Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering af genetisk modificerede Plasmodium berghei sporozoitter

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64992
Automatic Translation
1, 1,2
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

Summary

Malaria overføres gennem podning af sporozoitstadiet af Plasmodium af inficerede myg. Transgen Plasmodium har gjort det muligt for os at forstå malariaens biologi bedre og har bidraget direkte til udviklingen af malariavacciner. Her beskriver vi en strømlinet metode til at generere transgene Plasmodium berghei sporozoitter.

Abstract

Malaria er en dødelig sygdom forårsaget af parasitten Plasmodium og overføres gennem bid af kvindelige Anopheles myg. Det sporozoitiske stadium af Plasmodium deponeret af myg i huden hos hvirveldyrværter gennemgår en fase med obligatorisk udvikling i leveren, inden klinisk malaria påbegyndes. Vi ved lidt om biologien bag Plasmodiums udvikling i leveren; adgang til sporozoitstadiet og evnen til genetisk modifikation af sådanne sporozoitter er kritiske værktøjer til at studere arten af Plasmodium-infektion og det resulterende immunrespons i leveren. Her præsenterer vi en omfattende protokol til generering af transgene Plasmodium berghei sporozoitter. Vi genetisk modificerer blodstadiet P. berghei og bruger denne form til at inficere Anopheles myg, når de tager et blodmåltid. Efter at de transgene parasitter har gennemgået udvikling i myggene, isolerer vi parasittens sporozoitstadium fra myggens spytkirtler til in vivo - og in vitro-forsøg . Vi demonstrerer protokollens gyldighed ved at generere sporozoitter af en ny stamme af P. berghei , der udtrykker det grønne fluorescerende protein (GFP) underenhed 11 (GFP11), og viser, hvordan det kan bruges til at undersøge biologien bag malaria i leverstadiet.

Introduction

På trods af fremskridt inden for lægemiddeludvikling og forskning i malariaforebyggelse og -behandling er den globale sygdomsbyrde ved malaria fortsat høj. Over en halv million mennesker dør af malaria hvert år, med de højeste niveauer af dødelighed set blandt børn, der bor i malaria-endemiske regioner, såsom Afrika syd for Sahara1. Malaria er forårsaget af parasitten Plasmodium, som overføres til mennesker gennem bid af kvindelige Anopheles myg, der bærer parasitten i deres spytkirtler. Det infektiøse stadium af Plasmodium - sporozoitterne - deponeres i hvirveldyrværternes hud under et blodmåltid og rejser gennem blodbanen for at inficere leverceller, hvor de gennemgår obligatorisk udvikling (udgør præerythrocytisk malaria) inden infektion af erytrocytterne. Infektionen af erytrocytterne initierer malariaens blodstadium og er ansvarlig for hele sygeligheden og dødeligheden forbundet med sygdommen 2,3.

Den obligatoriske karakter af den præerythrocytiske udvikling af Plasmodium har gjort det til et attraktivt mål for profylaktisk vaccine- og lægemiddeludviklingsindsats4. En forudsætning for at studere biologien af præerythrocytisk malaria samt udviklingen af vacciner eller lægemidler rettet mod leverstadiet er adgang til Plasmodium sporozoitter. Desuden har vores evne til at generere genetisk modificerede Plasmodium sporozoitter været medvirkende til succesen med sådanne forskningsbestræbelser 5,6,7,8,9. Transgene Plasmodium-linjer, der udtrykker fluorescerende eller selvlysende reporterproteiner, har gjort det muligt for os at spore deres udvikling in vivo og in vitro10,11. Genetisk svækkede parasitter (GAPs), genereret ved sletning af flere gener i Plasmodium, er også nogle af de mest lovende vaccinekandidater12,13.

