Summary
이 작업은 배아 제브라피쉬 뇌의 방사형 신경교 전구체를 분할할 때 계통 내 Notch/DeltaD 신호 전달을 이미징하기 위한 항체 흡수 분석을 개발합니다.
Abstract
서로 다른 운명의 두 딸 세포를 생성하는 비대칭 세포 분열(ACD)은 세포 다양성을 생성하는 데 기본이 됩니다. 무척추 동물과 척추 동물의 발달 기관에서 비대칭으로 분열하는 선조는 Notchhi 자가 재생 및 Notchlo 차별화 딸을 생성합니다. 배아 제브라피쉬 뇌에서 주요 척추동물 신경 줄기 세포인 방사형 신경교 전구세포(RGP)는 대부분 ACD를 거쳐 하나의 RGP와 하나의 분화 뉴런을 낳습니다. 제브라피쉬 배아의 광학적 선명도와 쉬운 접근성은 ACD 동안 Notch 신호의 비대칭성이 언제 어떻게 설정되는지 직접 시각화하기 위한 생체 내 타임랩스 이미징에 이상적입니다. 최근 연구에 따르면 Notch 리간드 DeltaD의 동적 엔도사이토시스는 ACD 동안 세포 운명 결정에 중요한 역할을 하며, 이 과정은 진화적으로 보존된 극성 조절자 Par-3(Pard3라고도 함)과 다인 운동 복합체에 의해 조절됩니다. 유사분열 RGP에서 Notch 신호 엔도솜의 생체 내 트래피킹 패턴을 시각화하기 위해 우리는 이 항체 흡수 분석을 개발했습니다. 분석을 사용하여 RGP 분열 동안 DeltaD 함유 엔도솜의 역학을 밝혀냈습니다.
Introduction
노치 신호전달은 후생동물에서 발달하는 동안 세포의 운명 결정과 패터닝을 조절하며1, 최근 연구에 따르면 줄기세포 분열에서의 노치 신호전달은 주로 세포내 이동에 의존하는 것으로 나타났다 2,3. 엔도사이토시드 노치/델타는 핵에서 노치 신호전달을 활성화하고 노치 표적 유전자 4,5,6의 전사를 향상시킬 수 있습니다. 방향성 노치/델타 엔도솜 트래피킹은 비대칭 세포 분열(ACD) 동안 초파리 감각 기관 전구체(SOP) 세포에서 처음 관찰되었으며, 그 결과 pIIb 7,8보다 pIIa에서 더 높은 Notch 신호 전달 활성을 보였습니다. 유사분열 SOP 세포의 세포내 과정을 모니터링하기 위해 항-델타 및 항-노치 항체를 사용한 항체 흡수 분석이 적용되었습니다. Notch/DeltaD 엔도솜은 세포분열 동안 키네신 운동 단백질과 함께 중앙 방추체로 이동하고, 세포 분열의 마지막 순간에 비대칭 중심 방추의 역평행 배열로 인해 pIIa 세포로 비대칭적으로 전위됩니다 3,8. 이러한 연구는 초파리 SOP 세포에서 비대칭 분열을 조절하는 분자 메커니즘에 대해 밝혔지만 유사한 내세포 과정이 척추동물 방사형 신경교 전구체(RGP)에서 발생하는지 여부는 불분명합니다.
더욱이, 척추동물 RGP 분열 동안 비대칭 Notch/DeltaD 신호 전달을 조절하는 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 제브라피쉬에서 Notch와 Delta의 상호작용은 DeltaD 리간드9의 엔도사이토시스를 촉진하는 것으로 보고되었습니다. DeltaD 엔도사이토시스가 발달 중인 척추동물 뇌에서 딸 세포의 세포 운명 선택에 영향을 미칠 수 있는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 최근 연구에 따르면 형광 접합 항-DeltaD 항체를 신경관에 주입하면 신경상피 세포에서 Sara 엔도솜을 특이적으로 표지할 수 있으며, Sara 엔도솜을 함유한 항-DeltaD는 증식하는 딸 세포로 우선적으로 분리된다10. 엔도솜의 Notch 신호 전달이 딸 세포의 운명을 조절할 수 있다고 제안되었습니다. 이전 결과는 발달 중인 전뇌에서 대부분의 제브라피쉬 RGP 세포가 ACD를 겪고, 딸 세포의 운명 결정은 혈통 내 Notch/DeltaD 신호11에 의존한다는 것을 보여주었다. 제브라피쉬 RGP에서 intralineage Notch/DeltaD 신호 전달의 특성을 설명하기 위해 우리는 제브라피쉬 발달 뇌에서 항-DeltaD 항체 흡수 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜을 사용하여 유사분열 RGP에서 DeltaD 내세포 트래피킹의 실시간 라벨링 및 이미징을 성공적으로 수행했습니다.
