Summary
يطور هذا العمل مقايسة امتصاص الأجسام المضادة لتصوير إشارات Notch / DeltaD داخل السلالة في تقسيم أسلاف الدبقية الشعاعية لدماغ الزرد الجنيني.
Abstract
يعد الانقسام الخلوي غير المتماثل (ACD) ، الذي ينتج خليتين ابنتين من مصائر مختلفة ، أمرا أساسيا لتوليد التنوع الخلوي. في الأعضاء النامية لكل من اللافقاريات والفقاريات ، يولد السلف المنقسم بشكل غير متماثل الشق عالي التجديد الذاتي وابنة Notchlo المميزة. في دماغ الزرد الجنيني ، تخضع أسلاف الدبقية الكعبرية (RGPs) - الخلايا الجذعية العصبية الفقارية الرئيسية - في الغالب ل ACD لتلد RGP واحد وخلية عصبية متمايزة واحدة. إن الوضوح البصري وسهولة الوصول إلى أجنة الزرد يجعلها مثالية للتصوير بفاصل زمني في الجسم الحي لتصور مباشر كيف ومتى يتم إنشاء عدم تناسق إشارات Notch أثناء ACD. أظهرت الدراسات الحديثة أن التكاثر الخلوي الديناميكي ل Notch ligand DeltaD يلعب دورا مهما في تحديد مصير الخلية أثناء ACD ، ويتم تنظيم العملية بواسطة منظم القطبية المحفوظ تطوريا Par-3 (المعروف أيضا باسم Pard3) ومجمع محرك الداينين. لتصور أنماط الاتجار في الجسم الحي لإندوسومات إشارات Notch في RGPs الانقسامية ، قمنا بتطوير مقايسة امتصاص الأجسام المضادة هذه. باستخدام الفحص ، اكتشفنا ديناميكية الإندوسومات المحتوية على DeltaD أثناء تقسيم RGP.
Introduction
تتحكم إشارات الشق في قرار مصير الخلية ونمطها أثناء التطور في metazoans1 ، وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن إشارات Notch في انقسام الخلايا الجذعية تعتمد بشكل أساسي على الاتجار داخل الخلايا 2,3. يمكن ل Endocytosed Notch / Delta تنشيط إشارات Notch في النواة وتعزيز نسخ الجينات المستهدفة من Notch4،5،6. لوحظ الاتجار بالشق الاتجاهي / دلتا endosomal لأول مرة في خلايا سلائف الأعضاء الحسية (SOP) في ذبابة الفاكهة أثناء انقسام الخلايا غير المتماثل (ACD) ، مما أدى إلى نشاط إشارات Notch أعلى في pIIa مقارنة ب pIIb 7,8. تم تطبيق مقايسات امتصاص الأجسام المضادة مع الأجسام المضادة لدلتا والأجسام المضادة للشق لمراقبة العملية الداخلية في خلايا SOP الانقسامية. تتحرك إندوسومات الشق / دلتا D جنبا إلى جنب مع بروتين محرك كينيسين إلى المغزل المركزي أثناء التحريك الخلوي ، ويتم نقلها بشكل غير متماثل إلى خلية pIIa بسبب المصفوفة المضادة للتوازي للمغزل المركزي غير المتماثل في اللحظة الأخيرة من انقسام الخلية 3,8. ألقت هذه الدراسات الضوء على الآليات الجزيئية التي تنظم الانقسام غير المتماثل في خلايا ذبابة الفاكهة SOP ، ولكن من غير الواضح ما إذا كانت العمليات الداخلية المماثلة تحدث في أسلاف الخلايا الدبقية الشعاعية الفقارية (RGPs).
