Summary
Malaria wird durch Inokulation des Sporozoitenstadiums von Plasmodium durch infizierte Stechmücken übertragen. Transgenes Plasmodium hat es uns ermöglicht, die Biologie der Malaria besser zu verstehen und hat direkt zur Entwicklung von Malaria-Impfstoffen beigetragen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine optimierte Methodik zur Generierung transgener Plasmodium berghei-Sporozoite.
Abstract
Malaria ist eine tödliche Krankheit, die durch den Parasiten Plasmodium verursacht wird und durch den Stich weiblicher Anopheles-Mücken übertragen wird. Das Sporozoitenstadium von Plasmodium , das von Stechmücken in der Haut von Wirbeltierwirten abgelagert wird, durchläuft eine Phase der obligatorischen Entwicklung in der Leber, bevor die klinische Malaria beginnt. Wir wissen wenig über die Biologie der Plasmodienentwicklung in der Leber; Der Zugang zum Sporozoitenstadium und die Fähigkeit, solche Sporozoiten genetisch zu modifizieren, sind entscheidende Werkzeuge für die Untersuchung der Art der Plasmodium-Infektion und der daraus resultierenden Immunantwort in der Leber. In dieser Arbeit stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Generierung von transgenen Plasmodium berghei-Sporozoiten vor. Wir verändern P. berghei im Blutstadium genetisch und verwenden diese Form, um Anopheles-Mücken zu infizieren, wenn sie eine Blutmahlzeit zu sich nehmen. Nachdem sich die transgenen Parasiten in den Mücken entwickelt haben, isolieren wir das Sporozoitenstadium des Parasiten aus den Speicheldrüsen der Mücken für in vivo und in vitro Experimente. Wir demonstrieren die Validität des Protokolls durch die Generierung von Sporozoiten eines neuen Stammes von P. berghei , der die Untereinheit 11 (GFP11) des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) exprimiert, und zeigen, wie es zur Untersuchung der Biologie der Malaria im Leberstadium verwendet werden kann.
Introduction
Trotz Fortschritten in der Entwicklung von Medikamenten und der Forschung zur Malariaprävention und -behandlung ist die weltweite Krankheitslast durch Malaria nach wie vor hoch. Mehr als eine halbe Million Menschen sterben jedes Jahr an Malaria, wobei die höchste Sterblichkeitsrate bei Kindern beobachtet wird, die in Malaria-endemischen Regionen wie Afrika südlich der Sahara leben1. Malaria wird durch den Parasiten Plasmodium verursacht, der durch den Stich weiblicher Anopheles-Mücken, die den Parasiten in ihren Speicheldrüsen tragen, auf den Menschen übertragen wird. Das infektiöse Stadium der Plasmodien - die Sporozoiten - lagern sich während einer Blutmahlzeit in der Haut der Wirbeltierwirte ab und wandern durch den Blutkreislauf, um Leberzellen zu infizieren, wo sie sich vor der Infektion der Erythrozyten obligatorisch entwickeln (prä-erythrozytäre Malaria). Die Infektion der Erythrozyten löst das Blutstadium der Malaria aus und ist für die Gesamtheit der mit der Krankheit verbundenen Morbidität und Mortalität verantwortlich 2,3.
Die obligate Natur der präerythrozytären Entwicklung von Plasmodium hat es zu einem attraktiven Ziel für die prophylaktische Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten gemacht4. Eine Voraussetzung für die Erforschung der Biologie der präerythrozytären Malaria sowie für die Entwicklung von Impfstoffen oder Medikamenten, die auf das Leberstadium abzielen, ist der Zugang zu Plasmodium-Sporozoiten. Darüber hinaus war unsere Fähigkeit, genetisch veränderte Plasmodium-Sporozoiten zu erzeugen, maßgeblich für den Erfolg solcher Forschungsbemühungen 5,6,7,8,9. Transgene Plasmodiumlinien, die fluoreszierende oder lumineszierende Reporterproteine exprimieren, haben es uns ermöglicht, ihre Entwicklung in vivo und in vitro zu verfolgen 10,11. Genetisch abgeschwächte Parasiten (GAPs), die durch die Deletion mehrerer Gene in Plasmodium erzeugt werden, gehören ebenfalls zu den vielversprechendsten Impfstoffkandidaten12,13.