Malariamodeller for gnavere og ikke-menneskelige primater har hjulpet os med at forstå mekanismerne for værtsparasitinteraktioner i human malaria på grund af lighederne i biologi og livscyklus blandt Plasmodium-arter 14. Brugen af Plasmodium-arter, der inficerer gnavere, men ikke mennesker (f.eks. P. berghei), tillader opretholdelse af den komplette parasitlivscyklus og generering af infektiøse sporozoitter til undersøgelse af malaria i leverstadiet i en kontrolleret biosikkerhedsniveau 1-indstilling. Der findes allerede en række separate protokoller til generering af transgene blodstadiet Plasmodium-parasitter 15, infektion af myg16 og isolering af sporozoitter17. Her skitserer vi en omfattende protokol, der kombinerer disse metoder for at generere og isolere transgene P. berghei-sporozoitter ved hjælp af den nye transgene stamme PbGFP11 som et eksempel. PbGFP 11 smugler den 11. β-streng af supermappegrønt fluorescerende protein (GFP), GFP11, ind i den parasitoforøse vakuol (PV), der genereres i værtshepatocytterne. PbGFP 11 anvendes sammen med transgene hepatocytter (Hepa1-6 baggrund), der udtrykker rester, der udgør GFP 1-10-fragmentet (GFP 1-10) i cytoplasmaet (Hepa GFP 1-10 celler). PbGFP11 rapporterer PV-lyse i værtshepatocytterne gennem selvkomplementarisering og reformation af funktionel GFP og det grønne fluorescenssignal18. Bemærk, at GFP 11 er kodet som en serie på syv tandemsekvenser i PbGFP11 for at forbedre det resulterende fluorescenssignal. Ved farvning af PbGFP11 sporozoitter med det cytoplasmatiske farvestof CellTrace Violet (CTV) kan vi spore parasitterne. Lysen af sådanne CTV-farvede intracellulære parasitter resulterer i sig selv i lækage af CTV i værtscellecytoplasmaet og farvning af værtscellen. Ud over at visualisere og skelne lysis af Plasmodium PV og / eller parasitten i værtshepatocytter kan dette system pålideligt bruges til at studere immunveje, der er ansvarlige for en af disse processer, gennem den genetiske eller terapeutiske forstyrrelse af de molekylære komponenter i sådanne veje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Al forskning, der involverer hvirveldyr i vores laboratorium, blev udført i overensstemmelse med University of Georgias retningslinjer og protokoller for dyrebrug.

1. Generering af P. berghei-inficerede mus

  1. Start infektion i blodstadiet hos han- eller hunmus, 6-8 uger gamle C57BL/6 (B6) ved hjælp af vildtype P. berghei-parasitter. For at gøre dette overføres kryopræserveret P. berghei-inficeret blod (2 x 105 inficerede RBC'er), rekonstitueret i 400 μL fosfatbufret saltvand (PBS), til en eller to donormus intraperitonealt (i.p.).
  2. Overfør frisk blod indsamlet gennem retroorbital blødning fra donormusene 5 dage efter infektion (d.p.i.) til to naive B6-mus. For at gøre dette skal du indsamle 200 μL blod, rekonstituere med 300 μL PBS og injicere 200 μL i.p. i modtagermusene. Sørg for, at parasitæmien hos donorerne på dette tidspunkt er 2% -5% 19,20.
  3. Overvåg parasitæmi som tidligere beskrevet19,20, startende fra 2 d.p.i. hos modtagerne. Når parasitæmi varierer fra 3% -5% (ca. 5 d.p.i.), aflive modtagermusene og derefter indsamle blod gennem hjertepunktur eller retro-orbital blødning. Aflive musene ved hjælp af kuldioxidindånding efterfulgt af cervikal dislokation eller i henhold til institutionelle retningslinjer.
    BEMÆRK: Når parasitæmi overstiger 5%, kan transfektionseffektiviteten reduceres på grund af den øgede forekomst af multiplicere inficerede RBC'er.