علاوة على ذلك ، فإن الآليات الجزيئية التي تنظم إشارات Notch / DeltaD غير المتماثلة أثناء انقسام RGP للفقاريات ليست مفهومة جيدا. في الزرد ، تم الإبلاغ عن أن تفاعل Notch و Delta يسهل التداخل الخلوي ل DeltaDligand 9. من غير المعروف ما إذا كان التكاثر الخلوي DeltaD يمكن أن يؤثر على اختيار مصير الخلية للخلايا الوليدة في دماغ الفقاريات النامية. تظهر الدراسات الحديثة أن حقن الأجسام المضادة المضادة ل DeltaD المترافقة بالفلورسنت في الأنبوب العصبي يمكن أن يسمي إندوسومات سارة على وجه التحديد في الخلايا الظهارية العصبية ، ومضادات DeltaD التي تحتوي على إندوسومات سارة تنفصل بشكل تفضيلي إلى خلايا ابنة متكاثرة10. وقد اقترح أن إشارات الشق من الإندوسومات يمكن أن تنظم مصير الخلايا الابنة. أظهرت النتائج السابقة أن معظم خلايا RGP لأسماك الزرد في الدماغ الأمامي النامي تخضع ل ACD ، ويعتمد تحديد مصير الخلية الابنة على إشارات Notch / DeltaD داخل السلالة11. من أجل توضيح طبيعة إشارات Notch / DeltaD داخل النسب في RGPs الزرد ، قمنا بتطوير مقايسة امتصاص الأجسام المضادة ل DeltaD في الدماغ النامي لأسماك الزرد. باستخدام هذا البروتوكول ، نجحنا في إجراء وضع العلامات الحية والتصوير لتهريب الخلايا الداخلية DeltaD في RGPs الانقسامية.
يتم استيعاب الجسم المضاد المضاد DeltaD المسمى بالفلورسنت بكفاءة في RGPs على طول البطين الأمامي للدماغ. لقد سهل إلى حد كبير اكتشاف الاتجار الاتجاهي بإندوسومات DeltaD في RGPs المقسمة بشكل غير متماثل12,13. بالمقارنة مع بروتوكولات امتصاص الأجسام المضادة السابقة التي تم تطويرها لمزارع ذبابة الفاكهة والحبل الشوكي الزرد 10 ، حقق هذا البروتوكول علامات طويلة الأمد وعالية الكفاءة لمكافحة DeltaD في طبقة خلايا البطين في الدماغ ، وتحديدا مع أقل من10 nL من خليط الأجسام المضادة المحقونة بالحقن الدقيق. يعد حقن البطين الخلفي في الدماغ مناسبا جدا لتطبيق مقايسة امتصاص الأجسام المضادة في الدماغ النامي ، حيث يتم توسيع البطين الخلفي بشكل جيد في أجنة الزرد ويمتلئ بالسائل النخاعي في مرحلة التطورالمبكرة 14. من خلال حقن خليط الأجسام المضادة في البطين الخلفي للدماغ دون إصابة أي أنسجة نامية مهمة ، قلل البروتوكول من الضرر المحتمل لمنطقة التصوير في الدماغ الأمامي قدر الإمكان. كما تجنبت الجرعة المخفضة للجسم المضاد الأولي المحقون الآثار الجانبية المحتملة للتدخل في إشارات دلتا نوتش الداخلية في الجسم الحي. يمكن دمج هذا البروتوكول بسهولة مع الاضطرابات الدوائية أو الجينية الأخرى ، واستخدامه في مراحل نمو مختلفة ، وربما تكييفه مع الدماغ البالغ وكذلك عضويات الدماغ 2D / 3D المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية. مجتمعة ، جعل البروتوكول من الممكن فهم كيف ومتى يتم إنشاء عدم تناسق إشارات Notch أثناء ACD. يتمثل التحدي الرئيسي للتنفيذ الناجح لهذا البروتوكول في تحقيق التسليم الدقيق للتركيزات المناسبة للجسم المضاد بناء على ظروف تجريبية محددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
لقد استخدمنا خط النوع البري AB والخط المعدل وراثيا Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] للدراسة. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو ، الولايات المتحدة الأمريكية (رقم الموافقة: AN179000).
1. تحضير أجنة الزرد
- قم بإعداد خزانات عبور الأسماك في فترة ما بعد الظهر قبل الساعة 5:00 مساء ، مع أنثى سمكة من النوع البري وسمك ذكر واحد Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] باستخدام فواصل لفصلها في كل حوض.
- قم بإزالة الفواصل قبل الساعة 11:00 صباحا من جميع خزانات العبور في صباح اليوم التالي. التزم الصمت ولا تزعج الأسماك أثناء التزاوج. يحدث التبويض عادة في غضون 30 دقيقة بعد إزالة الفواصل. يبقى البيض المخصب في قاع الخزان.
- جمع البيض المخصب من الدبابات مع مرشح شبكة. انقل البيض عن طريق غسله في طبق بتري مليء بماء البيض وافحص الأجنة تحت مجهر تشريح بتكبير 10x إلى 20x.
