Summary
Малярия передается инфицированными комарами при инокуляции спорозоитной стадии плазмодия . Трансгенный плазмодий позволил нам лучше понять биологию малярии и внес непосредственный вклад в разработку вакцины против малярии. В данной статье мы опишем оптимизированную методологию получения трансгенных спорозоитов Plasmodium berghei .
Abstract
Малярия является смертельным заболеванием, вызываемым паразитом Plasmodium и передающимся через укусы самок комаров рода Anopheles . Спорозоитная стадия плазмодия , откладываемого комарами в коже позвоночных хозяев, проходит фазу обязательного развития в печени, прежде чем начать клиническую малярию. Мы мало знаем о биологии развития плазмодия в печени; доступ к стадии спорозоита и способность генетически модифицировать такие спорозоиты являются важнейшими инструментами для изучения природы инфекции Plasmodium и результирующего иммунного ответа в печени. Здесь мы представляем комплексный протокол генерации трансгенных спорозоитов Plasmodium berghei . Мы генетически модифицируем P. berghei в крови и используем эту форму для заражения комаров рода Anopheles , когда они едят кровь. После того, как трансгенные паразиты развиваются у комаров, мы выделяем спорозоитную стадию паразита из слюнных желез комаров для экспериментов in vivo и in vitro . Мы демонстрируем валидность протокола, генерируя спорозоиты нового штамма P. berghei , экспрессирующие субъединицу 11 зеленого флуоресцентного белка (GFP11), и показываем, как его можно использовать для исследования биологии малярии на стадии печени.
Introduction
Несмотря на успехи в разработке лекарств и научных исследованиях в области профилактики и лечения малярии, глобальное бремя малярии остается высоким. Ежегодно от малярии умирает более полумиллиона человек, при этом самые высокие уровни смертности наблюдаются среди детей, живущих в эндемичных по малярии регионах, таких как страны Африки к югу отСахары1. Малярия вызывается паразитом Plasmodium, который передается человеку через укусы самок комаров рода Anopheles, несущих паразита в своих слюнных железах. Инфекционная стадия плазмодия — спорозоиты — откладываются в коже позвоночных во время трапезы с кровью и путешествуют по кровотоку, чтобы заразить клетки печени, где они претерпевают обязательное развитие (составляющие преэритроцитарную малярию) до заражения эритроцитов. Инфекция эритроцитов инициирует стадию малярии в крови и ответственна за всю заболеваемость и смертность, связанные с этой болезнью 2,3.
Облигатный характер преэритроцитарного развития Plasmodium сделал его привлекательной мишенью для профилактических усилий по разработке вакцин и лекарств4. Обязательным условием для изучения биологии преэритроцитарной малярии, а также разработки вакцин или препаратов, нацеленных на стадию печени, является доступ к спорозоитам Plasmodium. Кроме того, наша способность генерировать генетически модифицированные спорозоиты Plasmodium сыграла важную роль в успехе таких исследований 5,6,7,8,9. Трансгенные линии плазмодия, экспрессирующие флуоресцентные или люминесцентные репортерные белки, позволили проследить их развитие in vivo и in vitro10,11. Генетически ослабленные паразиты (GAP), образующиеся в результате делеции нескольких генов в плазмодии, также являются одними из наиболее перспективных вакцин-кандидатов12,13.
Модели малярии грызунов и приматов помогли нам понять механизмы взаимодействия паразита-хозяина при малярии человека из-за сходства в биологии и жизненном цикле видов Plasmodium 14. Использование видов Plasmodium, которые заражают грызунов, но не человека (например, P. berghei), позволяет поддерживать полный жизненный цикл паразита и генерировать инфекционные спорозоиты для изучения малярии на стадии печени в контролируемых условиях с уровнем биобезопасности 1. В настоящее время существует множество отдельных протоколов для получения трансгенных паразитов Plasmodium 15 стадии крови, заражения комаров16 и выделения спорозоитов17. В этой статье мы излагаем комплексный протокол, объединяющий эти методологии для получения и изоляции трансгенных спорозоитов P. berghei, используя в качестве примера новый трансгенный штамм PbGFP11. PbGFP 11 транспортирует 11-ю β-цепочку супер-папки зеленого флуоресцентного белка (GFP), GFP11, в паразитофорную вакуоль (PV), образующуюся в гепатоцитах хозяина. PbGFP 11 используется совместно с трансгенными гепатоцитами (фон Hepa1-6), экспрессирующими остатки, составляющие фрагмент GFP 1-10 (GFP 1-10) в цитоплазме (клетки Hepa GFP 1-10). PbGFP11 сообщает о лизисе ФВ в гепатоцитах хозяина посредством самокомплементаризации и переформирования функционального GFP и зеленого флуоресцентного сигнала18. Следует отметить, что GFP 11 кодируется как серия из семи тандемных последовательностей в PbGFP11 для усиления результирующего флуоресцентного сигнала. Окрашивая спорозоиты PbGFP11 цитоплазматическим красителем CellTrace Violet (CTV), мы можем отследить паразитов. Лизис таких CTV-окрашенных внутриклеточных паразитов сам по себе приводит к утечке CTV в цитоплазму клетки-хозяина и окрашиванию клетки-хозяина. В дополнение к визуализации и дифференциации лизиса Plasmodium PV и/или паразита в гепатоцитах хозяина, эта система может быть надежно использована для изучения иммунных путей, ответственных за любой из этих процессов, посредством генетического или терапевтического возмущения молекулярных компонентов таких путей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования с участием позвоночных животных в нашей лаборатории проводились в соответствии с рекомендациями и протоколами Университета Джорджии по использованию животных.
1. Генерация мышей, инфицированных P. berghei
- Инициируйте инфекцию на стадии крови у самцов или самок мышей C57BL/6 (B6) в возрасте 6-8 недель, используя паразитов P. berghei дикого типа. Для этого криоконсервированную кровь, инфицированную P. berghei, (2 x 105 инфицированных эритроцитов), восстановленную в 400 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), переносят одной или двум мышам-донорам внутрибрюшинно (в/в).
- Пересадить свежую кровь, полученную в результате ретроорбитального кровотечения от мышей-доноров через 5 дней после заражения (d.p.i.), двум наивным мышам B6. Для этого берут 200 мкл крови, восстанавливают 300 мкл PBS и вводят 200 мкл внутривенно мышам-реципиентам. Убедитесь, что паразитемия у доноров в этот момент времени составляет 2%-5%19,20.
- Контролируйте паразитемию, как описано ранее19,20, начиная с 2 d.p.i. у реципиентов. Когда паразитемия колеблется от 3% до 5% (около 5 d.p.i.), усыпите мышей-реципиентов, а затем соберите кровь через пункцию сердца или ретроорбитальное кровотечение. Усыпляйте мышей с помощью ингаляции углекислого газа с последующим вывихом шейки матки или в соответствии с рекомендациями учреждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только паразитемия превышает 5%, эффективность трансфекции может быть снижена из-за увеличения распространенности многократно инфицированных эритроцитов.
2. Генерация шизонтов в культуре
- На этапе 1.3 берут кровь инфицированных мышей (всего примерно 2 мл от двух мышей) в 5 мл раствора Альсевера (см. таблицу материалов) в стерильной среде. Выполните шаги 2.1–3.12 в стерильных условиях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные условия включают ношение перчаток, протирание перчаток и поверхностей 70% этиловым спиртом, использование стерильных расходных материалов и материалов, а также работу в шкафу биобезопасности. - Центрифугируют кровь в течение 8 мин при 450 x g при комнатной температуре (RT). Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл полной среды RPMI (RPMI 1640 с 20% фетальной бычьей сывороткой [FBS] и 1% пенициллин-стрептомицином, v/v).
- Центрифуга в течение 8 мин при 450 x g при RT. Ресуспендируйте гранулу в 25 мл полной среды RPMI и переложите в колбу для культуры T75 с фильтрующим колпачком.
- Поместить в инкубатор при температуре 36,5 °С и 5%СО2, при этом слегка встряхивая, чтобы клетки оставались во взвешенном состоянии в течение 16 ч.
- Через 16 часов проверьте наличие шизонта. Для этого берут 500 мкл образца, центрифугируют при 450 х г в течение 8 мин, ресуспендируют гранулу в 10 мкл полной среды RPMI и готовят тонкий мазок крови. Окрасьте мазок крови красителем Гимзы19 (см. таблицу материалов) и определите частоту шизонтов (рисунок 1).
- Для оптимальной эффективности трансфекции 60%-70% паразитов должны находиться в стадии шизонта. Если установлено значение ниже этого порога, продолжайте культивирование, как описано в шаге 2.4, и проверяйте каждый час, чтобы убедиться, что вышеуказанный порог превышен, прежде чем продолжить.
3. Трансфекция Plasmodium schizonts
- Приготовьте градиентный центрифугирующий буфер, восстановив 13 мл среды с градиентной массой (см. таблицу материалов) с 1,44 мл 1,5 М NaCl и 5,6 мл 0,15 М NaCl в центрифугированной пробирке объемом 50 мл.
- Переложите 25 мл культуры крови в свежую центрифугированную пробирку объемом 50 мл. Осторожно нанесите 20 мл градиентного центрифугированного буфера на дно центрифугированной пробирки с помощью узкой стеклянной пипетки, чтобы создать градиентный столбик. Следите за тем, чтобы не нарушить слои жидкости и границы раздела, и обеспечьте четкое разделение между буфером и средой.
- Центрифуга в течение 20 мин при 450 x g без торможения при RT. С помощью пипетки Пастера осторожно удалите слой шизонта15 , расположенный на границе раздела питательной среды и буфера градиентной центрифугирования, и поместите его в новую центрифугированную пробирку объемом 50 мл.
- Суспендировать изолированные шизонты в полной среде RPMI и довести общий объем до 40 мл. Центрифугу при 450 x g в течение 8 мин при RT и выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте шизоны в 10 мл полной среды RPMI. Затем переносят 1 мл этого раствора в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для каждой трансфекции и центрифугируют при 16 000 x g в течение 5 с, чтобы гранулировать инфицированные эритроциты. Инфицированные эритроциты, полученные от двух мышей вышеуказанным способом, могут быть использованы для 10 отдельных трансфектов.
- Смешайте 100 мкл электропорационного буфера (раствор нуклеофектора из набора для электропорации; см. таблицу материалов) при RT с 5 мкг кольцевой или линеаризованной целевой плазмидной ДНК (в объеме до 10 мкл), в зависимости от того, применимо ли это для каждой трансфекции в отдельных пробирках микроцентрифуг по 1,5 мл. Образец «без плазмиды» должен быть включен в качестве контроля для трансфекции и выбора антибиотика.
- Удаляют надосадочную жидкость после центрифугирования с этапа 3.5 и осторожно ресуспендируют инфицированные эритроциты в приготовленном растворе нуклеофектора + плазмидная ДНК (с шага 3.6).
- Перенесите суспензию (раствор нуклеофектора + плазмида + шизонты; не более 110 мкл) в электропорационные кюветы. Трансфектирование с помощью подходящей программы нуклеофектора (U-033, см. таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что шаги с 3.8 по 3.10 выполнены в RT. - Добавьте 100 мкл полной среды RPMI в кювету и перелейте весь раствор (теперь общий объем 200 мкл) в пробирку для микроцентрифуги объемом 1,5 мл и оставьте на RT.
- Вводите мышам внутривенно (внутривенно) 200 мкл раствора трансфицированных паразитов, чтобы свести к минимуму время между трансфекцией и окончательной инъекцией мышам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфицированные шизонты вводятся мышам менее чем через 5 минут после электропорации, чтобы максимизировать эффективность протокола.
4. Отбор трансфицированных паразитов
- Проверяйте уровень паразитемии у мышей, привитых трансфицированными шизонтами, ежедневно от 2 d.p.i. для подтверждения инфекции.
- Как только инфекция будет подтверждена, начните выбор препарата с помощью перорального приема препарата с питьевой водой, предлагаемой вволю.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пириметамин был использован в качестве селективного лекарственного маркера для плазмиды. В этом случае к 250 мл чистой воды добавляли 17,5 мг пириметамина (конечная концентрация 70 мг/л). Кроме того, в эту воду добавляли 10 г сахара, чтобы стимулировать адекватное потребление пириметаминсодержащей воды мышами. - Контролируйте паразитемию каждые два дня с помощью мазков крови, взятых из 5 мкл крови, начиная с 6 дней после начала лечения пириметамином. Отсутствие обнаруживаемых паразитов через 15 дней свидетельствует о неудачной трансфекции; В этом случае повторно запустите процесс с шага 1.1 для новой попытки.
- Когда паразитемия достигает хотя бы 1%, переносят паразитов на наивных мышей В6 для создания запасов паразитов на стадии крови. Продолжайте селекцию у вновь инфицированных мышей до тех пор, пока паразитемия не достигнет 2%-5%, после чего создают запасы и криоконсервируют их21.
5. Заражение комаров трансгенными линиями
- Инфицировать мышей линии В6 200 мкл крови, содержащей выбранных паразитов (2 x 105 инфицированных эритроцитов на мышь внутривенно). Определите паразитемию у этих мышей в день кормления комаров и заражения. Паразитемия от 2% до 5% является оптимальной для заражения комаров. После проверки немедленно передайте инфекцию самкам комаров Anopheles stephensi в соответствии с шагами 5.2-5.4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубаторы, содержащие комаров для заражения, должны содержаться при температуре 20,5 °C, влажности 80% и в 12-часовом цикле свет/темнота (свет включен с 07:00 до 19:00). - За день до заражения комарами отделите самок комаров, поместив источник тепла на клетку, содержащую как самцов, так и самок комаров, например, тонкий пластиковый пузырь или перчатку, наполненную водой, нагретой до 37 °C. Удалите самок комаров, которых привлекает источник тепла, с помощью аспиратора насекомых и перенесите их в отдельную клетку меньшего размера для заражения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самцов комаров можно отличить от самок по их слегка уменьшенному размеру тела и перистым усикам. - Введите инфицированным мышам общий анестетик (например, 2% трибромэтанол/авертин). Обеспечьте полную анестезию, крепко зажав подушечку лапы каждой мыши. Если они не реагируют, они достаточно успокоены и готовы передать инфекцию комарам.
- Поместите мышей, находящихся под наркозом, поверх самок комаров в клетке (из шага 5.2) под грудным лежачьим положением. Вручную раздвиньте передние и задние лапы, чтобы обеспечить наибольшую площадь поверхности для кормления комаров. Оставьте инфицированных мышей над каждой клеткой в общей сложности на 15 минут, проверяя каждые 5 минут, чтобы убедиться, что мыши не проснулись. После завершения кормления усыпите мышей с помощью вывиха шейки матки или в соответствии с протоколом использования животных в учреждении и безопасно утилизируйте их.
6. Сбор спорозоитов
- Проверьте среднюю кишку комара на наличие ооцист примерно в 10 d.p.i., чтобы убедиться в успешном заражении и развитии плазмодия у комаров. Изолируйте среднюю кишку комара от брюшной полости, удалив терминальный сегмент брюшка с помощью щипцов. Визуализируйте среднюю кишку под поляризованным светом на наличие ооцист22.
- Ожидается, что спорозоиты дикого типа будут присутствовать в слюнных железах комаров через 18-21 день после питания инфицированными мышами. На 18-й день препарируют 5-10 комаров, чтобы оценить количество спорозоитов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Комаров моют и убивают в этаноле. Затем мертвых комаров дважды промывают PBS, чтобы удалить мусор перед вскрытием. - Чтобы выделить и подсчитать спорозоиты, осторожно удалите голову комара, одновременно надавливая на грудную клетку комара с помощью щипцов или тонкой препарирующей иглы. Слюнные железы остаются прикрепленными к удаленной головке (рис. 2).
- Удалите все дополнительные остатки комаров из слюнных желез и поместите в микроцентрифужную пробирку, содержащую 400 мкл среды для препарирования комаров (модифицированная среда Ealge [DMEM] Dulbecco с 1% сывороткой мыши, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина; см. таблицу материалов).
- Разрушьте работу изолированных слюнных желез, пропустив через иглу 30 G шприц 15-20 раз. Поместите 10 мкл разрушенных слюнных желез в среду для вскрытия комаров в гемоцитометр и подсчитывайте. Ресуспендируйте в желаемой концентрации среду для препарирования комаров или PBS для инъекции мышам, инокуляции в клеточные культуры или длительной криоконсервации23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Определение частоты и развития шизонтов имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы достаточное количество жизнеспособных паразитов находилось в оптимальной стадии для трансфекции. Незрелые шизонты можно отличить от полностью зрелых по наличию меньшего количества мерозоитов, которые не заполняют все внутриклеточное пространство эритроцитов (рис. 1Б). Важно отметить, что при взятии мазков из культивируемой крови инфицированные эритроциты могут вскрываться, что приводит к обнаружению свободных внеклеточных мерозоитов в мазке крови (рис. 1). Такие мерозоиты не учитываются при оценке частоты шизонтов на шаге 2.5.
Удаление слюнных желез у комаров может быть сложной задачей, если пользователь не знаком с физиологией комаров или мелкомасштабными вскрытиями. При изоляции слюнных желез от комаров следует учитывать, что полупрозрачность желез может быть использована для дифференциации их от непрозрачных остатков комаров (рисунок 2). Подсчет спорозоитов после разрушения желез наиболее эффективен при 400-кратном увеличении, а использование фазового контраста позволяет легче идентифицировать спорозоиты в счетной камере.
Мы показали, что более 90% плазмодия в гепатоцитах, возможно, элиминируется через внутриклеточные иммунные механизмы23. Поэтому мы ожидаем, что паразиты в значительном количестве гепатоцитов подвергнутся лизису. В качестве инструмента для определения лизиса плазмодия или его PV в гепатоцитах хозяина мы генерировали трансгенные гепатоциты, экспрессирующие субъединицу GFP 1-10 (Hepa-GFP1-10) и трансгенную P. berghei, экспрессирующую и транспортирующую субъединицу GFP 11 в ее PV (Pb-GFP 11). Фрагмент GFP 1-10, содержащий остатки, составляющие хромофор GFP, сам по себе нефлуоресцентный и флуоресцирует только при ассоциировании с GFP 11, возможно, путем самокомплементаризации. В дополнение к функциональной валидации трансгенеза в плазмодии, генерация зеленого флуоресцентного сигнала в инфицированных Pb-GFP 11 клетках-хозяевах Hepa-GFP1-10 указывала на лизис PV (рис. 3). Клетки Hepa-GFP 1-10, инфицированные P. berghei дикого типа, или клетки Hepa 1-6, инфицированные Pb-GFP11 дикого типа, не смогли сгенерировать какой-либо зеленый флуоресцентный сигнал (данные не показаны). Мы считаем, что лизис ФВ является ключевым предшествующим этапом разрушения плазмодия печени. Спорозоиты Pb-GFP11 также были окрашены CTV для визуализации паразитов в гепатоцитах. Ожидается, что CTV будет просачиваться в клетку-хозяина только после лизиса самого паразита (рис. 3). Рассеянный сигнал CTV, наблюдаемый в гепатоците-хозяине, вероятно, указывает на лизис паразита в гепатоците. Ожидается тесное перекрытие между сигналами CTV и GFP с одновременным лизисом как PV, так и паразита. Эта система позволяет нам исследовать отчетливый вклад отдельных молекул хозяина во врожденных и внутриклеточных иммунных путях в модуляцию лизиса плазмодия или его PV.
Рисунок 1: Plasmodium berghei schizonts. Репрезентативные изображения световой микроскопии, изображающие шизонты P. berghei в культуре крови паразитированных мышей (16 ч), окрашенных окрашиванием по Гимзе. Стрелками обозначены полностью созревшие (А) или незрелые (В) шизонты. Масштабные линейки: 5 мкм . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Слюнные железы комаров и спорозоиты. Изображения световой микроскопии, изображающие слюнные железы, выделенные у самок комаров рода Anopheles, инфицированных Pb-GFP11. (A) Изображение головы комара со слюнными железами (стрелка), которые не повреждены во время вскрытия, до ее удаления и дальнейшей обработки (масштабная линейка: 1 мм). (В,В) Репрезентативные изображения слюнных желез при меньшем (B) и большем (C) увеличении (масштабные линейки: 0,1 мм и 0,04 мм соответственно). Спорозоиты можно увидеть как внутри, так и снаружи железы (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Обнаружение лизиса плазмодия и его паразитофорной вакуоли в гепатоцитах хозяина. Дифференциально-интерференционно-контрастные (ДВС) и псевдоцветные иммунофлуоресцентные изображения с наложением гепатоцитов Hepa-GFP1-10, инфицированных спорозоитами Pb-GFP11. Спорозоиты окрашивали CTV до заражения (масштабная линейка: 10 мкм). В общей сложности 1 x 106 гепатоцитов Hepa-GFP 1-10 помещали в культуральную чашку со стеклянным дном 35/10 мм и инокулировали 3 x 10 5спорозоитов PbGFP11 через 4 ч после покрытия. Изображения были получены с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа при 600-кратном увеличении и через 16 ч после заражения. Сокращения: DIC = дифференциальный интерференционный контраст. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы использовали вышеописанный протокол в нашей лаборатории для создания нескольких линий трансгенных паразитов P. berghei. Несмотря на то, что этот протокол оптимизирован для P . berghei, мы также успешно использовали этот протокол для генерации трансгенных спорозоитов P. yoelii. После введения трансфицированных шизонтов мышам паразиты обнаруживаются, как правило, не позднее 3 d.p.i. во всех группах, включая группу без плазмид. Отбор начинают только после обнаружения паразитемии, чтобы обеспечить жизнеспособность паразитов после электропорации. Кроме того, при подготовке к подбору препарата может потребоваться подкисление воды соляной кислотой, снижающее рН до 4, для полного растворения пириметамина. Мы ожидаем, что паразиты полностью исчезнут из контрольной группы без плазмид, в то время как мыши, привитые трансфектантами, останутся инфицированными. Клиренс у контрольных мышей обычно наступает через 5-8 дней после начала лечения пириметамином. Следует отметить, что у мышей B6, инфицированных P. berghei , могут проявляться признаки экспериментальной церебральной малярии и смерть (следовать гуманным конечным точкам в соответствии с рекомендациями по использованию животных), как правило, в интервале 6-12 d.p.i. Этого можно избежать, выполнив выбор препарата для трансфектантов у мышей TCRaKO25 или перенеся паразитов, проходящих отбор при 5 d.p.i., новым реципиентам B6 и продолжая отбор у последних. Трансгенез плазмодия может быть проверен с помощью различных подходов, таких как генетический скрининг, фенотипическая оценка или приобретение или потеря определенных функций.
Важно отметить, что выбор подходящей плазмиды имеет решающее значение для успешной трансфекции и удержания введенной ДНК в организме паразита. Плазмиды также могут демонстрировать ограниченную эффективность в достижении трансгенеза между различными видами Plasmodium. Например, плазмида pSKspGFP11 (на основе PL0017; BEI), которые мы использовали для генерации PbGFP11, также могут быть использованы для эффективной генерации трансгенного P. yoelli, но не P. chabaudi. Для генерации pSKspGFP11 мы заменили последовательность GFP mutant3 в родительской плазмиде pL0017 (ресурсы BEI) семью тандемными последовательностями 11-й β-цепи суперпапки GFP, GFP 11 (GFP 11-7X)18. Несмотря на то, что линеаризация плазмид перед трансфекцией позволяет улучшить геномную интеграцию, как линейные, так и кольцевые плазмиды демонстрируют схожую эффективность трансфекции при использовании нашего протокола. Линии плазмодия, полученные в результате трансфекции кольцевыми плазмидами, также, по-видимому, сохраняют свои трансгенные свойства в ходе генерации спорозоитов у комаров.
Примечательно, что только самки комаров могут быть носителями и переносчиками плазмодия. После изоляции комаров на этом этапе рекомендуется не предоставлять изолированным комарам источник сахарной воды. Морить их голодом таким образом можно было бы увеличить вероятность того, что все самцы комаров, которые могли быть случайно перенесены, погибнут, а самки будут более эффективно питаться кровью инфицированных мышей. Обычно мы возвращаем сахарную воду через 1 день после передачи инфекции от мышей к комарам. Примечательно, что сроки развития и созревания спорозоита у комаров могут различаться у трансгенных линий Plasmodium . Поэтому важно оценить количество спорозоитов в слюнных железах в несколько моментов времени после заражения, прежде чем будет установлен протокол, специфичный для каждой трансгенной линии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения AI168307 SPK. Мы благодарим UGA CTEGD Flow Cytometry Core и UGA CTEGD Microscopy Core. Мы также признательны Эшу Патхаку, Энн Эллиот и сотрудникам UGA Sporocore за вклад в оптимизацию протокола. Мы хотим поблагодарить д-ра Дайчи Камияма (Daichi Kamiyama) за ценные идеи, обсуждение и родительские плазмиды, содержащие GFP11 и GFP 1-10. Мы также хотели бы поблагодарить сотрудников лаборатории Kurup за их постоянную поддержку, терпение и ободрение.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II - Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
References
- WHO.
- Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K.
- Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
- Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P.
- Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
- Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
- Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
- Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
- Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
- Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
- Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
- Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
- Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
- Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
- Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
- Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
- de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
- Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
- Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
- Bowers, C., et al.
- Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).
