Summary
Sıtma, enfekte sivrisinekler tarafından Plasmodium'un sporozoit aşamasının aşılanması yoluyla bulaşır. Transgenik Plazmodyum , sıtmanın biyolojisini daha iyi anlamamızı sağladı ve sıtma aşısı geliştirme çabalarına doğrudan katkıda bulundu. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitleri üretmek için aerodinamik bir metodolojiyi açıklıyoruz.
Abstract
Sıtma, parazit Plasmodium'un neden olduğu ölümcül bir hastalıktır ve dişi Anofel sivrisineklerinin ısırması yoluyla bulaşır. Omurgalı konakçıların derisinde sivrisinekler tarafından biriktirilen Plasmodium'un sporozoit aşaması, klinik sıtmaya başlamadan önce karaciğerde zorunlu bir gelişim aşamasına girer. Karaciğerdeki Plasmodium gelişiminin biyolojisi hakkında çok az şey biliyoruz; sporozoit aşamasına erişim ve bu tür sporozoitleri genetik olarak değiştirme yeteneği, Plasmodium enfeksiyonunun doğasını ve karaciğerde ortaya çıkan bağışıklık tepkisini incelemek için kritik araçlardır. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitlerinin üretimi için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Kan evresi P. berghei'yi genetik olarak değiştiriyoruz ve bu formu kan yemeği aldıklarında Anofel sivrisineklerini enfekte etmek için kullanıyoruz. Transgenik parazitler sivrisineklerde geliştikten sonra, in vivo ve in vitro deneyler için parazitin sporozoit aşamasını sivrisinek tükürük bezlerinden izole ediyoruz. Yeşil floresan protein (GFP) alt birimi 11'i (GFP11) eksprese eden yeni bir P. berghei suşunun sporozoitlerini üreterek protokolün geçerliliğini gösteriyoruz ve karaciğer evresi sıtmanın biyolojisini araştırmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Introduction
İlaç geliştirme ve sıtmanın önlenmesi ve tedavisine yönelik araştırmalardaki ilerlemelere rağmen, sıtmanın küresel hastalık yükü yüksek olmaya devam etmektedir. Her yıl yarım milyondan fazla insan sıtmadan ölüyor ve en yüksek ölüm oranları Sahra altı Afrika gibi sıtmanın endemik olduğu bölgelerde yaşayan çocuklar arasında görülüyor1. Sıtmaya, paraziti tükürük bezlerinde taşıyan dişi Anofel sivrisineklerinin ısırması yoluyla insanlara bulaşan parazit Plasmodium neden olur. Plasmodium'un enfeksiyöz aşaması - sporozoitler - bir kan yemeği sırasında omurgalı konakçıların derisinde birikir ve eritrositleri enfekte etmeden önce zorunlu gelişime (eritrosit öncesi sıtma oluşturan) maruz kaldıkları karaciğer hücrelerini enfekte etmek için kan dolaşımından geçer. Eritrositlerin enfeksiyonu sıtmanın kan evresini başlatır ve hastalıkla ilişkili morbidite ve mortalitenin tamamından sorumludur 2,3.
Plasmodium'un eritrositik gelişiminin zorunlu doğası, onu profilaktik aşı ve ilaç geliştirme çabaları için çekici bir hedef haline getirmiştir4. Pre-eritrositik sıtmanın biyolojisinin yanı sıra karaciğer evresini hedef alan aşıların veya ilaçların geliştirilmesini incelemek için bir ön koşul, Plasmodium sporozoitlerine erişimdir. Ayrıca, genetiği değiştirilmiş Plasmodium sporozoitleri üretme yeteneğimiz, bu tür araştırma çabalarının başarısında etkili olmuştur 5,6,7,8,9. Floresan veya ışıldayan raportör proteinleri eksprese eden Transgenik Plazmodyum hatları, gelişimlerini in vivo ve in vitro olarak izlememize izin verdi 10,11. Plasmodium'daki çoklu genlerin silinmesi yoluyla üretilen genetik olarak zayıflatılmış parazitler (GAP'ler) de en umut verici aşı adaylarından bazılarıdır12,13.