형광 표지된 항-DeltaD 항체는 전뇌 심실을 따라 RGP에 효율적으로 내재화됩니다. 그것은 비대칭적으로 분열하는 RGP12,13에서 DeltaD 엔도솜의 방향성 트래피킹의 발견을 크게 촉진했습니다. 초파리 노텀 배양 및 제브라피쉬 척수10을 위해 개발된 이전 항체 흡수 프로토콜과 비교하여 이 프로토콜은 특히 10nL 미만의 미세 주입된 항체 혼합물로 뇌실 세포층에서 오래 지속되고 매우 효율적인 항-DeltaD 라벨링을 달성했습니다. 후뇌 심실 주사는 제브라 피쉬 배아에서 후뇌 심실이 잘 확장되고 초기 발달 단계14에서 뇌척수액으로 채워지기 때문에 발달중인 뇌에 항체 흡수 분석을 적용하는 데 매우 편리합니다. 중요한 발달 조직을 손상시키지 않고 항체 혼합물을 후뇌 심실에 주입함으로써 프로토콜은 전뇌의 이미징 영역에 대한 가능한 손상을 최대한 최소화했습니다. 주입된 1차 항체의 감소된 용량은 또한 생체 내에서 내인성 Delta-Notch 신호 전달을 방해하는 잠재적인 부작용을 피했습니다. 이 프로토콜은 다른 약리학적 또는 유전적 섭동과 쉽게 결합할 수 있고, 다양한 발달 단계에서 활용될 수 있으며, 성인 뇌와 인간 만능 줄기 세포 유래 2D/3D 뇌 오가노이드에 적용될 수 있습니다. 종합하면, 이 프로토콜을 통해 ACD 동안 Notch 신호 비대칭이 언제 어떻게 설정되는지 이해할 수 있습니다. 이 프로토콜의 성공적인 구현을 위한 주요 과제는 특정 실험 조건에 따라 적절한 농도의 항체를 정확하게 전달하는 것입니다.
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Protocol
우리는 연구를 위해 AB 야생형 계통과 형질전환 계통 Tg[ef1a:Myr-Tdtomato] 를 사용했습니다. 모든 동물 실험은 미국 샌프란시스코 캘리포니아 대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다(승인 번호: AN179000).
1. 제브라피쉬 배아의 준비
- 오후 5:00 이전에 오후 5:00 이전에 암컷 야생형 물고기 1마리와 수컷 Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] 물고기 1마리를 칸막이를 사용하여 각 수조에서 분리하여 물고기 횡단 수조를 설치합니다.
- 다음날 아침 11:00 이전에 모든 교차 탱크에서 칸막이를 제거하십시오. 짝짓기하는 동안 조용히하고 물고기를 방해하지 마십시오. 산란은 일반적으로 칸막이를 제거한 후 30분 이내에 발생합니다. 수정란은 탱크 바닥에 남아 있습니다.
- 메쉬 필터로 탱크에서 수정란을 수집하십시오. 달걀을 씻어서 달걀 물이 가득 찬 페트리 접시에 옮기고 해부 현미경으로 배아를 10x에서 20x 배율로 검사합니다.
- 수정된 배아를 약 20mL의 배아 배지(1,000x 원액 100mL에는 NaCl 29.4g, KCl 1.27g, CaCl 2.2H2O 4.85g 및 MgSO 4.7H 2O8.13g이 포함되어 있음)가 들어 있는 깨끗한페트리 접시에 대구경 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 배아를 28 °C에서 보관하십시오. 28.5°C에서 30mL의 배아 배지와 함께 페트리 접시당 50개의 수정된 배아를 보관합니다.
참고: 한 쌍의 물고기는 일반적으로 100-300개의 배아를 생산하며 건강한 배아의 수정 및 생존율은 각 짝짓기에 대해 95% 이상입니다. - 다음날 아침, 배아가 수정 후 ~18-20시간(hpf)의 발달 단계에 도달한 오전 8:00에 인큐베이터에서 배아를 꺼냅니다. 처음에는 백색광을 사용하여 20x 배율의 epifluorescence 현미경으로 관찰합니다. 그 당시 제브라 피쉬 배아는 20 개의 체성 단계에 있습니다.
