Summary
Detta arbete utvecklar en antikroppsupptagsanalys för avbildning av intra-lineage Notch / DeltaD-signalering i delande radiella glia-förfäder till den embryonala zebrafiskhjärnan.
Abstract
Asymmetrisk celldelning (ACD), som producerar två dotterceller av olika öden, är grundläggande för att generera cellulär mångfald. I utvecklingsorganen hos både ryggradslösa djur och ryggradsdjur genererar asymmetriskt delande förfäder en Notchhej självförnyande och en Notchlo differentierande dotter. I den embryonala zebrafiskhjärnan genomgår radiella glia-progenitorer (RGP) - de viktigaste neurala stamcellerna hos ryggradsdjur - mestadels ACD för att föda en RGP och en differentierande neuron. Den optiska klarheten och lättillgängligheten hos zebrafiskembryon gör dem idealiska för in vivo-time-lapse-avbildning för att direkt visualisera hur och när asymmetrin i Notch-signalering etableras under ACD. Nya studier har visat att dynamisk endocytos av Notch-liganden DeltaD spelar en avgörande roll vid bestämning av cellens öde under ACD, och processen regleras av den evolutionärt bevarade polaritetsregulatorn Par-3 (även känd som Pard3) och dyneinmotorkomplexet. För att visualisera in vivo-handelsmönstren för Notch-signalendosomer i mitotiska RGP har vi utvecklat denna antikroppsupptagsanalys. Med hjälp av analysen har vi upptäckt dynamiken hos DeltaD-innehållande endosomer under RGP-delning.
Introduction
Notch-signalering styr cellens ödesbeslut och mönster under utvecklingen i metazoans1, och nyligen genomförda studier har visat att Notch-signalering vid stamcellsdelning huvudsakligen beror på endocytisk handel 2,3. Endocytosed Notch / Delta kan aktivera Notch-signalering i kärnan och förbättra transkriptionen av Notch-målgener 4,5,6. Riktad Notch/Delta endosomal trafficking observerades först i Drosophila sensoriska organprekursorceller (SOP) under dess asymmetriska celldelning (ACD), vilket resulterade i en högre Notch-signaleringsaktivitet i pIIa än i pIIb 7,8. Antikroppsupptagsanalyser med anti-Delta- och anti-Notch-antikroppar har tillämpats för att övervaka den endocytiska processen i mitotiska SOP-celler. Notch/DeltaD-endosomer rör sig tillsammans med ett kinesinmotoriskt protein till den centrala spindeln under cytokinese och translokeras asymmetriskt in i pIIa-cellen på grund av den asymmetriska centralspindelns antiparallella uppsättning i det sista ögonblicket av celldelning 3,8. Dessa studier har belyst de molekylära mekanismerna som reglerar asymmetrisk delning i Drosophila SOP-celler, men det är oklart om liknande endocytiska processer förekommer hos ryggradsdjur radiella glia progenitorer (RGP).
Dessutom är de molekylära mekanismerna som reglerar asymmetrisk Notch / DeltaD-signalering under ryggradsdjur RGP-delning inte väl förstådda. I zebrafisk har det rapporterats att interaktionen mellan Notch och Delta underlättar endocytosen hos DeltaD-liganden9. Det är okänt om DeltaD-endocytos kan påverka cellens öde val av dotterceller i den utvecklande ryggradsdjurhjärnan. Nya studier visar att injicera fluorescerande konjugerade anti-DeltaD-antikroppar i neuralröret kan märka Sara-endosomer specifikt i neuroepitelceller, och anti-DeltaD innehållande Sara-endosomer segregerar företrädesvis till prolifererande dotterceller10. Det har föreslagits att Notch-signalering från endosomerna skulle kunna reglera dottercellens öde. Tidigare resultat har visat att de flesta zebrafisk RGP-celler i den utvecklande framhjärnan genomgår ACD, och dottercellens ödesbestämning är beroende av intralineage Notch / DeltaD-signalering11. För att belysa karaktären av intralineage Notch / DeltaD-signalering i zebrafisk RGPs har vi utvecklat anti-DeltaD-antikroppsupptagsanalysen i zebrafiskens utvecklande hjärna. Med hjälp av detta protokoll har vi framgångsrikt utfört livemärkning och avbildning av DeltaD-endocytisk handel i mitotiska RGP.
