Summary
यह काम भ्रूण जेब्राफिश मस्तिष्क के रेडियल ग्लिया पूर्वजों को विभाजित करने में इंट्रा-वंशावली नॉच / डेल्टाडी सिग्नलिंग की इमेजिंग के लिए एक एंटीबॉडी अपटेक परख विकसित करता है।
Abstract
असममित कोशिका विभाजन (एसीडी), जो विभिन्न भाग्य की दो बेटी कोशिकाओं का उत्पादन करता है, सेलुलर विविधता उत्पन्न करने के लिए मौलिक है। अकशेरुकी और कशेरुकी दोनों के विकासशील अंगों में, असमान रूप से विभाजित पूर्वज एक नॉचहाय आत्म-नवीनीकरण और एक नॉचलो विभेदक बेटी उत्पन्न करते हैं। भ्रूण जेब्राफिश मस्तिष्क में, रेडियल ग्लिया पूर्वज (आरजीपी) - प्रमुख कशेरुक तंत्रिका स्टेम कोशिकाएं - ज्यादातर एक आरजीपी और एक विभेदक न्यूरॉन को जन्म देने के लिए एसीडी से गुजरती हैं। जेब्राफिश भ्रूण की ऑप्टिकल स्पष्टता और आसान पहुंच उन्हें विवो टाइम-लैप्स इमेजिंग में सीधे कल्पना करने के लिए आदर्श बनाती है कि एसीडी के दौरान नॉच सिग्नलिंग की विषमता कैसे और कब स्थापित होती है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि नॉच लिगैंड डेल्टाडी का गतिशील एंडोसाइटोसिस एसीडी के दौरान सेल भाग्य निर्धारण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और इस प्रक्रिया को क्रमिक रूप से संरक्षित ध्रुवीयता नियामक पार -3 (जिसे पार्ड 3 के रूप में भी जाना जाता है) और डायनेन मोटर कॉम्प्लेक्स द्वारा नियंत्रित किया जाता है। माइटोटिक आरजीपी में नॉच सिग्नलिंग एंडोसोम के विवो तस्करी पैटर्न की कल्पना करने के लिए, हमने इस एंटीबॉडी अपटेक परख को विकसित किया है। परख का उपयोग करते हुए, हमने आरजीपी डिवीजन के दौरान डेल्टाडी युक्त एंडोसोम की गतिशीलता को उजागर किया है।
Introduction
नॉच सिग्नलिंग मेटाज़ोन्स1 में विकास के दौरान सेल भाग्य निर्णय और पैटर्निंग को नियंत्रित करता है, और हाल के अध्ययनों से पता चला है कि स्टेम सेल डिवीजन में नॉच सिग्नलिंग मुख्य रूप से एंडोसाइटिक ट्रैफिकिंग 2,3 पर निर्भर करता है। डेल्टा नाभिक में नॉच सिग्नलिंग को सक्रिय कर सकता है और नॉच लक्ष्य जीन 4,5,6 के प्रतिलेखन को बढ़ा सकता है। डेल्टा एंडोसोमल तस्करी को पहली बार ड्रोसोफिला संवेदी अंग अग्रदूत (एसओपी) कोशिकाओं में इसके असममित कोशिका विभाजन (एसीडी) के दौरान देखा गया था, जिसके परिणामस्वरूप पीआईबी 7,8 की तुलना में पीआईए में उच्च नॉच सिग्नलिंग गतिविधि देखी गई थी। माइटोटिक एसओपी कोशिकाओं में एंडोसाइटिक प्रक्रिया की निगरानी के लिए एंटी-डेल्टा और एंटी-नॉच एंटीबॉडी के साथ एंटीबॉडी अपटेक परख लागू की गई है। डेल्टाडी एंडोसोम साइटोकिनेसिस के दौरान केंद्रीय स्पिंडल में एक किन्सिन मोटर प्रोटीन के साथ चलते हैं, और कोशिका विभाजन 3,8 के अंतिम क्षण में असममित केंद्रीय स्पिंडल की एंटीपैरेलल सरणी के कारण पीआईए सेल में असममित रूप से स्थानांतरित हो जाते हैं। इन अध्ययनों ने ड्रोसोफिला एसओपी कोशिकाओं में असममित विभाजन को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र पर प्रकाश डाला है, लेकिन यह स्पष्ट नहीं है कि कशेरुक रेडियल ग्लिया पूर्वजों (आरजीपी) में इसी तरह की एंडोसाइटिक प्रक्रियाएं होती हैं या नहीं।