- 유리 피펫을 사용하여 현미경으로 흐리거나 파열된 죽은 배아를 버립니다.
- 형광등을 켜고 현미경의 RFP 필터 설정을 선택합니다. 그런 다음 붉은 형광이 강한 배아를 선택하고 달걀 물이 담긴 새 접시에 옮깁니다.
- 백색광 아래에서 두 개의 미세한 집게(집게의 끝은 날카롭고 손상되지 않아야 함)를 사용하여 수동으로 배아를 Dechorionate합니다(재료 표).
- 한 쌍의 집게로 chorion을 잡고 다른 집게로 chorion을 찢습니다. 집게를 사용하여 조심스럽게 눈물을 열고 다른 집게의 끝으로 배아를 부드럽게 밀어 배아가 통과할 수 있을 만큼 충분히 크게 만듭니다.
- 미세 주입 전에 빠른 헹굼을 위해 신선한 배아 배지가 있는 새로운 페트리 접시에 박초를 제거합니다.
2. 미세주입제의 제조
- 풀러에서 미세 주사 바늘을 당기려면 모세관(1.2mm OD, 0.9mm ID, 필라멘트 포함)을 사용하십시오. 핸드북에 따라 당기는 프로그램을 설계하고 최적화하십시오.
- 입체 해부 현미경으로 집게로 바늘 끝을 엽니다. 팁의 직경을 약 10μm로 만들고 테이퍼 각도를 약 30°로 만듭니다.
- 주사 전에 마우스 단클론 항-Dld 항체를 항-Mouse-IgG-Atto647N과 접합합니다.
- 각 주사 실험에서 0.5μL의 항-Dld 항체(0.5mg/mL)와 2μL의 항-Mouse-IgG-Atto647N 항체(1mg/mL)를 5-10회 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 실온에서 최소 30분 동안(또는 얼음 위에서 2-3시간 동안) 배양합니다.
- 배양 후, 2.5 μL의 블로킹 완충액(10 mg/mL 마우스 IgG)과 0.5 μL의 0.5 μL의 0.5% 페놀 레드를 항체 혼합물에 첨가하고, 10x 피펫을 사용하여 완전히 혼합하여 혼합물에 남아 있는 비접합 항체를 차단합니다.
참고: 각 시험에 대해 항-Dld 항체가 없는 추가 혼합물 1개를 준비하고 대조군으로 사용하십시오.
- 배아 배지에서 1% 저융점 아가로스를 준비한다. 아가로오스 함유 혼합물을 70°C에서 혼합물이 투명해질 때까지 가열한다.
- 아가로스 용액을 2mL 미세원심분리기 튜브에 분취합니다. 분취량을 ~40°C의 열 블록에 보관하십시오.
- 1% 저융점 아가로스가 들어 있는 튜브에서 배아를 3초 동안 헹굽니다.
- 그림 1과 같이 배아를 개별 아가로오스 방울(~30-40μL)과 함께 거꾸로 된 플라스틱 페트리 접시 뚜껑에 놓고 각 배아를 뚜껑에 별도로 장착합니다. 배아를 아가로스에 옆으로 평평하게 놓고 아가로스가 실온에서 굳을 때까지 이 위치를 유지합니다.
- 위와 같이 12개의 배아를 3줄로 하나씩 장착합니다. agarose에 장착 된 모든 배아를 계란 배지로 덮으십시오.
3. 미세주입
- 매립된 배아를 실체현미경 아래에 놓고 아가로스를 계란수로 덮습니다.
- 공기 압력 인젝터를 마이크로 매니퓰레이터와 함께 설정하여 그림 1과 같이 현미경에 가깝게 배치합니다. 고압의 기체 질소(N2)를 함유한 강철 가스 실린더를 공기 자원으로 사용하십시오.
- 배아가 용란증에 장착 된 후에 만 가스 밸브를 엽니 다. 그런 다음 마이크로 인젝터의 전면 충전 모듈을 사용할 때 그림 1과 같이 제조된 유리 바늘에 2 μL의 항체 혼합물을 미세 조작기에 전면 로드합니다.
- 입력 압력을 ~80-90psi로 조정하고 사출 압력을 ~20psi로 조정합니다.
