Summary
Le paludisme est transmis par l’inoculation du stade sporozoïte de Plasmodium par des moustiques infectés. Le plasmodium transgénique nous a permis de mieux comprendre la biologie du paludisme et a contribué directement aux efforts de développement d’un vaccin contre le paludisme. Nous décrivons ici une méthodologie simplifiée pour générer des sporozoïtes transgéniques de Plasmodium berghei .
Abstract
Le paludisme est une maladie mortelle causée par le parasite Plasmodium et est transmis par la piqûre de moustiques anophèles femelles. Le stade sporozoïte de Plasmodium déposé par les moustiques dans la peau des hôtes vertébrés subit une phase de développement obligatoire dans le foie avant d’initier le paludisme clinique. Nous savons peu de choses sur la biologie du développement de Plasmodium dans le foie ; L’accès au stade de sporozoïte et la capacité de modifier génétiquement ces sporozoïtes sont des outils essentiels pour étudier la nature de l’infection à Plasmodium et la réponse immunitaire qui en résulte dans le foie. Nous présentons ici un protocole complet pour la génération de sporozoïtes transgéniques de Plasmodium berghei . Nous modifions génétiquement le stade sanguin de P. berghei et utilisons cette forme pour infecter les moustiques anophèles lorsqu’ils prennent un repas de sang. Une fois que les parasites transgéniques se sont développés chez les moustiques, nous isolons le stade sporozoïte du parasite des glandes salivaires des moustiques pour des expériences in vivo et in vitro . Nous démontrons la validité du protocole en générant des sporozoïtes d’une nouvelle souche de P. berghei exprimant la sous-unité 11 de la protéine fluorescente verte (GFP) (GFP11), et montrons comment elle pourrait être utilisée pour étudier la biologie du paludisme au stade hépatique.
Introduction
Malgré les progrès réalisés dans la mise au point de médicaments et la recherche sur la prévention et le traitement du paludisme, la charge mondiale du paludisme reste élevée. Plus d’un demi-million de personnes meurent du paludisme chaque année, les taux de mortalité les plus élevés étant observés chez les enfants vivant dans des régions où le paludisme est endémique, comme l’Afrique subsaharienne1. Le paludisme est causé par le parasite Plasmodium, qui est transmis à l’homme par la piqûre de moustiques anophèles femelles porteurs du parasite dans leurs glandes salivaires. Le stade infectieux de Plasmodium - les sporozoïtes - se déposent dans la peau des hôtes vertébrés lors d’un repas sanguin et voyagent dans la circulation sanguine pour infecter les cellules hépatiques, où ils subissent un développement obligatoire (constituant le paludisme pré-érythrocytaire) avant d’infecter les érythrocytes. L’infection des érythrocytes initie le stade sanguin du paludisme et est responsable de la totalité de la morbidité et de la mortalité associées à la maladie 2,3.
La nature obligatoire du développement pré-érythrocytaire de Plasmodium en a fait une cible attrayante pour les efforts de développement de vaccins et de médicaments prophylactiques4. L’accès aux sporozoïtes de Plasmodium est une condition préalable à l’étude de la biologie du paludisme pré-érythrocytaire, ainsi qu’à la mise au point de vaccins ou de médicaments ciblant le stade hépatique. De plus, notre capacité à générer des sporozoïtes de Plasmodium génétiquement modifiés a joué un rôle déterminant dans le succès de ces efforts de recherche 5,6,7,8,9. Des lignées transgéniques de Plasmodium exprimant des protéines rapporteures fluorescentes ou luminescentes nous ont permis de suivre leur développement in vivo et in vitro10,11. Les parasites génétiquement atténués (GAP), générés par la délétion de plusieurs gènes de Plasmodium, font également partie des candidats vaccins les plus prometteurs12,13.
