Summary
In dieser Arbeit wird ein Antikörper-Aufnahme-Assay für die Bildgebung des Intra-Lineage-Notch/DeltaD-Signalwegs in sich teilenden radialen Gliavorläuferzellen des embryonalen Zebrafischgehirns entwickelt.
Abstract
Die asymmetrische Zellteilung (ACD), bei der zwei Tochterzellen mit unterschiedlichem Schicksal entstehen, ist grundlegend für die Erzeugung zellulärer Vielfalt. In den sich entwickelnden Organen sowohl von Wirbellosen als auch von Wirbeltieren erzeugen asymmetrisch sich teilende Vorläuferzellen einesich selbst erneuernde und einesich differenzierende Tochter. Im embryonalen Zebrafischgehirn durchlaufen radiale Gliavorläuferzellen (RGPs) - die wichtigsten neuralen Stammzellen von Wirbeltieren - meist eine ACD, um ein RGP und ein differenzierendes Neuron zu gebären. Die optische Klarheit und die leichte Zugänglichkeit von Zebrafischembryonen machen sie ideal für In-vivo-Zeitrafferaufnahmen, um direkt zu visualisieren, wie und wann die Asymmetrie des Notch-Signalwegs während der ACD hergestellt wird. Neuere Studien haben gezeigt, dass die dynamische Endozytose des Notch-Liganden DeltaD eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des Zellschicksals während der ACD spielt und durch den evolutionär konservierten Polaritätsregulator Par-3 (auch bekannt als Pard3) und den Dynein-Motorkomplex reguliert wird. Um die in vivo Transportmuster von Notch-Signal-Endosomen in mitotischen RGPs sichtbar zu machen, haben wir diesen Antikörper-Aufnahme-Assay entwickelt. Mit Hilfe des Assays haben wir die Dynamik von DeltaD-haltigen Endosomen während der RGP-Teilung aufgedeckt.
Introduction
Der Notch-Signalweg steuert die Entscheidung über das Zellschicksal und die Musterbildung während der Entwicklung in Metazoen1, und neuere Studien haben gezeigt, dass der Notch-Signalweg bei der Stammzellteilung hauptsächlich vom endozytären Transport abhängt 2,3. Endozytosiertes Notch/Delta kann den Notch-Signalweg im Zellkern aktivieren und die Transkription der Notch-Zielgene 4,5,6 verbessern. Directional Notch/Delta endosomaler Transport wurde erstmals in Drosophila-Sinnesorgan-Vorläuferzellen (SOP) während der asymmetrischen Zellteilung (ACD) beobachtet, was zu einer höheren Notch-Signalaktivität in pIIa als in pIIbführte 7,8. Antikörperaufnahme-Assays mit Anti-Delta- und Anti-Notch-Antikörpern wurden eingesetzt, um den endozytären Prozess in mitotischen SOP-Zellen zu überwachen. Notch/DeltaD-Endosomen bewegen sich während der Zytokinese zusammen mit einem Kinesin-Motorprotein zur zentralen Spindel und werden aufgrund der antiparallelen Anordnung der asymmetrischen Zentralspindel im letzten Moment der Zellteilung asymmetrisch in die pIIa-Zelle transloziert 3,8. Diese Studien haben Aufschluss über die molekularen Mechanismen gegeben, die die asymmetrische Teilung in Drosophila-SOP-Zellen regulieren, aber es ist unklar, ob ähnliche endozytäre Prozesse in radialen Gliavorläuferzellen (RGPs) von Wirbeltieren ablaufen.