- 이전에 기술된 바와 같이 현미경 하에서 마이크로미터를 사용하여 주입 부피를 보정한다15. 바늘 구멍의 크기에 따라 튜닝 시간을 10ms에서 120ms로 설정합니다. 패들을 두드려 주입의 각 펄스를 전달하십시오. 각 전달의 주입량을 ~4-5nL로 조정합니다.
- 미세주입 바늘 끝을 r0/r1 힌지 포인트 후방의 등쪽 지붕판에 찔러 뇌 조직에 부딪히지 않고 약 10nL(2회 또는 3회 펄스)의 항체 혼합물을 주입합니다. 뇌실에서 붉은 액체가 흐르는 것을 관찰하십시오.
참고: 후뇌 심실은 중뇌 후뇌 경계의 뒤쪽에 있습니다. 주입된 페놀 레드 함유 항체 혼합물은 뇌척수액으로 확산되어 즉시 후뇌에서 전뇌로 뇌실을 채웁니다. - 주사 후 미세 조작기의 손잡이를 돌려 배아에서 바늘 끝을 신속하게 제거합니다. 성공적인 주사를 위해, 주입 된 혼합물의 적색 염료는 포위 된 용설로로 누출되지 않고 안정적으로 뇌실에 남아 있습니다.
- 마운팅 플레이트를 현미경 아래로 이동하여 반복에 적합한 위치에 장착된 다른 배아를 찾습니다.
- 6 내지 8개의 배아를 주입한 후, 미세수술용 칼로 아가로스를 벗겨 내포된 아가로스로부터 배아를 방출한다. 미세 주입된 배아를 30mL의 배아 배지가 있는 신선한 접시에 옮기고 다음 단계를 위해 실온에 두십시오.
4. 장착 및 타임랩스 라이브 이미징
- 30분 후, 선택된 배아를 10mL의 배아 배지로 옮깁니다. 420 μL의 트리카인 스톡(4 mg/mL)을 10 mL의 배아 배지에 첨가하여 배아를 마취시킵니다.
- 배아를 장착하기 위해, 튜브에 동일한 농도의 트리카인을 함유하는 0.8% 저융점 아가로스를 준비한다. 분취량을 ~40°C의 열 블록에 보관하십시오.
- 유리 피펫을 사용하여 주입 된 배아를 따뜻한 아가로스에 3 초 동안 담그십시오. 그런 다음 동일한 유리 피펫으로 아가로스에서 배아를 즉시 제거하고 튜브에서 아가로스 한 방울과 함께 35mm 유리 바닥 배양 접시의 중앙에 배아를 놓습니다. 유리에 한 방울 당 하나의 배아 만 놓습니다.
- 배아 뇌의 등쪽을 가능한 한 유리 바닥에 가깝게 유지하기 위해 섬유 프로브 또는 로딩 팁으로 배아의 방향을 부드럽게 지정합니다. 용란이 서서히 굳어짐에 따라 말리지 않고 배아를 확장하기 위해 배아 위치를 부드럽게 조정합니다.
- 그런 다음 유리 바닥 접시를 뒤집어 배아 위치를 확인합니다. 올바르게 장착된 배아가 있는 전체 등쪽 전뇌를 현미경으로 볼 수 있는지 확인하십시오.
- 배아를 덮기 위해 트리카인을 함유하는 28.5°C로 예열된 배아 배지 2-3mL를 추가합니다. 온도 제어 단계에 접시를 적절하게 놓습니다.tage, 그림 1과 같이 컨포칼 현미경. 이미징 챔버의 온도를 28.5°C로 조정합니다. 이제 배아를 이미징할 준비가 되었습니다.
- 40x Water Immersion Objective를 사용하여 고정된 시간 간격으로 타임랩스 라이브 이미징을 수행합니다.
- 이미징 및 현미경 제어 소프트웨어(μMANAGER: https://micro-manager.org/)16를 사용합니다.
- 세포에서 MyR-Tdtomato 형질전환 제브라피쉬 및 엔도솜 항-Dld-Atto647N의 막 형광을 이미징하기 위해 564nm 및 647nm의 이미징 채널을 선택합니다(그림 1).
- 두 채널 모두에 대해 레이저 출력을 30%로 설정합니다. 각 채널에 대해 z면당 노출 시간을 200ms로 사용합니다.
- 장착된 각 제브라피쉬 배아에 대해 총 20개의 z-평면에 대해 1μm의 스캐닝 z-스텝과 100개의 시간 프레임의 스캐닝 주기를 사용합니다.
