Summary
Dette arbejde udvikler et antistofoptagelsesassay til billeddannelse af intra-afstamning Notch/DeltaD-signalering ved opdeling af radiale glia-forfædre til den embryonale zebrafiskhjerne.
Abstract
Asymmetrisk celledeling (ACD), som producerer to datterceller af forskellige skæbner, er grundlæggende for at generere cellulær mangfoldighed. I de udviklende organer hos både hvirvelløse dyr og hvirveldyr genererer asymmetrisk delende forfædre et hakhej selvfornyende og et haktil differentierende datter. I den embryonale zebrafiskhjerne gennemgår radiale glia-forfædre (RGP'er) - de vigtigste neurale stamceller fra hvirveldyr - for det meste ACD for at føde en RGP og en differentierende neuron. Den optiske klarhed og nemme tilgængelighed af zebrafiskembryoner gør dem ideelle til in vivo time-lapse-billeddannelse til direkte visualisering af, hvordan og hvornår asymmetrien af Notch-signalering etableres under ACD. Nylige undersøgelser har vist, at dynamisk endocytose af Notch ligand DeltaD spiller en afgørende rolle i bestemmelse af celleskæbne under ACD, og processen reguleres af den evolutionært bevarede polaritetsregulator Par-3 (også kendt som Pard3) og dyneinmotorkomplekset. For at visualisere in vivo-handelsmønstrene for Notch-signalendosomer i mitotiske RGP'er har vi udviklet denne antistofoptagelsesanalyse. Ved hjælp af analysen har vi afdækket dynamikken i DeltaD-holdige endosomer under RGP-division.
Introduction
Notch-signalering styrer celleskæbnebeslutning og mønster under udvikling i metazoer1, og nylige undersøgelser har vist, at Notch-signalering i stamcelledeling hovedsageligt afhænger af endocytisk handel 2,3. Endocytosed Notch / Delta kan aktivere Notch-signalering i kernen og forbedre transkriptionen af Notch-målgener 4,5,6. Retningsbestemt hak / Delta endosomal handel blev først observeret i Drosophila sensoriske organforløberceller (SOP) under dets asymmetriske celledeling (ACD), hvilket resulterede i en højere Notch-signalaktivitet i pIIa end i pIIb 7,8. Antistofoptagelsesassays med anti-Delta og anti-Notch antistoffer er blevet anvendt til at overvåge den endocytiske proces i mitotiske SOP-celler. Notch/DeltaD-endosomer bevæger sig sammen med et kinesinmotorprotein til den centrale spindel under cytokinese og translokeres asymmetrisk ind i pIIa-cellen på grund af det antiparallelle array af den asymmetriske centrale spindel i sidste øjeblik af celledeling 3,8. Disse undersøgelser har kastet lys over de molekylære mekanismer, der regulerer asymmetrisk opdeling i Drosophila SOP-celler, men det er uklart, om lignende endocytiske processer forekommer i vertebrat radiale glia-forfædre (RGP'er).
Desuden er de molekylære mekanismer, der regulerer asymmetrisk Notch / DeltaD-signalering under hvirveldyrs RGP-deling, ikke godt forstået. I zebrafisk er det blevet rapporteret, at interaktionen mellem Notch og Delta letter endocytose af DeltaD-liganden9. Det vides ikke, om DeltaD-endocytose kan påvirke celleskæbnevalget af datterceller i den udviklende hvirveldyrhjerne. Nylige undersøgelser viser, at injektion af fluorescerende konjugerede anti-DeltaD-antistoffer i neuralrøret kunne mærke Sara-endosomer specifikt i neuroepitelceller, og anti-DeltaD indeholdende Sara-endosomer adskilles fortrinsvis i prolifererende datterceller10. Det er blevet foreslået, at Notch-signalering fra endosomerne kunne regulere dattercelleskæbnen. Tidligere resultater har vist, at de fleste zebrafisk RGP-celler i den udviklende forhjerne gennemgår ACD, og dattercellens skæbnebestemmelse er afhængig af intralineage Notch/DeltaD signalering11. For at belyse karakteren af intralineage Notch/DeltaD signaleringen i zebrafisk RGP'er, har vi udviklet anti-DeltaD antistof uptake assay i zebrafiskens udviklende hjerne. Ved hjælp af denne protokol har vi med succes udført live mærkning og billeddannelse af DeltaD endocytisk handel med mitotiske RGP'er.