Les modèles de paludisme chez les rongeurs et les primates non humains nous ont aidés à comprendre les mécanismes des interactions hôte-parasite dans le paludisme humain en raison des similitudes de la biologie et du cycle de vie entre les espèces de Plasmodium 14. L’utilisation d’espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, mais pas les humains (p. ex., P. berghei) permet de maintenir le cycle de vie complet du parasite et de générer des sporozoïtes infectieux pour l’étude du paludisme au stade hépatique dans un contexte contrôlé de niveau de biosécurité 1. Il existe déjà divers protocoles distincts pour la génération de parasites transgéniques sanguins Plasmodium 15, l’infection des moustiques16 et l’isolement des sporozoïtes17. Nous décrivons ici un protocole complet combinant ces méthodologies afin de générer et d’isoler des sporozoïtes transgéniques de P. berghei, en utilisant la nouvelle souche transgénique PbGFP11 comme exemple. PbGFP 11 trafique le 11e β brin de la protéine fluorescente verte (GFP) super-dossier, GFP11, dans la vacuole parasitophore (PV) générée dans les hépatocytes de l’hôte. PbGFP 11 est utilisé en conjonction avec des hépatocytes transgéniques (fond Hepa1-6) exprimant des résidus qui constituent le fragment GFP 1-10 (GFP 1-10) dans le cytoplasme (cellules Hepa GFP 1-10). PbGFP11 rapporte la lyse PV dans les hépatocytes de l’hôte par auto-complémentation et la reformation de la GFP fonctionnelle et du signal de fluorescence vert18. Il convient de noter que GFP 11 est codé sous la forme d’une série de sept séquences en tandem dans PbGFP11 afin d’améliorer le signal de fluorescence résultant. En colorant les sporozoïtes PbGFP11 avec le colorant cytoplasmique CellTrace Violet (CTV), nous pouvons suivre les parasites. La lyse de ces parasites intracellulaires colorés par CTV entraîne elle-même une fuite de CTV dans le cytoplasme de la cellule hôte et une coloration de la cellule hôte. En plus de visualiser et de distinguer la lyse de Plasmodium PV et/ou du parasite dans les hépatocytes de l’hôte, ce système peut être utilisé de manière fiable pour étudier les voies immunitaires responsables de l’un ou l’autre de ces processus, par la perturbation génétique ou thérapeutique des composants moléculaires de ces voies.
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Protocol
Toutes les recherches impliquant des animaux vertébrés dans notre laboratoire ont été effectuées conformément aux directives et protocoles d’utilisation des animaux de l’Université de Géorgie.
1. Génération de souris infectées par P. berghei
- Initier l’infection au stade sanguin chez les souris mâles ou femelles C57BL/6 (B6) âgées de 6 à 8 semaines à l’aide de parasites P. berghei de type sauvage. Pour ce faire, transférer du sang cryoconservé infecté par P. berghei (2 x 105 globules rouges infectés), reconstitué dans 400 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), dans une ou deux souris donneuses par voie intrapéritonéale (i.p.).
- Transférer le sang frais prélevé par saignement rétro-orbitaire des souris donneuses à 5 jours après l’infection (d.p.i.) à deux souris B6 naïves. Pour ce faire, prélevez 200 μL de sang, reconstituez avec 300 μL de PBS et injectez 200 μL i.p. aux souris receveuses. S’assurer que la parasitémie chez les donneurs à ce stade est de 2 % à 5 %19,20.
- Surveiller la parasitémie telle que décrite précédemment19,20, à partir de 2 d.p.i. chez les receveurs. Lorsque la parasitémie varie de 3 % à 5 % (environ 5 d.p.i.), euthanasiez les souris receveuses, puis prélevez du sang par ponction cardiaque ou hémorragie rétro-orbitaire. Euthanasier les souris en inhalant du dioxyde de carbone suivi d’une luxation cervicale, ou selon les directives de l’établissement.
REMARQUE : Une fois que la parasitémie dépasse 5 %, l’efficacité de la transfection peut être réduite en raison de la prévalence accrue des globules rouges infectés à plusieurs reprises.
2. Génération de schizontes en culture
- Prélever le sang des souris infectées à l’étape 1.3 (environ 2 mL au total de deux souris) dans 5 mL de solution d’Alsever (voir le tableau des matériaux) dans un environnement stérile. Effectuez les étapes 2.1 à 3.12 dans des conditions stériles.
REMARQUE : Les conditions stériles comprennent le port de gants, l’essuyage des gants et des surfaces contenant 70 % d’éthanol, l’utilisation de consommables et de matériaux stériles et le travail dans une enceinte de sécurité biologique. - Centrifuger le sang pendant 8 min à 450 x g à température ambiante (RT). Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu RPMI complet (RPMI 1640 avec 20 % de sérum de veau fœtal [FBS] et 1 % de pénicilline-streptomycine, v/v).
- Centrifuger pendant 8 min à 450 x g à RT. Remettre le granulé en suspension dans 25 mL de milieu RPMI complet et le transférer dans un flacon de culture T75 muni d’un bouchon filtrant.
- Placer dans un incubateur à 36,5 °C et 5 % de CO2, en agitant doucement pour maintenir les cellules en suspension pendant 16 h.
- À 16 h, vérifier le développement du schizonte. Pour ce faire, prélever 500 μL de l’échantillon, centrifuger à 450 x g pendant 8 min, remettre la pastille en suspension dans 10 μL de milieu RPMI complet et préparer un frottis sanguin fin. Colorer le frottis sanguin avec la coloration de Giemsa19 (voir le tableau des matériaux) et déterminer la fréquence des schizontes (figure 1).
- Pour une efficacité optimale de la transfection, 60 à 70 % des parasites doivent être au stade schizonte. Si moins que ce seuil est déterminé, poursuivre la culture comme à l’étape 2.4 et vérifier toutes les heures que le seuil ci-dessus est franchi avant de continuer.
3. Transfection de Plasmodium schizontes
- Préparer un tampon de centrifugation à gradient en reconstituant 13 mL de milieu de stockage à gradient de densité (voir le tableau des matériaux) avec 1,44 mL de NaCl à 1,5 M et 5,6 mL de NaCl à 0,15 M dans un tube de centrifugation de 50 mL.
- Transférez 25 mL d’hémoculture dans un tube de centrifugation neuf de 50 mL. Déposer délicatement 20 mL de tampon de centrifugation à gradient au fond du tube de centrifugation à l’aide d’une pipette en verre étroite pour créer une colonne de gradient. Veillez à ne pas perturber les couches de liquide et les interfaces et assurez-vous d’une séparation claire entre le tampon et le fluide.
- Centrifuger pendant 20 min à 450 x g sans frein à RT. À l’aide d’une pipette Pasteur, retirer délicatement la couche de schizonte15 située à l’interface du milieu de culture et du tampon de centrifugation à gradient, et la placer dans un nouveau tube de centrifugation de 50 mL.
- Remettre en suspension les schizontes isolés dans un milieu RPMI complet et porter le volume total à 40 mL. Centrifuger à 450 x g pendant 8 min à RT et jeter le surnageant.
- Remettre les schizontes en suspension dans 10 mL de milieu RPMI complet. Ensuite, transvasez 1 mL de cette solution dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL pour chaque transfection, et centrifugez à 16 000 x g pendant 5 s pour granuler les globules rouges infectés. Les globules rouges infectés dérivés de deux souris de la manière ci-dessus peuvent être utilisés pour un maximum de 10 transfections distinctes.
- Combiner 100 μL du tampon d’électroporation (solution de nucléofecteur de la trousse d’électroporation ; voir le tableau des matériaux) à RT avec 5 μg d’ADN plasmidique cible circulaire ou linéarisé (dans un volume maximal de 10 μL), selon le cas, pour chaque transfection dans des tubes de microcentrifugation séparés de 1,5 mL. Un échantillon « sans plasmide » doit être inclus comme témoin pour la transfection et la sélection d’antibiotiques.
- Retirer le surnageant après centrifugation de l’étape 3.5 et remettre soigneusement en suspension les globules rouges infectés dans la solution de nucléofecteur préparée + ADN plasmidique (à partir de l’étape 3.6).
- Transférer la suspension (solution de nucléofecteur + plasmide + schizontes ; 110 μL maximum) dans des cuvettes d’électroporation. Transfect à l’aide d’un programme de nucléofecteur approprié (U-033, voir Tableau des matériaux).
REMARQUE : Assurez-vous que les étapes 3.8 à 3.10 sont effectuées à RT. - Ajouter 100 μL de média RPMI complet dans la cuvette et transférer la solution entière (maintenant 200 μL de volume total) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et maintenir à RT.
- Injecter la solution de 200 μL de parasites transfectés à des souris par voie intraveineuse (i.v.), en minimisant le temps entre la transfection et l’injection finale chez la souris.
NOTE : Les schizontes transfectés sont injectés à des souris moins de 5 minutes après l’électroporation afin de maximiser l’efficacité du protocole.
4. Sélection des parasites transfectés
- Vérifier quotidiennement les niveaux de parasitémie chez les souris inoculées avec les schizontes transfectés à partir de 2 d.p.i. pour vérifier l’infection.
- Une fois l’infection vérifiée, commencez la sélection du médicament en utilisant l’administration orale du médicament dans l’eau potable, offert ad libitum.
REMARQUE : La pyriméthamine a été utilisée comme marqueur médicamenteux sélectionnable pour le plasmide. Dans ce cas, 17,5 mg de pyriméthamine ont été ajoutés à 250 mL d’eau propre (concentration finale de 70 mg/L). De plus, 10 g de sucre ont été ajoutés à cette eau pour encourager une consommation adéquate de l’eau contenant de la pyriméthamine par les souris. - Surveiller la parasitémie tous les deux jours à l’aide de frottis sanguins effectués avec 5 μl de sang, à partir de 6 jours après le début du traitement à la pyriméthamine. L’absence de parasites détectables après 15 jours indique l’échec de la transfection ; Dans ce cas, relancez le processus à partir de l’étape 1.1 pour une nouvelle tentative.
- Lorsque la parasitémie atteint au moins 1 %, transférez les parasites à des souris B6 naïves pour la création de stocks de parasites au stade sanguin. Poursuivre la sélection chez les souris nouvellement infectées jusqu’à ce que la parasitémie atteigne 2 à 5 %, après quoi générer des stocks et les cryoconserver21.
5. Infection des moustiques par les lignées transgéniques
- Infecter des souris B6 avec 200 μL de sang contenant les parasites sélectionnés (2 x 105 globules rouges infectés/souris, i.v.). Déterminer la parasitémie chez ces souris le jour de l’alimentation et de l’infection par les moustiques. Une parasitémie entre 2% et 5% est optimale pour l’infection des moustiques. Une fois vérifiée, transférez immédiatement l’infection aux moustiques femelles Anopheles stephensi selon les étapes 5.2 à 5.4).
REMARQUE : Les incubateurs contenant des moustiques infectés doivent être maintenus à 20,5 °C, à 80% d’humidité et sur un cycle lumière/obscurité de 12 h (lumières allumées entre 07h00 et 19h00). - La veille de l’infection par les moustiques, séparez les moustiques femelles en plaçant une source de chaleur sur le dessus de la cage contenant à la fois les moustiques mâles et femelles, comme une vessie ou un gant en plastique mince rempli d’eau chauffée à 37 °C. Retirez les moustiques femelles, qui sont attirées par la source de chaleur, à l’aide d’un aspirateur à insectes et transférez-les dans une cage séparée et plus petite pour l’infection.
REMARQUE : Les moustiques mâles peuvent être distingués des moustiques femelles par leur taille corporelle légèrement réduite et leurs antennes plumeuses. - Injecter aux souris infectées un anesthésique général (p. ex., 2 % de tribromoéthanol/avertin). Assurez une anesthésie complète en pinçant fermement le coussinet plantaire de chaque souris. S’ils ne réagissent pas, ils sont suffisamment sédatés et prêts à transmettre l’infection aux moustiques.
- Placez les souris anesthésiées sur les moustiques femelles en cage (à partir de l’étape 5.2) sous le décubitus sternal. Écartez manuellement les pattes avant et arrière pour fournir la plus grande surface pour l’alimentation des moustiques. Laissez les souris infectées au-dessus de chaque cage pendant un total de 15 minutes, en vérifiant toutes les 5 minutes pour vous assurer que les souris ne sont pas réveillées. Une fois l’alimentation terminée, euthanasiez les souris à l’aide d’une luxation cervicale ou conformément au protocole d’utilisation des animaux de l’établissement, et éliminez-les en toute sécurité.
6. Collection de sporozoïtes
- Vérifier la présence d’oocystes dans l’intestin moyen des moustiques à environ 10 d.p.i. pour vérifier le succès de l’infection et le développement de Plasmodium chez les moustiques. Isolez l’intestin moyen du moustique de l’abdomen en enlevant le segment abdominal terminal à l’aide d’une pince. Visualisez l’intestin moyen sous une lumière polarisée pour détecter la présence d’oocystes22.
- On s’attend à ce que les sporozoïtes de type sauvage soient présents dans les glandes salivaires des moustiques 18 à 21 jours après s’être nourris de souris infectées. Au jour 18, disséquez 5 à 10 moustiques pour évaluer le nombre de sporozoïtes.
REMARQUE : Les moustiques sont lavés et tués dans de l’éthanol. Par la suite, les moustiques morts sont lavés deux fois avec du PBS pour éliminer les débris avant la dissection. - Pour isoler et compter les sporozoïtes, retirez délicatement la tête du moustique tout en appliquant une pression sur le thorax du moustique à l’aide d’une pince ou d’une fine aiguille à disséquer. Les glandes salivaires restent attachées à la tête enlevée (figure 2).
- Retirez tous les débris de moustiques supplémentaires des glandes salivaires et placez-les dans un tube de microcentrifugation contenant 400 μL de milieu de dissection de moustiques (milieu Ealge modifié de Dulbecco [DMEM] avec 1 % de sérum de souris, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine ; voir le tableau des matériaux).
- Perturber les glandes salivaires isolées en passant 15 à 20 fois dans une seringue aiguilletée de 30 G. Placez 10 μL des glandes salivaires perturbées dans le milieu de dissection des moustiques dans un hémocytomètre et comptez. Remise en suspension à la concentration souhaitée de milieu de dissection de moustiques ou de PBS pour injection chez la souris, inoculation dans des cultures cellulaires ou cryoconservation à long terme23,24.
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Representative Results
Il est essentiel de déterminer la fréquence et le développement des schizontes pour s’assurer qu’un nombre suffisant de parasites viables sont au stade optimal pour la transfection. Les schizontes immatures peuvent être différenciés des schizontes complètement matures par la présence d’un nombre réduit de mérozoïtes qui ne remplissent pas tout l’espace intracellulaire des globules rouges (figure 1B). Il est important de noter que lors de la réalisation de frottis sanguins à partir de sang cultivé, les globules rouges infectés peuvent s’ouvrir, ce qui entraîne l’observation de mérozoïtes extracellulaires libres dans le frottis sanguin (Figure 1). Ces mérozoïtes ne sont pas pris en compte dans l’évaluation de la fréquence des schizontes à l’étape 2.5.
L’ablation des glandes salivaires des moustiques peut être difficile si l’utilisateur n’est pas familier avec la physiologie des moustiques ou les dissections à petite échelle. Lors de l’isolement des glandes salivaires des moustiques, notez que la translucidité des glandes peut être utilisée pour les différencier des débris opaques des moustiques (Figure 2). Le comptage des sporozoïtes à la suite d’une perturbation des glandes est plus efficace à un grossissement de 400x, et l’utilisation du contraste de phase permet une identification plus facile des sporozoïtes dans la chambre de comptage.
Nous avons montré que plus de 90 % des Plasmodium contenus dans les hépatocytes sont possiblement éliminés par des mécanismes immunitaires intrinsèques aux cellules23. Par conséquent, nous nous attendons à ce que les parasites d’un nombre considérable d’hépatocytes subissent une lyse. En tant qu’outil pour déterminer la lyse de Plasmodium ou de sa PV dans les hépatocytes de l’hôte, nous avons généré des hépatocytes transgéniques exprimant la sous-unité GFP 1-10 (Hepa-GFP1-10) et des P. berghei transgéniques exprimant et trafiquant la sous-unité GFP 11 vers sa PV (Pb-GFP 11). Le fragment GFP1-10, qui contient les résidus qui constituent le chromophore GFP, n’est pas fluorescent par lui-même et n’est fluorescent que lorsqu’il est associé à GFP11, potentiellement par auto-complémentation. En plus de valider fonctionnellement la transgénèse chez Plasmodium, la génération d’un signal de fluorescence verte dans les cellules hôtes Hepa-GFP1-10 infectées par le Pb-GFP 11 a indiqué la lyse du PV (Figure 3). Les cellules Hepa-GFP 1-10 infectées par P. berghei de type sauvage ou les cellules Hepa1-6 de type sauvage infectées par Pb-GFP11 n’ont pas réussi à générer de signal de fluorescence verte (données non présentées). Nous considérons que la lyse du PV est une étape clé dans la destruction du stade hépatique Plasmodium. Les sporozoïtes Pb-GFP11 ont également été colorés au CTV pour visualiser les parasites dans les hépatocytes. On s’attend à ce que le CTV ne s’infiltre dans la cellule hôte qu’au moment de la lyse du parasite lui-même (figure 3). Le signal CTV dispersé observé dans l’hépatocyte hôte indique probablement la lyse du parasite à l’intérieur de l’hépatocyte. On s’attend à ce que le chevauchement étroit entre les signaux CTV et GFP se produise avec la lyse concomitante du PV et du parasite. Ce système nous permet d’interroger les contributions distinctes des molécules hôtes individuelles dans les voies immunitaires innées et intrinsèques aux cellules dans la modulation de la lyse de Plasmodium ou de son PV.
Figure 1 : Schizontes de Plasmodium berghei. Images représentatives de microscopie optique représentant des schizontes de P. berghei dans des hémocultures de souris parasitées (16 h) colorées à la coloration de Giemsa. Les flèches indiquent les schizontes complètement matures (A) ou immatures (B). Barres d’échelle : 5 μm . Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Glandes salivaires et sporozoïtes des moustiques. Images de microscopie optique montrant des glandes salivaires isolées de moustiques anophèles femelles infectés par Pb-GFP11. (A) Image d’une tête de moustique dont les glandes salivaires (flèche) sont encore intactes pendant la dissection, avant leur retrait et leur traitement ultérieur (barre d’échelle : 1 mm). (B,C) Images représentatives des glandes salivaires à des grossissements inférieurs (B) et supérieurs (C) (barres d’échelle : 0,1 mm et 0,04 mm, respectivement). Les sporozoïtes peuvent être vus à la fois à l’intérieur et à l’extérieur de la glande (flèche). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Détection de la lyse de Plasmodium et de sa vacuole parasitophore dans les hépatocytes de l’hôte. Images de contraste interférentiel différentiel (DIC) et d’immunofluorescence pseudo-colorée avec superposition représentant des hépatocytes Hepa-GFP1-10 infectés par des sporozoïtes Pb-GFP11. Les sporozoïtes ont été colorés au CTV avant l’infection (échelle : 10 μm). Au total, 1 x 106 hépatocytes Hepa-GFP 1-10 ont été plaqués dans une boîte de culture à fond en verre de 35/10 mm et inoculés avec 3 x 10 5 sporozoïtes PbGFP11 4 h après le placage. Les images ont été prises avec un microscope fluorescent inversé à un grossissement de 600x et 16 h après l’infection. Abréviations : DIC = contraste d’interférence différentielle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous avons utilisé le protocole ci-dessus dans notre laboratoire pour créer plusieurs lignées de parasites transgéniques P. berghei. Bien qu’il soit optimisé pour P. berghei, nous avons également utilisé avec succès ce protocole pour générer des sporozoïtes transgéniques de P. yoelii. Après avoir injecté les schizontes transfectés à des souris, les parasites sont généralement détectables au plus tard à 3 d.p.i. dans tous les groupes, y compris le témoin sans plasmide. La sélection n’est commencée qu’une fois que la parasitémie a été détectée afin d’assurer la viabilité des parasites après électroporation. De plus, lors de la préparation à la sélection du médicament, l’acidification de l’eau avec de l’acide chlorhydrique, abaissant le pH à 4, peut être nécessaire pour que la pyriméthamine se dissolve complètement. Nous nous attendons à ce que les parasites soient complètement éliminés par le groupe témoin sans plasmide, tandis que les souris inoculées avec les transfectants restent infectées. La clairance chez les souris témoins se produit généralement 5 à 8 jours après le début du traitement à la pyriméthamine. Il convient de noter que les souris B6 infectées par P. berghei peuvent présenter des signes de paludisme cérébral expérimental et succomber à la mort (suivre les critères d’évaluation sans cruauté conformément aux directives d’utilisation des animaux en établissement), généralement dans un intervalle de 6 à 12 d.p.i. Cela peut être évité en effectuant la sélection médicamenteuse des transfectants chez les souris TCRaKO25, ou en transférant les parasites soumis à la sélection à 5 d.p.i. à de nouveaux receveurs B6 et en poursuivant la sélection chez ces dernières. La transgénèse chez Plasmodium peut être vérifiée à l’aide de diverses approches, telles que les criblages génétiques, l’évaluation phénotypique ou le gain ou la perte de fonctions spécifiques.
Il est important de noter que la sélection d’un plasmide approprié est cruciale pour la transfection réussie et la rétention de l’ADN introduit dans le parasite. Les plasmides peuvent également montrer une efficacité limitée dans la transgénèse entre différentes espèces de Plasmodium. Par exemple, le plasmide pSKspGFP11 (basé sur PL0017 ; BEI) que nous avons utilisées pour générer PbGFP11 peut également être utilisé pour générer efficacement P. yoelli transgénique, mais pas P. chabaudi. Pour générer pSKspGFP11, nous avons remplacé la séquence du mutant GFP3 dans le plasmide parent pL0017 (ressources BEI) par sept séquences en tandem du 11e β brin du super-dossier GFP, GFP 11 (GFP11-7X)18. Bien que la linéarisation des plasmides avant la transfection permette une meilleure intégration génomique, les plasmides linéaires et circulaires présentent des efficacités de transfection similaires en utilisant notre protocole. Les lignées de Plasmodium générées par transfection avec des plasmides circulaires semblent également conserver leurs propriétés transgéniques au cours de la génération de sporozoïtes chez les moustiques.
Notamment, seules les moustiques femelles peuvent héberger et transmettre Plasmodium. Suite à l’isolement des moustiques, il est recommandé de ne pas fournir aux moustiques isolés une source d’eau sucrée à ce stade. Les affamer de cette manière augmenterait le risque de mort des moustiques mâles qui auraient pu être transférés par inadvertance, et les femelles se nourriraient plus efficacement du sang des souris infectées. Nous retournons généralement l’eau sucrée 1 jour après avoir transféré l’infection des souris aux moustiques. Il est à noter que la période de développement et de maturation du sporozoïte chez les moustiques peut varier d’une lignée de Plasmodium transgénique à l’autre. Par conséquent, il est important d’évaluer le nombre de sporozoïtes dans les glandes salivaires à plusieurs moments après l’infection avant qu’un protocole spécifique à chaque lignée transgénique ne soit établi.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les AI168307 de subvention des National Institutes of Health à SPK. Nous remercions le noyau de cytométrie en flux CTEGD de l’UGA et le noyau de microscopie CTEGD de l’UGA. Nous reconnaissons également les contributions d’Ash Pathak, d’Anne Elliot et du personnel de l’UGA Sporocore dans l’optimisation du protocole. Nous tenons à remercier le Dr Daichi Kamiyama pour ses précieuses informations, ses discussions et les plasmides parents contenant la GFP11 et la GFP 1-10. Nous tenons également à remercier les membres du laboratoire Kurup pour leur soutien constant, leur patience et leurs encouragements.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II - Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
References
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