Kemirgen ve insan olmayan primat sıtma modelleri, Plasmodium türleri arasındaki biyoloji ve yaşam döngüsündeki benzerlikler nedeniyle insan sıtmasında konak-parazit etkileşimlerinin mekanizmalarını anlamamıza yardımcı olmuştur14. Kemirgenleri enfekte eden, ancak insanları enfekte etmeyen Plasmodium türlerinin (örneğin, P. berghei) kullanımı, tüm parazit yaşam döngüsünün sürdürülmesine ve kontrollü, biyogüvenlik seviyesi 1 ortamında karaciğer evresi sıtmanın incelenmesi için enfeksiyöz sporozoitlerin üretilmesine izin verir. Transgenik kan evresi Plasmodium parazitlerinin15, sivrisineklerin16 enfeksiyonu ve sporozoitlerin17 izolasyonu için çeşitli ayrı protokoller zaten mevcuttur. Burada, örnek olarak yeni transgenik suş PbGFP11'i kullanarak, transgenik P. berghei sporozoitlerini üretmek ve izole etmek için bu metodolojileri birleştiren kapsamlı bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz. PbGFP 11, süper klasör yeşil floresan proteinin (GFP) 11. β iplikçiğini, GFP11'i, konakçı hepatositlerde üretilen parazitoforöz vakuole (PV) aktarır. PbGFP 11, sitoplazmada (Hepa GFP 1-10 hücreleri) GFP 1-10 fragmanını (GFP 1-10) oluşturan kalıntıları eksprese eden transgenik hepatositler (Hepa1-6 arka planı) ile birlikte kullanılır. PbGFP11, kendi kendini tamamlama ve fonksiyonel GFP ve yeşil floresan sinyalinin18 yeniden oluşturulması yoluyla konakçı hepatositlerde PV lizizini bildirir. GFP 11'in, ortaya çıkan floresan sinyalini geliştirmek için PbGFP11'de yedi tandem dizisinden oluşan bir dizi olarak kodlandığını unutmayın. PbGFP11 sporozoitlerini sitoplazmik boya CellTrace Violet (CTV) ile boyadıktan sonra parazitleri izleyebiliriz. Bu tür CTV ile boyanmış hücre içi parazitlerin parçalanması, CTV'nin konak hücre sitoplazmasına sızmasına ve konak hücrenin boyanmasına neden olur. Plasmodium PV ve/veya konakçı hepatositlerdeki parazitin parçalanmasını görselleştirmeye ve ayırt etmeye ek olarak, bu sistem, bu yolların moleküler bileşenlerinin genetik veya terapötik bozulması yoluyla, bu süreçlerden herhangi birinden sorumlu bağışıklık yollarını incelemek için güvenilir bir şekilde kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Laboratuvarımızda omurgalı hayvanlarla ilgili tüm araştırmalar, Georgia Üniversitesi hayvan kullanım yönergelerine ve protokollerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. P. berghei ile enfekte farelerin üretimi
- Vahşi tip P. berghei parazitleri kullanarak erkek veya dişi, 6-8 haftalık C57BL / 6 (B6) farelerinde kan evresi enfeksiyonunu başlatın. Bunu yapmak için, 400 μL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde sulandırılan dondurularak saklanmış P. berghei ile enfekte olmuş kanı (2 x 105 enfekte RBC'ler) intraperitoneal olarak bir veya iki donör fareye aktarın (i.p.).
- Enfeksiyondan 5 gün sonra (d.p.i.) donör farelerden retro-orbital kanama yoluyla toplanan taze kanı iki saf B6 faresine aktarın. Bunu yapmak için, 200 μL kan toplayın, 300 μL PBS ile sulandırın ve alıcı farelere 200 μL ip enjekte edin. Bu zaman noktasında donörlerde paraziteminin %2-%5 olduğundan emin olun19,20.