Det fluorescerende mærkede anti-DeltaD-antistof internaliseres effektivt i RGP'erne langs forhjernens ventrikel. Det har i høj grad lettet opdagelsen af retningsbestemt handel med DeltaD-endosomer i de asymmetrisk opdelte RGP'er12,13. Sammenlignet med tidligere antistofoptagelsesprotokoller udviklet til Drosophila notumkulturer og zebrafiskens rygmarv 10, har denne protokol opnået langvarig og yderst effektiv anti-DeltaD-mærkning i hjernens ventrikelcellelag, specifikt med mindre end10 nL mikroinjiceret antistofblanding. Injektionen af baghjernens ventrikel er meget praktisk til anvendelse af antistofoptagelsesanalysen i den udviklende hjerne, da baghjernens ventrikel er godt udvidet i zebrafiskembryoner og fyldt op med cerebrospinalvæske i det tidlige udviklingsstadium14. Ved at injicere antistofblandingen i baghjernens ventrikel uden at skade afgørende udviklende væv, har protokollen minimeret mulig skade på billeddannelseszonen i forhjernen så meget som muligt. Den reducerede dosis af det injicerede primære antistof har også undgået potentielle bivirkninger ved at forstyrre endogen Delta-Notch-signalering in vivo. Denne protokol kan let kombineres med andre farmakologiske eller genetiske forstyrrelser, der anvendes på forskellige udviklingsstadier og muligvis tilpasses den voksne hjerne såvel som humane pluripotente stamcelleafledte 2D / 3D hjerneorganoider. Samlet set har protokollen gjort det muligt at forstå, hvordan og hvornår Notch-signalasymmetri etableres under ACD. Den største udfordring for en vellykket gennemførelse af denne protokol er at opnå præcis levering af passende koncentrationer af antistoffet baseret på specifikke eksperimentelle betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vi har brugt AB wild type line og transgene line Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] til undersøgelsen. Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of California, San Francisco, USA (godkendelsesnummer: AN179000).
1. Forberedelse af zebrafiskembryoner
- Opsæt fiskekrydsningstanke om eftermiddagen før kl. 17.00 med en kvindelig vildtypefisk og en mandlig Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] fisk ved hjælp af skillevægge til at adskille dem i hver tank.
- Fjern skillevæggene inden kl. 11.00 fra alle krydsningstanke næste morgen. Hold stille og forstyr ikke fiskene, mens de parrer sig. Gydning sker typisk inden for 30 min efter fjernelse af skillevægge. De befrugtede æg forbliver på bunden af tanken.
- Saml befrugtede æg fra tankene med et maskefilter. Overfør æggene ved at vaske dem af i en petriskål fuld af æggevand og undersøge embryonerne under et dissekerende mikroskop ved en 10x til 20x forstørrelse.
- De befrugtede embryoner overføres til en ren petriskål, der indeholder ca. 20 ml embryomedium (100 ml 1.000x stamopløsning indeholder 29,4 g NaCl, 1,27 g KCl, 4,85 g CaCl 2,2H 2 O og 8,13 g MgSO4,7H 2O) med Pasteur-pipetter med stor boring. Opbevar embryonerne ved 28 °C. Der opbevares 50 befrugtede embryoner pr. petriskål med 30 ml embryomedium ved 28,5 °C.
BEMÆRK: Et par fisk producerer normalt 100-300 embryoner, og befrugtningen og overlevelsesraten for sunde embryoner er over 95% for hver parring. - Næste morgen tages embryonerne ud af inkubatoren kl. 8.00, når embryonerne har nået udviklingsstadiet på ~ 18-20 timer efter befrugtning (hpf). Overhold dem under et epifluorescensmikroskop ved en 20x forstørrelse ved først at bruge hvidt lys. På det tidspunkt er zebrafiskembryonerne på 20 somitstadiet.
- Kassér døde embryoner, der er uklare eller bristet under mikroskopet ved hjælp af en glaspipette.