- انقل الأجنة المخصبة إلى طبق بتري نظيف يحتوي على حوالي 20 مل من وسط الجنين (100 مل من محلول مخزون 1000x يحتوي على 29.4 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.27 جم من KCl ، و 4.85 جم من CaCl 2.2H 2 O ، و 8.13 جم من MgSO4.7H 2O) مع ماصات باستور الزجاجية ذات التجويف الكبير. الحفاظ على الأجنة عند 28 درجة مئوية. احتفظ ب 50 جنينا مخصبا لكل طبق بتري مع 30 مل من وسط الجنين عند 28.5 درجة مئوية.
ملاحظة: ينتج زوج واحد من الأسماك عادة 100-300 جنين ، ومعدل الإخصاب والبقاء على قيد الحياة للأجنة السليمة يزيد عن 95٪ لكل تزاوج. - في صباح اليوم التالي ، أخرج الأجنة من الحاضنة في الساعة 8:00 صباحا ، عندما وصلت الأجنة إلى مرحلة النمو ~ 18-20 ساعة بعد الإخصاب (HPF). راقبهم تحت مجهر التألق عند تكبير 20x ، باستخدام الضوء الأبيض في البداية. في ذلك الوقت ، تكون أجنة الزرد في مرحلة 20 سوميت.
- تخلص من الأجنة الميتة الغائمة أو الممزقة تحت المجهر باستخدام ماصة زجاجية.
- قم بتشغيل مصباح الفلورسنت واختر إعداد مرشح RFP للمجهر. ثم ، حدد الأجنة ذات التألق الأحمر القوي وانقلها إلى طبق جديد بماء البيض.
- قم بإزالة الأجنة يدويا باستخدام ملقطين دقيقين (يجب أن تكون أطراف الملقط حادة وغير تالفة) تحت الضوء الأبيض (جدول المواد).
- امسك المشيم بزوج واحد من الملقط وقم بعمل تمزق في المشيم بالملقط الآخر. افتح المسيل للدموع بعناية باستخدام الملقط ، واجعله كبيرا بما يكفي لمرور الجنين عن طريق دفع الجنين برفق بأطراف الملقط الآخر.
- انقل الأجنة المنزوعة الأيونات إلى طبق بتري جديد بوسط جنيني طازج لشطف سريع قبل الحقن المجهري.
2. إعداد الحقن المجهري
- استخدم الشعيرات الدموية (1.2 مم OD ، 0.9 مم ID ، مع خيوط) لسحب إبر الحقن الدقيقة على مجتذب. تصميم وتحسين برنامج السحب وفقا للكتيب.
- افتح طرف الإبرة بالملقط تحت مجهر تشريح ستيريو. اجعل قطر الطرف حوالي 10 ميكرومتر ، وزاوية الاستدقاق حوالي 30 درجة.
- اقترن الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل Dld للفأر مع مضاد الفأر IgG-Atto647N قبل الحقن.
- لكل تجربة حقن، امزج 0.5 ميكرولتر من الجسم المضاد ل Dld (0.5 مجم / مل) مع 2 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد للفأر IgG-Atto647N (1 مجم / مل) عن طريق سحب 5-10 مرات. ثم ، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل (أو على الجليد لمدة 2-3 ساعات).
- بعد الحضانة ، أضف 2.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع (10 مجم / مل من الفأر IgG) و 0.5 ميكرولتر من 0.5٪ فينول أحمر إلى خليط الأجسام المضادة ، وماصة 10x للخلط جيدا ، لمنع أي أجسام مضادة غير مقترنة متبقية في الخليط.
ملاحظة: لكل تجربة، قم بإعداد خليط إضافي واحد بدون الجسم المضاد ل Dld واستخدمه كعنصر تحكم.
- تحضير 1 ٪ أغاروز نقطة انصهار منخفضة في وسط الجنين. سخني خليط الأغاروز على حرارة 70 درجة مئوية حتى يصبح المزيج شفافا.
- قسمة محلول الأغاروز في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 مل. احتفظ بالحصص في كتلة حرارية عند ~ 40 °C.
- شطف الجنين في أنبوب يحتوي على 1 ٪ نقطة انصهار منخفضة agarose لمدة 3 ثوان.
- ضع الجنين على غطاء طبق بتري بلاستيكي مقلوب مع قطرات فردية من الأغاروز (~ 30-40 ميكرولتر) لتركيب كل جنين على حدة على الغطاء كما هو موضح في الشكل 1. ضع الأجنة بشكل مسطح بشكل جانبي في الأغاروز وحافظ على هذا الوضع حتى يتجمد الأغاروز في درجة حرارة الغرفة.