Darüber hinaus sind die molekularen Mechanismen, die den asymmetrischen Notch/DeltaD-Signalweg während der RGP-Teilung von Wirbeltieren regulieren, nicht gut verstanden. Im Zebrafisch wurde berichtet, dass die Interaktion von Notch und Delta die Endozytose des DeltaD-Liganden9 erleichtert. Es ist nicht bekannt, ob die DeltaD-Endozytose die Wahl des Zellschicksals von Tochterzellen im sich entwickelnden Wirbeltiergehirn beeinflussen kann. Neuere Studien zeigen, dass die Injektion fluoreszenzkonjugierter Anti-DeltaD-Antikörper in das Neuralrohr Sara-Endosomen spezifisch in Neuroepithelzellen markieren könnte, und Anti-DeltaD-haltige Sara-Endosomen segregieren bevorzugt in proliferierende Tochterzellen10. Es wurde vermutet, dass der Notch-Signalweg von den Endosomen das Schicksal der Tochterzellen regulieren könnte. Frühere Ergebnisse haben gezeigt, dass die meisten RGP-Zellen des Zebrafisches im sich entwickelnden Vorderhirn einer ACD unterziehen, und die Bestimmung des Schicksals der Tochterzellen hängt von der intralinearen Notch/DeltaD-Signaltransduktionab 11. Um die Natur des Intralineage-Notch/DeltaD-Signalwegs in Zebrafisch-RGPs aufzuklären, haben wir den Anti-DeltaD-Antikörper-Aufnahme-Assay im sich entwickelnden Gehirn von Zebrafischen entwickelt. Mit diesem Protokoll haben wir erfolgreich Live-Markierungen und Bildgebungen des endozytären DeltaD-Transports in mitotischen RGPs durchgeführt.
Der fluoreszenzmarkierte Anti-DeltaD-Antikörper wird entlang des Vorderhirnventrikels effizient in die RGPs internalisiert. Es hat die Entdeckung des gerichteten Transports von DeltaD-Endosomen in den asymmetrisch teilenden RGPs erheblich erleichtert12,13. Im Vergleich zu früheren Antikörperaufnahmeprotokollen, die für Drosophila notum-Kulturen und das Rückenmark des Zebrafisches entwickelt wurden 10, hat dieses Protokoll eine lang anhaltende und hocheffiziente Anti-DeltaD-Markierung in der Zellschicht des Hirnventrikels erreicht, insbesondere mit weniger als10 nL mikroinjizierter Antikörpermischung. Die Injektion des Hinterhirnventrikels ist sehr praktisch für die Anwendung des Antikörperaufnahmetests im sich entwickelnden Gehirn, da der Hinterhirnventrikel in Zebrafischembryonen gut erweitert und im frühen Entwicklungsstadium mit Liquor cerebrospinalis gefüllt ist14. Durch die Injektion des Antikörpergemisches in die Hinterhirnkammer, ohne wichtige sich entwickelnde Gewebe zu verletzen, hat das Protokoll eine mögliche Schädigung der Bildgebungszone im Vorderhirn so weit wie möglich minimiert. Die reduzierte Dosis des injizierten Primärantikörpers hat auch mögliche Nebenwirkungen einer Störung des endogenen Delta-Notch-Signalwegs in vivo vermieden. Dieses Protokoll kann leicht mit anderen pharmakologischen oder genetischen Störungen kombiniert, in verschiedenen Entwicklungsstadien eingesetzt und möglicherweise an das erwachsene Gehirn sowie an aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gewonnene 2D/3D-Gehirnorganoide angepasst werden. Zusammenfassend hat das Protokoll es möglich gemacht zu verstehen, wie und wann eine Notch-Signalasymmetrie während der ACD entsteht. Die größte Herausforderung für die erfolgreiche Implementierung dieses Protokolls besteht darin, eine präzise Abgabe geeigneter Konzentrationen des Antikörpers auf der Grundlage spezifischer experimenteller Bedingungen zu erreichen.
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Protocol
Für die Studie haben wir die AB-Wildtyp-Linie und die transgene Linie Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] verwendet. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of California, San Francisco, USA genehmigt (Zulassungsnummer: AN179000).