- Parazitemiyi daha önce tarif edildiği gibiizleyin 19,20, alıcılarda 2 d.p.i.'den başlayarak. Parazitemi %3-5 (yaklaşık 5 d.p.i.) arasında değiştiğinde, alıcı farelere ötenazi yapın ve ardından kardiyak ponksiyon veya retro-orbital kanama yoluyla kan toplayın. Fareleri karbondioksit inhalasyonu ve ardından servikal çıkık kullanarak veya kurumsal yönergelere göre ötenazi yapın.
NOT: Parazitemi %5'i aştığında, çoklu enfekte eritrositlerin prevalansının artması nedeniyle transfeksiyon etkinliği azalabilir.
2. Kültürde şizont üretimi
- Adım 1.3'te enfekte farelerden kan toplayın (iki fareden toplamda yaklaşık 2 mL) steril bir ortamda 5 mL Alsever çözeltisine (Malzeme Tablosuna bakınız). Steril koşullar altında 2.1'den 3.12'ye kadar olan adımları gerçekleştirin.
NOT: Steril koşullar arasında eldiven giymek, eldiven ve yüzeyleri %70 etanol ile silmek, steril sarf malzemeleri ve malzemeler kullanmak ve bir biyogüvenlik kabini içinde çalışmak yer alır. - Kanı oda sıcaklığında (RT) 450 x g'da 8 dakika santrifüj edin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 10 mL tam RPMI ortamında (% 20 fetal sığır serumu [FBS] ve% 1 penisilin-streptomisin, v / v ile RPMI 1640) yeniden süspanse edin.
- RT'de 450 x g'da 8 dakika santrifüjleyin. Peletin 25 mL tam RPMI ortamında yeniden süspanse edilmesi ve filtre kapaklı bir T75 kültür şişesine aktarılması.
- Hücreleri 16 saat askıda tutmak için hafifçe sallarken 36.5 °C ve% 5CO2'de bir inkübatöre yerleştirin.
- 16 saatlik zaman noktasında, schizont gelişimini kontrol edin. Bunu yapmak için, 500 μL numune toplayın, 8 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin, peleti 10 μL tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin ve ince bir kan yayması hazırlayın. Kan yaymasını Giemsa boyası19 ile boyayın (bkz. Malzeme Tablosu) ve şizontların sıklığını belirleyin (Şekil 1).
- Optimum transfeksiyon verimliliği için, parazitlerin% 60-70'i şizont aşamasında olmalıdır. Bu eşikten daha azı belirlenirse, adım 2.4'teki gibi kültürlemeye devam edin ve devam etmeden önce yukarıdaki eşiğin geçildiğinden emin olmak için her saat kontrol edin.
3. Plasmodium şizontlarının transfeksiyonu
- 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 1.44 mL 1.5 M NaCl ve 5.6 mL 0.15 M NaCl ile 13 mL yoğunluk gradyan stok ortamını (Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden oluşturarak bir gradyan santrifüjleme tamponu hazırlayın.
- 25 mL kan kültürünü 50 mL'lik taze bir santrifüj tüpüne aktarın. Bir gradyan sütunu oluşturmak için dar bir cam pipet kullanarak santrifüj tüpünün dibine 20 mL gradyan santrifüj tamponunu dikkatlice katmanlayın. Sıvı katmanlarını ve arayüzleri bozmamaya dikkat edin ve tampon ile ortam arasında net bir ayrım sağlayın.
- RT'de frensiz 450 x g'de 20 dakika santrifüjleyin. Bir Pasteur pipeti kullanarak, kültür ortamının ve gradyan santrifüj tamponunun arayüzünde bulunan şizont tabakayı15 dikkatlice çıkarın ve yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
- İzole edilmiş şizontları tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin ve toplam hacmi 40 mL'ye getirin. RT'de 8 dakika boyunca 450 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Schizontları 10 mL tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, bu çözeltinin 1 mL'sini her transfeksiyon için 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve enfekte olmuş eritrositleri peletlemek için 5 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. Yukarıdaki şekilde iki fareden türetilen enfekte RBC'ler, 10 ayrı transfeksiyona kadar kullanılabilir.
- RT'de 100 μL elektroporasyon tamponunu (elektroporasyon kitinden nükleofektör çözeltisi; Malzeme Tablosuna bakınız) 5 μg dairesel veya doğrusallaştırılmış hedef plazmit DNA (maksimum 10 μL hacme kadar) ile birleştirin, ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde her transfeksiyon için uygulanabilir. Transfeksiyon ve antibiyotik seçimi için bir kontrol olarak "plazmidsiz" bir numune dahil edilmelidir.
- Santrifüjlemeden sonra süpernatanı adım 3.5'ten çıkarın ve enfekte olmuş RBC'leri hazırlanan nükleofektör çözeltisi + plazmit DNA'da (adım 3.6'dan itibaren) dikkatlice yeniden süspanse edin.
- Süspansiyonu (nükleofektör çözeltisi + plazmid + şizontlar; maksimum 110 μL) elektroporasyon küvetlerine aktarın. Uygun bir nükleofektör programı kullanarak transfekt yapın (U-033, Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: 3.8 ile 3.10 arasındaki adımların RT'de gerçekleştirildiğinden emin olun. - Küvete 100 μL tam RPMI ortamı ekleyin ve tüm çözeltiyi (şimdi 200 μL toplam hacim) 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve RT'de tutun.
- Transfekte edilmiş parazitlerin 200 μL çözeltisini intravenöz olarak farelere enjekte edin (i.v.), transfeksiyon ile farelere son enjeksiyon arasındaki süreyi en aza indirmeye çalışın.
NOT: Transfekte edilen şizontlar, protokolün verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için elektroporasyondan 5 dakikadan daha kısa bir süre sonra farelere enjekte edilir.
4. Transfekte edilen parazitlerin seçimi
- Enfeksiyonu doğrulamak için transfekte edilmiş şizontlarla aşılanan farelerde parazitemi seviyelerini günlük 2 d.p.i.'den kontrol edin.
- Enfeksiyon doğrulandıktan sonra, ilacın içme suyunda oral yoldan verilmesini kullanarak ilaç seçimine başlayın.
NOT: Plazmid için seçilebilir ilaç belirteci olarak pirimetamin kullanılmıştır. Bu durumda, 250 mL temiz suya 17.5 mg pirimetamin ilave edildi (son konsantrasyon 70 mg / L). Ek olarak, pirimetamin içeren suyun fareler tarafından yeterli tüketimini teşvik etmek için bu suya 10 g şeker ilave edildi. - Pirimetamin tedavisinin başlamasından 6 gün sonra başlayarak, 5 μl kanla yapılan kan yaymalarını kullanarak parazitemiyi her iki günde bir izleyin. 15 gün sonra saptanabilir parazitlerin olmaması, transfeksiyonun başarısız olduğunu gösterir; Bu durumda, yeni bir deneme için işlemi adım 1.1'den yeniden başlatın.
- Parazitemi en az% 1'e ulaştığında, kan evresi parazit stoklarının oluşturulması için parazitleri saf B6 farelerine aktarın. Yeni enfekte olmuş farelerde parazitemi %2-5'e ulaşana kadar seçime devam edin, bu noktada stoklar oluşturun ve bunları kriyoprezervasyonyapın 21.