- 각 스캔 주기 사이의 시간 간격을 20초로 설정하고 스캔 모드를 채널, 슬라이스로 설정합니다.
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Representative Results
도 2A에서, 1차 항체와 결합하지 않고 Atto647N을 주입한 배아는 뇌심실에서 배경 형광을 보였다. 세포에서 삼켜진 형광 입자는 거의 관찰되지 않습니다. 항-Dld-Atto647N 주사된 제브라피쉬 배아는 발달 중인 전뇌의 대부분의 세포에서 많은 양의 내재화된 형광 입자를 보여주었습니다(그림 2A, 오른쪽 패널). 그림 2B와 같이 유사분열 RGP에 초점을 맞추기 위해 확대한 후 세포 분열 동안 세포 내 항-Dld-Atto647N 엔도솜의 동적 움직임을 기록할 수 있었습니다(비디오 1). 대부분의 유사분열 RGP는 항-Dld-Atto647N 엔도솜이 두 개의 딸 세포로 전방 또는 후방 비대칭 분리를 보였다12. 우리는 또한 비대칭이 아나페이즈가 끝날 무렵 안정화되어 나중에 딸 세포에 의한 Notch 신호 엔도솜의 비대칭 유전을 초래한다는 것을 알아차렸습니다12.
그림 1: 실험 단계의 순서도. MyR-Tdtomato 리포터를 발현하는 형질전환 제브라피쉬는 1일째에 AB 야생형과 교배됩니다. 2일째에는 미세주입을 위해 적색 형광 배아를 선택한 후 시간 경과 이미징을 수행합니다. 2일째 되는 날의 전체 실험은 약 8시간이 소요됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 발달 중인 제브라피쉬 뇌에서 항-Dld-Atto-647N 항체 흡수의 타임랩스 이미징. (A) 수정 후 647일 배아의 전뇌에서 30분 미세 주입 후 항-Dld-Atto-1N 흡수. 왼쪽 패널에는 Atto-647N만 주입된 배아가 있습니다. 오른쪽 패널에는 항 -DLD-Atto-647N이 주입 된 배아가 있습니다. 점선은 심실을 따라 정점층을 나타냅니다. 직사각형 영역은 B에서 고배율로 표시됩니다. 스케일 바 = 40 μm. 약어: Di = 간뇌; Tel = 종뇌; Ve = 심실. (B) 유사분열 동안 항-Dld-Atto-647N 역학의 타임랩스 이미징 패널. 몽타주의 8개 시간대는 전체 유사분열 주기를 다루었으며, 항-Dld-Atto-647N이 분열하는 RGP의 두 딸 세포로 흡수되고 분리되는 것을 묘사합니다. 스케일 바 = 5 μm 세포막의 윤곽이 그려져 있습니다. A와 B 모두에서 멤브레인의 MyR-Tdtomato 라벨링은 파란색이고 anti-Dld-Atto-647N은 자홍색입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1 : 유사분열 전반에 걸쳐 방사상 신경교 세포를 분열시키는 내재화된 항-Dld-Atto-647N의 역학(40개의 시간 프레임 및 각 프레임 사이의 간격 시간 30초, 총 20분). 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 제브라피쉬 방사형 신경교 전구체의 엔도솜 노치/델타 트래피킹을 고효율로 표지하고 이미징하기 위한 항체 흡수 분석을 개발했습니다. 초파리 SOP 세포7,8에서 표지된 항-DeltaD 항체를 추적하는 데 사용된 이전 방법과 비교하여, 우리의 방법은 접합 항체에서 샘플을 배양하는 대신 미세주입을 사용했습니다. 형광 접합 항-Dld 항체를 후뇌 심실에 미세 주입했습니다. 이 기술은 주사 후 배아의 정상적인 발달과 완전한 회복에 의해 입증 된 바와 같이 부상을 일으키지 않습니다. 배아 심실은 연속적이어서 주입된 항체가 미세 주입 후 전뇌 쪽으로 자유롭게 분산될 수 있습니다. 주입된 항-Dld-atto647N은 뇌에서 지속적인 항체 흡수의 안정적인 자원으로 24시간 이상 지속됩니다. 이전 보고서10에서 소개된 신경관 주입과 비교하여 제브라피쉬 후뇌실 주입은 조직 손상을 일으키지 않으며 생체 내에서 뇌실을 둘러싸고 있는 유사분열 RGP에 의한 선택적 항-Dld-Atto647N 흡수를 가능하게 합니다. 척수의 신경 상피 세포에서 항체 흡수를 확인하지는 않았지만 뇌에서와 마찬가지로 항 -Dld-Atto647N 항체 흡수가 적용되어야합니다. 후뇌 심실에 주입된 접합 항체는 척수를 따라 확산될 것으로 예상됩니다.