1. Präparation von Zebrafischembryonen
- Stellen Sie am Nachmittag vor 17:00 Uhr Fischkreuzungsbecken mit einem weiblichen Wildtyp-Fisch und einem männlichen Tg [ef1a:Myr-Tdtomato]- Fisch auf, indem Sie sie in jedem Becken mit Trennwänden trennen.
- Entfernen Sie die Trennwände am nächsten Morgen vor 11:00 Uhr von allen Kreuzungstanks. Seien Sie ruhig und stören Sie die Fische nicht bei der Paarung. Das Laichen erfolgt in der Regel innerhalb von 30 Minuten nach dem Entfernen der Trennwände. Die befruchteten Eier verbleiben auf dem Boden des Aquariums.
- Sammeln Sie befruchtete Eier aus den Tanks mit einem Netzfilter. Übertragen Sie die Eizellen, indem Sie sie in eine mit Eiwasser gefüllte Petrischale abwaschen, und untersuchen Sie die Embryonen unter einem Seziermikroskop mit 10- bis 20-facher Vergrößerung.
- Die befruchteten Embryonen werden mit Pasteurpipetten aus Glas mit großem Durchmesser in eine saubere Petrischale mit ca. 20 ml Embryonenmedium (100 ml 1.000-fache Stammlösung enthält 29,4 g NaCl, 1,27 g KCl, 4,85 g CaCl 2,2H2O und 8,13 g MgSO 4,7H2O) übertragen. Bewahren Sie die Embryonen bei 28 °C auf. Bewahren Sie 50 befruchtete Embryonen pro Petrischale mit 30 ml Embryonenmedium bei 28,5 °C auf.
HINWEIS: Ein Fischpaar produziert normalerweise 100-300 Embryonen, und die Befruchtungs- und Überlebensrate gesunder Embryonen liegt bei jeder Paarung bei über 95%. - Am nächsten Morgen nehmen Sie die Embryonen um 8:00 Uhr aus dem Inkubator, wenn die Embryonen das Entwicklungsstadium von ~18-20 h nach der Befruchtung (hpf) erreicht haben. Beobachten Sie sie unter einem Epifluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung, zunächst mit weißem Licht. Zu diesem Zeitpunkt befinden sich die Zebrafischembryonen im Stadium von 20 Somiten.
- Entsorgen Sie tote Embryonen, die trüb oder geplatzt sind, unter dem Mikroskop mit einer Glaspipette.
- Schalten Sie die Leuchtstofflampe ein und wählen Sie die RFP-Filtereinstellung des Mikroskops. Wählen Sie dann die Embryonen mit starker roter Fluoreszenz aus und geben Sie sie in eine neue Schale mit Eiwasser.
- Dechorionisieren Sie die Embryonen manuell mit zwei feinen Pinzetten (die Pinzettenspitzen sollten scharf und unbeschädigt sein) unter weißem Licht (Materialtabelle).
- Halten Sie das Chorion mit einer Pinzette fest und machen Sie mit der anderen Pinzette einen Riss in das Chorion. Öffnen Sie den Riss vorsichtig mit der Pinzette und machen Sie ihn groß genug, damit der Embryo hindurchgehen kann, indem Sie den Embryo vorsichtig mit den Spitzen der anderen Pinzetten drücken.
- Übertragen Sie die dechorionierten Embryonen in eine neue Petrischale mit frischem embryonalem Medium, um sie vor der Mikroinjektion schnell zu spülen.
2. Vorbereitung der Mikroinjektion
- Verwenden Sie die Kapillaren (1,2 mm AD, 0,9 mm ID, mit Filament) zum Ziehen von feinen Injektionsnadeln auf einem Abzieher. Entwerfen und optimieren Sie das Zugprogramm gemäß dem Handbuch.
- Öffnen Sie die Nadelspitze mit einer Pinzette unter einem Stereo-Präpariermikroskop. Achten Sie darauf, dass der Durchmesser der Spitze etwa 10 μm und der Verjüngungswinkel etwa 30° beträgt.
- Vor der Injektion wird der monoklonale Anti-DLD-Antikörper der Maus mit dem Anti-Maus-IgG-Atto647N konjugiert.