- جبل 12 الأجنة في ثلاثة صفوف واحدا تلو الآخر على النحو الوارد أعلاه. تغطية جميع الأجنة المركبة في agarose مع وسط البيض.
3. الحقن المجهري
- ضع الأجنة المضمنة تحت المجهر المجسم وقم بتغطية الأغاروز بماء البيض.
- اضبط حاقن ضغط الهواء مع المعالجات الدقيقة ، وضعها بالقرب من المجاهر كما هو موضح في الشكل 1. استخدم أسطوانة الغاز الفولاذية التي تحتوي على النيتروجين الغازي (N2) تحت ضغط عال كمورد للهواء.
- افتح صمام الغاز فقط بعد تركيب الأجنة في الأغاروز. بعد ذلك ، قم بتحميل الإبرة الزجاجية المحضرة مسبقا ب 2 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة على المعالج الدقيق ، كما هو موضح في الشكل 1 ، عند استخدام وحدة التعبئة الأمامية للحاقن الدقيق.
- اضبط ضغط الإدخال على ~ 80-90 رطل / بوصة مربعة ، وضغط الحقن على ~ 20 رطل / بوصة مربعة.
- معايرة حجم الحقن باستخدام ميكرومتر تحت المجهر ، كما هو موضح سابقا15. اضبط مدة وقت الضبط لتكون من 10 مللي ثانية إلى 120 مللي ثانية ، وفقا لحجم فتحة الإبرة. قم بتوصيل كل نبضة من الحقن عن طريق النقر على المجداف. ضبط حجم الحقن لكل تسليم إلى ~ 4-5 nL.
- قم بوخز طرف إبرة الحقن المجهري من خلال لوحة السقف الظهرية للدماغ الخلفي الخلفي إلى نقطة المفصلة r0 / r1 ، وحقن حوالي 10 nL (نبضتان أو ثلاث نبضات) من خليط الأجسام المضادة دون ضرب أنسجة المخ. مراقبة تدفق السوائل الحمراء في بطين الدماغ.
ملاحظة: البطين الخلفي للدماغ الخلفي هو الخلفي لحدود الدماغ الخلفي للدماغ المتوسط. يملأ خليط الأجسام المضادة المحتوي على الفينول الأحمر المحقون بطين الدماغ من الدماغ الخلفي إلى الدماغ الأمامي على الفور عن طريق الانتشار بالسائل الدماغي الشوكي. - بعد الحقن ، قم بإزالة طرف الإبرة من الجنين بسرعة عن طريق تدوير مقبض المعالج الدقيق. للحصول على حقن ناجح ، تبقى الصبغة الحمراء للخليط المحقون في بطين الدماغ بثبات دون أن تتسرب إلى الأغاروز المحيط.
- حرك لوحة التثبيت تحت المجهر لتحديد موقع جنين مركب آخر في وضع مناسب للتكرار.
- بعد حقن ستة إلى ثمانية أجنة ، قشر الأغاروز بسكين جراحي مجهري لتحرير الأجنة من الأغاروز المدمج. انقل الأجنة المحقونة بالحقن الدقيق إلى طبق طازج يحتوي على 30 مل من وسط الجنين ، وضعها في درجة حرارة الغرفة للخطوات التالية.
4. تصاعد والتصوير الحي الفاصل الزمني
- بعد 30 دقيقة ، انقل الأجنة المختارة إلى 10 مل من وسط الجنين. أضف 420 ميكرولتر من مخزون التريكايين (4 مجم / مل) إلى 10 مل من وسط الجنين لتخدير الأجنة.
- لتركيب الأجنة ، قم بإعداد أغاروز منخفض بنسبة 0.8٪ يحتوي على نفس تركيز التريكايين في الأنبوب. احتفظ بالحصص في كتلة حرارية عند ~ 40 °C.
- استخدم ماصة زجاجية لغمر الأجنة المحقونة في الأغاروز الدافئ لمدة 3 ثوان. بعد ذلك ، قم بإزالة الأجنة على الفور من الأغاروز بنفس الماصة الزجاجية وضع الأجنة في وسط أطباق الثقافة ذات القاع الزجاجي 35 مم مع قطرة من الأغاروز من الأنبوب. ضع جنينا واحدا فقط لكل قطرة على الزجاج.