5. Sivrisineklerin transgenik çizgilerle enfeksiyonu
- B6 farelerini, seçilen parazitleri içeren 200 μL kanla enfekte edin (2 x 105 enfekte RBC/fare, i.v.). Sivrisinek besleme ve enfeksiyon gününde bu farelerde parazitemiyi belirleyin. % 2 -% 5 arasındaki parazitemi, sivrisineklerin enfeksiyonu için idealdir. Doğrulandıktan sonra, enfeksiyonu hemen 5.2-5.4 adımlarına göre dişi Anopheles stephensi sivrisineklerine aktarın).
NOT: Enfeksiyon için sivrisinek içeren kuluçka makineleri 20.5 °C'de, %80 nemde ve 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsünde tutulmalıdır (ışıklar 07:00 - 07:00 saatleri arasında açıktır). - Sivrisinek enfeksiyonundan bir gün önce, hem erkek hem de dişi sivrisinekleri içeren kafesin üzerine, 37 °C'ye ısıtılmış suyla doldurulmuş ince bir plastik mesane veya eldiven gibi bir ısı kaynağı yerleştirerek dişi sivrisinekleri ayırın. Isı kaynağına çekilen dişi sivrisinekleri bir böcek aspiratörü kullanarak çıkarın ve bunları enfeksiyon için ayrı, daha küçük bir kafese aktarın.
NOT: Erkek sivrisinekler, biraz küçültülmüş vücut boyutları ve tüylü antenleri ile dişi sivrisineklerden ayırt edilebilir. - Enfekte farelere genel anestezik enjekte edin (ör.% 2 tribromoetanol / avertin). Her farenin ayak pedini sıkıca sıkıştırarak tam anestezi sağlayın. Reaksiyona girmezlerse, yeterince yatıştırılırlar ve enfeksiyonu sivrisineklere aktarmaya hazırdırlar.
- Anestezi uygulanmış fareleri, sternal yaslanma altında kafesli dişi sivrisineklerin üzerine (adım 5.2'den itibaren) yerleştirin. Sivrisinek beslemesi için en büyük yüzey alanını sağlamak için ön ve arka bacakları manuel olarak açın. Enfekte fareleri her kafesin üzerinde toplam 15 dakika bırakın ve farelerin uyanık olmadığından emin olmak için her 5 dakikada bir kontrol edin. Beslenme tamamlandıktan sonra, fareleri servikal çıkık kullanarak veya kurumsal hayvan kullanım protokolüne göre ötenazi yapın ve güvenli bir şekilde atın.
6. Sporozoitlerin toplanması
- Başarılı enfeksiyonu ve sivrisineklerde Plasmodium gelişimini doğrulamak için yaklaşık 10 d.p.i.'de sivrisinek orta bağırsaklarını ookistler açısından kontrol edin. Forseps kullanarak terminal karın segmentini çıkararak sivrisinek orta bağırsaklarını karından izole edin. Ookistlerin varlığı için orta bağırsakları polarize ışık altında görselleştirin22.
- Yabani tip sporozoitlerin, enfekte farelerle beslendikten 18-21 gün sonra sivrisineklerin tükürük bezlerinde bulunması beklenir. 18. günde, sporozoit sayılarını değerlendirmek için 5-10 sivrisineği inceleyin.
NOT: Sivrisinekler etanolde yıkanır ve öldürülür. Daha sonra, ölü sivrisinekler diseksiyondan önce kalıntıları gidermek için PBS ile iki kez yıkanır. - Sporozoitleri izole etmek ve saymak için, forseps veya ince bir diseksiyon iğnesi kullanarak sivrisinek göğsüne basınç uygularken sivrisineğin başını dikkatlice çıkarın. Tükürük bezleri çıkarılan kafaya yapışık kalır (Şekil 2).
- Tükürük bezlerindeki ek sivrisinek kalıntılarını çıkarın ve 400 μL sivrisinek diseksiyon ortamı içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin (Dulbecco'nun %1 fare serumu, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin içeren modifiye Ealge ortamı [DMEM]; bkz.
- İzole edilen tükürük bezlerini 30 G iğneli bir şırıngadan 15-20 kez geçirerek bozun. Sivrisinek diseksiyon ortamındaki bozulmuş tükürük bezlerinin 10 μL'sini bir hemositometreye yerleştirin ve sayın. Farelere enjeksiyon, hücre kültürlerine aşılama veya uzun süreli kriyoprezervasyon için istenen sivrisinek diseksiyon ortamı veya PBS konsantrasyonunda yeniden süspanse edin23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şizontların sıklığını ve gelişimini belirlemek, yeterli sayıda canlı parazitin transfeksiyon için en uygun aşamada olmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Olgunlaşmamış şizontlar, RBC'nin tüm hücre içi boşluğunu doldurmayan daha az merozoitin varlığı ile tamamen olgun şizontlardan ayırt edilebilir (Şekil 1B). Kültürlenmiş kandan kan yayması yapılırken, enfekte olmuş eritrositlerin kırılabileceğini ve bunun da kan yaymasında serbest, hücre dışı merozoitlerin gözlenmesine neden olabileceğini belirtmek önemlidir (Şekil 1). Bu tür merozoitler, adım 2.5'teki şizontların sıklığının değerlendirilmesine dahil değildir.
Tükürük bezlerinin sivrisineklerden çıkarılması, kullanıcı sivrisinek fizyolojisine veya küçük ölçekli diseksiyonlara aşina değilse zor olabilir. Tükürük bezlerinin sivrisineklerden izolasyonu sırasında, bezlerin yarı saydamlığının, onları opak sivrisinek kalıntılarından ayırt etmek için kullanılabileceğine dikkat edin (Şekil 2). Bezlerin bozulmasını takiben sporozoitlerin sayımı, 400x büyütmede en verimlidir ve faz kontrastının kullanılması, sayım odası içindeki sporozoitlerin daha kolay tanımlanmasını sağlar.
Hepatositlerdeki Plasmodium'un %90'ından fazlasının hücre içi bağışıklık mekanizmaları yoluyla muhtemelen elimine edildiğini gösterdik23. Bu nedenle, önemli sayıda hepatositteki parazitlerin lizise uğramasını bekliyoruz. Plasmodium veya PV'sinin konakçı hepatositlerde parçalanmasını belirlemek için bir araç olarak, GFP 1-10 alt birimini (Hepa-GFP1-10) eksprese eden transgenik hepatositler ve GFP 11 alt birimini PV'sine (Pb-GFP 11) aktaran transgenik hepatositler ürettik. GFP kromoforunu oluşturan kalıntıları içeren GFP 1-10 fragmanı, kendi başına floresan değildir ve yalnızca GFP 11 ile birleştiğinde, potansiyel olarak kendi kendini tamamlama yoluyla floresan verir. Plasmodium'da transgenezi fonksiyonel olarak doğrulamaya ek olarak, Pb-GFP 11 ile enfekte olmuş Hepa-GFP1-10 konakçı hücrelerinde yeşil floresan sinyalinin üretilmesi PV'nin parçalanmasını gösterdi (Şekil 3). Yabani tip P. berghei ile enfekte olmuş Hepa-GFP 1-10 hücreleri veya Pb-GFP11 ile enfekte olmuş vahşi tip Hepa 1-6 hücreleri herhangi bir yeşil floresan sinyali üretemedi (veriler gösterilmemiştir). PV'nin parçalanmasının, karaciğer evresi Plasmodium'un yok edilmesinde önemli bir önceki adım olduğunu düşünüyoruz. Pb-GFP11 sporozoitleri ayrıca hepatositlerdeki parazitleri görselleştirmek için CTV ile boyandı. CTV'nin konak hücreye ancak parazitin parçalanması üzerine sızması beklenir (Şekil 3). Konakçı hepatositte gözlenen dağınık CTV sinyali muhtemelen hepatosit içindeki parazitin parçalandığını gösterir. CTV ve GFP sinyalleri arasındaki yakın örtüşme, hem PV hem de parazitin birlikte parçalanması ile beklenir. Bu sistem, Plasmodium veya PV'sinin parçalanmasını modüle etmede bireysel konakçı moleküllerin doğuştan gelen ve hücreye özgü bağışıklık yollarındaki farklı katkılarını sorgulamamızı sağlar.