2. Generering af skizonter i kultur

  1. Opsaml blod fra de inficerede mus i trin 1.3 (ca. 2 ml i alt fra to mus) i 5 ml Alsevers opløsning (se materialetabel) i et sterilt miljø. Udfør trin 2.1 til 3.12 under sterile forhold.
    BEMÆRK: Sterile forhold omfatter brug af handsker, aftørring af handsker og overflader med 70% ethanol, anvendelse af sterile forbrugsstoffer og materialer og arbejde i et biosikkerhedsskab.
  2. Centrifuger blodet i 8 minutter ved 450 x g ved stuetemperatur (RT). Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 10 ml komplet RPMI-medie (RPMI 1640 med 20 % føtalt bovint serum [FBS] og 1 % penicillin-streptomycin, v/v).
  3. Der centrifugeres i 8 minutter ved 450 x g ved RT. Pelletsen resuspenderes i 25 ml komplet RPMI-medie og overføres til en T75-dyrkningskolbe med filterdæksel.
  4. Anbring i en inkubator ved 36,5 °C og 5% CO2, mens du forsigtigt ryster for at holde cellerne i suspension i 16 timer.
  5. På tidspunktet på 16 timer skal du kontrollere for schizont-udvikling. For at gøre dette skal du samle 500 μL af prøven, centrifugere ved 450 x g i 8 minutter, resuspendere pelleten i 10 μL komplet RPMI-medie og forberede et tyndt blodudstrygning. Plet blodudstrygningen med Giemsa-plet19 (se materialetabel) og bestem hyppigheden af skizonter (figur 1).
  6. For optimal transfektionseffektivitet bør 60% -70% af parasitterne være i skizontstadiet. Hvis der er fastsat færre end denne tærskel, skal du fortsætte dyrkningen som i trin 2.4 og kontrollere hver time for at sikre, at ovennævnte tærskel overskrides, før du fortsætter.

3. Transfektion af Plasmodium schizonts

  1. Der fremstilles en gradientcentrifugeringsbuffer ved at rekonstituere 13 ml stamsubstrat med densitetsgradient (se materialetabel) med 1,44 ml 1,5 M NaCl og 5,6 ml 0,15 M NaCl i et 50 ml centrifugeringsrør.
  2. Overfør 25 ml bloddyrkning til et frisk 50 ml centrifugeringsrør. Læg forsigtigt 20 ml gradientcentrifugeringsbuffer i bunden af centrifugeringsrøret ved hjælp af en smal glaspipette for at skabe en gradientsøjle. Pas på ikke at forstyrre væskelagene og grænsefladerne, og sørg for en klar opdeling mellem bufferen og mediet.
  3. Centrifuger i 20 minutter ved 450 x g uden bremse ved RT. Brug en Pasteur-pipette til forsigtigt at fjerne skizontlag15 , der er placeret ved grænsefladen mellem kulturmediet og gradientcentrifugeringsbufferen, og anbring det i et nyt 50 ml centrifugeringsrør.
  4. Resuspender de isolerede schizonts i komplette RPMI-medier, og bring det samlede volumen op til 40 ml. Der centrifugeres ved 450 x g i 8 minutter ved RT, og supernatanten kasseres.
  5. Resuspender skizonterne i 10 ml komplette RPMI-medier. Overfør derefter 1 ml af denne opløsning til et 1,5 ml mikrocentrifugerør for hver transfektion, og centrifuger ved 16.000 x g i 5 s for at pelletere de inficerede RBC'er. De inficerede RBC'er afledt af to mus på ovennævnte måde kan bruges til op til 10 separate transfektioner.
  6. Der kombineres 100 μL elektroporationsbuffer (nukleofektoropløsning fra elektroporationssættet; se materialetabel) ved RT med 5 μg cirkulært eller lineært målplasmid-DNA (i op til maksimalt 10 μL volumen), alt efter hvad der er relevant for hver transfektion i separate 1,5 ml mikrocentrifugeglas. En "ingen plasmid" prøve skal indgå som en kontrol for transfektion og antibiotikavalg.
  7. Efter centrifugering fjernes supernatanten fra trin 3.5, og de inficerede RBC'er resuspenderes forsigtigt i den fremstillede nukleofektoropløsning + plasmid-DNA (fra trin 3.6).
  8. Suspensionen (nukleofektoropløsning + plasmid + skizonter; maksimalt 110 μL) overføres til elektroporationskuvetter. Transfekt ved hjælp af et passende nukleofektorprogram (U-033, se materialetabel).
    BEMÆRK: Sørg for, at trin 3.8 til 3.10 udføres på RT.
  9. Tilsæt 100 μL komplet RPMI-medie til kuvetten, og overfør hele opløsningen (nu 200 μL totalvolumen) til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og hold ved RT.
  10. Injicer 200 μL opløsningen af transfekterede parasitter i mus intravenøst (i.v.), idet du arbejder for at minimere tiden mellem transfektion og den endelige injektion i mus.
    BEMÆRK: Transfekterede skizonter injiceres i mus mindre end 5 minutter efter elektroporation for at maksimere protokollens effektivitet.