Den fluorescerande märkta anti-DeltaD-antikroppen internaliseras effektivt i RGP: erna längs framhjärnkammaren. Det har i hög grad underlättat upptäckten av riktad handel med DeltaD-endosomer i de asymmetriskt delande RGP: erna12,13. Jämfört med tidigare antikroppsupptagsprotokoll som utvecklats för Drosophila notum-kulturer och zebrafiskryggmärgen 10, har detta protokoll uppnått långvarig och mycket effektiv anti-DeltaD-märkning i hjärnventrikelcellskiktet, specifikt med mindre än10 nL mikroinjicerad antikroppsblandning. Injektionen av bakhjärnans ventrikel är mycket lämplig för att applicera antikroppsupptagsanalysen i den utvecklande hjärnan, eftersom bakhjärnans ventrikel är väl expanderad i zebrafiskembryon och fylld med cerebrospinalvätska i tidigt utvecklingsstadium14. Genom att injicera antikroppsblandningen i bakhjärnans kammare utan att skada några viktiga utvecklingsvävnader har protokollet minimerat eventuella skador på avbildningszonen i framhjärnan så mycket som möjligt. Den reducerade dosen av den injicerade primära antikroppen har också undvikit potentiella biverkningar av att störa endogen Delta-Notch-signalering in vivo. Detta protokoll kan enkelt kombineras med andra farmakologiska eller genetiska störningar, som används i olika utvecklingsstadier, och möjligen anpassas till den vuxna hjärnan såväl som humana pluripotenta stamcellshärledda 2D/3D-hjärnorganoider. Sammantaget har protokollet gjort det möjligt att förstå hur och när Notch-signalasymmetri etableras under ACD. Den största utmaningen för ett framgångsrikt genomförande av detta protokoll är att uppnå exakt leverans av lämpliga koncentrationer av antikroppen baserat på specifika experimentella förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vi har använt AB wild type line och transgenlinjen Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] för studien. Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of California, San Francisco, USA (godkännandenummer: AN179000).
1. Beredning av zebrafiskembryon
- Ställ in fiskkorsningstankar på eftermiddagen före 17:00, med en kvinnlig vildtypfisk och en manlig Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] fisk genom att använda avdelare för att separera dem i varje tank.
- Ta bort avdelarna före kl. 11.00 från alla korsningstankar nästa morgon. Håll tyst och stör inte fisken medan de parar sig. Gytning sker vanligtvis inom 30 minuter efter att avdelarna har tagits bort. De befruktade äggen förblir på botten av tanken.
- Samla befruktade ägg från tankarna med ett nätfilter. Överför äggen genom att tvätta dem i en petriskål full av äggvatten och undersök embryon under ett dissekerande mikroskop med en förstoring på 10x till 20x.
- Överför de befruktade embryona till en ren petriskål som innehåller cirka 20 ml embryomedium (100 ml 1 000x stamlösning innehåller 29,4 g NaCl, 1,27 g KCl, 4,85 g CaCl 2,2H2O och 8,13 g MgSO 4,7H2O) med Pasteurpipetter av glas med stor borrning. Förvara embryona vid 28 °C. Förvara 50 befruktade embryon per petriskål med 30 ml embryomedium vid 28,5 °C.
OBS: Ett par fiskar producerar normalt 100-300 embryon, och befruktnings- och överlevnadsgraden för friska embryon är över 95% för varje parning. - Nästa morgon, ta embryon ur inkubatorn klockan 8:00, när embryon har nått utvecklingsstadiet på ~ 18-20 h efter befruktning (hpf). Observera dem under ett epifluorescensmikroskop vid en 20x förstoring, med vitt ljus först. Vid den tiden är zebrafiskembryon på 20 somitstadiet.
- Kassera döda embryon som är grumliga eller spruckna under mikroskopet med en glaspipett.