Malariamodelle von Nagetieren und nicht-menschlichen Primaten haben uns geholfen, die Mechanismen der Wirt-Parasiten-Interaktionen bei der menschlichen Malaria zu verstehen, da die Plasmodium-Arten Ähnlichkeiten in Biologie und Lebenszyklus aufweisen14. Die Verwendung von Plasmodium-Spezies, die Nagetiere, aber nicht den Menschen infizieren (z. B. P. berghei), ermöglicht die Aufrechterhaltung des gesamten Parasitenlebenszyklus und die Generierung infektiöser Sporozoiten für die Untersuchung von Malaria im Leberstadium in einer kontrollierten Umgebung der Biosicherheitsstufe 1. Für die Generierung von transgenen Plasmodium-Parasiten im Blutstadium15, die Infektion von Stechmücken16 und die Isolierung von Sporozoiten17 gibt es bereits eine Vielzahl separater Protokolle. In dieser Arbeit skizzieren wir ein umfassendes Protokoll, das diese Methoden kombiniert, um transgene P. berghei-Sporozoite am Beispiel des neuartigen transgenen Stammes PbGFP11 zu generieren und zu isolieren. PbGFP 11 transportiert den 11. β-Strang des grün fluoreszierenden Super-Ordner-Proteins (GFP), GFP11, in die parasitophore Vakuole (PV), die in den Wirtshepatozyten erzeugt wird. PbGFP11 wird in Verbindung mit transgenen Hepatozyten (Hepa1-6-Hintergrund) verwendet, die Reste exprimieren, die das GFP 1-10-Fragment (GFP 1-10) im Zytoplasma bilden (Hepa-GFP-1-10-Zellen). PbGFP11 berichtet über die PV-Lyse in den Wirtshepatozyten durch Selbstkomplementierung und die Neubildung von funktionellem GFP und dem grünen Fluoreszenzsignal18. Bemerkenswert ist, dass GFP 11 als eine Reihe von sieben Tandemsequenzen in PbGFP11 kodiert ist, um das resultierende Fluoreszenzsignal zu verstärken. Durch die Färbung von PbGFP11 Sporozoiten mit dem zytoplasmatischen Farbstoff CellTrace Violet (CTV) können wir die Parasiten verfolgen. Die Lyse solcher CTV-gefärbten intrazellulären Parasiten selbst führt zu einem Austritt von CTV in das Zytoplasma der Wirtszelle und zur Färbung der Wirtszelle. Neben der Visualisierung und Unterscheidung der Lyse von Plasmodium PV und/oder des Parasiten in Wirtshepatozyten kann dieses System zuverlässig verwendet werden, um die für einen dieser Prozesse verantwortlichen Immunwege durch die genetische oder therapeutische Störung der molekularen Komponenten solcher Signalwege zu untersuchen.
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Protocol
Alle Forschungen mit Wirbeltieren in unserem Labor wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Protokollen der University of Georgia zur Verwendung von Tieren durchgeführt.
1. Generierung von P. berghei-infizierten Mäusen
- Initiierung einer Infektion im Blutstadium bei männlichen oder weiblichen, 6-8 Wochen alten C57BL/6 (B6)-Mäusen unter Verwendung von Wildtyp-P. berghei-Parasiten. Zu diesem Zweck wird kryokonserviertes P. berghei-infiziertes Blut (2 x 105 infizierte Erythrozyten), rekonstituiert in 400 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), in eine oder zwei Spendermäuse intraperitoneal (i.p.) übertragen.
- Frisches Blut, das durch retroorbitale Blutungen von den Spendermäusen 5 Tage nach der Infektion (d.p.i.) entnommen wurde, wurde in zwei naive B6-Mäuse übertragen. Dazu werden 200 μl Blut entnommen, mit 300 μl PBS rekonstituiert und 200 μl i.p. in die Empfängermäuse injiziert. Stellen Sie sicher, dass die Parasitämie bei den Spendern zu diesem Zeitpunkt 2%-5%19,20 beträgt.
- Überwachen Sie die Parasitämie wie zuvor beschrieben19,20, beginnend mit 2 d.p.i. bei den Empfängern. Wenn die Parasitämie zwischen 3 % und 5 % (ca. 5 d.p.i.) liegt, werden die Empfängermäuse eingeschläfert und dann Blut durch Herzpunktion oder retroorbitale Blutung entnommen. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Kohlendioxid-Inhalation mit anschließender Zervixluxation oder gemäß den institutionellen Richtlinien.
HINWEIS: Sobald die Parasitämie 5% überschreitet, kann die Transfektionseffizienz aufgrund der erhöhten Prävalenz von mehrfach infizierten Erythrozyten reduziert sein.
2. Generierung von Schizonten in der Kultur
- Blut von den infizierten Mäusen in Schritt 1.3 (insgesamt ca. 2 ml von zwei Mäusen) in 5 ml Alsever-Lösung (siehe Materialtabelle) in einer sterilen Umgebung sammeln. Die Schritte 2.1 bis 3.12 sind unter sterilen Bedingungen durchzuführen.
HINWEIS: Zu den sterilen Bedingungen gehören das Tragen von Handschuhen, das Abwischen von Handschuhen und Oberflächen mit 70 % Ethanol, die Verwendung steriler Verbrauchsmaterialien und Materialien sowie die Arbeit in einer Biosicherheitswerkbank. - Das Blut wird 8 min lang bei 450 x g bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml vollständigem RPMI-Medium (RPMI 1640 mit 20 % fötalem Kälberserum [FBS] und 1 % Penicillin-Streptomycin, v/v).
- 8 min bei 450 x g bei RT zentrifugieren. Das Pellet wird in 25 ml vollständigem RPMI-Medium resuspendiert und in einen T75-Kulturkolben mit Filterkappe überführt.
- In einen Inkubator bei 36,5 °C und 5 % CO2 geben und dabei vorsichtig schütteln, um die Zellen 16 Stunden lang in der Schwebe zu halten.
- Prüfen Sie nach 16 Uhr, ob sich ein Schizont entwickelt. Dazu werden 500 μl der Probe entnommen, 8 min lang bei 450 x g zentrifugiert, das Pellet in 10 μl vollständiger RPMI-Medien resuspendiert und ein dünner Blutausstrich vorbereitet. Färben Sie den Blutausstrich mit der Giemsa-Färbung19 (siehe Materialtabelle) und bestimmen Sie die Häufigkeit von Schizonten (Abbildung 1).
- Für eine optimale Transfektionseffizienz sollten sich 60%-70% der Parasiten im schizonten Stadium befinden. Wenn weniger als dieser Schwellenwert festgestellt wird, setzen Sie die Kultivierung wie in Schritt 2.4 fort und überprüfen Sie stündlich, ob der oben genannte Schwellenwert überschritten wird, bevor Sie fortfahren.
3. Transfektion von Plasmodium-Schizonten
- Bereiten Sie einen Gradientenzentrifugationspuffer vor, indem Sie 13 ml Dichtegradienten-Stammmedium (siehe Materialtabelle) mit 1,44 ml 1,5 M NaCl und 5,6 ml 0,15 M NaCl in einem 50-ml-Zentrifugationsröhrchen rekonstituieren.
- 25 ml Blutkultur in ein frisches 50-ml-Zentrifugationsröhrchen überführen. Tragen Sie vorsichtig 20 ml Gradientenzentrifugationspuffer mit einer schmalen Glaspipette auf den Boden des Zentrifugationsröhrchens, um eine Gradientensäule zu erzeugen. Achten Sie darauf, die flüssigen Schichten und Grenzflächen nicht zu stören und sorgen Sie für eine klare Trennung zwischen Puffer und Medien.
- Zentrifugieren Sie 20 Minuten lang bei 450 x g ohne Unterbrechung bei RT. Entfernen Sie mit einer Pasteurpipette vorsichtig die Schizontschicht15 , die sich an der Grenzfläche zwischen dem Nährmedium und dem Gradientenzentrifugationspuffer befindet, und geben Sie sie in ein neues 50-ml-Zentrifugationsröhrchen.
- Resuspendieren Sie die isolierten Schizonten in vollständigen RPMI-Medien und erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 40 ml. Bei 450 x g 8 min bei RT zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Sie die Schizonten in 10 ml vollständigem RPMI-Medium. Dann wird 1 ml dieser Lösung für jede Transfektion in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 5 s lang bei 16.000 x g zentrifugiert, um die infizierten Erythrozyten zu pelletieren. Die infizierten Erythrozyten, die auf die oben beschriebene Weise von zwei Mäusen abgeleitet wurden, können für bis zu 10 separate Transfektionen verwendet werden.
- Kombinieren Sie 100 μl des Elektroporationspuffers (Nukleofektorlösung aus dem Elektroporationskit; siehe Materialtabelle) bei RT mit 5 μg zirkulärer oder linearisierter Zielplasmid-DNA (in bis zu einem Maximum von 10 μl Volumen), je nach anwendbar für jede Transfektion in separaten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Eine "No-Plasmid"-Probe muss als Kontrolle für die Transfektion und die Antibiotikaauswahl eingeschlossen werden.
- Der Überstand wird nach der Zentrifugation aus Schritt 3.5 entfernt und die infizierten Erythrozyten vorsichtig in der hergestellten Nukleofektorlösung + Plasmid-DNA (aus Schritt 3.6) resuspendiert.
- Die Suspension (Nukleofektorlösung + Plasmid + Schizonten; maximal 110 μl) wird in Elektroporationsküvetten überführt. Transfektion mit einem geeigneten Nukleofektorprogramm (U-033, siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Schritte 3.8 bis 3.10 bei RT ausgeführt werden. - Geben Sie 100 μl des vollständigen RPMI-Mediums in die Küvette und überführen Sie die gesamte Lösung (jetzt 200 μl Gesamtvolumen) in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und bewahren Sie es bei RT auf.
- Injizieren Sie die 200-μl-Lösung transfizierter Parasiten intravenös (i.v.) in Mäuse, um die Zeit zwischen der Transfektion und der endgültigen Injektion in Mäuse zu minimieren.
HINWEIS: Transfizierte Schizonten werden weniger als 5 Minuten nach der Elektroporation in Mäuse injiziert, um die Effizienz des Protokolls zu maximieren.
4. Auswahl der transfizierten Parasiten
- Überprüfen Sie die Parasitämiewerte bei den Mäusen, die täglich ab 2 d.p.i. mit den transfizierten Schizonten geimpft wurden, um die Infektion zu überprüfen.
- Sobald die Infektion verifiziert ist, beginnen Sie mit der Auswahl des Arzneimittels durch orale Verabreichung des Arzneimittels in Trinkwasser, das ad libitum angeboten wird.
HINWEIS: Pyrimethamin wurde als selektierbarer Wirkstoffmarker für das Plasmid verwendet. In diesem Fall wurden 17,5 mg Pyrimethamin zu 250 ml sauberem Wasser (Endkonzentration von 70 mg/l) gegeben. Zusätzlich wurden diesem Wasser 10 g Zucker zugesetzt, um die Mäuse zu einem ausreichenden Verzehr des Pyrimethamin-haltigen Wassers zu ermutigen. - Überwachen Sie die Parasitämie alle zwei Tage mit Blutausstrichen mit 5 μl Blut, beginnend 6 Tage nach Beginn der Pyrimethamin-Behandlung. Das Fehlen nachweisbarer Parasiten nach 15 Tagen deutet auf eine fehlgeschlagene Transfektion hin; Initiieren Sie in diesem Fall den Prozess ab Schritt 1.1 erneut, um einen neuen Versuch zu starten.
- Wenn die Parasitämie mindestens 1 % erreicht, werden die Parasiten auf naive B6-Mäuse übertragen, um Parasitenvorräte im Blutstadium zu bilden. Setzen Sie die Selektion in den neu infizierten Mäusen fort, bis die Parasitämie 2%-5% erreicht, woraufhin die Bestände erzeugt und kryokonserviertwerden 21.
5. Infektion von Stechmücken mit den transgenen Linien
- Infizieren Sie B6-Mäuse mit 200 μl Blut, das die ausgewählten Parasiten enthält (2 x 105 infizierte Erythrozyten/Maus, i.v.). Bestimmen Sie die Parasitämie bei diesen Mäusen am Tag der Mückenfütterung und -infektion. Eine Parasitämie zwischen 2%-5% ist optimal für die Infektion von Mücken. Nach der Verifizierung ist die Infektion gemäß den Schritten 5.2-5.4 sofort auf die weiblichen Anopheles-stephensi-Mücken zu übertragen.
HINWEIS: Inkubatoren, die infektiöse Mücken enthalten, sollten bei 20,5 °C, 80 % Luftfeuchtigkeit und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus (Licht zwischen 07:00 und 19:00 Uhr eingeschaltet) aufbewahrt werden. - Am Tag vor der Mückeninfektion trennen Sie die weiblichen Mücken, indem Sie eine Wärmequelle auf den Käfig legen, der sowohl männliche als auch weibliche Mücken enthält, z. B. eine dünne Plastikblase oder einen Handschuh, der mit Wasser gefüllt ist, das auf 37 °C erhitzt wird. Entfernen Sie die weiblichen Mücken, die von der Wärmequelle angezogen werden, mit einem Insektensauger und bringen Sie sie zur Infektion in einen separaten, kleineren Käfig.
HINWEIS: Männliche Mücken können von weiblichen Mücken durch ihre leicht reduzierte Körpergröße und ihre gefiederten Fühler unterschieden werden. - Injizieren Sie den infizierten Mäusen ein Vollnarkosemittel (z. B. 2% Tribromethanol/Avertin). Sorgen Sie für eine vollständige Anästhesie, indem Sie das Fußpolster jeder Maus fest zusammendrücken. Wenn sie nicht reagieren, sind sie ausreichend sediert und bereit, die Infektion auf Mücken zu übertragen.
- Legen Sie die betäubten Mäuse auf die weiblichen Mücken im Käfig (aus Schritt 5.2) unter Brustbeinlage. Spreizen Sie die Vorder- und Hinterbeine manuell, um die größte Oberfläche für die Mückenfütterung zu schaffen. Lassen Sie die infizierten Mäuse insgesamt 15 Minuten lang über jedem Käfig und überprüfen Sie alle 5 Minuten, ob die Mäuse nicht wach sind. Sobald die Fütterung abgeschlossen ist, euthanasieren Sie die Mäuse durch Gebärmutterhalsverrenkung oder gemäß dem institutionellen Tierverwendungsprotokoll und entsorgen Sie sie sicher.
6. Sammlung von Sporozoiten
- Untersuchen Sie den Mitteldarm der Mücke auf Oozysten bei etwa 10 d.p.i., um eine erfolgreiche Infektion und die Entwicklung von Plasmodium in den Mücken zu überprüfen. Isolieren Sie die Mitteleingeweide der Mücken vom Bauchraum, indem Sie das terminale Bauchsegment mit einer Zange entfernen. Visualisieren Sie den Mitteldarm unter polarisiertem Licht auf das Vorhandensein von Oozysten22.
- Es wird erwartet, dass Wildtyp-Sporozoiten 18-21 Tage nach dem Fressen infizierter Mäuse in den Speicheldrüsen von Mücken vorhanden sind. Sezieren Sie am 18. Tag 5-10 Mücken, um die Anzahl der Sporozoiten zu bestimmen.
HINWEIS: Mücken werden in Ethanol gewaschen und getötet. Anschließend werden tote Mücken zweimal mit PBS gewaschen, um Ablagerungen vor dem Sezieren zu entfernen. - Um die Sporozoiten zu isolieren und zu zählen, entfernen Sie vorsichtig den Kopf der Mücke und üben Sie dabei mit einer Pinzette oder einer feinen Präpariernadel Druck auf den Mückenthorax aus. Die Speicheldrüsen bleiben am entfernten Kopf befestigt (Abbildung 2).
- Entfernen Sie alle zusätzlichen Mückenreste aus den Speicheldrüsen und geben Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 400 μl Mückendissektionsmedium (modifiziertes Ealge-Medium [DMEM] von Dulbecco mit 1 % Mausserum, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin; siehe Materialtabelle).
- Brechen Sie die isolierten Speicheldrüsen auf, indem Sie sie 15-20 Mal durch eine 30-G-Nadelspritze führen. Geben Sie 10 μl der gestörten Speicheldrüsen in Mückendissektionsmedien in ein Hämozytometer und zählen Sie. Resuspension in der gewünschten Konzentration von Mücken-Dissektionsmedien oder PBS zur Injektion in Mäuse, zur Inokulation in Zellkulturen oder zur Langzeit-Kryokonservierung23,24.
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Representative Results
Die Bestimmung der Häufigkeit und Entwicklung von Schizonten ist entscheidend, um sicherzustellen, dass sich genügend lebensfähige Parasiten im optimalen Stadium für die Transfektion befinden. Unreife Schizonten können von voll ausgereiften Schizonten durch das Vorhandensein von weniger Merozoiten unterschieden werden, die nicht den gesamten intrazellulären Raum des Erythrozyten ausfüllen (Abbildung 1B). Es ist wichtig zu beachten, dass bei der Herstellung von Blutausstrichen aus kultiviertem Blut infizierte Erythrozyten aufbrechen können, was zur Beobachtung von freien, extrazellulären Merozoiten im Blutausstrich führt (Abbildung 1). Solche Merozoiten fließen nicht in die Beurteilung der Häufigkeit von Schizonten in Schritt 2.5 ein.
Die Entfernung von Speicheldrüsen aus Stechmücken kann eine Herausforderung sein, wenn der Benutzer mit der Physiologie der Mücken oder kleinen Sektionen nicht vertraut ist. Bei der Isolierung der Speicheldrüsen von Mücken ist zu beachten, dass die Transluzenz der Drüsen genutzt werden kann, um sie von den undurchsichtigen Mückenresten zu unterscheiden (Abbildung 2). Die Zählung der Sporozoiten nach der Störung der Drüsen ist bei 400-facher Vergrößerung am effizientesten, und die Verwendung von Phasenkontrast ermöglicht eine einfachere Identifizierung der Sporozoiten in der Zählkammer.
Wir haben gezeigt, dass über 90% der Plasmodien in Hepatozyten möglicherweise durch zellintrinsische Immunmechanismen eliminiert werden23. Daher erwarten wir, dass Parasiten in einer beträchtlichen Anzahl von Hepatozyten einer Lyse unterzogen werden. Um die Lyse von Plasmodium oder seiner PV in den Wirtshepatozyten zu bestimmen, haben wir transgene Hepatozyten erzeugt, die die GFP 1-10-Untereinheit (Hepa-GFP1-10) exprimieren, und transgene P. berghei, die die GFP 11-Untereinheit exprimieren und zu ihrem PV (Pb-GFP 11) transportieren. Das GFP 1-10-Fragment, das die Reste enthält, aus denen das GFP-Chromophor besteht, ist selbst nicht fluoreszierend und fluoresziert nur bei Assoziation mit GFP 11, möglicherweise durch Selbstkomplementierung. Neben der funktionellen Validierung der Transgenese in Plasmodium deutete die Erzeugung eines grünen Fluoreszenzsignals in den mit Pb-GFP 11 infizierten Hepa-GFP 1-10-Wirtszellen auf die Lyse des PV hin (Abbildung 3). Wildtyp-P. berghei-infizierte Hepa-GFP 1-10-Zellen oder Pb-GFP11-infizierte Wildtyp-Hepa-1-6-Zellen erzeugten kein grünes Fluoreszenzsignal (Daten nicht gezeigt). Wir betrachten die Lyse des PV als einen wichtigen Schritt bei der Zerstörung von Plasmodium im Leberstadium. Die Pb-GFP11 Sporozoiten wurden ebenfalls mit CTV gefärbt, um die Parasiten in den Hepatozyten sichtbar zu machen. Es wird erwartet, dass CTV erst nach der Lyse des Parasiten selbst in die Wirtszelle gelangt (Abbildung 3). Das dispergierte CTV-Signal, das in der Wirtshepatozyte beobachtet wurde, deutet wahrscheinlich auf die Lyse des Parasiten innerhalb der Hepatozyten hin. Die enge Überlappung zwischen den CTV- und GFP-Signalen wird bei gleichzeitiger Lyse sowohl des PV als auch des Parasiten erwartet. Dieses System ermöglicht es uns, die unterschiedlichen Beiträge der einzelnen Wirtsmoleküle in angeborenen und zellintrinsischen Immunwegen bei der Modulation der Lyse von Plasmodium oder seiner PV zu untersuchen.
Abbildung 1: Plasmodium berghei schizonts. Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen von P. berghei schizonts in parasitierter Mäuseblutkultur (16 h), gefärbt mit Giemsa-Färbung. Die Pfeile zeigen voll ausgereifte (A) oder unreife (B) Schizonten an. Maßstabsleisten: 5 μm . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Mückenspeicheldrüsen und Sporozoiten. Lichtmikroskopische Aufnahmen von Speicheldrüsen, die aus Pb-GFP11-infizierten weiblichen Anopheles-Mücken isoliert wurden. (A) Bild eines Mückenkopfes mit noch intakten Speicheldrüsen (Pfeil) während der Präparation, vor der Entfernung und Weiterverarbeitung (Maßstabsbalken: 1 mm). (B,C) Repräsentative Bilder von Speicheldrüsen bei niedrigeren (B) und höheren (C) Vergrößerungen (Maßstabsbalken: 0,1 mm bzw. 0,04 mm). Sporozoiten sind sowohl innerhalb als auch außerhalb der Drüse zu sehen (Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Nachweis der Lyse von Plasmodium und seiner parasitophoren Vakuole in Wirtshepatozyten. Differentieller Interferenzkontrast (DIC) und pseudofarbige Immunfluoreszenzbilder mit Overlay von Hepa-GFP1-10 Hepatozyten, die mit Pb-GFP11 Sporozoiten infiziert sind. Sporozoiten wurden vor der Infektion mit CTV gefärbt (Maßstab: 10 μm). Insgesamt 1 x 106 Hepa-GFP 1-10 Hepatozyten wurden in einer 35/10 mm Glasboden-Kulturschale plattiert und 4 h nach dem Plattieren mit 3 x 10 5PbGFP11 Sporozoiten inokuliert. Die Bilder wurden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop bei 600-facher Vergrößerung und 16 Stunden nach der Infektion aufgenommen. Abkürzungen: DIC = differentieller Interferenzkontrast. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir haben das obige Protokoll in unserem Labor verwendet, um mehrere Linien transgener P. berghei-Parasiten zu erzeugen. Obwohl dieses Protokoll für P. berghei optimiert ist, haben wir dieses Protokoll auch erfolgreich zur Generierung transgener P. yoelii-Sporozoite verwendet . Nach Injektion der transfizierten Schizonten in Mäuse sind die Parasiten in der Regel spätestens nach 3 d.p.i. in allen Gruppen nachweisbar, einschließlich der Kontrolle ohne Plasmid. Mit der Selektion wird erst begonnen, wenn eine Parasitämie festgestellt wurde, um die Lebensfähigkeit der Parasiten nach der Elektroporation zu gewährleisten. Darüber hinaus kann bei der Vorbereitung auf die Arzneimittelauswahl eine Ansäuerung des Wassers mit Salzsäure erforderlich sein, um den pH-Wert auf 4 zu senken, damit sich Pyrimethamin vollständig auflösen kann. Wir erwarten eine vollständige Eliminierung der Parasiten aus der Kontrollgruppe ohne Plasmid, während die mit den Transfektantien inokulierten Mäuse infiziert bleiben. Die Clearance bei den Kontrollmäusen erfolgt typischerweise 5-8 Tage nach Beginn der Pyrimethamin-Behandlung. Bemerkenswert ist, dass B6-Mäuse, die mit P. berghei infiziert sind, Anzeichen einer experimentellen zerebralen Malaria zeigen und dem Tod erliegen (humane Endpunkte gemäß den institutionellen Richtlinien für die Verwendung von Tieren befolgen), typischerweise im Intervall von 6-12 d.p.i. Dies kann vermieden werden, indem die Transfektanten in TCRaKO-Mäusenausgewählt werden 25 oder indem die Parasiten, die bei 5 d.p.i. selektiert werden, auf neue B6-Empfänger übertragen und die Selektion in letzteren fortgesetzt werden. Die Transgenese in Plasmodium kann mit einer Vielzahl von Ansätzen verifiziert werden, wie z. B. genetischen Screenings, phänotypischer Bewertung oder dem Gewinn oder Verlust bestimmter Funktionen.
Es ist wichtig zu beachten, dass die Auswahl eines geeigneten Plasmids entscheidend für die erfolgreiche Transfektion und den Verbleib der eingeführten DNA im Parasiten ist. Plasmide können auch eine begrenzte Wirksamkeit bei der Transgenese zwischen verschiedenen Plasmodium-Spezies zeigen. Zum Beispiel kann das pSKspGFP11-Plasmid (basierend auf PL0017; BEI-Ressourcen), die wir zur Generierung von PbGFP11 verwendet haben, kann auch zur effizienten Generierung von transgenem P. yoelli verwendet werden, nicht jedoch von P. chabaudi. Um pSKspGFP11 zu generieren, ersetzten wir die GFP-Mutante3-Sequenz im übergeordneten pL0017-Plasmid (BEI-Ressourcen) durch sieben Tandemsequenzen des 11. β-Strangs des Super-Folder-GFP, GFP 11 (GFP11-7X)18. Obwohl die Linearisierung der Plasmide vor der Transfektion eine bessere genomische Integration ermöglicht, zeigen sowohl lineare als auch zirkuläre Plasmide ähnliche Transfektionseffizienzen unter Verwendung unseres Protokolls. Die durch Transfektion mit zirkulären Plasmiden erzeugten Plasmodium-Linien scheinen ihre transgenen Eigenschaften auch im Laufe der Sporozoitenbildung in den Stechmücken beizubehalten.
Bemerkenswert ist, dass nur weibliche Stechmücken Plasmodium beherbergen und übertragen können.Nach der Isolierung der Mücken wird empfohlen, den isolierten Mücken in diesem Stadium keine Zuckerwasserquelle zur Verfügung zu stellen. Sie auf diese Weise auszuhungern, würde die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass männliche Mücken, die möglicherweise versehentlich übertragen wurden, sterben und die Weibchen das Blut der infizierten Mäuse effizienter ernähren. In der Regel geben wir das Zuckerwasser 1 Tag nach der Übertragung der Infektion von Mäusen auf Mücken zurück. Bemerkenswert ist, dass der Zeitrahmen für die Entwicklung und Reifung des Sporozoiten in Stechmücken zwischen transgenen Plasmodium-Linien variieren kann. Daher ist es wichtig, die Sporozoitenzahl in den Speicheldrüsen zu mehreren Zeitpunkten nach der Infektion zu bestimmen, bevor ein spezifisches Protokoll für jede transgene Linie erstellt wird.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss der National Institutes of Health AI168307 an SPK unterstützt. Wir danken dem UGA CTEGD Durchflusszytometrie-Kern und dem UGA CTEGD-Mikroskopie-Kern. Wir danken auch den Beiträgen von Ash Pathak, Anne Elliot und den Mitarbeitern von UGA Sporocore bei der Optimierung des Protokolls. Wir danken Dr. Daichi Kamiyama für wertvolle Einblicke, Diskussionen und die Elternplasmide, die GFP11 und GFP 1-10 enthalten. Wir möchten uns auch bei den Mitgliedern des Kurup-Labors für ihre ständige Unterstützung, Geduld und Ermutigung bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II - Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
References
- WHO.
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