4. Udvælgelse af de transfekterede parasitter

  1. Kontroller parasitæminiveauerne hos musene podet med de transfekterede skizonter dagligt fra 2 dpi for at verificere infektionen.
  2. Når infektionen er verificeret, skal du starte lægemiddelvalg ved oral administration af lægemidlet i drikkevand, der tilbydes ad libitum.
    BEMÆRK: Pyrimethamin blev anvendt som den valgbare lægemiddelmarkør for plasmidet. I dette tilfælde blev 17,5 mg pyrimethamin tilsat til 250 ml rent vand (slutkoncentration på 70 mg / l). Derudover blev der tilsat 10 g sukker til dette vand for at tilskynde til tilstrækkeligt forbrug af pyrimethaminholdigt vand hos mus.
  3. Overvåg parasitæmi hver anden dag ved hjælp af blodudstrygninger lavet med 5 μl blod, startende fra 6 dage efter initiering af pyrimethaminbehandling. Manglen på påviselige parasitter efter 15 dage indikerer en mislykket transfektion; I dette tilfælde skal du genstarte processen fra trin 1.1 for et nyt forsøg.
  4. Når parasitæmi når mindst 1%, overføres parasitterne til naive B6-mus til oprettelse af parasitbestande i blodstadiet. Fortsæt selektion i de nyligt inficerede mus, indtil parasitæmi når 2% -5%, hvorefter generere lagre og kryopræservere dem21.

5. Infektion af myg med de transgene linjer

  1. Inficere B6-mus med 200 μL blod indeholdende de udvalgte parasitter (2 x 105 inficerede RBC'er/mus, i.v.). Bestem parasitæmi hos disse mus på dagen for mygfodring og infektion. Parasitæmi mellem 2% -5% er optimal til infektion af myg. Når det er verificeret, skal du straks overføre infektionen til de kvindelige Anopheles stephensi myg i henhold til trin 5.2-5.4).
    BEMÆRK: Inkubatorer, der indeholder myg til infektion, bør opretholdes ved 20,5 ° C, ved 80% fugtighed og på en 12 timers lys / mørk cyklus (lys tændt mellem 07:00 og 07:00).
  2. Dagen før myggeinfektion adskilles hunmyggene ved at placere en varmekilde oven på buret, der indeholder både han- og hunmyg, såsom en tynd plastblære eller handske fyldt med vand opvarmet til 37 °C. Fjern de kvindelige myg, der tiltrækkes af varmekilden, ved hjælp af en insektaspirator og overfør disse til et separat, mindre bur til infektion.
    BEMÆRK: Mandlige myg kan skelnes fra kvindelige myg ved deres lidt reducerede kropsstørrelse og plumose antenner.
  3. Injicer de inficerede mus med en generel bedøvelse (f.eks. 2% tribromethanol / avertin). Sørg for fuldstændig bedøvelse ved at klemme fodpuden på hver mus fast. Hvis de ikke reagerer, er de tilstrækkeligt bedøvede og klar til at overføre infektionen til myg.
  4. Placer de bedøvede mus oven på de burede kvindelige myg (fra trin 5.2) under brystliggende. Spred manuelt for- og bagbenene for at give det største overfladeareal til mygfodring. Lad de inficerede mus ligge over hvert bur i alt 15 minutter, kontroller hvert 5. minut for at sikre, at musene ikke er vågne. Når fodringen er færdig, skal du aflive musene ved hjælp af cervikal dislokation eller i henhold til den institutionelle dyrebrugsprotokol og bortskaffe dem sikkert.