इसके अलावा, कशेरुक आरजीपी विभाजन के दौरान असममित नॉच / डेल्टाडी सिग्नलिंग को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। जेब्राफिश में, यह बताया गया है कि नॉच और डेल्टा की बातचीत डेल्टाडी लिगैंड9 के एंडोसाइटोसिस की सुविधा प्रदान करती है। यह अज्ञात है कि क्या डेल्टाडी एंडोसाइटोसिस विकासशील कशेरुक मस्तिष्क में बेटी कोशिकाओं की कोशिका भाग्य पसंद को प्रभावित कर सकता है। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि न्यूरल ट्यूब में फ्लोरोसेंटली संयुग्मित एंटी-डेल्टाडी एंटीबॉडी इंजेक्ट करने से सारा एंडोसोम को विशेष रूप से न्यूरोएपिथेलियल कोशिकाओं में लेबल किया जा सकता है, और एंटी-डेल्टाडी युक्त सारा एंडोसोम अधिमानतःबेटी कोशिकाओं के प्रसार में अलग हो सकते हैं। यह सुझाव दिया गया है कि एंडोसोम से नॉच सिग्नलिंग बेटी सेल भाग्य को नियंत्रित कर सकती है। पिछले परिणामों से पता चला है कि विकासशील फोरब्रेन में अधिकांश जेब्राफिश आरजीपी कोशिकाएं एसीडी से गुजरती हैं, और बेटी सेल भाग्य निर्धारण इंट्रावंशावली नॉच / डेल्टाडी सिग्नलिंग11 पर निर्भर है। जेब्राफिश आरजीपी में इंट्रावंशावली नॉच / डेल्टाडी सिग्नलिंग की प्रकृति को स्पष्ट करने के लिए, हमने जेब्राफिश विकासशील मस्तिष्क में एंटी-डेल्टाडी एंटीबॉडी अपटेक परख विकसित की है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने माइटोटिक आरजीपी में डेल्टाडी एंडोसाइटिक तस्करी के लाइव लेबलिंग और इमेजिंग का सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया है।
फ्लोरोसेंटली लेबल एंटी-डेल्टाडी-एंटीबॉडी को फोरब्रेन वेंट्रिकल के साथ आरजीपी में कुशलतापूर्वक आंतरिक रूप से आंतरिक किया जाता है। इसने असममित रूप से विभाजित आरजीपी12,13 में डेल्टाडी एंडोसोम की दिशात्मक तस्करी की खोज को बहुत सुविधाजनक बनाया है। ड्रोसोफिला नोटम संस्कृतियों और जेब्राफिश रीढ़ की हड्डी 10 के लिए विकसित पिछले एंटीबॉडी अपटेक प्रोटोकॉल की तुलना में, इस प्रोटोकॉल ने मस्तिष्क वेंट्रिकल सेल परत में लंबे समय तक चलने वाले और अत्यधिक कुशल एंटी-डेल्टाडी लेबलिंग हासिल की है, विशेष रूप से10 एनएल से कम माइक्रोइंजेक्टेड एंटीबॉडी मिश्रण के साथ। हिंडब्रेन वेंट्रिकल इंजेक्शन विकासशील मस्तिष्क में एंटीबॉडी अपटेक परख को लागू करने के लिए बहुत सुविधाजनक है, क्योंकि हिंडब्रेन वेंट्रिकल जेब्राफिश भ्रूण में अच्छी तरह से विस्तारित होता है और प्रारंभिक विकास चरण14 में मस्तिष्कमेरु द्रव से भर जाता है। किसी भी महत्वपूर्ण विकासशील ऊतकों को घायल किए बिना हिंडब्रेन वेंट्रिकल में एंटीबॉडी मिश्रण को इंजेक्ट करके, प्रोटोकॉल ने फोरब्रेन में इमेजिंग ज़ोन को यथासंभव संभावित नुकसान को कम कर दिया है। इंजेक्शन वाले प्राथमिक एंटीबॉडी की कम खुराक ने विवो में अंतर्जात डेल्टा-नॉच सिग्नलिंग में हस्तक्षेप करने के संभावित दुष्प्रभावों से भी बचा है। इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य औषधीय या आनुवंशिक गड़बड़ी के साथ जोड़ा जा सकता है, जिसका उपयोग विभिन्न विकास चरणों में किया जाता है, और संभवतः वयस्क मस्तिष्क के साथ-साथ मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न 2 डी / 3 डी मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स के लिए अनुकूलित किया जाता है। एक साथ लिया गया, प्रोटोकॉल ने यह समझना संभव बना दिया है कि एसीडी के दौरान नॉच सिग्नलिंग विषमता कैसे और कब स्थापित होती है। इस प्रोटोकॉल के सफल कार्यान्वयन के लिए मुख्य चुनौती विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर एंटीबॉडी की उचित सांद्रता के सटीक वितरण को प्राप्त करना है।
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Protocol
हमने अध्ययन के लिए एबी वाइल्ड टाइप लाइन और ट्रांसजेनिक लाइन टीजी [ईएफ 1 ए: मायर-टीडीटोमेटो] का उपयोग किया है। सभी पशु प्रयोगों को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन फ्रांसिस्को, संयुक्त राज्य अमेरिका में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था (अनुमोदन संख्या: एएन 179000)।
1. जेब्राफिश भ्रूण की तैयारी
- प्रत्येक टैंक में डिवाइडर का उपयोग करके एक मादा जंगली प्रकार की मछली और एक नर टीजी [ef1a: Myr-Tdtomato] मछली के साथ दोपहर में शाम 5:00 बजे से पहले मछली पार करने वाले टैंक स्थापित करें।
- अगली सुबह सभी क्रॉसिंग टैंकों से 11:00 बजे से पहले डिवाइडर हटा दें। चुप रहें और संभोग करते समय मछलियों को परेशान न करें। स्पॉनिंग आमतौर पर डिवाइडर को हटाने के बाद 30 मिनट के भीतर होता है। निषेचित अंडे टैंक के तल पर रहते हैं।
- जाल फिल्टर के साथ टैंक से निषेचित अंडे एकत्र करें। अंडे को अंडे के पानी से भरे पेट्री डिश में धोकर स्थानांतरित करें और 10x से 20x आवर्धन पर विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण की जांच करें।
- निषेचित भ्रूण को एक साफ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें लगभग 20 मिलीलीटर भ्रूण माध्यम (1,000x स्टॉक समाधान के 100 मिलीलीटर में 29.4 ग्राम NaCl, 1.27 ग्राम KCl, 4.85 g CaCl 2.2H2O, और 8.13 g MgSO 4.7H2 O) बड़े बोर ग्लास पाश्चर पिपेट होते हैं। भ्रूण को 28 डिग्री सेल्सियस पर रखें। 28.5 डिग्री सेल्सियस पर 30 एमएल भ्रूण माध्यम के साथ प्रति पेट्री डिश 50 निषेचित भ्रूण रखें।
नोट: मछली की एक जोड़ी आम तौर पर 100-300 भ्रूण का उत्पादन करती है, और स्वस्थ भ्रूण की निषेचन और जीवित रहने की दर प्रत्येक संभोग के लिए 95% से अधिक है। - अगली सुबह, भ्रूण को 8:00 बजे इनक्यूबेटर से बाहर निकालें, जब भ्रूण ~ 18-20 घंटे के बाद निषेचन (एचपीएफ) के विकास चरण में पहुंच गया हो। पहली बार सफेद प्रकाश का उपयोग करके, 20x आवर्धन पर एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत उनका निरीक्षण करें। उस समय, ज़ेबराफ़िश भ्रूण 20 सोमाइट चरण में होते हैं।
- कांच के पिपेट का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के नीचे बादल या टूटे हुए मृत भ्रूण को फेंक दें।
- फ्लोरोसेंट लैंप चालू करें और माइक्रोस्कोप की आरएफपी फ़िल्टर सेटिंग चुनें। फिर, मजबूत लाल प्रतिदीप्ति वाले भ्रूण का चयन करें और उन्हें अंडे के पानी के साथ एक नए पकवान में स्थानांतरित करें।
- सफेद प्रकाश (सामग्री की तालिका) के तहत भ्रूण को दो महीन बल (बल की युक्तियां तेज और क्षतिग्रस्त होनी चाहिए) के साथ मैन्युअल रूप से डिकोरियोनेट करें।
- कोरियन को एक जोड़ी बल के साथ पकड़ें और अन्य बल के साथ कोरियन में एक आंसू बनाएं। बल का उपयोग करके आंसू को सावधानी से खोलें, और भ्रूण को अन्य बलों की युक्तियों के साथ धीरे से धक्का देकर गुजरने के लिए पर्याप्त बड़ा बनाएं।
- माइक्रोइंजेक्शन से पहले त्वरित कुल्ला करने के लिए ताजा भ्रूण माध्यम के साथ एक नए पेट्री डिश में डिकोरियोनेटेड भ्रूण को स्थानांतरित करें।
2. माइक्रोइंजेक्शन की तैयारी
- एक पुलर पर ठीक इंजेक्शन सुइयों को खींचने के लिए केशिकाओं (1.2 मिमी ओडी, 0.9 मिमी आईडी, फिलामेंट के साथ) का उपयोग करें। हैंडबुक के अनुसार पुलिंग प्रोग्राम को डिजाइन और अनुकूलित करें।
- एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत बल के साथ सुई की नोक खोलें। टिप का व्यास लगभग 10 μm करें, और टेपर कोण 30 ° के आसपास बनाएं।
- इंजेक्शन से पहले माउस मोनोक्लोनल एंटी-डीएलडी एंटीबॉडी को एंटी-माउस-आईजीजी-एटो 647 एन के साथ संयुग्मित करें।
- प्रत्येक इंजेक्शन प्रयोग के लिए, एंटी-डीएलडी एंटीबॉडी (0.5 मिलीग्राम / एमएल) के 0.5 μL को एंटी-माउस-आईजीजी-एटो 647 एन एंटीबॉडी (1 मिलीग्राम / एमएल) के 2 μL के साथ 5-10 बार पाइप करके मिलाएं। फिर, कम से कम 30 मिनट (या 2-3 घंटे के लिए बर्फ पर) के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन के बाद, एंटीबॉडी मिश्रण में 2.5 μL ब्लॉकिंग बफर (10 मिलीग्राम / एमएल माउस आईजीजी) और 0.5% फिनोल लाल का 0.5 μL जोड़ें, और मिश्रण में शेष किसी भी असंगत एंटीबॉडी को अवरुद्ध करने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए पिपेट 10x जोड़ें।
नोट: प्रत्येक परीक्षण के लिए, एंटी-डीएलडी एंटीबॉडी के बिना एक अतिरिक्त मिश्रण तैयार करें और इसे नियंत्रण के रूप में उपयोग करें।
- भ्रूण माध्यम में 1% कम गलनांक एगारोस तैयार करें। अगारोस युक्त मिश्रण को 70 डिग्री सेल्सियस पर तब तक गर्म करें जब तक कि मिश्रण पारदर्शी न हो जाए।
- 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में अगारोस समाधान का उपयोग करें। एलिकोट को ~ 40 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ब्लॉक में रखें।
- भ्रूण को ट्यूब में 1% कम गलनांक वाली ट्यूब में 3 सेकंड के लिए रगड़ें।
- भ्रूण को एक उल्टे प्लास्टिक पेट्री डिश ढक्कन पर एक साथ अगारोस (~ 30-40 μL) की अलग-अलग बूंदों के साथ रखें ताकि प्रत्येक भ्रूण को ढक्कन पर अलग से माउंट किया जा सके जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। भ्रूण को अगारोस में पार्श्व रूप से सपाट रखें और इस स्थिति को तब तक रखें जब तक कि अगारोस कमरे के तापमान पर जम न जाए।
- ऊपर के रूप में एक-एक करके तीन पंक्तियों में 12 भ्रूण माउंट करें। अंडे के माध्यम के साथ अगारोस में सभी घुड़सवार भ्रूण को कवर करें।
3. माइक्रोइंजेक्शन
- एम्बेडेड भ्रूण को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें और अंडे के पानी के साथ अगारोस को कवर करें।
- एयर प्रेशर इंजेक्टर को माइक्रोमैनिपुलेटर्स के साथ सेट करें, उन्हें माइक्रोस्कोप के करीब रखें जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है। वायु संसाधन के रूप में उच्च दबाव में गैसीय नाइट्रोजन (एन2) युक्त स्टील गैस सिलेंडर का उपयोग करें।
- अगारोस में भ्रूण लगाए जाने के बाद ही गैस वाल्व खोलें। फिर, माइक्रोइंजेक्टर के फ्रंट फिल मॉड्यूल का उपयोग करते समय, माइक्रोमैनिपुलेटर पर 2 μL एंटीबॉडी मिश्रण के साथ तैयार ग्लास सुई को फ्रंट लोड करें, जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है।
- इनपुट दबाव को ~ 80-90 पीएसआई तक ट्यून करें, और इंजेक्शन दबाव ~ 20 पीएसआई तक।
- माइक्रोस्कोप के नीचे एक माइक्रोमीटर का उपयोग करके इंजेक्शन की मात्रा को कैलिब्रेट करें, जैसा कि पहले15 में वर्णित है। सुई खोलने के आकार के अनुसार, ट्यून समय अवधि 10 एमएस से 120 एमएस तक सेट करें। पैडल टैप करके इंजेक्शन की प्रत्येक पल्स को वितरित करें। प्रत्येक डिलीवरी की इंजेक्शन मात्रा को ~ 4-5 एनएल तक ट्यून करें।
- माइक्रोइंजेक्शन सुई की नोक को हिंडब्रेन की पृष्ठीय छत प्लेट के माध्यम से आर0/आर 1 हिंज बिंदु तक घुमाएं, और मस्तिष्क के ऊतकों से टकराए बिना एंटीबॉडी मिश्रण के लगभग 10 एनएल (दो या तीन दालें) इंजेक्ट करें। मस्तिष्क वेंट्रिकल में लाल तरल पदार्थ के प्रवाह का निरीक्षण करें।
नोट: हिंडब्रेन वेंट्रिकल मिडब्रेन हिंडब्रेन सीमा के पीछे है। इंजेक्शन फिनोल लाल युक्त एंटीबॉडी मिश्रण मस्तिष्कमेरु द्रव के साथ अलग करके मस्तिष्क के वेंट्रिकल को हिंदब्रेन से फोरब्रेन तक भर देता है। - इंजेक्शन के बाद, माइक्रोमैनिपुलेटर के नॉब को घुमाकर भ्रूण से सुई की नोक को तेजी से हटा दें। एक सफल इंजेक्शन के लिए, इंजेक्शन वाले मिश्रण की लाल डाई मस्तिष्क वेंट्रिकल में चारों ओर से घिरे अगारोस में लीक हुए बिना स्थिर रहती है।
- दोहराव के लिए उपयुक्त स्थिति में एक और माउंटेड भ्रूण का पता लगाने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे माउंटिंग प्लेट को स्थानांतरित करें।
- छह से आठ भ्रूण ों को इंजेक्ट करने के बाद, एम्बेडेड अगारोस से भ्रूण को छोड़ने के लिए एक माइक्रोसर्जिकल चाकू के साथ अगारोस को छील लें। माइक्रोइंजेक्टेड भ्रूण को 30 एमएल भ्रूण माध्यम के साथ एक ताजा डिश में स्थानांतरित करें, और उन्हें अगले चरणों के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
4. माउंटिंग और टाइम-लैप्स लाइव इमेजिंग
- 30 मिनट के बाद, चयनित भ्रूण को भ्रूण माध्यम के 10 एमएल में स्थानांतरित करें। भ्रूण को एनेस्थेटाइज करने के लिए भ्रूण माध्यम के 10 एमएल में 420 μL ट्राइकेन स्टॉक (4 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें।
- भ्रूण को माउंट करने के लिए, ट्यूब में ट्राइकेन की समान सांद्रता वाले 0.8% कम पिघलने बिंदु एगरोज तैयार करें। एलिकोट को ~ 40 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ब्लॉक में रखें।
- इंजेक्शन भ्रूण को 3 सेकंड के लिए गर्म अगारोस में डुबोने के लिए एक ग्लास पिपेट का उपयोग करें। फिर, तुरंत उसी ग्लास पिपेट के साथ अगारोस से भ्रूण को हटा दें और ट्यूब से अगारोस की एक बूंद के साथ भ्रूण को 35 मिमी ग्लास बॉटम कल्चर व्यंजनों के केंद्र पर रखें। ग्लास पर प्रति बूंद केवल एक भ्रूण रखें।
- भ्रूण के मस्तिष्क के पृष्ठीय पक्ष को यथासंभव कांच के तल के करीब रखने के लिए फाइबर जांच या लोडिंग टिप के साथ भ्रूण को धीरे से उन्मुख करें। कर्लिंग के बिना भ्रूण का विस्तार करने के लिए भ्रूण की स्थिति को धीरे से ट्यून करें क्योंकि अगारोस धीरे-धीरे जम जाता है।
- बाद में, ग्लास बॉटम डिश को पलटकर भ्रूण की स्थिति की जांच करें। सुनिश्चित करें कि सही ढंग से लगाए गए भ्रूण के साथ पूरे पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क को माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है।
- भ्रूण को कवर करने के लिए ट्राइकेन युक्त 28.5 डिग्री सेल्सियस प्रीहीट भ्रूण माध्यम के 2-3 एमएल जोड़ें। डिश को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तापमान-नियंत्रित चरण पर ठीक से रखें, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। इमेजिंग कक्ष के तापमान को 28.5 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें। भ्रूण अब इमेजिंग के लिए तैयार है।
- 40x जल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके एक निश्चित समय अंतराल के साथ टाइम-लैप्स लाइव इमेजिंग करें।
- इमेजिंग और माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16 का उपयोग करें।
- सेल में MyR-Tdtomto ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफिश और एंडोसोमल एंटी-DLD-Atto647N की झिल्ली प्रतिदीप्ति की इमेजिंग के लिए 564 nm और 647 nm के इमेजिंग चैनलों का चयन करें (चित्रा 1)।
- दोनों चैनलों के लिए 30% पर लेजर पावर सेट करें। प्रत्येक चैनल के लिए 200 एमएस के प्रति जेड-प्लेन एक्सपोज़र समय का उपयोग करें।
- प्रत्येक माउंटेड ज़ेब्राफ़िश भ्रूण के लिए, कुल मिलाकर 20 जेड-प्लेन के लिए 1 μm के स्कैनिंग z-step का उपयोग करें, और 100 टाइमफ्रेम का स्कैनिंग चक्र।
- प्रत्येक स्कैनिंग चक्र के बीच समय अंतराल 20 सेकंड और स्कैनिंग मोड को चैनल, स्लाइस के रूप में सेट करें।
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Representative Results
चित्रा 2 ए में, प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ बंधे बिना, एटो 647 एन के साथ इंजेक्ट किए गए भ्रूण ने मस्तिष्क वेंट्रिकल में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति दिखाई। कोशिकाओं में बहुत कम फ्लोरोसेंट कण देखे जा सकते हैं। एंटी-डीएलडी-एटो 647 एन इंजेक्शन जेब्राफिश भ्रूण ने विकासशील फोरब्रेन (चित्रा 2 ए, दाएं पैनल) की अधिकांश कोशिकाओं में बड़ी मात्रा में आंतरिक फ्लोरोसेंट कणों को दिखाया। माइटोटिक आरजीपी पर ध्यान केंद्रित करने के लिए ज़ूम इन करने के बाद, जैसा कि चित्रा 2 बी में दिखाया गया है, हम कोशिका विभाजन के दौरान इंट्रासेल्युलर एंटी-डीएलडी-एटो 647 एन एंडोसोम के गतिशील आंदोलन को रिकॉर्ड करने में सक्षम थे (वीडियो 1)। अधिकांश माइटोटिक आरजीपी ने एंटी-डीएलडी-एटो 647 एन एंडोसोम के पूर्वकाल या पीछे के असममित अलगाव को दो बेटी कोशिकाओं12 में दिखाया। हमने यह भी देखा कि विषमता एनाफ़ेज़ के अंत में स्थिर हो गई, जिसके परिणामस्वरूप12 के बाद बेटी कोशिकाओं द्वारा नॉच सिग्नलिंग एंडोसोम की असममित विरासत हुई।
चित्रा 1: प्रयोगात्मक चरणों का फ़्लोचार्ट। मायआर-टीडीटोमेटो रिपोर्टर को व्यक्त करने वाली ट्रांसजेनिक जेब्राफिश को पहले दिन एबी वाइल्ड-टाइप के साथ पार किया जाता है। दिन 2 पर, लाल फ्लोरोसेंट भ्रूण को माइक्रोइंजेक्शन के लिए चुना जाता है, इसके बाद टाइम-लैपिंग इमेजिंग होती है। दूसरेदिन पूरे प्रयोग में लगभग 8 घंटे लगते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: विकासशील ज़ेब्राफिश मस्तिष्क में एंटी-डीएलडी-एटो -647 एन एंटीबॉडी अपटेक की टाइम-लैप्स इमेजिंग। (ए) 1 दिन के पोस्ट-फर्टिलाइजेशन (डीपीएफ) भ्रूण के अग्रमस्तिष्क में 30 मिनट के माइक्रोइंजेक्शन के बाद एंटी-डीएलडी-एटो-647 एन अपटेक। बाएं पैनल पर भ्रूण को केवल एटो -647 एन के साथ इंजेक्ट किया जाता है। दाहिने पैनल पर भ्रूण को एंटी-डीएलडी-एटो -647 एन के साथ इंजेक्ट किया जाता है। डैश लाइनें वेंट्रिकल के साथ एपिकल परत को इंगित करती हैं। आयत क्षेत्र को B में उच्च आवर्धन में दिखाया गया है। स्केल बार = 40 μm. संक्षेप: Di = Diencephalon; टेल = टेलेसेफ्लोन; वे = वेंट्रिकल। (बी) माइटोसिस के दौरान एंटी-डीएलडी-एटो-647 एन गतिशीलता के टाइम-लैप्स इमेजिंग पैनल। मोंटेज में आठ टाइमफ्रेम ने पूरे माइटोटिक चक्र को कवर किया, जिसमें एक विभाजित आरजीपी की दो बेटी कोशिकाओं में एंटी-डीएलडी-एटो -647 एन के उत्थान और पृथक्करण को दर्शाया गया है। स्केल बार = 5 μm कोशिका झिल्ली को रेखांकित किया गया है। ए और बी दोनों में, झिल्ली पर मायआर-टीडीटोमैटो लेबलिंग नीला है, और एंटी-डीएलडी-एटो -647 एन मैजेंटा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
वीडियो 1: माइटोसिस के दौरान रेडियल ग्लिया कोशिकाओं को विभाजित करने में आंतरिक एंटी-डीएलडी-एटो -647 एन की गतिशीलता (प्रत्येक फ्रेम के बीच 40 टाइमफ्रेम और 30 सेकंड का अंतराल समय; कुल मिलाकर 20 मिनट)। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
हमने उच्च दक्षता के साथ जेब्राफिश रेडियल ग्लिया पूर्वजों में एंडोसोमल नॉच / डेल्टा तस्करी को लेबल करने और इमेजिंग करने के लिए एक एंटीबॉडी अपटेक परख विकसित की है। ड्रोसोफिला एसओपी कोशिकाओं7,8 में लेबल एंटी-डेल्टाडी एंटीबॉडी को ट्रैक करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पिछले तरीकों की तुलना में, हमारी विधि ने संयुग्मित एंटीबॉडी में नमूनों के इनक्यूबेशन के बजाय माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग किया। फ्लोरोसेंटली संयुग्मित एंटी-डीएलडी एंटीबॉडी को हिंडब्रेन वेंट्रिकल में माइक्रोइंजेक्ट किया गया था; यह तकनीक चोट का कारण नहीं बनती है, जैसा कि इंजेक्शन के बाद भ्रूण के सामान्य विकास और पूर्ण वसूली से स्पष्ट है। भ्रूण वेंट्रिकल्स निरंतर होते हैं, जिससे इंजेक्शन एंटीबॉडी माइक्रोइंजेक्शन के बाद अग्रमस्तिष्क की ओर स्वतंत्र रूप से फैल सकता है। इंजेक्शन एंटी-डीएलडी-एट्टो 647 एन मस्तिष्क में निरंतर एंटीबॉडी अपटेक के एक स्थिर संसाधन के रूप में 24 घंटे से अधिक समय तक रहता है। न्यूरल ट्यूब इंजेक्शन की तुलना में, पिछली रिपोर्ट10 में पेश किया गया, ज़ेबराफिश हिंडब्रेन वेंट्रिकल इंजेक्शन ऊतक की चोट का कारण नहीं बनता है और विवो में मस्तिष्क वेंट्रिकल्स को अस्तर करने वाले माइटोटिक आरजीपी द्वारा चयनात्मक एंटी-डीएलडी-एटो 647 एन अपटेक को सक्षम बनाता है। यद्यपि हमने रीढ़ की हड्डी में न्यूरोएपिथेलियल कोशिकाओं में एंटीबॉडी अपटेक की जांच नहीं की है, लेकिन एंटी-डीएलडी-एटो 647 एन एंटीबॉडी अपटेक मस्तिष्क की तरह वहां लागू होना चाहिए। हिंडब्रेन वेंट्रिकल में इंजेक्ट किए गए संयुग्मित एंटीबॉडी को रीढ़ की हड्डी के साथ-साथ फैलने की उम्मीद है।
एंटीबॉडी अपटेक परख के सफल अनुप्रयोग के लिए, सबसे महत्वपूर्ण मुद्दा एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करना है जिसमें झिल्ली प्रोटीन लक्ष्य के बाह्य डोमेन के लिए उच्च बाध्यकारी संबंध और विशिष्टता है। डेल्टा सिग्नलिंग को लेबल करने के अलावा, प्रोटोकॉल समान रणनीतियों का उपयोग करके अन्य झिल्ली प्रोटीन या बाह्य प्रोटीन को लेबल करने के लिए लागू होता है। हमारे प्रोटोकॉल ने एंटी-डीएलडी प्राथमिक एंटीबॉडी की उच्च गुणवत्ता और उच्च विशिष्टता के कारण जेब्राफिश भ्रूण विकसित करने में अत्यधिक कुशल एंटी-डीएलडी एंटीबॉडी अपटेक का प्रदर्शन किया है। दूसरे, फ्लोरोसेंट सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ एंटी-डीएलडी प्राथमिक एंटीबॉडी का संयुग्मन विवो में एंटीबॉडी अपटेक दक्षता के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। हमने पाया है कि एटो गैर-विरंजन द्वितीयक एंटीबॉडी अन्य फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी की तुलना में अधिक स्थिर और बहुत उज्जवल हैं, जैसे कि ड्रोसोफिला नोटमसंस्कृतियों 7,10 में उपयोग किए जाने वाले ज़ेनॉन और एलेक्सा सेकेंडरी एंटीबॉडी। हमने फ्लोरोसेंट लेबल के रूप में एटो 647 एन को चुना, क्योंकि हम आम तौर पर इसे जीएफपी या आरएफपी ट्रांसजेनिक जेब्राफिश या कुछ अन्य फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ उपयोग करेंगे जो जीएफपी या आरएफपी के समान उत्तेजना तरंग दैर्ध्य साझा करते हैं। विभिन्न उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ अन्य गैर-विरंजन द्वितीयक एंटीबॉडी को भी प्रोटोकॉल के साथ काम करना चाहिए। हमारे प्रोटोकॉल में, हमने एटो सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ मिश्रित प्राथमिक एंटीबॉडी के इनक्यूबेशन समय को 12 घंटे से 30 मिनट तक कम कर दिया, और अंतिम माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण में एंटी-डीएलडी एंटीबॉडी की एकाग्रता को 0.05 मिलीग्राम / एमएल तक कम कर दिया। एंटी-डीएलडी एंटीबॉडी (0.25 मिलीग्राम / एमएल) की उच्च सांद्रता ने जेब्राफिश भ्रूण में एंटीबॉडी अपटेक दक्षता में वृद्धि नहीं की; फ्लोरोसेंट सेकेंडरी एंटीबॉडी10 के साथ पर्याप्त लेबलिंग प्राप्त करने के लिए, लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता का कारण हो सकता है। हमनेपिछले अध्ययनों की तरह उच्च सांद्रता पर एंटी-डीएलडी एंटीबॉडी का उपयोग नहीं किया, क्योंकि एक संभावना है कि इंजेक्शन एंटी-डीएलडी-एटो 647 एन एंटीबॉडी आरजीपी की झिल्ली पर डेल्टाडी लिगैंड को बांधते समय अंतर्जात रूप से व्यक्त नॉच / डेल्टा के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं, जिससे विवो में सीआईएस या ट्रांस नॉच / डेल्टा सिग्नलिंग में हस्तक्षेप होता है। हमने यह भी पाया कि प्राथमिक एंटीबॉडी संयुग्मन के बाद जोड़ा गया ब्लॉकिंग बफर विवो में एंटीबॉडी अपटेक परख की विशिष्टता बढ़ाने के लिए सहायक था। जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, फोरब्रेन में अधिकांश आरजीपी सक्रिय रूप से एंटी-डीएलडी-एटो 647 एन को आंतरिक करते हैं। ब्लॉकिंग बफर को जोड़ने के बिना, अधिकांश कोशिकाएं बहुत कम आंतरिक एंटी-डीएलडी-एटो 647 एन एंडोसोम दिखाती हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है)।
प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा एंटीबॉडी की उपलब्धता है जिसका उपयोग अपटेक परख के लिए किया जा सकता है। हमारा प्रोटोकॉल झिल्ली व्यक्त प्रोटीन को लेबल करने के लिए लागू होता है, अगर बाह्य डोमेन के लिए एक अच्छा एंटीबॉडी उपलब्ध है। साइटोसोलिक और परमाणु प्रोटीन के लिए, एंटीबॉडी अपटेक परख लागू नहीं होती है, क्योंकि संयुग्मित एंटीबॉडी अपने इंट्रासेल्युलर बाइंडिंग लक्ष्यों को बांधने के लिए कोशिका झिल्ली से नहीं गुजर सकते हैं। इंट्रासेल्युलर प्रोटीन की लाइव इमेजिंग मुख्य रूप से विभिन्न प्रकार के फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक मॉडल पर निर्भर करती है। हाल के दशकों में, लाइव-सेल इमेजिंग के लिए अधिक फ्लोरोसेंट रंजक विकसित किए गए हैं, जैसे कि सिलिकॉन रोडामाइन जैसी (एसआईआर) तकनीक, जिसने डीएनए, आरएनए, एक्टिन और ट्यूबुलिन17 के लाइव सेल इमेजिंग में महत्वपूर्ण योगदान दिया है। विभिन्न लाइव लेबलिंग रणनीतियों का एक संयोजन जीवित कोशिकाओं में जटिल सिग्नलिंग मार्गों का अध्ययन करने का सबसे अच्छा तरीका होगा।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस परियोजना को एनआईएच आर 01एनएस 120218, यूसीएसएफ मैरी ऐनी कोडा-किम्बल सीड अवार्ड फॉर इनोवेशन और चान जुकरबर्ग बायोहब द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
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