- Tænd lysstofrøret, og vælg mikroskopets RFP-filterindstilling. Vælg derefter embryonerne med stærk rød fluorescens og overfør dem til en ny skål med ægvand.
- Dechorionere embryonerne manuelt med to fine tang (spidserne af tang skal være skarpe og ubeskadigede) under hvidt lys (Tabel over materialer).
- Hold korionen med et par tang og lav en tåre i korionen med de andre tang. Åbn riften forsigtigt ved hjælp af tangen, og gør den stor nok til, at embryoet kan passere igennem ved forsigtigt at skubbe embryoet med spidserne af de andre tang.
- Overfør de dechorionerede embryoner til en ny petriskål med frisk embryonmedium for hurtig skylning inden mikroinjektion.
2. Fremstilling af mikroinjektion
- Brug kapillærerne (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, med glødetråd) til at trække fine injektionsnåle på en aftrækker. Design og optimer trækprogrammet i henhold til håndbogen.
- Åbn spidsen af nålen med tang under et stereodissektionsmikroskop. Spidsens diameter er ca. 10 μm og konusvinklen ca. 30°.
- Det monoklonale anti-DLD-antistof fra musen konjugeres med anti-Mus-IgG-Atto647N før injektion.
- For hvert injektionsforsøg blandes 0,5 μL anti-DLD-antistoffet (0,5 mg/ml) med 2 μL anti-Mouse-IgG-Atto647N-antistoffet (1 mg/ml) ved pipettering 5-10 gange. Derefter inkuberes ved stuetemperatur i mindst 30 minutter (eller på is i 2-3 timer).
- Efter inkubation tilsættes 2,5 μL blokerende buffer (10 mg/ml mus IgG) og 0,5 μL 0,5 % phenolrødt til antistofblandingen, og pipetten 10x blandes grundigt for at blokere eventuelle ukonjugerede antistoffer, der er tilbage i blandingen.
BEMÆRK: For hvert forsøg skal du forberede en ekstra blanding uden anti-DLD-antistoffet og bruge det som kontrol.
- Forbered 1% lavsmeltepunkt agarose i embryomediet. Den indeholdte agaroseblanding opvarmes ved 70 °C, indtil blandingen bliver gennemsigtig.
- Alikvoten agaroseopløsningen i 2 ml mikrocentrifugeglas. Opbevar delprøverne i en varmeblok ved ~40 °C.
- Skyl embryoet i røret indeholdende 1% lavsmeltepunkt agarose i 3 s.
- Placer embryoet på et omvendt plastik petriskållåg sammen med individuelle dråber agarose (~ 30-40 μL) for at montere hvert embryo separat på låget som vist i figur 1. Læg embryonerne fladt sideværts i agarosen og hold denne position, indtil agaroseen er størknet ved stuetemperatur.
- Monter 12 embryoner i tre rækker en efter en som ovenfor. Dæk alle de monterede embryoner i agarose med ægmedium.
3. Mikroinjektion
- Sæt de indlejrede embryoner under stereomikroskopet og dæk agaroseen med ægvand.
- Lufttryksinjektoren indstilles sammen med mikromanipulatorer, og placer dem tæt på mikroskoperne som vist i figur 1. Brug stålgasflasken indeholdende gasformigt nitrogen (N2) under højt tryk som luftressource.
- Åbn først gasventilen, efter at embryonerne er monteret i agarose. Derefter frontfyldes den forberedte glasnål med 2 μL antistofblanding på mikromanipulatoren, som vist i figur 1, når mikroinjektorens forreste påfyldningsmodul anvendes.
- Indstil indgangstrykket til ~80-90 psi og indsprøjtningstrykket til ~20 psi.
- Kalibrer injektionsvolumenet ved hjælp af et mikrometer under mikroskopet, som beskrevet tidligere15. Indstil varigheden af indstillingstiden til at være fra 10 ms til 120 ms i henhold til størrelsen på nåleåbningen. Giv hver injektionspuls ved at banke på pagajen. Indstil injektionsvolumen for hver levering til ~ 4-5 nL.