- Mischen Sie für jedes Injektionsexperiment 0,5 μl des Anti-Dld-Antikörpers (0,5 mg/ml) mit 2 μl des Anti-Maus-IgG-Atto647N-Antikörpers (1 mg/ml) durch 5-10-maliges Pipettieren. Dann mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur (oder 2-3 Stunden auf Eis) inkubieren.
- Nach der Inkubation fügen Sie der Antikörpermischung 2,5 μl Blockierungspuffer (10 mg/ml Maus-IgG) und 0,5 μl 0,5 % Phenolrot hinzu und pipettieren Sie 10x, um gründlich zu mischen, um alle in der Mischung verbleibenden unkonjugierten Antikörper zu blockieren.
HINWEIS: Bereiten Sie für jede Studie eine zusätzliche Mischung ohne den Anti-Dld-Antikörper vor und verwenden Sie sie als Kontrolle.
- Bereiten Sie 1%ige Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt im Embryomedium vor. Die in Agarose enthaltene Mischung bei 70 °C erhitzen, bis die Masse durchsichtig wird.
- Aliquotieren Sie die Agaroselösung in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie die Aliquots in einem Heizblock bei ~40 °C auf.
- Spülen Sie den Embryo in dem Röhrchen mit 1% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt 3 s lang aus.
- Legen Sie den Embryo zusammen mit einzelnen Tropfen Agarose (~30-40 μL) auf einen umgedrehten Petrischaledeckel aus Kunststoff, um jeden Embryo separat auf dem Deckel zu befestigen, wie in Abbildung 1 gezeigt. Legen Sie die Embryonen flach seitlich in die Agarose und halten Sie diese Position, bis die Agarose bei Raumtemperatur erstarrt ist.
- Montieren Sie 12 Embryonen in drei Reihen, einen nach dem anderen, wie oben. Bedecken Sie alle montierten Embryonen in der Agarose mit Eimedium.
3. Mikroinjektion
- Legen Sie die eingebetteten Embryonen unter das Stereomikroskop und bedecken Sie die Agarose mit Eiwasser.
- Stellen Sie den Luftdruckinjektor zusammen mit Mikromanipulatoren ein und platzieren Sie sie in der Nähe der Mikroskope, wie in Abbildung 1 gezeigt. Verwenden Sie die Stahlgasflasche mit gasförmigem Stickstoff (N2) unter hohem Druck als Luftquelle.
- Öffnen Sie das Gasventil erst, nachdem die Embryonen in die Agarose eingesetzt wurden. Legen Sie dann die vorbereitete Glasnadel mit 2 μl Antikörpermischung auf den Mikromanipulator, wie in Abbildung 1 gezeigt, wenn Sie das Frontfill-Modul des Mikroinjektors verwenden.
- Stellen Sie den Eingangsdruck auf ~80-90 psi und den Einspritzdruck auf ~20 psi ein.
- Kalibrieren Sie das Injektionsvolumen mit einem Mikrometer unter dem Mikroskop, wie zuvor beschrieben15. Stellen Sie die Dauer der Abstimmungszeit auf 10 ms bis 120 ms ein, je nach Größe der Nadelöffnung. Geben Sie jeden Injektionsimpuls ab, indem Sie auf das Paddel tippen. Stellen Sie das Injektionsvolumen jeder Abgabe auf ~4-5 nL ein.
- Stechen Sie die Spitze der Mikroinjektionsnadel durch die dorsale Dachplatte des Hinterhirns hinter dem r0/r1-Scharnierpunkt und injizieren Sie etwa 10 nL (zwei oder drei Impulse) Antikörpermischung, ohne das Gehirngewebe zu treffen. Beobachte das Fließen roter Flüssigkeiten in der Hirnkammer.