- قم بتوجيه الأجنة برفق باستخدام مسبار الألياف أو طرف التحميل لإبقاء الجانب الظهري من الدماغ الجنيني قريبا من القاع الزجاجي قدر الإمكان. اضبطي موضع الجنين برفق لتمديد الجنين دون تجعيد الشعر حيث يتجمد الأغاروز تدريجيا.
- بعد ذلك ، تحقق من موضع الجنين عن طريق قلب الطبق السفلي الزجاجي. تأكد من أن الدماغ الأمامي الظهري بالكامل مع الأجنة المثبتة بشكل صحيح يمكن رؤيته تحت المجهر.
- أضف 2-3 مل من 28.5 درجة مئوية من وسط جنيني مسخن مسبقا يحتوي على تريكايين لتغطية الجنين. ضع الطبق بشكل صحيح على مرحلة التحكم في درجة حرارة المجهر متحد البؤر، كما هو موضح في الشكل 1. اضبط درجة حرارة غرفة التصوير لتكون عند 28.5 درجة مئوية. الجنين جاهز الآن للتصوير.
- قم بإجراء تصوير مباشر بفاصل زمني مع فاصل زمني ثابت باستخدام هدف غمر الماء 40x.
- استخدم برنامج التصوير والتحكم المجهري (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.
- حدد قنوات التصوير 564 نانومتر و 647 نانومتر لتصوير مضان الغشاء لسمك الزرد المعدل وراثيا MyR-Tdtomato ومضاد الاندوسوم Dld-Atto647N في الخلية (الشكل 1).
- اضبط طاقة الليزر على 30٪ لكلتا القناتين. استخدم وقت تعريض لكل مستوى z يبلغ 200 مللي ثانية لكل قناة.
- لكل جنين زرد مركب ، استخدم خطوة z للمسح تبلغ 1 ميكرومتر ل 20 طائرة z في المجموع ، ودورة مسح من 100 إطار زمني.
- اضبط الفاصل الزمني بين كل دورة مسح ضوئي على 20 ثانية ووضع المسح كقناة ، شريحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الشكل 2 أ ، أظهرت الأجنة المحقونة ب Atto647N ، دون الارتباط بالجسم المضاد الأولي ، مضان الخلفية في بطين الدماغ. يمكن ملاحظة عدد قليل جدا من جزيئات الفلورسنت المبتلعة في الخلايا. أظهرت أجنة الزرد المحقونة المضادة ل Dld-Atto647N كميات كبيرة من جزيئات الفلورسنت الداخلية في معظم خلايا الدماغ الأمامي النامي (الشكل 2 أ ، اللوحة اليمنى). بعد التكبير للتركيز على RGPs الانقسامي ، كما هو موضح في الشكل 2B ، تمكنا من تسجيل الحركة الديناميكية للإندوسومات المضادة ل Dld-Atto647N داخل الخلايا أثناء انقسام الخلايا (الفيديو 1). أظهرت معظم RGPs الانقسامية فصلا غير متماثل أمامي أو خلفي للإندوسومات المضادة ل Dld-Atto647N إلى خليتين ابنتين12. لاحظنا أيضا أن عدم التماثل استقر في نهاية الطور الانفصالي ، مما أدى إلى وراثة غير متماثلة لإندوسومات إشارات Notch بواسطة الخلايا الوليدة بعد12.