항체 흡수 분석의 성공적인 적용을 위해 가장 중요한 문제는 막 단백질 표적의 세포외 도메인에 대해 높은 결합 친화도 및 특이성을 갖는 1차 항체를 사용하는 것입니다. Notch/Delta 신호 전달 라벨링 외에도 이 프로토콜은 유사한 전략을 사용하여 다른 막 단백질 또는 세포외 단백질을 라벨링하는 데 적용할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 항-Dld 1차 항체의 높은 품질과 높은 특이성으로 인해 제브라피쉬 배아 발달에서 매우 효율적인 항-Dld 항체 흡수를 입증했습니다. 둘째, 항-Dld 1차 항체와 형광 2차 항체의 접합은 생체 내에서 높은 수준의 항체 흡수 효율을 달성하는 데 중요합니다. 우리는 Atto 비표백 2차 항체가 Drosophila notum 배양에 사용되는 Zenon 및 Alexa 2차 항체와 같은 다른 형광 항체보다 더 안정적이고 훨씬 더 밝다는 것을 발견했습니다 7,10. 우리는 일반적으로 GFP 또는 RFP 형질전환 제브라피쉬 또는 GFP 또는 RFP와 유사한 여기 파장을 공유하는 다른 형광 마커와 함께 사용하기 때문에 Atto647N을 형광 라벨로 선택했습니다. 여기 파장이 다른 다른 표백할 수 없는 2차 항체도 프로토콜과 함께 작동해야 합니다. 우리의 프로토콜에서 우리는 Atto 2차 항체와 혼합된 1차 항체의 배양 시간을 12시간에서 30분으로 단축하고 최종 미세주입 혼합물에서 Anti-Dld 항체의 농도를 0.05mg/mL로 감소시켰습니다. 더 높은 농도의 항-Dld 항체(0.25mg/mL)는 제브라피쉬 배아에서 항체 흡수 효율을 증가시키지 않았습니다. 이는 형광 2차 항체로 충분한 표지를 달성하기 위해 긴 배양 시간을 필요로 하는 이유일 수 있다10. 주입된 anti-Dld-Atto647N 항체가 RGP의 막에 DeltaD 리간드를 결합할 때 내인성으로 발현된 Notch/Delta와 경쟁하여 생체 내에서 시스 또는 트랜스 Notch/Delta 신호 전달을 방해할 가능성이 있기 때문에 이전 연구10에서와 같이 더 높은 농도의 anti-Dld 항체를 사용하지 않았습니다. 우리는 또한 1차 항체 접합 후 첨가된 차단 완충액이 생체 내에서 항체 흡수 분석의 특이성을 증가시키는 데 도움이 된다는 것을 발견했습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 전뇌의 대부분의 RGP는 항-Dld-Atto647N을 능동적으로 내재화합니다. 블로킹 완충액을 첨가하지 않으면, 대부분의 세포는 매우 적은 수의 내재화된 항-Dld-Atto647N 엔도솜을 나타낸다 (데이터는 나타내지 않음).
프로토콜의 주요 한계는 흡수 분석에 사용할 수 있는 항체의 가용성입니다. 우리의 프로토콜은 세포외 도메인에 대한 우수한 항체를 사용할 수 있는 경우 막 발현 단백질을 라벨링하는 데 적용할 수 있습니다. 세포질 및 핵 단백질의 경우, 접합 항체가 세포막을 통과하여 세포 내 결합 표적에 결합할 수 없기 때문에 항체 흡수 분석은 적용할 수 없습니다. 세포내 단백질의 라이브 이미징은 주로 다양한 유형의 형광 형질전환 모델에 따라 달라집니다. 최근 수십 년 동안 실리콘 로다민 유사(SiR) 기술과 같이 생세포 이미징을 위해 더 많은 형광 염료가 개발되었으며, 이는 DNA, RNA, 액틴 및 튜불린17의 생세포 이미징에 크게 기여했습니다. 다양한 라이브 라벨링 전략의 조합은 라이브 셀에서 복잡한 신호 전달 경로를 연구하는 가장 좋은 방법이 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation 및 Chan Zuckerberg Biohub의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
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