- Stik spidsen af mikroinjektionsnålen gennem den dorsale tagplade på baghjernen bageste til r0/r1-hængselpunktet, og injicer ca. 10 nL (to eller tre impulser) antistofblanding uden at ramme hjernevævet. Overhold strømmen af røde væsker i hjernens ventrikel.
BEMÆRK: Baghjernens ventrikel er bageste til midthjernens baghjernegrænse. Den injicerede phenolrødholdige antistofblanding fylder straks hjernens ventrikel fra baghjernen til forhjernen ved at diffundere med cerebrospinalvæske. - Efter injektionen fjernes kanylespidsen hurtigt fra embryoet ved at dreje mikromanipulatorens knap. For en vellykket injektion forbliver det røde farvestof af den injicerede blanding stabilt i hjernens ventrikel uden at lække ind i den omgivende agarose.
- Flyt monteringspladen under mikroskopet for at lokalisere et andet monteret embryo på et passende sted til gentagelser.
- Efter injektion af seks til otte embryoner skræl agaroseen med en mikrokirurgisk kniv for at frigive embryonerne fra den indlejrede agarose. Overfør de mikroinjicerede embryoner til en frisk skål med 30 ml embryomedium, og anbring dem ved stuetemperatur til de næste trin.
4. Montering og time-lapse live imaging
- Efter 30 minutter overføres de udvalgte embryoner til 10 ml embryomedium. Tilsæt 420 μL tricainstamme (4 mg / ml) til 10 ml embryomedium for at bedøve embryonerne.
- For at montere embryonerne fremstilles 0,8% agarose med lavt smeltepunkt indeholdende samme koncentration af tricain i røret. Opbevar delprøverne i en varmeblok ved ~40 °C.
- Brug en glaspipette til at nedsænke de injicerede embryoner i den varme agarose i 3 s. Fjern derefter straks embryonerne fra agaroseen med den samme glaspipette og placer embryonerne på midten af 35 mm glasbundskulturskåle med en dråbe agarose fra røret. Anbring kun et embryo pr. dråbe på glasset.
- Orienter embryonerne forsigtigt med en fibersonde eller lastespids for at holde den dorsale side af den embryonale hjerne så tæt på glasbunden som muligt. Indstil embryopositionen forsigtigt for at forlænge embryoet uden at krølle, da agarose gradvist størkner.
- Kontroller derefter embryoets position ved at vende glasbundskålen om. Sørg for, at hele den dorsale forhjerne med de korrekt monterede embryoner kan ses under mikroskopet.
- Der tilsættes 2-3 ml forvarmet embryonalt medium indeholdende tricain til at dække embryoet ved 28,5 °C. Opvask anbringes korrekt på det temperaturstyrede trin i konfokalmikroskopet, som vist i figur 1. Billedkammerets temperatur indstilles til 28,5 °C. Embryoet er nu klar til billeddannelse.
- Udfør time-lapse live imaging med et fast tidsinterval ved hjælp af et 40x vandnedsænkningsmål.
- Brug billedbehandlings- og mikroskopstyringssoftwaren (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.
- Vælg billeddannelseskanalerne på 564 nm og 647 nm til billeddannelse af membranfluorescensen af MyR-Tdtomato transgene zebrafisk og endosomal anti-Dld-Atto647N i cellen (figur 1).
- Indstil lasereffekten til 30 % for begge kanaler. Brug en eksponeringstid pr. z-plan på 200 ms for hver kanal.
- For hvert monteret zebrafiskembryo skal du bruge et scannings-z-trin på 1 μm til i alt 20 z-planer og en scanningscyklus på 100 tidsrammer.
- Indstil tidsintervallet mellem hver scanningscyklus til 20 s og scanningstilstanden som kanal, udsnit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 2A viste embryonerne injiceret med Atto647N, uden binding med det primære antistof, baggrundsfluorescens i hjernens ventrikel. Meget få opslugte fluorescerende partikler kan observeres i cellerne. De anti-Dld-Atto647N injicerede zebrafiskembryoner viste store mængder internaliserede fluorescerende partikler i de fleste celler i den udviklende forhjerne (figur 2A, højre panel). Efter at have zoomet ind for at fokusere på mitotiske RGP'er, som vist i figur 2B, var vi i stand til at registrere den dynamiske bevægelse af intracellulære anti-Dld-Atto647N-endosomer under celledeling (video 1). De fleste mitotiske RGP'er viste anterior eller posterior asymmetrisk adskillelse af anti-Dld-Atto647N-endosomer i to datterceller12. Vi bemærkede også, at asymmetrien blev stabiliseret mod slutningen af anafasen, hvilket resulterede i asymmetrisk arv af Notch-signalendosomer af dattercellerne bagefter12.