6. Indsamling af sporozoitter

  1. Kontroller myggemidguts for oocyster ved ca. 10 d.p.i. for at verificere vellykket infektion og udviklingen af Plasmodium i myggene. Isoler myg midguts fra maven ved at fjerne det terminale abdominale segment ved hjælp af tang. Visualiser midguts under polariseret lys for tilstedeværelsen af oocyster22.
  2. Vildtype sporozoitter forventes at være til stede i myggenes spytkirtler 18-21 dage efter fodring på inficerede mus. På dag 18 dissekeres 5-10 myg for at vurdere sporozoitantal.
    BEMÆRK: Myg vaskes og dræbes i ethanol. Derefter vaskes døde myg to gange med PBS for at fjerne snavs inden dissektion.
  3. For at isolere og tælle sporozoitterne skal du forsigtigt fjerne myggens hoved, mens du lægger pres på myggens thorax ved hjælp af tang eller en fin dissekeringsnål. Spytkirtlerne forbliver fastgjort til det fjernede hoved (figur 2).
  4. Fjern eventuelle yderligere mygrester fra spytkirtlerne og læg dem i et mikrocentrifugerør indeholdende 400 μL myggedissektionsmedier (Dulbeccos modificerede Ealge-medium [DMEM] med 1% museserum, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin; se materialetabel).
  5. De isolerede spytkirtler forstyrres ved at passere gennem en 30 G nålesprøjt 15-20 gange. Anbring 10 μL af de forstyrrede spytkirtler i mygdissektionsmedier i et hæmocytometer og tæl. Resuspender i den ønskede koncentration af myggedissektionsmedier eller PBS til injektion i mus, podning i cellekulturer eller langtidskryopræservering23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bestemmelse af hyppigheden og udviklingen af schizonts er afgørende for at sikre, at nok levedygtige parasitter er i det optimale stadium til transfektion. Umodne skizonter kan differentieres fra fuldt modne schizonts ved tilstedeværelsen af færre merozoitter, der ikke fylder hele RBC's intracellulære rum (figur 1B). Det er vigtigt at bemærke, at når der foretages blodudstrygninger fra dyrket blod, kan inficerede RBC'er bryde op, hvilket resulterer i observation af frie, ekstracellulære merozoitter i blodudstrygningen (figur 1). Sådanne merozoitter tæller ikke med i vurderingen af hyppigheden af skizonter i trin 2.5.

Fjernelse af spytkirtler fra myg kan være udfordrende, hvis brugeren ikke er bekendt med mygfysiologi eller små dissektioner. Under isolering af spytkirtler fra myg skal du bemærke, at kirtlernes gennemskinnelighed kan bruges til at differentiere dem fra det uigennemsigtige mygaffald (figur 2). Tællingen af sporozoitter efter forstyrrelse af kirtlerne er mest effektiv ved 400x forstørrelse, og brugen af fasekontrast giver mulighed for lettere identifikation af sporozoitterne i tællekammeret.

Vi har vist, at over 90% af Plasmodium i hepatocytter muligvis elimineres gennem celle-iboende immunmekanismer23. Derfor forventer vi, at parasitter i et betydeligt antal hepatocytter gennemgår lysis. Som et værktøj til at bestemme lysen af Plasmodium eller dets PV i værtshepatocytterne genererede vi transgene hepatocytter, der udtrykte GFP 1-10-underenheden (Hepa-GFP1-10) og transgen P. berghei, der udtrykte og handlede GFP 11-underenheden til dens PV (Pb-GFP 11). GFP 1-10-fragmentet, som indeholder resterne, der udgør GFP-kromoforen, er ikke-fluorescerende i sig selv og fluorescerer kun ved tilknytning til GFP 11, potentielt gennem selvkomplementaritet. Ud over funktionelt validerende transgenese i Plasmodium indikerede genereringen af grønt fluorescenssignal i Pb-GFP11-inficerede Hepa-GFP 1-10-værtsceller lysen af PV (figur 3). Wild-type P. berghei-inficerede Hepa-GFP 1-10 celler eller Pb-GFP11-inficerede wild-type Hepa 1-6 celler kunne ikke generere noget grønt fluorescenssignal (data ikke vist). Vi anser lysering af PV for at være et vigtigt forudgående trin i ødelæggelsen af leverstadiet Plasmodium. Pb-GFP11 sporozoitterne blev også farvet med CTV for at visualisere parasitterne i hepatocytterne. CTV forventes først at lække ind i værtscellen ved lysis af selve parasitten (figur 3). Det dispergerede CTV-signal, der observeres i værtshepatocytten, indikerer sandsynligvis lysen af parasitten i hepatocytten. Den tætte overlapning mellem CTV- og GFP-signalerne forventes med samtidig lysering af både PV og parasitten. Dette system giver os mulighed for at forespørge de forskellige bidrag fra de enkelte værtsmolekyler i medfødte og celle-iboende immunveje i modulering af lysen af Plasmodium eller dets PV.