الشكل 1: مخطط انسيابي للخطوات التجريبية. يتم تهجين أسماك الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن مراسل MyR-Tdtomato مع النوع البري AB في اليوم 1. في اليوم 2 ، يتم اختيار أجنة الفلورسنت الحمراء للحقن المجهري ، يليها التصوير المنقضي زمنيا. تستغرق التجربة بأكملهافي اليوم الثاني حوالي 8 ساعات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التصوير بفاصل زمني لامتصاص الأجسام المضادة ل Dld-Atto-647N في دماغ الزرد النامي. (أ) امتصاص مضاد Dld-Atto-647N بعد 30 دقيقة من الحقن المجهري في الدماغ الأمامي لجنين 1 يوم بعد الإخصاب (dpf). على اللوحة اليسرى يوجد الجنين المحقون ب Atto-647N فقط. على اللوحة اليمنى يوجد الجنين المحقون بمضاد Dld-Atto-647N. تشير خطوط الشرطة إلى الطبقة القمية على طول البطين. تظهر منطقة المستطيل بالتكبير العالي في B. شريط المقياس = 40 ميكرومتر. الاختصارات: Di = الدماغ البيني. الهاتف = الدماغ الدماغي. Ve = البطين. (ب) لوحات التصوير بفاصل زمني لديناميكيات مكافحة Dld-Atto-647N أثناء الانقسام. غطت الأطر الزمنية الثمانية في المونتاج الدورة الانقسامية بأكملها ، والتي تصور امتصاص وفصل مضاد Dld-Atto-647N إلى خليتين ابنتين من RGP المنقسم. شريط المقياس = 5 ميكرومتر تم تحديد غشاء الخلية. في كل من A و B ، يكون وضع العلامات MyR-Tdtomato على الغشاء أزرق ، ومضاد Dld-Atto-647N أرجواني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: ديناميات مضادات Dld-Atto-647N الداخلية في تقسيم الخلايا الدبقية الشعاعية في جميع أنحاء الانقسام (40 إطارا زمنيا وزمنا فاصلا قدره 30 ثانية بين كل إطار ؛ 20 دقيقة في المجموع). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد طورنا مقايسة امتصاص الأجسام المضادة لوضع العلامات والتصوير للاتجار بالشق / دلتا الإندوسومي في أسلاف الدبقية الشعاعية الزرد بكفاءة عالية. مقارنة بالطرق السابقة المستخدمة لتتبع الأجسام المضادة المضادة ل DeltaD في خلايا ذبابة الفاكهةSOP 7,8 ، استخدمت طريقتنا الحقن المجهري بدلا من حضانة العينات في الجسم المضاد المقترن. تم حقن الأجسام المضادة المضادة ل Dld المترافقة بالفلورسنت في البطين الخلفي. هذه التقنية لا تسبب إصابة ، كما يتضح من التطور الطبيعي والشفاء التام للأجنة بعد الحقن. البطينان الجنينيان مستمران ، مما يسمح للجسم المضاد المحقون بالانتشار بحرية نحو الدماغ الأمامي بعد الحقن المجهري. يستمر مضاد Dld-atto647N المحقون لأكثر من 24 ساعة كمورد مستقر لامتصاص الأجسام المضادة المستمر في الدماغ. بالمقارنة مع حقن الأنبوب العصبي ، الذي تم تقديمه في تقرير سابق10 ، فإن حقن البطين الخلفي لدماغ الزرد لا يسبب إصابة الأنسجة ويتيح امتصاص انتقائي مضاد ل Dld-Atto647N بواسطة RGPs الانقسامية التي تبطن بطينات الدماغ في الجسم الحي. على الرغم من أننا لم نتحقق من امتصاص الأجسام المضادة في الخلايا العصبية الظهارية في الحبل الشوكي ، إلا أن امتصاص الأجسام المضادة ل Dld-Atto647N يجب أن يكون قابلا للتطبيق هناك ، تماما كما هو الحال في الدماغ. من المتوقع أن تنتشر الأجسام المضادة المقترنة التي يتم حقنها في البطين الخلفي للدماغ على طول الحبل الشوكي أيضا.