- Slå på lysröret och välj RFP-filterinställningen för mikroskopet. Välj sedan embryon med stark röd fluorescens och överför dem till en ny maträtt med äggvatten.
- Dekorionera embryona manuellt med två fina pincett (spetsarna på pincetten ska vara skarpa och oskadade) under vitt ljus (materialtabell).
- Håll korionen med ett par pincett och gör en tår i korionen med de andra pincetterna. Öppna tåran försiktigt med pincetten och gör den tillräckligt stor för att embryot ska passera genom att försiktigt trycka på embryot med spetsarna på de andra pincetterna.
- Överför de dekorionerade embryona till en ny petriskål med färskt embryonalt medium för snabb sköljning före mikroinjektion.
2. Beredning av mikroinjektion
- Använd kapillärerna (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, med filament) för att dra fina injektionsnålar på en avdragare. Designa och optimera dragprogrammet enligt handboken.
- Öppna nålspetsen med pincett under ett stereodissektionsmikroskop. Gör spetsens diameter cirka 10 μm och konans vinkel cirka 30°.
- Konjugera musens monoklonala anti-DLD-antikropp med anti-mus-IgG-Atto647N före injektion.
- För varje injektionsexperiment, blanda 0,5 μL av anti-DLD-antikroppen (0,5 mg/ml) med 2 μL av anti-Mouse-IgG-Atto647N-antikroppen (1 mg/ml) genom pipettering 5-10 gånger. Inkubera sedan vid rumstemperatur i minst 30 minuter (eller på is i 2-3 timmar).
- Efter inkubation, tillsätt 2,5 μL blockerande buffert (10 mg/ml mus IgG) och 0,5 μl 0,5% fenolrött till antikroppsblandningen och pipettera 10x för att blanda noggrant, för att blockera eventuella okonjugerade antikroppar kvar i blandningen.
OBS: För varje försök, förbered en extra blandning utan anti-DLD-antikroppen och använd den som en kontroll.
- Förbered 1% agaros med låg smältpunkt i embryomediet. Värm blandningen av agarosinnehåll vid 70 °C tills blandningen blir genomskinlig.
- Alikvot agaroslösningen i 2 ml mikrocentrifugrör. Förvara alikvoterna i ett värmeblock vid ~ 40 ° C.
- Skölj embryot i röret innehållande 1% agaros med låg smältpunkt i 3 s.
- Placera embryot på ett uppochnedvänt petriskållock av plast tillsammans med enskilda droppar agaros (~30–40 μl) för att montera varje embryo separat på locket enligt figur 1. Lägg embryona platt i sidled i agarosen och behåll denna position tills agarosen har stelnat vid rumstemperatur.
- Montera 12 embryon i tre rader en efter en som ovan. Täck alla monterade embryon i agarosen med äggmedium.
3. Mikroinjektion
- Sätt de inbäddade embryon under stereomikroskopet och täck agarosen med äggvatten.
- Ställ in lufttrycksinjektorn tillsammans med mikromanipulatorer och placera dem nära mikroskopen enligt figur 1. Använd stålgasflaskan som innehåller gasformigt kväve (N2) under högt tryck som luftresurs.
- Öppna gasventilen först efter att embryon har monterats i agarosen. Fyll sedan på den förberedda glasnålen med 2 μL antikroppsblandning på mikromanipulatorn, såsom visas i figur 1, när mikroinjektorns främre fyllningsmodul används.
- Ställ in ingångstrycket på ~ 80-90 psi och injektionstrycket på ~ 20 psi.
- Kalibrera injektionsvolymen med hjälp av en mikrometer under mikroskopet, som beskrivits tidigare15. Ställ in varaktigheten för meloditiden till från 10 ms till 120 ms, beroende på nålöppningens storlek. Leverera varje injektionspuls genom att knacka på paddeln. Ställ in injektionsvolymen för varje leverans till ~ 4-5 nL.
- Stick spetsen på mikroinjektionsnålen genom bakhjärnans dorsala takplatta bakom gångjärnspunkten r0/r1 och injicera cirka 10 nL (två eller tre pulser) antikroppsblandning utan att träffa hjärnvävnaden. Observera flödet av röda vätskor i hjärnkammaren.
OBS: Bakhjärnans ventrikel är bakre till gränsen för bakhjärnans bakhjärna. Den injicerade fenolrödinnehållande antikroppsblandningen fyller upp hjärnventrikeln från bakhjärnan till framhjärnan omedelbart genom att diffundera med cerebrospinalvätska. - Efter injektion, ta bort nålspetsen från embryot snabbt genom att vrida på mikromanipulatorns ratt. För en lyckad injektion förblir det röda färgämnet i den injicerade blandningen stabilt i hjärnventrikeln utan att läcka in i den omgivna agarosen.
- Flytta monteringsplattan under mikroskopet för att lokalisera ett annat monterat embryo i en lämplig position för upprepningar.
- Efter att ha injicerat sex till åtta embryon, skala agarosen med en mikrokirurgisk kniv för att frigöra embryon från den inbäddade agarosen. Överför de mikroinjicerade embryona till en färsk skål med 30 ml embryomedium och placera dem i rumstemperatur för nästa steg.
4. Montering och time-lapse live-avbildning
- Efter 30 minuter överförs de valda embryona till 10 ml embryomedium. Tillsätt 420 μl trikainstam (4 mg/ml) till 10 ml embryomedium för att bedöva embryona.
- För att montera embryon, förbered 0,8% agaros med låg smältpunkt innehållande samma koncentration av tricaine i röret. Förvara alikvoterna i ett värmeblock vid ~ 40 ° C.
- Använd en glaspipett för att fördjupa de injicerade embryon i den varma agarosen i 3 s. Ta sedan omedelbart bort embryon från agarosen med samma glaspipett och placera embryon på mitten av 35 mm glasbottenodlingsskålar med en droppe agaros från röret. Placera endast ett embryo per droppe på glaset.
- Orientera embryona försiktigt med en fibersond eller laddningsspets för att hålla den dorsala sidan av den embryonala hjärnan så nära glasbotten som möjligt. Ställ in embryopositionen försiktigt för att förlänga embryot utan att krulla när agarosen stelnar gradvis.
- Kontrollera sedan embryopositionen genom att vända glasbottenskålen. Se till att hela dorsala framhjärnan med de korrekt monterade embryona kan ses under mikroskopet.
- Tillsätt 2-3 ml 28,5 °C förvärmt embryonalt medium innehållande trikain för att täcka embryot. Placera skålen ordentligt på det temperaturkontrollerade steget i konfokalmikroskopet, som visas i figur 1. Justera bildbehandlingskammarens temperatur till 28,5 °C. Embryot är nu redo för avbildning.
- Utför timelapse-live-avbildning med ett fast tidsintervall med ett 40x vattennedsänkningsmål.
- Använd programvaran för bild- och mikroskopkontroll (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.
- Välj avbildningskanalerna 564 nm och 647 nm för avbildning av membranfluorescensen hos MyR-Tdtomato transgena zebrafiskar och endosomalt anti-Dld-Atto647N i cellen (figur 1).
- Ställ in lasereffekten på 30% för båda kanalerna. Använd en exponeringstid per z-plan på 200 ms för varje kanal.
- För varje monterat zebrafiskembryo, använd ett svepande z-steg på 1 μm för totalt 20 z-plan och en skanningscykel på 100 tidsramar.
- Ställ in tidsintervallet mellan varje skanningscykel på 20 s och skanningsläget som kanal, segment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 2A visade embryon injicerade med Atto647N, utan bindning till den primära antikroppen, bakgrundsfluorescens i hjärnventrikeln. Mycket få uppslukade fluorescerande partiklar kan observeras i cellerna. De anti-Dld-Atto647N-injicerade zebrafiskembryona visade stora mängder internaliserade fluorescerande partiklar i de flesta celler i den utvecklande framhjärnan (figur 2A, höger panel). Efter att ha zoomat in för att fokusera på mitotiska RGP, som visas i figur 2B, kunde vi registrera den dynamiska rörelsen av intracellulära anti-Dld-Atto647N-endosomer under celldelning (Video 1). De flesta mitotiska RGPs visade främre eller bakre asymmetrisk segregering av anti-Dld-Atto647N-endosomer i två dotterceller12. Vi märkte också att asymmetrin stabiliserades mot slutet av anafas, vilket resulterade i asymmetriskt arv av Notch-signalendosomer av dottercellerna efteråt12.
Figur 1: Flödesschema över experimentella steg. Transgena zebrafiskar som uttrycker MyR-Tdtomato-reportern korsas med AB vildtyp på dag 1. På dag 2 väljs röda fluorescerande embryon ut för mikroinjektion, följt av tidsfördröjning. Hela experimentet på 2:a dagen tar ca 8 h. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Time-lapse-avbildning av anti-Dld-Atto-647N-antikroppsupptag i den utvecklande zebrafiskhjärnan. (A) Upptag av anti-Dld-Atto-647N efter 30 minuters mikroinjektion i framhjärnan på ett embryo på 1 dag efter befruktning (DPF). På den vänstra panelen injiceras embryot endast med Atto-647N. På den högra panelen injiceras embryot med anti-Dld-Atto-647N. Dash-linjer indikerar det apikala skiktet längs ventrikeln. Rektangelzonen visas i hög förstoring i B. Skalstapel = 40 μm. Förkortningar: Di = Diencephalon; Tel = Telencephalon; Ve = Kammare. (B) Time-lapse-avbildningspaneler av anti-Dld-Atto-647N-dynamik under mitos. De åtta tidsramarna i montaget täckte hela den mitotiska cykeln och skildrade upptaget och segregeringen av anti-Dld-Atto-647N i två dotterceller i en delande RGP. Skalstång = 5 μm Cellmembranet är skisserat. I både A och B är MyR-Tdtomato-märkningen på membranet blå och anti-Dld-Atto-647N är magenta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Videoklipp 1: Dynamik av internaliserad anti-Dld-Atto-647N vid delning av radiella gliaceller genom mitos (40 tidsramar och en intervalltid på 30 s mellan varje bildruta; totalt 20 min). Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utvecklat en antikroppsupptagsanalys för märkning och avbildning av endosomal Notch / Delta-handel i zebrafisk radiella glia-förfäder med hög effektivitet. Jämfört med tidigare metoder som använts för att spåra märkt anti-DeltaD-antikropp i Drosophila SOP-celler7,8, använde vår metod mikroinjektion istället för inkubation av prover i den konjugerade antikroppen. Fluorescerande konjugerade anti-DLD-antikroppar mikroinjicerades i bakhjärnans ventrikel; Denna teknik orsakar inte skada, vilket framgår av normal utveckling och full återhämtning av embryon efter injektion. De embryonala ventriklarna är kontinuerliga, vilket gör att den injicerade antikroppen fritt kan spridas mot framhjärnan efter mikroinjektion. Den injicerade anti-Dld-atto647N varar i över 24 timmar som en stabil resurs för kontinuerligt antikroppsupptag i hjärnan. Jämfört med neuralrörsinjektion, som introducerades i en tidigare rapport10, orsakar zebrafiskens ventrikelinjektion i bakhjärnan inte vävnadsskada och möjliggör selektivt upptag mot Dld-Atto647N av mitotiska RGP som kantar hjärnventriklarna in vivo. Även om vi inte har kontrollerat antikroppsupptaget i neuroepitelceller i ryggmärgen, bör anti-Dld-Atto647N-antikroppsupptaget vara tillämpligt där, precis som i hjärnan. De konjugerade antikropparna som injiceras i bakhjärnans ventrikel förväntas också diffundera längs ryggmärgen.
För framgångsrik tillämpning av antikroppsupptagsanalysen är den viktigaste frågan att använda en primär antikropp som har hög bindningsaffinitet och specificitet för den extracellulära domänen hos ett membranproteinmål. Förutom märkning av Notch / Delta-signalering är protokollet tillämpligt för märkning av andra membranproteiner eller extracellulära proteiner genom att använda liknande strategier. Vårt protokoll har visat mycket effektivt anti-DLD-antikroppsupptag vid utveckling av zebrafiskembryon på grund av den höga kvaliteten och höga specificiteten hos den primära anti-DLD-antikroppen. För det andra är konjugeringen av anti-Dld primär antikropp med den fluorescerande sekundära antikroppen avgörande för att uppnå en hög nivå av antikroppsupptagseffektivitet in vivo. Vi har funnit att Atto icke-blekande sekundära antikroppar är mer stabila och mycket ljusare än andra fluorescerande antikroppar, såsom Zenon och Alexa sekundära antikroppar som används i Drosophila notum-kulturer 7,10. Vi valde Atto647N som fluorescerande etikett, eftersom vi normalt skulle använda den tillsammans med GFP eller RFP transgena zebrafiskar eller några andra fluorescerande markörer som delar liknande excitationsvåglängder som GFP eller RFP. Andra icke-blekbara sekundära antikroppar med olika excitationsvåglängder bör också fungera med protokollet. I vårt protokoll förkortade vi inkubationstiden för primära antikroppar blandade med den sekundära antikroppen Atto från 12 timmar till 30 minuter och minskade koncentrationen av Anti-DLD-antikroppar till 0,05 mg/ml i de slutliga mikroinjektionsblandningarna. En högre koncentration av anti-DLD-antikroppar (0,25 mg/ml) ökade inte antikroppsupptagseffektiviteten i zebrafiskembryon; Detta kan vara anledningen till att man behöver långa inkubationstider för att uppnå tillräcklig märkning med fluorescerande sekundära antikroppar10. Vi använde inte anti-DLD-antikroppar i en högre koncentration som i tidigare studier10, eftersom det finns en möjlighet att injicerade anti-Dld-Atto647N-antikroppar konkurrerar med den endogent uttryckta Notch / Delta när de binder DeltaD-ligand på membranet av RGPs och därmed stör cis- eller trans Notch / Delta-signalering in vivo. Vi fann också att blockerande buffert tillsatt efter primär antikroppskonjugering var till hjälp för att öka specificiteten hos antikroppsupptagsanalysen in vivo. Som visas i figur 2 internaliserar de flesta RGP i framhjärnan aktivt anti-Dld-Atto647N. Utan att lägga till blockeringsbufferten visar de flesta celler mycket få internaliserade anti-Dld-Atto647N-endosomer (data visas inte).
Den huvudsakliga begränsningen i protokollet är tillgängligheten av antikroppar som kan användas för upptagsanalysen. Vårt protokoll är tillämpligt för märkning av membranuttryckta proteiner, om en bra antikropp mot den extracellulära domänen finns tillgänglig. För cytosoliska och nukleära proteiner är antikroppsupptagsanalysen inte tillämplig, eftersom de konjugerade antikropparna inte kan passera genom cellmembranet för att binda till sina intracellulära bindningsmål. Levande avbildning av intracellulära proteiner beror huvudsakligen på olika typer av fluorescerande transgena modeller. Under de senaste decennierna har mer fluorescerande färgämnen utvecklats för avbildning av levande celler, såsom kiselrodaminliknande (SiR) -teknik, vilket väsentligt har bidragit till levande cellavbildning av DNA, RNA, aktin och tubulin17. En kombination av olika levande märkningsstrategier skulle vara det bästa sättet att studera komplexa signalvägar i levande celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Projektet stöddes av NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation och Chan Zuckerberg Biohub.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).
- Le Borgne, R., Schweisguth, F. Notch signaling: endocytosis makes delta signal better. Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).
- Chapman, G., et al. Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).
- Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain. Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).
- Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).
- Derivery, E., et al. Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division. Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).
- Matsuda, M., Chitnis, A. B. Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue. Development. 136 (2), 197-206 (2009).
- Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord. Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).
- Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -Y., Chitnis, A., Guo, S. Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia. Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).
- Zhao, X., et al. Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division. Science Advances. 7 (24), (2021).
- Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP. Bio-Protocol. 12 (5), 4336 (2022).
- Gutzman, J. H., Sive, H.
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).
- Lukinavičius, G., et al. Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).