Figure 1
Figur 1: Plasmodium berghei skizonts. Repræsentative lysmikroskopibilleder, der viser P. berghei-skizonts i parasiteret museblodkultur (16 timer) farvet med Giemsa-plet. Pile angiver fuldt modne (A) eller umodne (B) skizonter. Skalastænger: 5 μm . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Myggespytkirtler og sporozoitter. Lysmikroskopibilleder, der viser spytkirtler isoleret fra Pb-GFP11-inficerede kvindelige Anopheles-myg . (A) Billede af et myggehoved med spytkirtlerne (pilen) stadig intakte under dissektionen, før det fjernes og viderebehandles (skalabjælke: 1 mm). (B,C) Repræsentative billeder af spytkirtler ved lavere (B) og højere (C) forstørrelser (skalastænger: henholdsvis 0,1 mm og 0,04 mm). Sporozoitter kan ses både inden for og uden for kirtlen (pil). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Påvisning af lysis af Plasmodium og dets parasitofore vakuol i værtshepatocytter. Differentiel interferenskontrast (DIC) og pseudofarvede immunfluorescensbilleder med overlay, der viser Hepa-GFP1-10 hepatocytter inficeret med Pb-GFP11 sporozoitter. Sporozoitter blev farvet med CTV før infektionen (skalabjælke: 10 μm). I alt 1 x 106 Hepa-GFP 1-10 hepatocytter blev belagt i en 35/10 mm glasbundet kulturskål og podet med 3 x 10 5PbGFP11 sporozoitter 4 timer efter plettering. Billeder blev taget med et omvendt fluorescerende mikroskop ved 600x forstørrelse og 16 timer efter infektion. Forkortelser: DIC = differentiel interferenskontrast. Klik her for at se en større version af denne figur. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har brugt ovenstående protokol i vores laboratorium til at skabe flere linjer af transgene P. berghei parasitter. Selvom optimeret til P. berghei, har vi også med succes brugt denne protokol til at generere transgene P. yoelii sporozoitter. Efter injektion af de transfekterede skizonter i mus kan parasitter påvises typisk senest 3 d.p.i. i alle grupper, herunder ingen plasmidkontrol. Selektion påbegyndes først, når parasitæmi er blevet påvist for at sikre parasitternes levedygtighed efter elektroporation. Derudover kan det ved forberedelse til lægemiddelvalg være nødvendigt at forsure vandet med saltsyre, hvilket bringer pH ned til 4, for at pyrimethamin opløses fuldt ud. Vi forventer fuldstændig clearance af parasitterne fra kontrolgruppen uden plasmid, mens musene podet med transfektanterne forbliver inficerede. Clearance hos kontrolmusene sker typisk 5-8 dage efter initiering af pyrimethaminbehandling. Det skal bemærkes, at B6-mus inficeret med P. berghei kan vise tegn på eksperimentel cerebral malaria og bukke under for døden (følg humane endepunkter i henhold til institutionelle retningslinjer for brug af dyr), typisk i intervallet 6-12 d.p.i. Dette kan undgås ved at udføre lægemiddelselektion af transfektanterne i TCRaKO-mus25 eller ved at overføre parasitterne, der gennemgår selektion ved 5 d.p.i., til nye B6-modtagere og fortsætte selektion i sidstnævnte. Transgenese i Plasmodium kan verificeres ved hjælp af en række forskellige tilgange, såsom genetiske screeninger, fænotypisk vurdering eller gevinst eller tab af specifikke funktioner.

Det er vigtigt at bemærke, at udvælgelsen af et passende plasmid er afgørende for en vellykket transfektion og tilbageholdelse af det indførte DNA i parasitten. Plasmider kan også vise begrænset effektivitet til at opnå transgenese på tværs af forskellige Plasmodium-arter. For eksempel pSKspGFP11-plasmidet (baseret på PL0017; BEI-ressourcer), vi brugte til at generere PbGFP11, kan også bruges til effektivt at generere transgene P. yoelli, men ikke P. chabaudi. For at generere pSKspGFP11 erstattede vi GFP-mutant3-sekvensen i det overordnede pL0017-plasmid (BEI-ressourcer) med syv tandemsekvenser af den 11. β-streng af supermappe GFP, GFP 11 (GFP11-7X)18. Selvom linearisering af plasmiderne før transfektion tillader bedre genomisk integration, viser både lineære og cirkulære plasmider lignende transfektionseffektivitet ved hjælp af vores protokol. Plasmodiumlinjerne genereret ved transfektion med cirkulære plasmider synes også at opretholde deres transgene egenskaber i løbet af dannelsen af sporozoitter i myggene.