Anmerkung: Der Hinterhirnventrikel befindet sich hinter der Hinterhirngrenze. Das injizierte phenolrothaltige Antikörpergemisch füllt die Hirnkammer vom Hinterhirn bis zum Vorderhirn sofort auf, indem es mit Liquor diffundiert. - Entfernen Sie nach der Injektion die Nadelspitze schnell vom Embryo, indem Sie den Knopf des Mikromanipulators drehen. Für eine erfolgreiche Injektion verbleibt der rote Farbstoff der injizierten Mischung stabil in der Hirnkammer, ohne in die umgebende Agarose auszutreten.
- Bewegen Sie die Montageplatte unter das Mikroskop, um einen anderen montierten Embryo an einer geeigneten Position für Wiederholungen zu lokalisieren.
- Nachdem Sie sechs bis acht Embryonen injiziert haben, schälen Sie die Agarose mit einem mikrochirurgischen Messer, um die Embryonen aus der eingebetteten Agarose zu lösen. Übertragen Sie die mikroinjizierten Embryonen in eine frische Schale mit 30 ml Embryomedium und legen Sie sie für die nächsten Schritte bei Raumtemperatur auf.
4. Montage und Zeitraffer-Live-Aufnahme
- Nach 30 Minuten werden die ausgewählten Embryonen in 10 ml Embryonenmedium übertragen. Fügen Sie 420 μl Tricain-Stamm (4 mg/ml) zu 10 ml Embryomedium hinzu, um die Embryonen zu betäuben.
- Um die Embryonen zu montieren, bereiten Sie eine 0,8%ige Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt vor, die die gleiche Konzentration an Tricain im Röhrchen enthält. Bewahren Sie die Aliquots in einem Heizblock bei ~40 °C auf.
- Tauchen Sie die injizierten Embryonen mit einer Glaspipette 3 s lang in die warme Agarose. Nehmen Sie dann sofort die Embryonen mit derselben Glaspipette aus der Agarose und legen Sie die Embryonen mit einem Tropfen Agarose aus dem Röhrchen in die Mitte von 35-mm-Glasbodenkulturschalen. Legen Sie nur einen Embryo pro Tropfen auf das Glas.
- Richten Sie die Embryonen vorsichtig mit einer Fasersonde oder einer Ladespitze aus, um die dorsale Seite des embryonalen Gehirns so nah wie möglich am Glasboden zu halten. Stellen Sie die Position des Embryos sanft ein, um den Embryo zu dehnen, ohne sich zu kräuseln, während sich die Agarose allmählich verfestigt.
- Überprüfen Sie anschließend die Position des Embryos, indem Sie die Glasbodenschale umdrehen. Stellen Sie sicher, dass das gesamte dorsale Vorderhirn mit den korrekt montierten Embryonen unter dem Mikroskop zu sehen ist.
- Fügen Sie 2-3 ml 28,5 °C vorgewärmtes embryonales Medium hinzu, das Tricain enthält, um den Embryo zu bedecken. Stellen Sie die Schüssel richtig auf den temperaturgesteuerten Tisch des konfokalen Mikroskops, wie in Abbildung 1 gezeigt. Stellen Sie die Temperatur der Bildkammer auf 28,5 °C ein. Der Embryo ist nun bereit für die Bildgebung.
- Führen Sie Zeitraffer-Live-Aufnahmen mit einem festen Zeitintervall mit einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv durch.
- Verwenden Sie die Bildgebungs- und Mikroskopsteuerungssoftware (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.
- Wählen Sie die Bildgebungskanäle von 564 nm und 647 nm für die Abbildung der Membranfluoreszenz von MyR-Tdtomato transgenen Zebrafischen und endosomalem anti-Dld-Atto647N in der Zelle (Abbildung 1).
- Stellen Sie die Laserleistung für beide Kanäle auf 30 % ein. Verwenden Sie für jeden Kanal eine Belichtungszeit pro z-Ebene von 200 ms.
- Verwenden Sie für jeden montierten Zebrafischembryo einen Scanning-Z-Schritt von 1 μm für insgesamt 20 z-Ebenen und einen Scanzyklus von 100 Zeitrahmen.
