Summary
Ce travail développe un test d’absorption d’anticorps pour l’imagerie intra-lignée de la signalisation Notch / DeltaD dans la division des progéniteurs de la glie radiale du cerveau embryonnaire du poisson zèbre.
Abstract
La division cellulaire asymétrique (DCA), qui produit deux cellules filles de destins différents, est fondamentale pour générer la diversité cellulaire. Dans les organes en développement des invertébrés et des vertébrés, la division asymétrique des progéniteurs génère un Notchhi auto-renouvelant et un Notchlo différenciant une fille différenciatrice. Dans le cerveau embryonnaire du poisson-zèbre, les progéniteurs de la glie radiale (RGP) - les principales cellules souches neurales des vertébrés - subissent principalement une DCA pour donner naissance à un neurone RGP et un neurone différenciant. La clarté optique et la facilité d’accès des embryons de poisson zèbre les rendent idéaux pour l’imagerie in vivo en accéléré afin de visualiser directement comment et quand l’asymétrie de la signalisation Notch est établie pendant la DCA. Des études récentes ont montré que l’endocytose dynamique du ligand Notch DeltaD joue un rôle crucial dans la détermination du destin cellulaire pendant la DCA, et le processus est régulé par le régulateur de polarité conservé au cours de l’évolution Par-3 (également connu sous le nom de Pard3) et le complexe moteur de dynéine. Pour visualiser les schémas de trafic in vivo des endosomes de signalisation Notch dans les RGP mitotiques, nous avons développé ce test d’absorption d’anticorps. En utilisant le test, nous avons découvert la dynamique des endosomes contenant DeltaD pendant la division RGP.
Introduction
La signalisation Notch contrôle la décision et la structuration du destin cellulaire au cours du développement chez les métazoaires1, et des études récentes ont montré que la signalisation Notch dans la division des cellules souches dépend principalement du trafic endocytaire 2,3. Endocytosed Notch / Delta peut activer la signalisation Notch dans le noyau et améliorer la transcription des gènes ciblesNotch 4,5,6. Le trafic endosomal directionnel Notch/Delta a été observé pour la première fois dans les cellules précurseurs d’organes sensoriels (SOP) de la drosophile au cours de sa division cellulaire asymétrique (DCA), ce qui a entraîné une activité de signalisation Notch plus élevée dans pIIa que dans pIIb 7,8. Des tests d’absorption d’anticorps avec des anticorps anti-Delta et anti-Notch ont été appliqués pour surveiller le processus endocytaire dans les cellules SOP mitotiques. Les endosomes Notch/DeltaD se déplacent avec une protéine motrice kinésine vers le fuseau central pendant la cytocinèse et sont transloqués de manière asymétrique dans la cellule pIIa en raison du réseau antiparallèle du fuseau central asymétrique au dernier moment de la division cellulaire 3,8. Ces études ont mis en lumière les mécanismes moléculaires régulant la division asymétrique dans les cellules SOP de drosophile, mais il n’est pas clair si des processus endocytaires similaires se produisent chez les progéniteurs de la glie radiale des vertébrés (RGP).
De plus, les mécanismes moléculaires qui régulent la signalisation asymétrique Notch/DeltaD pendant la division RGP des vertébrés ne sont pas bien compris. Chez le poisson zèbre, il a été rapporté que l’interaction de Notch et Delta facilite l’endocytose du ligand9 DeltaD. On ne sait pas si l’endocytose DeltaD peut avoir un impact sur le choix du devenir cellulaire des cellules filles dans le cerveau des vertébrés en développement. Des études récentes montrent que l’injection d’anticorps anti-DeltaD conjugués par fluorescence dans le tube neural pourrait marquer les endosomes Sara spécifiquement dans les cellules neuroépithéliales, et les endosomes anti-DeltaD contenant Sara se séparent préférentiellement en cellules filles proliférantes10. Il a été suggéré que la signalisation Notch des endosomes pourrait réguler le destin des cellules filles. Des résultats antérieurs ont montré que la plupart des cellules RGP du poisson zèbre dans le cerveau antérieur en développement subissent une DCA et que la détermination du devenir des cellules filles dépend de la signalisation intralignée Notch / DeltaD11. Afin d’élucider la nature de la signalisation intralignée Notch / DeltaD dans les RGP du poisson zèbre, nous avons développé le test d’absorption des anticorps anti-DeltaD dans le cerveau en développement du poisson zèbre. En utilisant ce protocole, nous avons réalisé avec succès le marquage en direct et l’imagerie du trafic endocytaire DeltaD dans les RGP mitotiques.
L’anticorps anti-DeltaD marqué par fluorescence est efficacement internalisé dans les RGP le long du ventricule du cerveau antérieur. Il a grandement facilité la découverte du trafic directionnel des endosomes DeltaD dans les RGP à division asymétrique12,13. Par rapport aux protocoles précédents d’absorption d’anticorps développés pour les cultures de Drosophila notum et la moelle épinière du poisson zèbre 10, ce protocole a permis d’obtenir un marquage anti-DeltaD durable et très efficace dans la couche cellulaire du ventricule cérébral, en particulier avec moins de10 nL de mélange d’anticorps micro-injectés. L’injection du ventricule du cerveau postérieur est très pratique pour appliquer le test d’absorption des anticorps dans le cerveau en développement, car le ventricule du cerveau postérieur est bien élargi chez les embryons de poisson zèbre et rempli de liquide céphalorachidien au stadede développement précoce 14. En injectant le mélange d’anticorps dans le ventricule postérieur du cerveau sans blesser les tissus en développement cruciaux, le protocole a minimisé autant que possible les dommages possibles à la zone d’imagerie dans le cerveau antérieur. La dose réduite de l’anticorps primaire injecté a également évité les effets secondaires potentiels d’interférence avec la signalisation endogène Delta-Notch in vivo. Ce protocole peut être facilement combiné avec d’autres perturbations pharmacologiques ou génétiques, utilisé à différents stades de développement, et éventuellement adapté au cerveau adulte ainsi qu’aux organoïdes cérébraux 2D/3D dérivés de cellules souches pluripotentes humaines. Pris ensemble, le protocole a permis de comprendre comment et quand l’asymétrie de signalisation Notch est établie pendant l’ACD. Le principal défi pour une mise en œuvre réussie de ce protocole est d’obtenir une livraison précise de concentrations appropriées de l’anticorps en fonction de conditions expérimentales spécifiques.
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Protocol
Nous avons utilisé la lignée de type sauvage AB et la lignée transgénique Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] pour l’étude. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie à San Francisco, États-Unis (numéro d’approbation : AN179000).
1. Préparation d’embryons de poisson zèbre
- Installez des bassins de croisement de poissons dans l’après-midi avant 17h00, avec une femelle de type sauvage et un poisson mâle Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] en utilisant des séparateurs pour les séparer dans chaque réservoir.
- Retirez les séparateurs avant 11 h 00 de tous les réservoirs de passage le lendemain matin. Restez silencieux et ne dérangez pas les poissons pendant qu’ils s’accouplent. Le frai a généralement lieu dans les 30 minutes suivant le retrait des séparateurs. Les œufs fécondés restent au fond du réservoir.
- Ramassez les œufs fécondés dans les réservoirs avec un filtre à mailles. Transférez les œufs en les lavant dans une boîte de Petri remplie d’eau d’œuf et examinez les embryons au microscope à dissection à un grossissement de 10x à 20x.
- Transférer les embryons fécondés dans une boîte de Petri propre contenant environ 20 ml de milieu embryonnaire (100 mL de solution mère 1 000x contient 29,4 g de NaCl, 1,27 g de KCl, 4,85 g de CaCl 2.2H 2 O et 8,13 gde MgSO4,7H 2 O) avec des pipettes Pasteur en verre de gros calibre. Conserver les embryons à 28 °C. Conservez 50 embryons fécondés par boîte de Petri avec 30 ml de milieu embryonnaire à 28,5 °C.
REMARQUE: Une paire de poissons produit normalement 100 à 300 embryons, et le taux de fécondation et de survie des embryons sains est supérieur à 95% pour chaque accouplement. - Le lendemain matin, sortez les embryons de l’incubateur à 8h00, lorsque les embryons ont atteint le stade de développement de ~18-20 h post-fécondation (HPF). Observez-les au microscope à épifluorescence à un grossissement de 20x, en utilisant d’abord la lumière blanche. À ce moment-là, les embryons de poisson zèbre sont au stade 20 somites.
- Jetez les embryons morts qui sont troubles ou rompus au microscope à l’aide d’une pipette en verre.
- Allumez la lampe fluorescente et choisissez le réglage du filtre RFP du microscope. Ensuite, sélectionnez les embryons à forte fluorescence rouge et transférez-les dans un nouveau plat avec de l’eau d’œuf.
- Déchorioner les embryons manuellement avec deux pinces fines (les extrémités des pinces doivent être tranchantes et intactes) sous lumière blanche (Tableau des matériaux).
- Tenez le chorion avec une paire de forceps et faites une déchirure dans le chorion avec l’autre forceps. Ouvrez soigneusement la déchirure à l’aide des forceps et faites-la suffisamment grande pour que l’embryon puisse passer à travers en poussant doucement l’embryon avec les extrémités des autres forceps.
- Transférer les embryons déchorionés dans une nouvelle boîte de Petri avec un milieu embryonnaire frais pour un rinçage rapide avant la micro-injection.
2. Préparation de la micro-injection
- Utilisez les capillaires (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, avec filament) pour tirer les aiguilles d’injection fines sur un extracteur. Concevoir et optimiser le programme de traction selon le manuel.
- Ouvrez l’extrémité de l’aiguille avec une pince sous un microscope à dissection stéréo. Faire le diamètre de la pointe autour de 10 μm, et l’angle de conicité autour de 30°.
- Conjuguer l’anticorps monoclonal anti-DLD de souris avec l’anticorps anti-souris-IgG-Atto647N avant l’injection.
- Pour chaque expérience d’injection, mélanger 0,5 μL de l’anticorps anti-Dld (0,5 mg/mL) avec 2 μL de l’anticorps anti-souris-IgG-Atto647N (1 mg/mL) en pipetant 5 à 10 fois. Ensuite, incuber à température ambiante pendant au moins 30 minutes (ou sur glace pendant 2-3 h).
- Après l’incubation, ajouter 2,5 μL de tampon bloquant (10 mg/mL d’IgG de souris) et 0,5 μL de rouge de phénol à 0,5 % au mélange d’anticorps, et pipeter 10x pour bien mélanger, afin de bloquer les anticorps non conjugués restant dans le mélange.
NOTE: Pour chaque essai, préparer un mélange supplémentaire sans l’anticorps anti-DLD et l’utiliser comme témoin.
- Préparer 1% d’agarose à bas point de fusion dans le milieu embryonnaire. Chauffer le mélange contenu dans l’agarose à 70 °C jusqu’à ce que le mélange devienne transparent.
- Aliquote la solution d’agarose dans des tubes microcentrifugés de 2 mL. Conserver les aliquotes dans un bloc thermique à ~40 °C.
- Rincer l’embryon dans le tube contenant 1% d’agarose à bas point de fusion pendant 3 s.
- Placez l’embryon sur un couvercle de boîte de Petri en plastique inversé avec des gouttes individuelles d’agarose (~30-40 μL) pour monter chaque embryon séparément sur le couvercle, comme illustré à la figure 1. Posez les embryons à plat latéralement dans l’agarose et maintenez cette position jusqu’à ce que l’agarose se soit solidifiée à température ambiante.
- Montez 12 embryons sur trois rangées un par un comme ci-dessus. Couvrir tous les embryons montés dans l’agarose avec un milieu d’œuf.
3. Micro-injection
- Placez les embryons incrustés sous le stéréomicroscope et couvrez l’agarose avec de l’eau d’œuf.
- Réglez l’injecteur de pression d’air avec des micromanipulateurs, en les plaçant près des microscopes comme illustré à la figure 1. Utiliser la bouteille de gaz en acier contenant de l’azote gazeux (N2) sous haute pression comme ressource d’air.
- N’ouvrez la valve de gaz qu’après que les embryons ont été montés dans l’agarose. Ensuite, chargez l’aiguille en verre préparée avec 2 μL de mélange d’anticorps sur le micromanipulateur, comme illustré à la figure 1, lors de l’utilisation du module de remplissage avant du micro-injecteur.
- Réglez la pression d’entrée sur ~80-90 psi et la pression d’injection sur ~20 psi.
- Calibrer le volume d’injection à l’aide d’un micromètre au microscope, comme décrit précédemment15. Réglez la durée de la mélodie de 10 ms à 120 ms, en fonction de la taille de l’ouverture de l’aiguille. Délivrez chaque impulsion d’injection en tapotant la palette. Réglez le volume d’injection de chaque administration à ~4-5 nL.
- Introduisez la pointe de l’aiguille de micro-injection à travers la plaque de toit dorsale du cerveau postérieur postérieur jusqu’au point de charnière r0/r1 et injectez environ 10 nL (deux ou trois impulsions) de mélange d’anticorps sans toucher le tissu cérébral. Observez l’écoulement des fluides rouges dans le ventricule cérébral.
REMARQUE: Le ventricule du cerveau postérieur est postérieur à la limite du cerveau postérieur du mésencéphale. Le mélange d’anticorps injecté contenant du rouge de phénol remplit immédiatement le ventricule cérébral du cerveau postérieur au cerveau antérieur en diffusant avec du liquide céphalorachidien. - Après l’injection, retirez rapidement la pointe de l’aiguille de l’embryon en tournant le bouton du micromanipulateur. Pour une injection réussie, le colorant rouge du mélange injecté reste dans le ventricule cérébral de manière stable sans fuite dans l’agarose entourée.
- Déplacez la plaque de montage sous le microscope pour localiser un autre embryon monté à une position appropriée pour les répétitions.
- Après avoir injecté six à huit embryons, pelez l’agarose avec un couteau microchirurgical pour libérer les embryons de l’agarose incrustée. Transférer les embryons microinjectés dans un plat frais contenant 30 ml de milieu embryonnaire et les placer à température ambiante pour les prochaines étapes.
4. Montage et imagerie en direct accélérée
- Après 30 min, transférer les embryons sélectionnés sur 10 mL de milieu embryonnaire. Ajouter 420 μL de tricaïne (4 mg/mL) à 10 mL de milieu embryonnaire pour anesthésier les embryons.
- Pour monter les embryons, préparer 0,8% d’agarose à bas point de fusion contenant la même concentration de tricaïne dans le tube. Conserver les aliquotes dans un bloc thermique à ~40 °C.
- Utilisez une pipette en verre pour immerger les embryons injectés dans l’agarose chaude pendant 3 s. Ensuite, retirez immédiatement les embryons de l’agarose avec la même pipette en verre et placez les embryons au centre de boîtes de culture à fond de verre de 35 mm avec une goutte d’agarose du tube. Placez un seul embryon par goutte sur le verre.
- Orientez doucement les embryons avec une sonde à fibres ou une pointe de chargement pour garder la face dorsale du cerveau embryonnaire aussi près que possible du fond de verre. Ajustez doucement la position de l’embryon pour étendre l’embryon sans se courber à mesure que l’agarose se solidifie progressivement.
- Ensuite, vérifiez la position de l’embryon en retournant le plat de fond en verre. Assurez-vous que tout le cerveau antérieur dorsal avec les embryons correctement montés peut être vu au microscope.
- Ajouter 2 à 3 mL de milieu embryonnaire préchauffé à 28,5 °C contenant de la tricaïne pour couvrir l’embryon. Placez correctement la capsule sur la platine à température contrôlée du microscope confocal, comme illustré à la figure 1. Régler la température de la chambre d’imagerie à 28,5 °C. L’embryon est maintenant prêt pour l’imagerie.
- Effectuez des images en direct en accéléré avec un intervalle de temps fixe à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau 40x.
- Utilisez le logiciel d’imagerie et de contrôle du microscope (μMANAGER : https://micro-manager.org/)16.
- Sélectionnez les canaux d’imagerie de 564 nm et 647 nm pour l’imagerie de la fluorescence membranaire membranaire transgénique MyR-Tdtomato et de l’anti-Dld-Atto647N endosomal dans la cellule (Figure 1).
- Réglez la puissance laser à 30% pour les deux canaux. Utilisez un temps d’exposition par plan z de 200 ms pour chaque canal.
- Pour chaque embryon de poisson-zèbre monté, utilisez un balayage z-step de 1 μm pour 20 z-plans au total, et un cycle de balayage de 100 périodes.
- Définissez l’intervalle de temps entre chaque cycle de numérisation à 20 s et le mode de numérisation sous forme de canal, tranche.
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Representative Results
Sur la figure 2A, les embryons injectés d’Atto647N, sans liaison avec l’anticorps primaire, ont montré une fluorescence de fond dans le ventricule cérébral. Très peu de particules fluorescentes englouties peuvent être observées dans les cellules. Les embryons de poisson-zèbre injectés anti-Dld-Atto647N ont montré de grandes quantités de particules fluorescentes internalisées dans la plupart des cellules du cerveau antérieur en développement (Figure 2A, panneau de droite). Après avoir zoomé pour nous concentrer sur les RGP mitotiques, comme le montre la figure 2B, nous avons pu enregistrer le mouvement dynamique des endosomes intracellulaires anti-Dld-Atto647N pendant la division cellulaire (Vidéo 1). La plupart des RGP mitotiques ont montré une ségrégation asymétrique antérieure ou postérieure des endosomes anti-Dld-Atto647N en deux cellules filles12. Nous avons également remarqué que l’asymétrie s’est stabilisée vers la fin de l’anaphase, ce qui a entraîné une hérédité asymétrique des endosomes de signalisation Notch par les cellules filles par la suite12.
Figure 1 : Organigramme des étapes expérimentales. Le poisson zèbre transgénique exprimant le myR-Tdtomato reporter est croisé avec le type sauvage AB le jour 1. Le jour 2, des embryons fluorescents rouges sont sélectionnés pour la micro-injection, suivie d’une imagerie temporelle. L’expérience complète le 2ème jour dure environ 8 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Imagerie accélérée de l’absorption des anticorps anti-Dld-Atto-647N dans le cerveau en développement du poisson-zèbre. (A) Absorption d’anticorps anti-Dld-Atto-647N après 30 minutes de micro-injection dans le cerveau antérieur d’un embryon 1 jour post-fécondation (DPF). Sur le panneau de gauche se trouve l’embryon injecté avec Atto-647N uniquement. Sur le panneau de droite se trouve l’embryon injecté avec l’anti-Dld-Atto-647N. Les lignes de tirets indiquent la couche apicale le long du ventricule. La zone rectangulaire est représentée en fort grossissement en B. Barre d’échelle = 40 μm. Abréviations : Di = Diencéphale; Tel = Telencephalon; Ve = Ventricule. (B) Panels d’imagerie accélérée de la dynamique anti-Dld-Atto-647N pendant la mitose. Les huit périodes du montage couvraient l’ensemble du cycle mitotique, décrivant l’absorption et la ségrégation de l’anti-Dld-Atto-647N en deux cellules filles d’un RGP en division. Barre d’échelle = 5 μm La membrane cellulaire est soulignée. Dans A et B, le marquage MyR-Tdtomato sur la membrane est bleu et l’anti-Dld-Atto-647N est magenta. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : Dynamique de l’anti-Dld-Atto-647N internalisé dans la division des cellules gliales radiales tout au long de la mitose (40 périodes et un intervalle de temps de 30 s entre chaque image; 20 minutes au total). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Nous avons développé un test d’absorption d’anticorps pour le marquage et l’imagerie endosomale Notch/Delta trafic dans les progéniteurs de la glie radiale du poisson zèbre avec une grande efficacité. Par rapport aux méthodes précédentes utilisées pour suivre les anticorps anti-DeltaD marqués dans les cellules SOP de drosophile7,8, notre méthode a utilisé la micro-injection au lieu de l’incubation d’échantillons dans l’anticorps conjugué. Des anticorps anti-DLD conjugués par fluorescence ont été micro-injectés dans le ventricule postérieur ; Cette technique ne provoque pas de blessures, comme en témoignent le développement normal et la récupération complète des embryons après l’injection. Les ventricules embryonnaires sont continus, ce qui permet à l’anticorps injecté de se disperser librement vers le cerveau antérieur après la micro-injection. L’anti-Dld-atto647N injecté dure plus de 24 heures en tant que ressource stable d’absorption continue d’anticorps dans le cerveau. Par rapport à l’injection de tube neural, introduite dans un rapport précédent10, l’injection de ventricule postérieur du poisson zèbre ne provoque pas de lésions tissulaires et permet une absorption sélective anti-Dld-Atto647N par les RGP mitotiques tapissant les ventricules cérébraux in vivo. Bien que nous n’ayons pas vérifié l’absorption d’anticorps dans les cellules neuroépithéliales de la moelle épinière, l’absorption d’anticorps anti-Dld-Atto647N devrait y être applicable, tout comme dans le cerveau. Les anticorps conjugués injectés dans le ventricule postérieur du cerveau devraient également diffuser le long de la moelle épinière.
Pour une application réussie du test d’absorption des anticorps, la question la plus importante est d’utiliser un anticorps primaire qui a une affinité de liaison élevée et une spécificité pour le domaine extracellulaire d’une cible protéique membranaire. En plus du marquage de la signalisation Notch / Delta, le protocole est applicable pour marquer d’autres protéines membranaires ou des protéines extracellulaires en utilisant des stratégies similaires. Notre protocole a démontré une absorption très efficace des anticorps anti-DLD dans le développement d’embryons de poisson zèbre en raison de la haute qualité et de la spécificité élevée de l’anticorps primaire anti-DLD. Deuxièmement, la conjugaison de l’anticorps primaire anti-Dld avec l’anticorps secondaire fluorescent est essentielle pour atteindre un niveau élevé d’efficacité d’absorption des anticorps in vivo. Nous avons constaté que les anticorps secondaires non blanchissants Atto étaient plus stables et beaucoup plus brillants que d’autres anticorps fluorescents, tels que les anticorps secondaires Zenon et Alexa utilisés dans les cultures de Drosophila notum 7,10. Nous avons choisi Atto647N comme étiquette fluorescente, car nous l’utiliserions normalement avec le poisson-zèbre transgénique GFP ou RFP ou d’autres marqueurs fluorescents partageant des longueurs d’onde d’excitation similaires à celles du GFP ou du RFP. D’autres anticorps secondaires non blanchissants avec différentes longueurs d’onde d’excitation devraient également fonctionner avec le protocole. Dans notre protocole, nous avons raccourci le temps d’incubation des anticorps primaires mélangés à l’anticorps secondaire Atto de 12 h à 30 min, et diminué la concentration d’anticorps anti-DLD à 0,05 mg / mL dans les mélanges finaux de micro-injection. Une concentration plus élevée d’anticorps anti-DLD (0,25 mg/mL) n’a pas augmenté l’efficacité de l’absorption des anticorps chez les embryons de poisson zèbre; Cela peut être la raison pour laquelle il faut de longs temps d’incubation, afin d’obtenir un marquage suffisant avec des anticorps secondaires fluorescents10. Nous n’avons pas utilisé d’anticorps anti-Dld à une concentration plus élevée que dans les études précédentes10, car il est possible que les anticorps anti-Dld-Atto647N injectés entrent en compétition avec les anticorps Notch/Delta exprimés de manière endogène lors de la liaison du ligand DeltaD sur la membrane des RGP, interférant ainsi avec la signalisation cis ou trans Notch/Delta in vivo. Nous avons également constaté que le tampon de blocage ajouté après la conjugaison des anticorps primaires était utile pour augmenter la spécificité du test d’absorption des anticorps in vivo. Comme le montre la figure 2, la plupart des RGP dans le cerveau antérieur internalisent activement l’anti-Dld-Atto647N. Sans ajouter le tampon bloquant, la plupart des cellules montrent très peu d’endosomes anti-Dld-Atto647N internalisés (données non présentées).
La principale limitation du protocole est la disponibilité des anticorps qui peuvent être utilisés pour le test d’absorption. Notre protocole est applicable pour le marquage des protéines membranaires, si un bon anticorps contre le domaine extracellulaire est disponible. Pour les protéines cytosoliques et nucléaires, le test d’absorption des anticorps n’est pas applicable, car les anticorps conjugués ne peuvent pas traverser la membrane cellulaire pour se lier à leurs cibles de liaison intracellulaires. L’imagerie en direct des protéines intracellulaires dépend principalement de différents types de modèles transgéniques fluorescents. Au cours des dernières décennies, davantage de colorants fluorescents ont été développés pour l’imagerie de cellules vivantes, tels que la technologie de type silicium rhodamine (SiR), qui a contribué de manière significative à l’imagerie cellulaire vivante de l’ADN, de l’ARN, de l’actine et de la tubuline17. Une combinaison de différentes stratégies de marquage en direct serait le meilleur moyen d’étudier des voies de signalisation complexes dans les cellules vivantes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le projet a été soutenu par NIH R01NS120218, le prix Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation de l’UCSF et le Chan Zuckerberg Biohub.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
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