Figur 1: Rutediagram over eksperimentelle trin. Transgene zebrafisk, der udtrykker MyR-Tdtomat-reporteren, krydses med AB vildtype på dag 1. På dag 2 udvælges røde fluorescerende embryoner til mikroinjektion efterfulgt af tidsforløbende billeddannelse. Hele eksperimentet på 2. dagen tager ca. 8 timer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Time-lapse imaging af anti-Dld-Atto-647N antistof optagelse i udviklingen zebrafisk hjerne. (A) Anti-DLD-Atto-647N-optagelse efter 30 minutters mikroinjektion i forhjernen af et 1 dags embryo efter befrugtning (dpf). På venstre panel er embryoet kun injiceret med Atto-647N. På højre panel injiceres embryoet med anti-Dld-Atto-647N. Dash linjer angiver det apikale lag langs ventriklen. Rektangelzonen vises med høj forstørrelse i B. Skalabjælke = 40 μm. Forkortelser: Di = Diencephalon; Tlf = Telencephalon; Ve = ventrikel. (B) Time-lapse billeddannelsespaneler af anti-Dld-Atto-647N dynamik under mitose. De otte tidsrammer i montagen dækkede hele mitotisk cyklus og skildrede optagelsen og adskillelsen af anti-Dld-Atto-647N i to datterceller af en delende RGP. Skalabjælke = 5 μm Cellemembranen er skitseret. I både A og B er MyR-Tdtomat-mærkning på membranen blå, og anti-Dld-Atto-647N er magenta. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: Dynamik af internaliseret anti-Dld-Atto-647N i delende radiale gliaceller gennem mitose (40 tidsrammer og en intervaltid på 30 s mellem hver ramme; 20 minutter i alt). Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har udviklet et antistofoptagelsesassay til mærkning og billeddannelse af endosomal Notch/Delta handel med zebrafisk radiale glia-forfædre med høj effektivitet. Sammenlignet med tidligere metoder, der blev brugt til sporing af mærket anti-DeltaD-antistof i Drosophila SOP-celler7,8, brugte vores metode mikroinjektion i stedet for inkubation af prøver i det konjugerede antistof. Fluorescerende konjugerede anti-DLD-antistoffer blev mikroinjiceret i baghjernens ventrikel; Denne teknik forårsager ikke skade, som det fremgår af den normale udvikling og fuld genopretning af embryoner efter injektion. De embryonale ventrikler er kontinuerlige, hvilket gør det muligt for det injicerede antistof frit at sprede sig mod forhjernen efter mikroinjektion. Den injicerede anti-Dld-atto647N varer i over 24 timer som en stabil ressource af kontinuerlig antistofoptagelse i hjernen. Sammenlignet med neuralrørsinjektion, der blev introduceret i en tidligere rapport10, forårsager zebrafiskens baghjerneventrikelinjektion ikke vævsskade og muliggør selektiv anti-Dld-Atto647N-optagelse af mitotiske RGP'er, der forer hjernens ventrikler in vivo. Selvom vi ikke har kontrolleret antistofoptagelsen i neuroepitelceller i rygmarven, bør anti-Dld-Atto647N-antistofoptagelsen være anvendelig der, ligesom i hjernen. De konjugerede antistoffer, der injiceres i baghjernens ventrikel, forventes også at diffundere langs rygmarven.
For en vellykket anvendelse af antistofoptagelsesanalysen er det vigtigste spørgsmål at anvende et primært antistof, der har høj bindingsaffinitet og specificitet for det ekstracellulære domæne af et membranproteinmål. Ud over mærkning af Notch / Delta signalering er protokollen anvendelig til mærkning af andre membranproteiner eller ekstracellulære proteiner ved hjælp af lignende strategier. Vores protokol har vist meget effektiv anti-DLD antistofoptagelse i udviklingen af zebrafiskembryoner på grund af den høje kvalitet og høje specificitet af det primære antistof mod DLD. For det andet er konjugeringen af anti-DLD primært antistof med det fluorescerende sekundære antistof afgørende for at opnå et højt niveau af antistofoptagelseseffektivitet in vivo. Vi har fundet Atto ikke-blegende sekundære antistoffer at være mere stabile og meget lysere end andre fluorescerende antistoffer, såsom Zenon og Alexa sekundære antistoffer, der anvendes i Drosophila notum kulturer 7,10. Vi valgte Atto647N som fluorescerende mærke, da vi normalt ville bruge det sammen med GFP eller RFP transgene zebrafisk eller nogle andre fluorescerende markører, der deler lignende excitationsbølgelængder som GFP eller RFP. Andre ikke-blegelige sekundære antistoffer med forskellige excitationsbølgelængder bør også arbejde med protokollen. I vores protokol forkortede vi inkubationstiden for primære antistoffer blandet med Atto sekundært antistof fra 12 timer til 30 minutter og reducerede koncentrationen af anti-DLD-antistoffer til 0,05 mg/ml i de endelige mikroinjektionsblandinger. En højere koncentration af anti-DLD-antistof (0,25 mg/ml) øgede ikke antistofoptagelseseffektiviteten i zebrafiskembryoner; Dette kan være årsagen til behov for lange inkubationstider for at opnå tilstrækkelig mærkning med fluorescerende sekundære antistoffer10. Vi brugte ikke anti-DLD-antistof i en højere koncentration som i tidligere undersøgelser10, fordi der er en mulighed for, at injicerede anti-Dld-Atto647N-antistoffer konkurrerer med det endogent udtrykte Notch/Delta, når DeltaD-ligand bindes på membranen i RGP'er, hvorved det forstyrrer cis- eller transhak/delta-signalering in vivo. Vi fandt også, at blokering af buffer tilsat efter primær antistofkonjugering var nyttig til at øge specificiteten af antistofoptagelsesanalysen in vivo. Som vist i figur 2 internaliserer de fleste RGP'er i forhjernen aktivt anti-Dld-Atto647N. Uden at tilføje blokeringsbufferen viser de fleste celler meget få internaliserede anti-Dld-Atto647N-endosomer (data ikke vist).
Hovedbegrænsningen i protokollen er tilgængeligheden af de antistoffer, der kan anvendes til optagelsesanalysen. Vores protokol gælder for mærkning af membranudtrykte proteiner, hvis et godt antistof mod det ekstracellulære domæne er tilgængeligt. For cytosoliske og nukleare proteiner er antistofoptagelsesanalysen ikke anvendelig, da de konjugerede antistoffer ikke kan passere gennem cellemembranen for at binde til deres intracellulære bindingsmål. Live billeddannelse af intracellulære proteiner afhænger hovedsageligt af forskellige typer fluorescerende transgene modeller. I de seneste årtier er der udviklet flere fluorescerende farvestoffer til levende cellebilleddannelse, såsom Silicon Rhodamin-lignende (SiR) teknologi, som har bidraget væsentligt til levende cellebilleddannelse af DNA, RNA, actin og tubulin17. En kombination af forskellige levende mærkningsstrategier ville være den bedste måde at studere komplekse signalveje i levende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Projektet blev støttet af NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation og Chan Zuckerberg Biohub.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).
- Le Borgne, R., Schweisguth, F. Notch signaling: endocytosis makes delta signal better. Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).
- Chapman, G., et al. Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).
- Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain. Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).
- Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).
- Derivery, E., et al. Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division. Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).
- Matsuda, M., Chitnis, A. B. Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue. Development. 136 (2), 197-206 (2009).
- Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord. Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).
- Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -Y., Chitnis, A., Guo, S. Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia. Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).
- Zhao, X., et al. Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division. Science Advances. 7 (24), (2021).
- Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP. Bio-Protocol. 12 (5), 4336 (2022).
- Gutzman, J. H., Sive, H.
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).
- Lukinavičius, G., et al. Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).