Især kan kun kvindelige myg huse og overføre Plasmodium. Efter isolering af myg anbefales det ikke at give de isolerede myg en kilde til sukkervand på dette stadium. Sult dem på denne måde ville øge chancen for, at eventuelle mandlige myg, der kan være blevet utilsigtet overført, dør, og hunnerne fodrer blodet mere effektivt fra de inficerede mus. Vi returnerer typisk sukkervandet 1 dag efter overførsel af infektionen fra mus til myg. Det er bemærkelsesværdigt, at tidsrammen for udvikling og modning af sporozoitten i myg kan variere mellem transgene Plasmodium-linjer . Derfor er det vigtigt at vurdere sporozoitantallet i spytkirtlerne på flere tidspunkter efter infektion, før der etableres en protokol, der er specifik for hver transgen linje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-tilskuddet AI168307 til SPK.  Vi takker UGA CTEGD Flow Cytometry Core og UGA CTEGD Microscopy Core. Vi anerkender også bidragene fra Ash Pathak, Anne Elliot og personalet i UGA Sporocore i optimeringen af protokollen. Vi vil gerne takke Dr. Daichi Kamiyama for værdifuld indsigt, diskussion og de overordnede plasmider, der indeholder GFP11 og GFP 1-10. Vi vil også gerne takke medlemmer af Kurup-laboratoriet for deres konstante støtte, tålmodighed og opmuntring.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 G x 1/2" Syringe needle Exel international 26437
Alsever's solution Sigma-Aldritch A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 Lonza VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) TCI America T1420
Blood collection tubes BD bioscience 365967 for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer INCYTO DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish Greiner Bio-One 627860
Centrifuge 5425 Eppendorf 5405000107
Centrifuge 5910R Eppendorf 5910R For gradient centrifugation
Delta Vision II - Inverted microscope system Olympus IX-71
Dimethyl Sulfoxide Sigma D5879-500ml
Fetal bovine serum GenClone 25-525
GFP11 plasmid Kurup Lab pSKspGFP11 Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain Sigma-Aldritch 48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells Kurup Lab Hepa GFP1-10 Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum Used for mosquito dissection media
NaCl Millipore-Sigma SX0420-5 1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II Amaxa Biosystems (Lonza) Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette VWR 14673-043
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldritch P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium) Cytivia 17-0891-02 Details in protocol
PL0017 Plasmid BEI Resources MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration) Sigma 46706 Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640 Corning 15-040-CV
SoftWoRx microscopy software Applied Precision v6.1.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Geneva. World Health Organization. , 1 (2020).
  2. Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
  3. Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
  4. Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. Pre-erythrocytic vaccines against malaria. Vaccines. 8 (3), 400 (2020).
  5. Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
  6. Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
  7. Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
  8. Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
  9. Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
  10. Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
  11. Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
  12. Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
  13. Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
  14. Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
  15. Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
  16. Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
  17. Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
  18. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  19. Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
  20. Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
  21. de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
  22. Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
  23. Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
  24. Bowers, C., et al. Cryopreservation of Plasmodium sporozoites. Pathogens. 11 (12), 1487 (2022).
  25. Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).

Tags

Genetisk modificerede Plasmodium berghei sporozoitter malaria parasit plasmodium Anopheles myg lever-stadium udvikling klinisk malaria immunrespons transgene parasitter blod-stadium P. berghei myg spytkirtler in vivo eksperimenter in vitro eksperimenter grøn fluorescerende protein (GFP) lever-stadium malaria
Generering af genetisk modificerede <em>Plasmodium berghei</em> sporozoitter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bowers, C., Kurup, S. P. Generating… More

Bowers, C., Kurup, S. P. Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites. J. Vis. Exp. (195), e64992, doi:10.3791/64992 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter