Summary
Malaria wordt overgedragen door inoculatie van het sporozoietstadium van Plasmodium door geïnfecteerde muggen. Transgeen Plasmodium heeft ons in staat gesteld de biologie van malaria beter te begrijpen en heeft rechtstreeks bijgedragen aan de ontwikkeling van malariavaccins. Hier beschrijven we een gestroomlijnde methodologie om transgene Plasmodium berghei sporozoïeten te genereren.
Abstract
Malaria is een dodelijke ziekte die wordt veroorzaakt door de parasiet Plasmodium en wordt overgedragen door de beet van vrouwelijke Anopheles-muggen . Het sporozoietstadium van Plasmodium dat door muggen in de huid van gewervelde gastheren wordt afgezet, ondergaat een fase van verplichte ontwikkeling in de lever voordat klinische malaria wordt geïnitieerd. We weten weinig over de biologie van de ontwikkeling van Plasmodium in de lever; toegang tot het sporozoietstadium en het vermogen om dergelijke sporozoïeten genetisch te modificeren zijn cruciale hulpmiddelen voor het bestuderen van de aard van Plasmodium-infectie en de resulterende immuunrespons in de lever. Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor het genereren van transgene Plasmodium berghei sporozoïeten. We modificeren P. berghei genetisch in het bloedstadium en gebruiken deze vorm om Anopheles-muggen te infecteren wanneer ze een bloedmaaltijd nemen. Nadat de transgene parasieten zich in de muggen hebben ontwikkeld, isoleren we het sporozoietstadium van de parasiet uit de speekselklieren van de mug voor in vivo en in vitro experimenten. We demonstreren de validiteit van het protocol door sporozoïeten te genereren van een nieuwe stam van P. berghei die het groen fluorescerende eiwit (GFP) subeenheid 11 (GFP11) tot expressie brengt, en laten zien hoe het kan worden gebruikt om de biologie van malaria in het leverstadium te onderzoeken.
Introduction
Ondanks de vooruitgang in de ontwikkeling van geneesmiddelen en onderzoek naar malariapreventie en -behandeling, blijft de wereldwijde ziektelast van malaria hoog. Elk jaar sterven meer dan een half miljoen mensen aan malaria, met de hoogste sterftecijfers onder kinderen die in malaria-endemische regio's wonen,zoals Afrika ten zuiden van de Sahara. Malaria wordt veroorzaakt door de parasiet Plasmodium, die op mensen wordt overgedragen door de beet van vrouwelijke Anopheles-muggen die de parasiet in hun speekselklieren dragen. Het infectieuze stadium van Plasmodium - de sporozoïeten - wordt tijdens een bloedmaaltijd afgezet in de huid van de gewervelde gastheren en reist door de bloedbaan om levercellen te infecteren, waar ze een verplichte ontwikkeling ondergaan (pre-erytrocytaire malaria vormen) voordat ze de erytrocyten infecteren. De infectie van de erytrocyten initieert het bloedstadium van malaria en is verantwoordelijk voor het geheel van de morbiditeit en mortaliteit die met de ziekte gepaardgaan2,3.
De obligate aard van de pre-erytrocytaire ontwikkeling van Plasmodium heeft het tot een aantrekkelijk doelwit gemaakt voor profylactische inspanningen op het gebied van vaccin- engeneesmiddelenontwikkeling4. Een voorwaarde voor het bestuderen van de biologie van pre-erytrocytaire malaria, evenals de ontwikkeling van vaccins of geneesmiddelen gericht op het leverstadium, is toegang tot Plasmodium sporozoïeten. Bovendien heeft ons vermogen om genetisch gemodificeerde Plasmodium-sporozoïeten te genereren een belangrijke rol gespeeld in het succes van dergelijke onderzoeksinspanningen 5,6,7,8,9. Transgene Plasmodium-lijnen die fluorescerende of lichtgevende reportereiwitten tot expressie brengen, hebben ons in staat gesteld hun ontwikkeling in vivo en in vitro te volgen 10,11. Genetisch verzwakte parasieten (GAP's), gegenereerd door de deletie van meerdere genen in Plasmodium, zijn ook enkele van de meest veelbelovende vaccinkandidaten12,13.
Malariamodellen van knaagdieren en niet-menselijke primaten hebben ons geholpen de mechanismen van gastheer-parasietinteracties bij menselijke malaria te begrijpen vanwege de overeenkomsten in biologie en levenscyclus tussen Plasmodium-soorten 14. Het gebruik van Plasmodium-soorten die knaagdieren infecteren, maar geen mensen (bijv. P. berghei) maakt het mogelijk om de volledige levenscyclus van parasieten te behouden en infectieuze sporozoïeten te genereren voor het bestuderen van malaria in het leverstadium in een gecontroleerde omgeving met bioveiligheidsniveau 1. Er bestaan al verschillende afzonderlijke protocollen voor het genereren van transgene Plasmodium-parasieten in het bloedstadium15, infectie van muggen 16 en isolatie van sporozoïeten17. Hier schetsen we een uitgebreid protocol dat deze methodologieën combineert om transgene P. berghei-sporozoïeten te genereren en te isoleren, met de nieuwe transgene stam PbGFP11 als voorbeeld. PbGFP 11 transporteert de 11e β-streng van super-folder groen fluorescerend eiwit (GFP), GFP11, naar de parasitofore vacuole (PV) die wordt gegenereerd in de hepatocyten van de gastheer. PbGFP 11 wordt gebruikt in combinatie met transgene hepatocyten (Hepa1-6-achtergrond) die residuen tot expressie brengen die het GFP 1-10-fragment (GFP 1-10) in het cytoplasma vormen (Hepa GFP 1-10-cellen). PbGFP11 rapporteert PV-lysis in de hepatocyten van de gastheer door zelfcomplementatie en de hervorming van functioneel GFP en het groene fluorescentiesignaal18. Merk op dat GFP 11 is gecodeerd als een reeks van zeven tandemsequenties in PbGFP11 om het resulterende fluorescentiesignaal te versterken. Bij het kleuren van PbGFP11 sporozoïeten met de cytoplasmatische kleurstof CellTrace Violet (CTV), kunnen we de parasieten volgen. De lysis van dergelijke CTV-gekleurde intracellulaire parasieten zelf resulteert in lekkage van CTV in het cytoplasma van de gastheercel en kleuring van de gastheercel. Naast het visualiseren en onderscheiden van de lysis van Plasmodium PV en/of de parasiet in gastheerhepatocyten, kan dit systeem op betrouwbare wijze worden gebruikt om de immuunroutes te bestuderen die verantwoordelijk zijn voor een van deze processen, door de genetische of therapeutische verstoring van de moleculaire componenten van dergelijke routes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al het onderzoek met gewervelde dieren in ons laboratorium werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en protocollen voor diergebruik van de Universiteit van Georgia.
1. Generatie van P. berghei-geïnfecteerde muizen
- Start een infectie in het bloedstadium bij mannelijke of vrouwelijke, 6-8 weken oude C57BL/6 (B6)-muizen met behulp van wildtype P. berghei-parasieten. Om dit te doen, brengt u gecryopreserveerd P. berghei-geïnfecteerd bloed (2 x 105 geïnfecteerde rode bloedcellen), gereconstitueerd in 400 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), intraperitoneaal (i.p.) over in een of twee donormuizen.
- Breng vers bloed dat is verzameld door retro-orbitale bloeding van de donormuizen 5 dagen na infectie (d.p.i.) over naar twee naïeve B6-muizen. Om dit te doen, verzamelt u 200 μL bloed, reconstitueert u met 300 μL PBS en injecteert u 200 μL i.p. in de ontvangende muizen. Zorg ervoor dat de parasitemie bij de donoren op dit tijdstip 2%-5%19,20 is.
- Monitor parasitemie zoals eerder beschreven19,20, beginnend bij 2 d.p.i. bij de ontvangers. Wanneer parasitemie varieert van 3%-5% (ongeveer 5 d.p.i.), euthanaseer dan de ontvangende muizen en verzamel vervolgens bloed door middel van een hartpunctie of retro-orbitale bloeding. Euthanaseer de muizen met behulp van kooldioxide-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie, of volgens de richtlijnen van de instelling.
OPMERKING: Zodra de parasitemie meer dan 5% bedraagt, kan de transfectie-efficiëntie afnemen als gevolg van de verhoogde prevalentie van meervoudig geïnfecteerde rode bloedcellen.
2. Generatie schizonten in cultuur
- Verzamel bloed van de geïnfecteerde muizen in stap 1.3 (ongeveer 2 ml in totaal van twee muizen) in 5 ml Alsever's oplossing (zie Materiaaltabel) in een steriele omgeving. Voer de stappen 2.1 tot en met 3.12 uit onder steriele omstandigheden.
OPMERKING: Steriele omstandigheden omvatten het dragen van handschoenen, het afvegen van handschoenen en oppervlakken met 70% ethanol, het gebruik van steriele verbruiksartikelen en materialen en het werken in een bioveiligheidskast. - Centrifugeer het bloed gedurende 8 minuten bij 450 x g bij kamertemperatuur (RT). Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in 10 ml volledig RPMI-medium (RPMI 1640 met 20% foetaal runderserum [FBS] en 1% penicilline-streptomycine, v/v).
- Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 450 x g bij RT. Resuspendeer de pellet in 25 ml volledig RPMI-medium en breng over naar een T75-kweekkolf met een filterdop.
- Plaats in een incubator bij 36,5 °C en 5% CO2 , terwijl u zachtjes schudt om de cellen gedurende 16 uur in suspensie te houden.
- Controleer op het tijdstip van 16 uur op de ontwikkeling van schizont. Om dit te doen, verzamelt u 500 μL van het monster, centrifugeert u gedurende 8 minuten bij 450 x g , resuspendeert u de pellet in 10 μL volledige RPMI-media en bereidt u een dun bloeduitstrijkje voor. Kleur het bloeduitstrijkje met Giemsa-kleuring19 (zie Tabel met materialen) en bepaal de frequentie van schizonten (Figuur 1).
- Voor een optimale transfectie-efficiëntie moet 60%-70% van de parasieten zich in het schizontstadium bevinden. Als er minder dan deze drempelwaarde wordt vastgesteld, ga dan door met kweken zoals in stap 2.4 en controleer elk uur of de bovenstaande drempel is overschreden voordat u verder gaat.
3. Transfectie van Plasmodium schizonts
- Bereid een gradiëntcentrifugatiebuffer voor door 13 ml dichtheidsgradiëntvoorraadmedium (zie materiaaltabel) te reconstitueren met 1,44 ml 1,5 M NaCl en 5,6 ml 0,15 M NaCl in een centrifugatiebuis van 50 ml.
- Breng 25 ml bloedkweek over in een verse centrifugatiebuis van 50 ml. Laag voorzichtig 20 ml gradiëntcentrifugatiebuffer op de bodem van de centrifugatiebuis met behulp van een smalle glazen pipet om een gradiëntkolom te creëren. Zorg ervoor dat u de vloeistoflagen en grensvlakken niet verstoort en zorg voor een duidelijke scheiding tussen de buffer en de media.
- Centrifugeer gedurende 20 minuten op 450 x g zonder rem bij RT. Verwijder met een pasteurpipet voorzichtig de schizontlaag15 die zich op het grensvlak van de kweekmedia en de gradiëntcentrifugatiebuffer bevindt en plaats deze in een nieuwe centrifugatiebuis van 50 ml.
- Resuspendeer de geïsoleerde schizonten in volledige RPMI-media en breng het totale volume op 40 ml. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 8 minuten bij RT en gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de schizonten in 10 ml volledige RPMI-media. Breng vervolgens 1 ml van deze oplossing over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml voor elke transfectie en centrifugeer gedurende 5 seconden bij 16.000 x g om de geïnfecteerde rode bloedcellen te pelleteren. De geïnfecteerde rode bloedcellen die op de bovenstaande manier van twee muizen zijn afgeleid, kunnen voor maximaal 10 afzonderlijke transfecties worden gebruikt.
- Combineer 100 μl van de elektroporatiebuffer (nucleofectoroplossing uit de elektroporatiekit; zie materiaaltabel) bij RT met 5 μg circulair of gelineariseerd doelplasmide-DNA (in een volume van maximaal 10 μl), al naar gelang van toepassing voor elke transfectie in afzonderlijke microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Een "geen plasmide"-monster moet worden opgenomen als controle voor transfectie en antibioticaselectie.
- Verwijder het supernatans na centrifugeren uit stap 3.5 en resuspendeer de geïnfecteerde rode bloedcellen voorzichtig in de bereide nucleofectoroplossing + plasmide-DNA (uit stap 3.6).
- Breng de suspensie (nucleofectoroplossing + plasmide + schizonten; maximaal 110 μl) over in elektroporatiecuvetten. Transfect met behulp van een geschikt nucleofectorprogramma (U-033, zie Tabel met materialen).
NOTITIE: Zorg ervoor dat stap 3.8 tot 3.10 bij RT wordt uitgevoerd. - Voeg 100 μl volledig RPMI-medium toe aan de cuvet en breng de volledige oplossing (nu 200 μl totaal volume) over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en houd op RT.
- Injecteer de 200 μL-oplossing van getransfecteerde parasieten intraveneus (i.v.) in muizen, waarbij de tijd tussen transfectie en de uiteindelijke injectie bij muizen wordt geminimaliseerd.
OPMERKING: Getransfecteerde schizonten worden minder dan 5 minuten na elektroporatie in muizen geïnjecteerd om de efficiëntie van het protocol te maximaliseren.
4. Selectie van de getransfecteerde parasieten
- Controleer de parasitemieniveaus bij de muizen die zijn ingeënt met de getransfecteerde schizonten dagelijks vanaf 2 d.p.i. om de infectie te verifiëren.
- Zodra de infectie is geverifieerd, begint u met de selectie van geneesmiddelen met behulp van orale toediening van het geneesmiddel in drinkwater, ad libitum aangeboden.
OPMERKING: Pyrimethamine werd gebruikt als de selecteerbare geneesmiddelmarker voor het plasmide. In dit geval werd 17,5 mg pyrimethamine toegevoegd aan 250 ml schoon water (eindconcentratie van 70 mg/l). Bovendien werd 10 g suiker aan dit water toegevoegd om een adequate consumptie van het pyrimethaminehoudende water door muizen aan te moedigen. - Controleer parasitemie om de twee dagen met behulp van bloeduitstrijkjes gemaakt met 5 μl bloed, vanaf 6 dagen na de start van de behandeling met pyrimethamine. Het ontbreken van detecteerbare parasieten na 15 dagen duidt op een mislukte transfectie; Start in dit geval het proces opnieuw vanaf stap 1.1 voor een nieuwe poging.
- Wanneer parasitemie ten minste 1% bereikt, worden de parasieten overgebracht naar naïeve B6-muizen voor de aanmaak van parasieten in het bloedstadium. Ga door met de selectie in de nieuw geïnfecteerde muizen totdat parasitemie 2%-5% bereikt, waarna u voorraden genereerten ze cryopreserveert.
5. Infectie van muggen met de transgene lijnen
- Infecteer B6-muizen met 200 μL bloed dat de geselecteerde parasieten bevat (2 x 105 geïnfecteerde rode bloedcellen/muis, i.v.). Bepaal parasitemie bij deze muizen op de dag van muggenvoeding en infectie. Parasitemie tussen 2%-5% is optimaal voor de infectie van muggen. Eenmaal geverifieerd, breng de infectie onmiddellijk over op de vrouwelijke Anopheles stephensi-muggen volgens stap 5.2-5.4).
OPMERKING: Incubatoren die muggen voor infectie bevatten, moeten worden gehouden op 20.5 °C, op een luchtvochtigheid van 80% en op een licht/donker-cyclus van 12 uur (lichten aan tussen 07:00 uur en 19:00 uur). - Scheid de vrouwtjesmuggen de dag voor de muggeninfectie door een warmtebron bovenop de kooi te plaatsen met zowel mannelijke als vrouwelijke muggen, zoals een dunne plastic blaas of handschoen gevuld met water verwarmd tot 37 °C. Verwijder de vrouwelijke muggen, die worden aangetrokken door de warmtebron, met behulp van een insectenaspirator en breng deze over naar een aparte, kleinere kooi voor infectie.
OPMERKING: Mannelijke muggen kunnen worden onderscheiden van vrouwelijke muggen door hun iets kleinere lichaamsgrootte en pluimantennes. - Injecteer de geïnfecteerde muizen met een algemene verdoving (bijv. 2% tribroomethanol/avertin). Zorg voor volledige anesthesie door stevig in het voetkussen van elke muis te knijpen. Als ze niet reageren, zijn ze voldoende verdoofd en klaar om de infectie over te brengen op muggen.
- Plaats de verdoofde muizen bovenop de gekooide vrouwtjesmuggen (uit stap 5.2) onder sternale ligging. Spreid de voor- en achterpoten handmatig om het grootste oppervlak te bieden voor het voeden van muggen. Laat de geïnfecteerde muizen in totaal 15 minuten boven elke kooi staan en controleer elke 5 minuten of de muizen niet wakker zijn. Zodra het voeren is voltooid, euthanaseert u de muizen met behulp van cervicale dislocatie, of volgens het institutionele protocol voor diergebruik, en gooit u ze veilig weg.
6. Verzameling van sporozoïeten
- Controleer de middendarm van muggen op oöcysten bij ongeveer 10 d.p.i. om een succesvolle infectie en de ontwikkeling van Plasmodium in de muggen te verifiëren. Isoleer de middendarm van de mug van de buik door het terminale abdominale segment met een tang te verwijderen. Visualiseer de middendarm onder gepolariseerd licht op de aanwezigheid van oöcysten22.
- Wild-type sporozoïeten zullen naar verwachting aanwezig zijn in de speekselklieren van muggen 18-21 dagen na het voeden met geïnfecteerde muizen. Ontleed op dag 18 5-10 muggen om het aantal sporozoieten te beoordelen.
OPMERKING: Muggen worden gewassen en gedood in ethanol. Vervolgens worden dode muggen twee keer gewassen met PBS om puin te verwijderen voordat ze worden versneden. - Om de sporozoïeten te isoleren en te tellen, verwijdert u voorzichtig de kop van de mug terwijl u druk uitoefent op de thorax van de mug met een pincet of een fijne ontleednaald. De speekselklieren blijven vastzitten aan de verwijderde kop (Figuur 2).
- Verwijder eventueel extra muggenresten uit de speekselklieren en plaats deze in een microcentrifugebuisje met 400 μl muggendissectiemedia (Dulbecco's gemodificeerde Ealge-medium [DMEM] met 1% muizenserum, 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine; zie materiaaltabel).
- Verstoor de geïsoleerde speekselklieren door 15-20 keer door een injectiespuit van 30 G te gaan. Plaats 10 μL van de verstoorde speekselklieren in muggendissectiemedia in een hemocytometer en tel. Resuspenderen in de gewenste concentratie muggendissectiemedia of PBS voor injectie bij muizen, inoculatie in celculturen of cryopreservatie op lange termijn23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het bepalen van de frequentie en ontwikkeling van schizonten is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat voldoende levensvatbare parasieten zich in het optimale stadium voor transfectie bevinden. Onrijpe schizonten kunnen worden onderscheiden van volledig volwassen schizonten door de aanwezigheid van minder merozoïeten die niet de hele intracellulaire ruimte van de RBC vullen (Figuur 1B). Het is belangrijk op te merken dat bij het maken van bloeduitstrijkjes uit gekweekt bloed, geïnfecteerde rode bloedcellen kunnen openbreken, wat resulteert in de waarneming van vrije, extracellulaire merozoïeten in het bloeduitstrijkje (Figuur 1). Dergelijke merozoïeten tellen niet mee voor de beoordeling van de frequentie van schizonten in stap 2.5.
Het verwijderen van speekselklieren van muggen kan een uitdaging zijn als de gebruiker niet bekend is met de fysiologie van muggen of kleinschalige dissecties. Houd er tijdens de isolatie van speekselklieren van muggen rekening mee dat de doorschijnendheid van de klieren kan worden gebruikt om ze te onderscheiden van de ondoorzichtige muggenresten (Figuur 2). Het tellen van sporozoïeten na verstoring van de klieren is het meest efficiënt bij een vergroting van 400x, en het gebruik van fasecontrast zorgt voor een gemakkelijkere identificatie van de sporozoïeten in de telkamer.
We hebben aangetoond dat meer dan 90% van het Plasmodium in hepatocyten mogelijk wordt geëlimineerd via cel-intrinsieke immuunmechanismen23. Daarom verwachten we dat parasieten in een aanzienlijk aantal hepatocyten lysis ondergaan. Als hulpmiddel om de lysis van Plasmodium of zijn PV in de hepatocyten van de gastheer te bepalen, genereerden we transgene hepatocyten die de GFP 1-10-subeenheid tot expressie brengen (Hepa-GFP1-10) en transgene P. berghei die de GFP 11-subeenheid tot expressie brengen en transporteren naar zijn PV (Pb-GFP 11). Het GFP 1-10-fragment, dat de residuen bevat waaruit de GFP-chromofoor bestaat, is op zichzelf niet-fluorescerend en fluoresceert alleen bij associatie met GFP 11, mogelijk door zelfaanvulling. Naast het functioneel valideren van transgenese in Plasmodium, gaf het genereren van groen fluorescentiesignaal in de met Pb-GFP 11 geïnfecteerde Hepa-GFP 1-10-gastheercellen de lysis van de PV aan (Figuur 3). Wild-type P. berghei-geïnfecteerde Hepa-GFP 1-10-cellen of Pb-GFP11-geïnfecteerde wild-type Hepa 1-6-cellen genereerden geen groen fluorescentiesignaal (gegevens niet getoond). We beschouwen de lysis van de PV als een belangrijke voorafgaande stap in de vernietiging van leverstadium Plasmodium. De Pb-GFP11 sporozoïeten werden ook gekleurd met CTV om de parasieten in de hepatocyten zichtbaar te maken. Verwacht wordt dat CTV alleen in de gastheercel lekt na lysis van de parasiet zelf (Figuur 3). Het verspreide CTV-signaal dat in de hepatocyt van de gastheer wordt waargenomen, duidt waarschijnlijk op de lysis van de parasiet in de hepatocyt. De nauwe overlapping tussen de CTV- en GFP-signalen wordt verwacht met de gelijktijdige lysis van zowel de PV als de parasiet. Dit systeem stelt ons in staat om de verschillende bijdragen van de individuele gastheermoleculen in aangeboren en cel-intrinsieke immuunroutes te onderzoeken bij het moduleren van de lysis van Plasmodium of zijn PV.
Figuur 1: Plasmodium berghei schizonts. Representatieve lichtmicroscopiebeelden van P. berghei schizonts in geparasiteerde muizenbloedkweek (16 uur) gekleurd met Giemsa-kleuring. Pijlen duiden op volledig gerijpte (A) of onvolgroeide (B) schizonten. Schaal balken: 5 μm . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Speekselklieren en sporozoïeten van muggen. Lichtmicroscopiebeelden van speekselklieren geïsoleerd uit met Pb-GFP11 geïnfecteerde vrouwelijke Anopheles-muggen . (A) Afbeelding van een muggenkop met de speekselklieren (pijl) nog intact tijdens de dissectie, voorafgaand aan de verwijdering en verdere verwerking (schaalbalk: 1 mm). (B,C) Representatieve beelden van speekselklieren bij lagere (B) en hogere (C) vergrotingen (schaalbalken: respectievelijk 0,1 mm en 0,04 mm). Sporozoïeten zijn zowel binnen als buiten de klier te zien (pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Detectie van de lysis van Plasmodium en zijn parasitofore vacuole in hepatocyten van de gastheer. Differentieel interferentiecontrast (DIC) en pseudo-gekleurde immunofluorescentiebeelden met overlay met Hepa-GFP1-10 hepatocyten geïnfecteerd met Pb-GFP11 sporozoïeten. Sporozoïeten werden voorafgaand aan de infectie gekleurd met CTV (schaalbalk: 10 μm). In totaal werden 1 x 106 Hepa-GFP 1-10 hepatocyten geplateerd in een 35/10 mm kweekschaal met glazen bodem en 4 uur na het uitplateren geënt met 3 x 10 5PbGFP11 sporozoïeten. De beelden werden gemaakt met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een vergroting van 600x en 16 uur na infectie. Afkortingen: DIC = differentieel interferentiecontrast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben het bovenstaande protocol in ons laboratorium gebruikt om verschillende lijnen van transgene P. berghei-parasieten te maken. Hoewel geoptimaliseerd voor P. berghei, hebben we dit protocol ook met succes gebruikt om transgene P. yoelii-sporozoïeten te genereren. Na het injecteren van de getransfecteerde schizonten in muizen, zijn parasieten meestal niet later dan 3 d.p.i. detecteerbaar in alle groepen, inclusief de controle zonder plasmide. De selectie wordt pas gestart nadat parasitemie is gedetecteerd om de levensvatbaarheid van parasieten na elektroporatie te garanderen. Bovendien kan bij de voorbereiding van de selectie van geneesmiddelen verzuring van het water met zoutzuur, waardoor de pH tot 4 wordt verlaagd, nodig zijn om pyrimethamine volledig op te lossen. We verwachten volledige klaring van de parasieten van de controlegroep zonder plasmide, terwijl de muizen die met de transfectanten zijn ingeënt geïnfecteerd blijven. Klaring bij de controlemuizen treedt doorgaans 5-8 dagen na de start van de behandeling met pyrimethamine op. Merk op dat B6-muizen die zijn geïnfecteerd met P. berghei tekenen van experimentele cerebrale malaria kunnen vertonen en aan de dood kunnen bezwijken (volg humane eindpunten volgens de richtlijnen voor institutioneel gebruik van dieren), meestal in het interval van 6-12 d.p.i. Dit kan worden vermeden door medicijnselectie van de transfectanten uit te voeren in TCRaKO muizen25, of door de parasieten die selectie ondergaan bij 5 d.p.i. over te brengen naar nieuwe B6-ontvangers en de selectie in de laatste voort te zetten. Transgenese in Plasmodium kan worden geverifieerd met behulp van verschillende benaderingen, zoals genetische screenings, fenotypische beoordeling of winst of verlies van specifieke functies.
Het is belangrijk op te merken dat de selectie van een geschikt plasmide cruciaal is voor de succesvolle transfectie en retentie van het geïntroduceerde DNA in de parasiet. Plasmiden kunnen ook een beperkte werkzaamheid vertonen bij het bereiken van transgenese bij verschillende Plasmodium-soorten. Bijvoorbeeld het pSKspGFP11-plasmide (gebaseerd op PL0017; BEI-bronnen) die we hebben gebruikt om PbGFP11 te genereren, kunnen ook worden gebruikt om transgene P. yoelli efficiënt te genereren, maar niet P. chabaudi. Om pSKspGFP11 te genereren, hebben we de GFP-mutant3-sequentie in het ouderplasmide pL0017 (BEI-bronnen) vervangen door zeven tandemsequenties van de 11e β-streng van super-folder GFP, GFP 11 (GFP11-7X)18. Hoewel linearisatie van de plasmiden vóór transfectie een betere genomische integratie mogelijk maakt, vertonen zowel lineaire als circulaire plasmiden vergelijkbare transfectie-efficiëntie met behulp van ons protocol. De Plasmodium-lijnen die worden gegenereerd door transfectie met cirkelvormige plasmiden lijken ook hun transgene eigenschappen te behouden in de loop van de generatie van sporozoïeten in de muggen.
Met name kunnen alleen vrouwelijke muggen Plasmodium herbergen en overbrengen.Na de isolatie van muggen wordt aanbevolen om de geïsoleerde muggen in dit stadium geen bron van suikerwater te geven. Door ze op deze manier uit te hongeren, zou de kans groter worden dat mannelijke muggen die mogelijk per ongeluk zijn overgedragen, sterven en dat de vrouwtjes het bloed van de geïnfecteerde muizen efficiënter voeden. We geven het suikerwater meestal 1 dag na het overbrengen van de infectie van muizen naar muggen terug. Het is opmerkelijk dat het tijdsbestek voor de ontwikkeling en rijping van de sporozoiet bij muggen kan variëren tussen transgene Plasmodium-lijnen . Daarom is het belangrijk om het aantal sporozoieten in de speekselklieren op meerdere tijdstippen na infectie te beoordelen voordat een protocol wordt opgesteld dat specifiek is voor elke transgene lijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidie AI168307 aan SPK. We danken de UGA CTEGD Flow Cytometry Core en de UGA CTEGD Microscopy Core. We erkennen ook de bijdragen van Ash Pathak, Anne Elliot en het personeel van UGA Sporocore bij het optimaliseren van het protocol. We willen Dr. Daichi Kamiyama bedanken voor waardevolle inzichten, discussie en de ouderplasmiden die GFP11 en GFP 1-10 bevatten. We willen ook de leden van het Kurup-lab bedanken voor hun constante steun, geduld en aanmoediging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II - Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
References
- WHO.
- Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K.
- Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
- Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P.
- Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
- Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
- Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
- Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
- Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
- Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
- Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
- Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
- Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
- Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
- Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
- Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
- de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
- Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
- Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
- Bowers, C., et al.
- Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).