من أجل التطبيق الناجح لمقايسة امتصاص الأجسام المضادة ، فإن أهم مشكلة هي استخدام جسم مضاد أولي له تقارب وخصوصية عالية للمجال خارج الخلية لهدف بروتين غشائي. بالإضافة إلى وضع العلامات على إشارات Notch / Delta ، فإن البروتوكول قابل للتطبيق لوضع علامات على البروتينات الغشائية الأخرى أو البروتينات خارج الخلية باستخدام استراتيجيات مماثلة. أظهر بروتوكولنا كفاءة عالية في امتصاص الأجسام المضادة المضادة ل DLD في تطوير أجنة الزرد بسبب الجودة العالية والخصوصية العالية للجسم المضاد الأولي المضاد ل DLD. ثانيا ، يعد اقتران الجسم المضاد الأولي المضاد ل Dld مع الجسم المضاد الثانوي الفلوري أمرا بالغ الأهمية لتحقيق مستوى عال من كفاءة امتصاص الأجسام المضادة في الجسم الحي. لقد وجدنا أن الأجسام المضادة الثانوية غير المبيضة هي Atto أكثر استقرارا وأكثر إشراقا من الأجسام المضادة الفلورية الأخرى ، مثل الأجسام المضادة الثانوية Zenon و Alexa المستخدمة في مزارع ذبابة الفاكهة 7,10. اخترنا Atto647N كملصق الفلورسنت ، حيث نستخدمه عادة مع GFP أو RFP الزرد المعدل وراثيا أو بعض علامات الفلورسنت الأخرى التي تشترك في أطوال موجية إثارة مماثلة مثل GFP أو RFP. يجب أن تعمل الأجسام المضادة الثانوية الأخرى غير القابلة للتبييض ذات الأطوال الموجية المختلفة للإثارة مع البروتوكول أيضا. في بروتوكولنا ، قمنا بتقصير وقت حضانة الأجسام المضادة الأولية الممزوجة بالجسم المضاد الثانوي Atto من 12 ساعة إلى 30 دقيقة ، وقللنا تركيز الأجسام المضادة المضادة ل Dld إلى 0.05 مجم / مل في مخاليط الحقن المجهري النهائية. لم يؤد التركيز العالي للأجسام المضادة المضادة ل Dld (0.25 مجم / مل) إلى زيادة كفاءة امتصاص الأجسام المضادة في أجنة الزرد. قد يكون هذا هو السبب في الحاجة إلى أوقات حضانة طويلة ، من أجل تحقيق وضع علامات كافية مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية10. لم نستخدم الأجسام المضادة المضادة ل Dld بتركيز أعلى كما في الدراسات السابقة10 ، لأن هناك احتمالا أن تتنافس الأجسام المضادة المضادة ل Dld-Atto647N المحقونة مع Notch / Delta المعبر عنها داخليا عند ربط DeltaD ligand على غشاء RGPs ، وبالتالي تتداخل مع رابطة الدول المستقلة أو إشارات Notch / Delta العابرة في الجسم الحي. وجدنا أيضا أن منع المخزن المؤقت المضاف بعد اقتران الأجسام المضادة الأولية كان مفيدا لزيادة خصوصية مقايسة امتصاص الأجسام المضادة في الجسم الحي. كما هو موضح في الشكل 2 ، فإن معظم RGPs في الدماغ الأمامي تستوعب مضاد Dld-Atto647N بنشاط. بدون إضافة المخزن المؤقت للحظر ، تظهر معظم الخلايا عددا قليلا جدا من الإندوسومات الداخلية المضادة ل Dld-Atto647N (البيانات غير معروضة).
القيد الرئيسي للبروتوكول هو توافر الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها لفحص الامتصاص. بروتوكولنا قابل للتطبيق لوضع العلامات على البروتينات المعبر عنها بالغشاء ، إذا كان الجسم المضاد الجيد للمجال خارج الخلية متاحا. بالنسبة للبروتينات الخلوية والنووية ، لا ينطبق فحص امتصاص الأجسام المضادة ، حيث لا يمكن للأجسام المضادة المترافقة المرور عبر غشاء الخلية لترتبط بأهداف الربط داخل الخلايا. يعتمد التصوير المباشر للبروتينات داخل الخلايا بشكل أساسي على أنواع مختلفة من النماذج الفلورية المعدلة وراثيا. في العقود الأخيرة ، تم تطوير المزيد من الأصباغ الفلورية لتصوير الخلايا الحية ، مثل تقنية السيليكون الشبيهة بالرودامين (SiR) ، والتي ساهمت بشكل كبير في تصوير الخلايا الحية للحمض النووي والحمض النووي الريبي والأكتين والتوبولين17. سيكون الجمع بين استراتيجيات وضع العلامات الحية المختلفة هو أفضل طريقة لدراسة مسارات الإشارات المعقدة في الخلايا الحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم المشروع من قبل NIH R01NS120218 ، وجائزة UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed للابتكار ، و Chan Zuckerberg Biohub.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).
- Le Borgne, R., Schweisguth, F. Notch signaling: endocytosis makes delta signal better. Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).
- Chapman, G., et al. Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).
- Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain. Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).
- Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).
- Derivery, E., et al. Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division. Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).
- Matsuda, M., Chitnis, A. B. Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue. Development. 136 (2), 197-206 (2009).
- Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord. Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).
- Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -Y., Chitnis, A., Guo, S. Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia. Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).
- Zhao, X., et al. Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division. Science Advances. 7 (24), (2021).
- Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP. Bio-Protocol. 12 (5), 4336 (2022).
- Gutzman, J. H., Sive, H.
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).
- Lukinavičius, G., et al. Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).