Resim 1: Plasmodium berghei schizonts. Giemsa boyası ile boyanmış parazitlenmiş fare kan kültüründe (16 saat) P. berghei schizonts'u gösteren temsili ışık mikroskobu görüntüleri. Oklar tamamen olgunlaşmış (A) veya olgunlaşmamış (B) şizontları gösterir. Ölçek çubukları: 5 μm . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sivrisinek tükürük bezleri ve sporozoitler. Pb-GFP11 ile enfekte olmuş dişi Anofel sivrisineklerinden izole edilen tükürük bezlerini gösteren ışık mikroskobu görüntüleri. (A) Tükürük bezleri (ok) diseksiyon sırasında, çıkarılmadan ve daha fazla işlemden geçirilmeden önce hala bozulmamış bir sivrisinek kafasının görüntüsü (ölçek çubuğu: 1 mm). (B,C) Tükürük bezlerinin daha düşük (B) ve daha yüksek (C) büyütmelerde temsili görüntüleri (ölçek çubukları: sırasıyla 0,1 mm ve 0,04 mm). Sporozoitler bezin hem içinde hem de dışında görülebilir (ok). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Konakçı hepatositlerde Plasmodium ve parazitoforöz vakuolünün parçalanmasının saptanması. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ve Pb-GFP 11 sporozoitleri ile enfekte Hepa-GFP1-10 hepatositlerini gösteren kaplamaya sahip yalancı renkli immünofloresan görüntüler. Sporozoitler enfeksiyondan önce CTV ile boyandı (ölçek çubuğu: 10 μm). Toplam 1 x 106 Hepa-GFP 1-10 hepatosit, 35/10 mm'lik cam tabanlı bir kültür kabına kaplandı ve kaplamadan 4 saat sonra 3 x 10 5PbGFP11 sporozoit ile aşılandı. Görüntüler ters çevrilmiş bir floresan mikroskop ile 600x büyütmede ve enfeksiyondan 16 saat sonra çekildi. Kısaltmalar: DIC = diferansiyel girişim kontrastı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laboratuvarımızda birkaç transgenik P. berghei paraziti hattı oluşturmak için yukarıdaki protokolü kullandık. P. berghei için optimize edilmiş olmasına rağmen, bu protokolü transgenik P. yoelii sporozoitleri üretmek için de başarıyla kullandık. Transfekte edilen şizontları farelere enjekte ettikten sonra, parazitler tipik olarak en geç 3 d.p.i. plazmid kontrolü de dahil olmak üzere tüm gruplarda. Elektroporasyonu takiben parazitlerin yaşayabilirliğini sağlamak için sadece parazitemi tespit edildiğinde seçim başlatılır. Ek olarak, ilaç seçimine hazırlanırken, pirimetaminin tamamen çözünmesi için suyun hidroklorik asit ile asitleştirilmesi, pH'ın 4'e düşürülmesi gerekebilir. Transfektanlarla aşılanan fareler enfekte kalırken, plazmidsiz kontrol grubundan parazitlerin tamamen temizlenmesini bekliyoruz. Kontrol farelerinde klerens tipik olarak pirimetamin tedavisinin başlamasından 5-8 gün sonra ortaya çıkar. P. berghei ile enfekte olmuş B6 fareleri, deneysel serebral sıtma belirtileri gösterebilir ve tipik olarak 6-12 d.p.i aralığında ölüme yenik düşebilir (kurumsal hayvan kullanım yönergelerine göre insancıl uç noktaları takip edin). Bu, TCRaKO farelerinde25 transfektanların ilaç seçimini gerçekleştirerek veya 5 d.p.i.'de seçilim geçiren parazitleri yeni B6 alıcılarına aktararak ve ikincisinde seçime devam ederek önlenebilir. Plasmodium'daki transgenez, genetik taramalar, fenotipik değerlendirme veya belirli işlevlerin kazanılması veya kaybı gibi çeşitli yaklaşımlar kullanılarak doğrulanabilir.
Uygun bir plazmitin seçiminin, parazite sokulan DNA'nın başarılı bir şekilde transfeksiyonu ve tutulması için çok önemli olduğuna dikkat etmek önemlidir. Plazmitler ayrıca farklı Plasmodium türlerinde transgenez elde etmede sınırlı etkinlik gösterebilir. Örneğin, pSKspGFP11 plazmidi (PL0017'ye göre; PbGFP11'i üretmek için kullandığımız BEI kaynakları, transgenik P. yoelli'yi de verimli bir şekilde üretmek için kullanılabilir, ancak P. chabaudi'yi değil. pSKspGFP11 oluşturmak için, ana pL0017 plazmidindeki (BEI kaynakları) GFP mutant3 dizisini, süper klasör GFP, GFP 11 (GFP 11-7X)18'in 11. β iplikçikli yedi tandem dizisiyle değiştirdik. Transfeksiyondan önce plazmitlerin doğrusallaştırılması daha iyi genomik entegrasyona izin verse de, hem doğrusal hem de dairesel plazmitler, protokolümüzü kullanarak benzer transfeksiyon verimlilikleri gösterir. Dairesel plazmitlerle transfeksiyon yoluyla üretilen Plasmodium hatları, sivrisineklerde sporozoitlerin oluşumu boyunca transgenik özelliklerini koruyor gibi görünmektedir.
Özellikle, sadece dişi sivrisinekler Plasmodium'u barındırabilir ve bulaştırabilir.Sivrisineklerin izolasyonunu takiben, izole edilen sivrisineklere bu aşamada şekerli su kaynağı verilmemesi önerilir. Onları bu şekilde aç bırakmak, yanlışlıkla transfer edilmiş olabilecek erkek sivrisineklerin ölme şansını artıracak ve dişiler enfekte farelerden kanı daha verimli bir şekilde besleyecektir. Şekerli suyu genellikle enfeksiyonu farelerden sivrisineklere aktardıktan 1 gün sonra geri veririz. Sivrisineklerde sporozoitin gelişimi ve olgunlaşması için zaman çerçevesinin transgenik Plasmodium hatları arasında değişebileceği dikkat çekicidir. Bu nedenle, her transgenik hat için spesifik bir protokol oluşturulmadan önce enfeksiyondan sonra tükürük bezlerindeki sporozoit sayılarını birden fazla zaman noktasında değerlendirmek önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından SPK'ya AI168307 desteklenmiştir. UGA CTEGD Akış Sitometrisi Çekirdeğine ve UGA CTEGD Mikroskopi Çekirdeğine teşekkür ederiz. Ayrıca Ash Pathak, Anne Elliot ve UGA Sporocore personelinin protokolü optimize etmedeki katkılarını da takdir ediyoruz. Değerli içgörüler, tartışmalar ve GFP 11 ve GFP 1-10 içeren ana plazmitler için Dr. Daichi Kamiyama'ya teşekkür etmek istiyoruz. Ayrıca Kurup laboratuvarı üyelerine sürekli destekleri, sabırları ve teşvikleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II - Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
References
- WHO.
- Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K.
- Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
- Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P.
- Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
- Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
- Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
- Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
- Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
- Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
- Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
- Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
- Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
- Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
- Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
- Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
- de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
- Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
- Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
- Bowers, C., et al.
- Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).
