurup Lab Hepa GFP1-10 Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum Used for mosquito dissection media
NaCl Millipore-Sigma SX0420-5 1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II Amaxa Biosystems (Lonza) Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette VWR 14673-043
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldritch P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium) Cytivia 17-0891-02 Details in protocol
PL0017 Plasmid BEI Resources MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration) Sigma 46706 Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640 Corning 15-040-CV
SoftWoRx microscopy software Applied Precision v6.1.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Geneva. World Health Organization. , 1 (2020).
  2. Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
  3. Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
  4. Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. Pre-erythrocytic vaccines against malaria. Vaccines. 8 (3), 400 (2020).
  5. Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
  6. Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
  7. Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
  8. Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
  9. Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
  10. Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
  11. Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
  12. Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
  13. Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
  14. Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
  15. Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
  16. Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
  17. Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
  18. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  19. Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
  20. Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
  21. de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
  22. Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
  23. Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
  24. Bowers, C., et al. Cryopreservation of Plasmodium sporozoites. Pathogens. 11 (12), 1487 (2022).
  25. Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).

Tags

المتصورة المعدلة وراثيا Berghei Sporozoites ، الملاريا ، البلازموديوم الطفيلي ، بعوض الأنوفيليس ، تطور مرحلة الكبد ، الملاريا السريرية ، الاستجابة المناعية ، الطفيليات المعدلة وراثيا ، مرحلة الدم P. berghei ، الغدد اللعابية البعوضية ، التجارب في الجسم الحي ، التجارب في المختبر ، البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، الملاريا في مرحلة الكبد
توليد المتصورة المعدلة وراثيا <em>بيرغي</em> سبوروزويتات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bowers, C., Kurup, S. P. Generating… More

Bowers, C., Kurup, S. P. Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites. J. Vis. Exp. (195), e64992, doi:10.3791/64992 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter