Summary
Malaria överförs genom inokulering av sporozoitstadiet av Plasmodium av infekterade myggor. Transgent Plasmodium har gjort det möjligt för oss att förstå malarians biologi bättre och har bidragit direkt till utvecklingen av malariavaccin. Här beskriver vi en strömlinjeformad metodik för att generera transgena Plasmodium berghei-sporozoiter.
Abstract
Malaria är en dödlig sjukdom som orsakas av parasiten Plasmodium och överförs genom bett av honmyggor . Sporozoitstadiet av Plasmodium som deponeras av myggor i huden på ryggradsdjur genomgår en fas av obligatorisk utveckling i levern innan klinisk malaria inleds. Vi vet lite om biologin bakom Plasmodiums utveckling i levern; tillgång till sporozoitstadiet och förmågan att genetiskt modifiera sådana sporozoiter är viktiga verktyg för att studera arten av Plasmodium-infektion och det resulterande immunsvaret i levern. Här presenterar vi ett omfattande protokoll för generering av transgena Plasmodium berghei-sporozoiter. Vi genmodifierar P. berghei i blodstadiet och använder denna form för att infektera Anopheles-myggor när de tar en blodmåltid. Efter att de transgena parasiterna har utvecklats i myggorna isolerar vi parasitens sporozoitstadium från myggornas spottkörtlar för in vivo och in vitro-experiment . Vi demonstrerar protokollets giltighet genom att generera sporozoiter av en ny stam av P. berghei som uttrycker det gröna fluorescerande proteinet (GFP) subenhet 11 (GFP11), och visar hur det kan användas för att undersöka biologin bakom levermalaria.
Introduction
Trots framsteg inom läkemedelsutveckling och forskning om förebyggande och behandling av malaria är den globala sjukdomsbördan av malaria fortfarande hög. Över en halv miljon människor dör av malaria varje år, och den högsta dödligheten bland barn som lever i malariaendemiska regioner,såsom Afrika söder om Sahara1. Malaria orsakas av parasiten Plasmodium, som överförs till människor genom bett av honmyggor av hona som bär parasiten i sina spottkörtlar. Det infektiösa stadiet av Plasmodium - sporozoiterna - deponeras i huden hos ryggradsdjuren under en blodmåltid och färdas genom blodomloppet för att infektera leverceller, där de genomgår obligatorisk utveckling (som utgör pre-erytrocytisk malaria) innan de infekterar erytrocyterna. Infektionen i erytrocyterna initierar malarians blodstadium och är ansvarig för hela den sjuklighet och dödlighet som är förknippadmed sjukdomen.
Den obligatoriska karaktären hos den pre-erytrocytiska utvecklingen av Plasmodium har gjort det till ett attraktivt mål för profylaktiska vaccin- och läkemedelsutvecklingsinsatser4. En förutsättning för att studera biologin bakom pre-erytrocytisk malaria, samt utveckling av vacciner eller läkemedel som riktar sig mot leverstadiet, är tillgång till Plasmodium sporozoiter. Dessutom har vår förmåga att generera genetiskt modifierade Plasmodium sporozoiter varit avgörande för framgången för sådana forskningssträvanden 5,6,7,8,9. Transgena Plasmodium-linjer som uttrycker fluorescerande eller självlysande reporterproteiner har gjort det möjligt för oss att spåra deras utveckling in vivo och in vitro10,11. Genetiskt försvagade parasiter (GAPs), som genereras genom radering av flera gener i Plasmodium, är också några av de mest lovande vaccinkandidaterna12,13.
Malariamodeller från gnagare och icke-mänskliga primater har hjälpt oss att förstå mekanismerna för värd-parasitinteraktioner i mänsklig malaria på grund av likheterna i biologi och livscykel mellan Plasmodium-arter 14. Användningen av Plasmodium-arter som infekterar gnagare, men inte människor (t.ex. P. berghei) gör det möjligt att upprätthålla parasitens hela livscykel och generera infektiösa sporozoiter för att studera malaria i leverstadiet i en kontrollerad biosäkerhetsnivå 1-miljö. Det finns redan en mängd separata protokoll för generering av transgena Plasmodium-parasiter i blodstadiet15, infektion av myggor 16 och isolering av sporozoiter17. Här beskriver vi ett omfattande protokoll som kombinerar dessa metoder för att generera och isolera transgena P. berghei-sporozoiter, med hjälp av den nya transgena stammen PbGFP11 som exempel. PbGFP 11 transporterar den 11:e β-strängen av det gröna fluorescerande proteinet (GFP), GFP11, till den parasitofora vakuolen (PV) som genereras i värdhepatocyterna. PbGFP 11 används tillsammans med transgena hepatocyter (Hepa1-6-bakgrund) som uttrycker rester som utgör GFP 1-10-fragmentet (GFP 1-10) i cytoplasman (Hepa GFP 1-10-celler). PbGFP11 rapporterar PV-lys i värdhepatocyterna genom självkomplementering och reformation av funktionell GFP och den gröna fluorescenssignalen18. Värt att notera är att GFP 11 kodas som en serie av sju tandemsekvenser i PbGFP11 för att förstärka den resulterande fluorescenssignalen. Genom att färga PbGFP11-sporozoiter med det cytoplasmatiska färgämnet CellTrace Violet (CTV) kan vi spåra parasiterna. Lysen av sådana CTV-färgade intracellulära parasiter resulterar i sig i läckage av CTV in i värdcellens cytoplasma och färgning av värdcellen. Förutom att visualisera och särskilja lysen av Plasmodium PV och/eller parasiten i värdhepatocyter, kan detta system på ett tillförlitligt sätt användas för att studera de immunvägar som är ansvariga för någon av dessa processer, genom genetisk eller terapeutisk störning av de molekylära komponenterna i sådana vägar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All forskning som involverar ryggradsdjur i vårt laboratorium utfördes i enlighet med University of Georgias riktlinjer och protokoll för djuranvändning.
1. Generering av P. berghei-infekterade möss
- Initiera infektion i blodstadiet hos han- eller honmöss, 6-8 veckor gamla C57BL/6 (B6) med vildtypsparasiter av P. berghei. För att göra detta, överför kryokonserverat P. berghei-infekterat blod (2 x 105 infekterade röda blodkroppar), rekonstituerat i 400 μl fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS), till en eller två donatormöss intraperitonealt (i.p.).
- Överför färskt blod som samlats in genom retroorbital blödning från donatormössen 5 dagar efter infektion (d.p.i.) till två naiva B6-möss. För att göra detta, samla upp 200 μL blod, bered med 300 μL PBS och injicera 200 μL i.p. i mottagarmössen. Se till att parasitemin hos donatorerna vid denna tidpunkt är 2%-5%19,20.
- Övervaka parasitemi som tidigare beskrivits19,20, med början från 2 d.p.i. hos mottagarna. När parasitemi varierar från 3%-5% (cirka 5 d.p.i.), avliva mottagarmössen och samla sedan blod genom hjärtpunktion eller retroorbital blödning. Avliva mössen med hjälp av inandning av koldioxid följt av cervikal luxation, eller enligt institutionens riktlinjer.
OBS: När parasitemi överstiger 5 % kan transfektionseffektiviteten minska på grund av den ökade prevalensen av multiplikationsinfekterade röda blodkroppar.
2. Generering av schizonter i kulturen
- Samla blod från de infekterade mössen i steg 1.3 (cirka 2 ml totalt från två möss) till 5 ml Alsevers lösning (se materialtabell) i en steril miljö. Utför steg 2.1 till 3.12 under sterila förhållanden.
OBS: Sterila förhållanden inkluderar att bära handskar, torka av handskar och ytor med 70 % etanol, använda sterila förbrukningsvaror och material och arbeta i ett biosäkerhetsskåp. - Centrifugera blodet i 8 minuter vid 450 x g vid rumstemperatur (RT). Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 ml komplett RPMI-media (RPMI 1640 med 20 % fetalt bovint serum [FBS] och 1 % penicillin-streptomycin, v/v).
- Centrifugera i 8 minuter vid 450 x g vid RT. Återsuspendera pelleten i 25 ml komplett RPMI-medium och överför till en T75-odlingskolv med filterlock.
- Placera i en inkubator vid 36,5 °C och 5 % CO2 under en försiktig skakning för att hålla cellerna i suspension i 16 timmar.
- Vid 16 timmars tidpunkt, kontrollera om schizont utvecklas. För att göra detta, samla upp 500 μl av provet, centrifugera vid 450 x g i 8 minuter, återsuspendera pelleten i 10 μL komplett RPMI-medium och förbered ett tunt blodutstryk. Färga blodutstryket med Giemsa-fläck19 (se materialtabell) och bestäm frekvensen av schizonter (Figur 1).
- För optimal transfektionseffektivitet bör 60-70 % av parasiterna vara i schizontstadiet. Om färre än detta tröskelvärde bestäms, fortsätt odlingen som i steg 2.4 och kontrollera varje timme för att säkerställa att ovanstående tröskel har överskridits innan du fortsätter.
3. Transfektion av Plasmodium schizonts
- Bered en gradientcentrifugeringsbuffert genom att rekonstituera 13 ml densitetsgradientmedium (se materialtabell) med 1,44 ml 1,5 M NaCl och 5,6 ml 0,15 M NaCl i ett 50 ml centrifugeringsrör.
- Överför 25 ml blododling till ett nytt 50 ml centrifugeringsrör. Lägg försiktigt 20 ml gradientcentrifugeringsbuffert i botten av centrifugeringsröret med en smal glaspipett för att skapa en gradientkolonn. Var noga med att inte störa vätskeskikten och gränssnitten och se till att det finns en tydlig uppdelning mellan bufferten och mediet.
- Centrifugera i 20 minuter vid 450 x g utan broms vid RT. Använd en Pasteur-pipett, ta försiktigt bort schizontskiktet15 som finns vid gränssnittet mellan odlingsmediet och gradientcentrifugeringsbufferten och placera det i ett nytt 50 ml centrifugeringsrör.
- Återsuspendera de isolerade schizonterna i kompletta RPMI-medier och höj den totala volymen till 40 ml. Centrifugera vid 450 x g i 8 minuter vid RT och kassera supernatanten.
- Återsuspendera schizonterna i 10 ml komplett RPMI-media. Överför sedan 1 ml av denna lösning till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör för varje transfektion och centrifugera vid 16 000 x g i 5 s för att pelletera de infekterade röda blodkropparna. De infekterade röda blodkropparna som härstammar från två möss på ovanstående sätt kan användas för upp till 10 separata transfektioner.
- Kombinera 100 μl av elektroporeringsbufferten (nukleofektorlösning från elektroporeringssatsen, se materialtabell) vid RT med 5 μg cirkulärt eller linjäriserat målplasmid-DNA (i upp till en maximal volym på 10 μL), beroende på vad som är tillämpligt för varje transfektion, i separata 1,5 ml mikrocentrifugrör. Ett "no plasmid"-prov måste inkluderas som en kontroll för transfektion och antibiotikaval.
- Ta bort supernatanten efter centrifugering från steg 3.5 och återsuspendera försiktigt de infekterade röda blodkropparna i den beredda nukleofektorlösningen + plasmid-DNA (från steg 3.6).
- Överför suspensionen (nukleofektorlösning + plasmid + schizonter; max 110 μL) till elektroporeringskyvetter. Transfekt med lämpligt nukleofektorprogram (U-033, se Materialförteckning).
OBS: Se till att steg 3.8 till 3.10 utförs vid RT. - Tillsätt 100 μL komplett RPMI-media till kyvetten och överför hela lösningen (nu 200 μL total volym) till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och håll vid RT.
- Injicera 200 μL lösning av transfekterade parasiter i möss intravenöst (i.v.), arbeta för att minimera tiden mellan transfektionen och den slutliga injektionen i möss.
OBS: Transfekterade schizonter injiceras i möss mindre än 5 minuter efter elektroporering för att maximera protokollets effektivitet.
4. Urval av transfekterade parasiter
- Kontrollera parasiteminivåerna hos mössen som inokulerats med de transfekterade schizonterna dagligen från 2 d.p.i. för att verifiera infektionen.
- När infektionen är verifierad, börja läkemedelsval med oral administrering av läkemedlet i dricksvatten, som erbjuds ad libitum.
OBS: Pyrimetamin användes som den valbara läkemedelsmarkören för plasmiden. I detta fall tillsattes 17,5 mg pyrimetamin till 250 ml rent vatten (slutlig koncentration 70 mg/l). Dessutom tillsattes 10 g socker till detta vatten för att uppmuntra möss att konsumera det pyrimetaminhaltiga vattnet på ett adekvat sätt. - Övervaka parasitemi varannan dag med hjälp av blodutstryk gjord med 5 μl blod, med början 6 dagar efter påbörjad pyrimetaminbehandling. Avsaknaden av detekterbara parasiter efter 15 dagar indikerar en misslyckad transfektion; I det här fallet initierar du om processen från steg 1.1 för ett nytt försök.
- När parasitemi når minst 1 % överförs parasiterna till naiva B6-möss för att skapa parasitlager i blodstadiet. Fortsätt selektionen i de nyligen infekterade mössen tills parasitemien når 2%-5%, då generera bestånd och kryokonservera dem21.
5. Infektion av myggor med de transgena linjerna
- Infektera B6-möss med 200 μL blod som innehåller de utvalda parasiterna (2 x 105 infekterade röda blodkroppar/mus, i.v.). Bestäm parasitemi hos dessa möss på dagen för myggmatning och infektion. Parasitemi mellan 2%-5% är optimalt för infektion av myggor. När infektionen har verifierats ska den omedelbart överföras till honmyggor av honkön Anopheles stephensi enligt steg 5.2-5.4).
OBS: Inkubatorer som innehåller myggor för infektion bör hållas vid 20.5 °C, vid 80 % luftfuktighet och på en 12 timmars ljus/mörk cykel (lamporna tänds mellan 07:00 och 19:00). - Dagen före mygginfektion separerar du honmyggorna genom att placera en värmekälla ovanpå buren som innehåller både han- och honmyggor, till exempel en tunn plastblåsa eller handske fylld med vatten uppvärmt till 37 °C. Ta bort honmyggorna, som lockas till värmekällan, med hjälp av en insektssug och överför dessa till en separat, mindre bur för infektion.
OBS: Hanmyggor kan skiljas från honmyggor genom sin något reducerade kroppsstorlek och plymantenner. - Injicera de infekterade mössen med ett narkosmedel (t.ex. 2 % tribrometanol/avertin). Säkerställ fullständig anestesi genom att nypa ordentligt på fotdynan på varje mus. Om de inte reagerar är de tillräckligt nedsövda och redo att överföra infektionen till myggor.
- Placera de sövda mössen ovanpå de instängda honmyggorna (från steg 5.2) under sternal religgande. Sprid ut fram- och bakbenen manuellt för att ge den största ytan för myggmatning. Lämna de infekterade mössen över varje bur i totalt 15 minuter, kontrollera var 5:e minut för att se till att mössen inte är vakna. När utfodringen är klar, avliva mössen med hjälp av livmoderhalsluxation, eller enligt det institutionella djuranvändningsprotokollet, och kassera dem på ett säkert sätt.
6. Insamling av sporozoiter
- Kontrollera myggornas mitttarmar för oocystor vid cirka 10 dpi för att verifiera framgångsrik infektion och utveckling av Plasmodium i myggorna. Isolera myggans mellantarmar från buken genom att ta bort det terminala buksegmentet med en pincett. Visualisera mellantarmen under polariserat ljus för närvaron av oocystor22.
- Vildtypsporozoiter förväntas finnas i myggornas spottkörtlar 18-21 dagar efter att de ätit infekterade möss. På dag 18, dissekera 5-10 myggor för att bedöma antalet sporozoiter.
OBS: Myggor tvättas och dödas i etanol. Därefter tvättas döda myggor två gånger med PBS för att ta bort skräp före dissektion. - För att isolera och räkna sporozoiterna, ta försiktigt bort myggans huvud samtidigt som du trycker på myggans bröstkorg med en pincett eller en fin dissekerande nål. Spottkörtlarna sitter kvar på det borttagna huvudet (figur 2).
- Ta bort eventuellt ytterligare myggskräp från spottkörtlarna och placera det i ett mikrocentrifugrör som innehåller 400 μL myggdissektionsmedia (Dulbeccos modifierade Ealge-medium [DMEM] med 1 % musserum, 100 E/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin; se Materialförteckning).
- Bryt de isolerade spottkörtlarna genom att passera genom en 30 G nålspruta 15-20 gånger. Placera 10 μL av de störda spottkörtlarna i myggdissektionsmedia i en hemocytometer och räkna. Återsuspendera i önskad koncentration av myggdissektionsmedia eller PBS för injektion i möss, inokulering i cellkulturer eller långvarig kryokonservering23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att bestämma frekvensen och utvecklingen av schizonter är avgörande för att säkerställa att tillräckligt många livskraftiga parasiter är i det optimala stadiet för transfektion. Omogna schizonter kan skiljas från fullt mogna schizonter genom närvaron av färre merozoiter som inte fyller hela det intracellulära utrymmet i RBC (Figur 1B). Det är viktigt att notera att när man gör blodutstryk från odlat blod kan infekterade röda blodkroppar brytas upp, vilket resulterar i observation av fria, extracellulära merozoiter i blodutstryket (Figur 1). Sådana merozoiter räknas inte in i bedömningen av frekvensen av schizonter i steg 2.5.
Att ta bort spottkörtlar från myggor kan vara utmanande om användaren inte är bekant med myggfysiologi eller småskaliga dissektioner. Under isoleringen av spottkörtlarna från myggor, observera att körtlarnas genomskinlighet kan användas för att skilja dem från det ogenomskinliga myggskräpet (Figur 2). Räkningen av sporozoiter efter störning av körtlarna är mest effektiv vid 400x förstoring, och användningen av faskontrast gör det lättare att identifiera sporozoiterna i räknekammaren.
Vi har visat att över 90 % av Plasmodium i hepatocyter möjligen elimineras genom cellinneboende immunmekanismer23. Därför förväntar vi oss att parasiter i ett stort antal hepatocyter kommer att genomgå lys. Som ett verktyg för att bestämma lysen av Plasmodium eller dess PV i värdhepatocyterna, genererade vi transgena hepatocyter som uttrycker GFP 1-10-subenheten (Hepa-GFP1-10) och transgen P. berghei som uttrycker och transporterar GFP 11-subenheten till dess PV (Pb-GFP 11). GFP 1-10-fragmentet, som innehåller de rester som utgör GFP-kromoforen, är icke-fluorescerande i sig självt och fluorescerar endast vid associering med GFP 11, möjligen genom självkomplementering. Förutom att funktionellt validera transgenes i Plasmodium, indikerade genereringen av grön fluorescenssignal i de Pb-GFP 11-infekterade Hepa-GFP 1-10-värdcellerna lysen av PV (figur 3). Vildtyp P. berghei-infekterade Hepa-GFP 1-10-celler eller Pb-GFP11-infekterade Hepa 1-6-celler av vildtyp kunde inte generera någon grön fluorescenssignal (data visas inte). Vi anser att lysen av PV är ett viktigt föregående steg i förstörelsen av leverstadiet Plasmodium. Pb-GFP 11-sporozoiterna färgades också med CTV för att visualisera parasiterna i hepatocyterna. CTV förväntas läcka in i värdcellen endast vid lys av själva parasiten (figur 3). Den dispergerade CTV-signalen som observerats i värdhepatocyten indikerar sannolikt att parasiten är lyserad i hepatocyten. Den nära överlappningen mellan CTV- och GFP-signalerna förväntas med samtidig lys av både PV och parasiten. Detta system gör det möjligt för oss att undersöka de distinkta bidragen från de enskilda värdmolekylerna i medfödda och cellinneboende immunvägar för att modulera lysen av Plasmodium eller dess PV.
Figur 1: Plasmodium berghei schizonts. Representativa ljusmikroskopibilder föreställande P. berghei-schizonter i parasiterad musblododling (16 h) färgad med Giemsa-färg. Pilar indikerar fullt mogna (A) eller omogna (B) schizonter. Skalstaplar: 5 μm . Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Myggors spottkörtlar och sporozoiter. Ljusmikroskopibilder som visar spottkörtlar isolerade från Pb-GFP11-infekterade honmyggor av typen Anopheles . (A) Bild av ett mygghuvud med spottkörtlarna (pilen) fortfarande intakta under dissektionen, innan den avlägsnas och bearbetas vidare (skalstreck: 1 mm). (B,C) Representativa bilder av spottkörtlar vid lägre (B) och högre (C) förstoringar (skalstreck: 0,1 mm respektive 0,04 mm). Sporozoiter kan ses både inuti och utanför körteln (pilen). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Detektion av lys av Plasmodium och dess parasitofora vakuol i värdhepatocyter. Differentiell interferenskontrast (DIC) och pseudofärgade immunofluorescensbilder med överlagring som visar Hepa-GFP 1-10 hepatocyter infekterade med Pb-GFP11 sporozoiter. Sporozoiter färgades med CTV före infektionen (skalstreck: 10 μm). Totalt 1 x 106 Hepa-GFP 1-10 hepatocyter pläterades i en 35/10 mm odlingsskål med glasbotten och inokulerades med 3 x 10 5PbGFP11 sporozoiter 4 timmar efter plätering. Bilderna togs med ett inverterat fluorescerande mikroskop vid 600x förstoring och 16 timmar efter infektion. Förkortningar: DIC = differentiell interferenskontrast. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har använt ovanstående protokoll i vårt laboratorium för att skapa flera linjer av transgena P. berghei-parasiter. Även om det är optimerat för P. berghei, har vi också framgångsrikt använt detta protokoll för att generera transgena P. yoelii sporozoiter. Efter att ha injicerat de transfekterade schizonterna i möss kan parasiter vanligtvis inte påvisas senare än 3 dpi i alla grupper, inklusive kontrollen utan plasmid. Selektionen påbörjas först när parasitemi har upptäckts för att säkerställa parasiternas livskraft efter elektroporering. Dessutom, vid förberedelse för val av läkemedel, kan försurning av vattnet med saltsyra, vilket sänker pH till 4, vara nödvändigt för att pyrimetamin ska lösas upp helt. Vi förväntar oss fullständig eliminering av parasiterna från kontrollgruppen utan plasmid, medan mössen som inokulerats med transfektanterna förblir infekterade. Clearance hos kontrollmössen sker vanligtvis 5-8 dagar efter påbörjad behandling med pyrimetamin. Värt att notera är att B6-möss som infekterats med P. berghei kan visa tecken på experimentell cerebral malaria och duka under för döden (följ humana endpoints enligt riktlinjer för institutionell djuranvändning), vanligtvis i intervallet 6-12 d.p.i. Detta kan undvikas genom att utföra läkemedelsselektion av transfektanterna i TCRaKO-möss25, eller genom att överföra de parasiter som genomgår selektion vid 5 dpi till nya B6-mottagare och fortsätta selektion i de senare. Transgenes i Plasmodium kan verifieras med hjälp av en mängd olika metoder, såsom genetiska screeningar, fenotypisk bedömning eller vinst eller förlust av specifika funktioner.
Det är viktigt att notera att valet av en lämplig plasmid är avgörande för framgångsrik transfektion och retention av det introducerade DNA:t i parasiten. Plasmider kan också visa begränsad effekt när det gäller att uppnå transgenes mellan olika Plasmodium-arter. Till exempel pSKspGFP11-plasmiden (baserad på PL0017; BEI-resurser) som vi använde för att generera PbGFP11 kan också användas för att effektivt generera transgen P. yoelli, men inte P. chabaudi. För att generera pSKspGFP11 ersatte vi GFP-mutant3-sekvensen i den överordnade pL0017-plasmiden (BEI-resurser) med sju tandemsekvenser av den 11:e β-strängen av super-folder GFP, GFP 11 (GFP11-7X)18. Även om linjärisering av plasmiderna före transfektion möjliggör bättre genomisk integration, visar både linjära och cirkulära plasmider liknande transfektionseffektivitet med hjälp av vårt protokoll. Plasmodiumlinjerna som genereras genom transfektion med cirkulära plasmider verkar också behålla sina transgena egenskaper under loppet av genereringen av sporozoiter i myggorna.
Noterbart är att endast honmyggor kan hysa och överföra Plasmodium. Efter isolering av myggor rekommenderas det att inte förse de isolerade myggorna med en källa till sockervatten i detta skede. Att svälta dem på detta sätt skulle öka risken för att hanmyggor som oavsiktligt kan ha överförts dör, och att honorna matar blodet mer effektivt från de infekterade mössen. Vi återför vanligtvis sockervattnet 1 dag efter att infektionen överförts från möss till myggor. Det är värt att notera att tidsramen för utveckling och mognad av sporozoiten i myggor kan variera mellan transgena Plasmodium-linjer . Därför är det viktigt att bedöma antalet sporozoiter i spottkörtlarna vid flera tidpunkter efter infektion innan ett protokoll som är specifikt för varje transgen linje upprättas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar att det inte föreligger någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Healths anslag AI168307 till SPK. Vi tackar UGA CTEGD Flow Cytometry Core och UGA CTEGD Microscopy Core. Vi erkänner också bidragen från Ash Pathak, Anne Elliot och personalen på UGA Sporocore för att optimera protokollet. Vi vill tacka Dr. Daichi Kamiyama för värdefulla insikter, diskussioner och de moderplasmider som innehåller GFP11 och GFP 1-10. Vi vill också tacka medlemmarna i Kurup-labbet för deras ständiga stöd, tålamod och uppmuntran.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II - Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
References
- WHO.
- Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K.
- Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
- Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P.
- Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
- Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
- Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
- Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
- Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
- Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
- Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
- Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
- Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
- Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
- Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
- Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
- de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
- Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
- Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
- Bowers, C., et al.
- Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).