- Stellen Sie das Zeitintervall zwischen den einzelnen Scanzyklen auf 20 s und den Scanmodus als Kanal, Slice ein.
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Representative Results
In Abbildung 2A zeigten die Embryonen, denen Atto647N injiziert wurde, ohne an den primären Antikörper zu binden, eine Hintergrundfluoreszenz im Hirnventrikel. In den Zellen sind nur sehr wenige verschlungene fluoreszierende Partikel zu beobachten. Die anti-Dld-Atto647N injizierten Zebrafischembryonen zeigten große Mengen internalisierter fluoreszierender Partikel in den meisten Zellen des sich entwickelnden Vorderhirns (Abbildung 2A, rechtes Bild). Nach dem Zoomen auf mitotische RGPs, wie in Abbildung 2B gezeigt, konnten wir die dynamische Bewegung intrazellulärer anti-Dld-Atto647N-Endosomen während der Zellteilung aufzeichnen (Video 1). Die meisten mitotischen RGPs zeigten eine anteriore oder posteriore asymmetrische Segregation von anti-Dld-Atto647N-Endosomen in zwei Tochterzellen12. Wir stellten auch fest, dass sich die Asymmetrie gegen Ende der Anaphase stabilisierte, was zu einer asymmetrischen Vererbung von Notch-Signal-Endosomen durch die Tochterzellen danach führte12.
Abbildung 1: Flussdiagramm der Versuchsschritte. Transgene Zebrafische, die den MyR-Tdtomate-Reporter exprimieren, werden an Tag 1 mit dem AB-Wildtyp ausgekreuzt. An Tag 2 werden rot fluoreszierende Embryonen für die Mikroinjektion ausgewählt, gefolgt von einer Zeitraffer-Bildgebung. Das gesamte Experiment am 2. Tag dauert ca. 8 h. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Zeitrafferaufnahme der Aufnahme von Anti-Dld-Atto-647N-Antikörpern im sich entwickelnden Zebrafischgehirn. (A) Anti-Dld-Atto-647N-Aufnahme nach 30-minütiger Mikroinjektion in das Vorderhirn eines Embryos 1 Tag nach der Befruchtung (dpf). Auf der linken Seite ist nur der Embryo zu sehen, dem Atto-647N injiziert wurde. Auf der rechten Seite ist der Embryo zu sehen, dem Anti-Dld-Atto-647N injiziert wurde. Gestrichelte Linien zeigen die apikale Schicht entlang des Ventrikels an. Die Rechteckzone ist in starker Vergrößerung in B dargestellt. Maßstabsbalken = 40 μm. Abkürzungen: Di = Zwischenhirn; Tel = Telencephalon; ve = Ventrikel. (B) Zeitraffer-Bildgebungstafeln der Anti-Dld-Atto-647N-Dynamik während der Mitose. Die acht Zeitrahmen in der Montage deckten den gesamten mitotischen Zyklus ab und zeigten die Aufnahme und Segregation von anti-Dld-Atto-647N in zwei Tochterzellen eines sich teilenden RGP. Maßstabsbalken = 5 μm Die Zellmembran ist umrissen. Sowohl bei A als auch bei B ist die MyR-Tdtomate-Markierung auf der Membran blau und anti-Dld-Atto-647N magenta. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Video 1: Dynamik internalisierter Anti-Dld-Atto-647N in sich teilenden radialen Gliazellen während der Mitose (40 Zeitrahmen und eine Intervallzeit von 30 s zwischen jedem Bild; insgesamt 20 Minuten). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Wir haben einen Antikörper-Aufnahme-Assay entwickelt, mit dem der endosomale Notch/Delta-Transport in radialen Gliavorläuferzellen von Zebrafischen mit hoher Effizienz markiert und abgebildet werden kann. Im Vergleich zu früheren Methoden, die zur Verfolgung markierter Anti-DeltaD-Antikörper in Drosophila-SOP-Zellenverwendet wurden 7,8, verwendete unsere Methode die Mikroinjektion anstelle der Inkubation von Proben im konjugierten Antikörper. Fluoreszenzkonjugierte Anti-Dld-Antikörper wurden in den Hinterhirnventrikel mikroinjiziert; Diese Technik verursacht keine Verletzungen, was durch die normale Entwicklung und vollständige Erholung der Embryonen nach der Injektion belegt wird. Die embryonalen Ventrikel sind kontinuierlich, so dass sich der injizierte Antikörper nach der Mikroinjektion frei in Richtung Vorderhirn ausbreiten kann. Das injizierte Anti-Dld-Atto647N hält über 24 Stunden als stabile Ressource für die kontinuierliche Antikörperaufnahme im Gehirn. Im Vergleich zur Neuralrohrinjektion, die in einem früheren Bericht10 vorgestellt wurde, verursacht die Zebrafisch-Hinterhirnventrikelinjektion keine Gewebeverletzung und ermöglicht eine selektive Aufnahme von Anti-Dld-Atto647N durch mitotische RGPs, die die Hirnventrikel in vivo auskleiden. Obwohl wir die Antikörperaufnahme in Neuroepithelzellen im Rückenmark nicht überprüft haben, sollte die Anti-Dld-Atto647N-Antikörperaufnahme dort anwendbar sein, genau wie im Gehirn. Es wird erwartet, dass die konjugierten Antikörper, die in die Hinterhirnkammer injiziert werden, auch entlang des Rückenmarks diffundieren.
Für die erfolgreiche Anwendung des Antikörperaufnahmetests ist es vor allem wichtig, einen primären Antikörper zu verwenden, der eine hohe Bindungsaffinität und Spezifität für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteinziels aufweist. Neben der Markierung des Notch/Delta-Signalwegs ist das Protokoll auch für die Markierung anderer Membranproteine oder extrazellulärer Proteine mit ähnlichen Strategien geeignet. Unser Protokoll hat aufgrund der hohen Qualität und Spezifität des Anti-Dld-Primärantikörpers eine hocheffiziente Aufnahme von Anti-Dld-Antikörpern in sich entwickelnden Zebrafischembryonen gezeigt. Zweitens ist die Konjugation des Anti-DLD-Primärantikörpers mit dem fluoreszierenden Sekundärantikörper entscheidend für das Erreichen einer hohen Antikörperaufnahmeeffizienz in vivo. Wir haben festgestellt, dass die nicht bleichenden Sekundärantikörper von Atto stabiler und viel heller sind als andere fluoreszierende Antikörper, wie z. B. Zenon- und Alexa-Sekundärantikörper, die in Drosophila-Notum-Kulturen verwendet werden 7,10. Wir haben uns für Atto647N als Fluoreszenzmarkierung entschieden, da wir es normalerweise zusammen mit GFP- oder RFP-transgenen Zebrafischen oder einigen anderen Fluoreszenzmarkern verwenden würden, die ähnliche Anregungswellenlängen wie GFP oder RFP aufweisen. Andere nicht bleichbare Sekundärantikörper mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen sollten ebenfalls mit dem Protokoll funktionieren. In unserem Protokoll verkürzten wir die Inkubationszeit von Primärantikörpern, die mit dem Atto-Sekundärantikörper gemischt wurden, von 12 h auf 30 min und senkten die Konzentration von Anti-DLD-Antikörpern auf 0,05 mg/ml in den endgültigen Mikroinjektionsmischungen. Eine höhere Konzentration von Anti-DLD-Antikörpern (0,25 mg/ml) erhöhte die Effizienz der Antikörperaufnahme in Zebrafischembryonen nicht; Dies könnte der Grund dafür sein, dass lange Inkubationszeiten erforderlich sind, um eine ausreichende Markierung mit fluoreszierenden Sekundärantikörpern zu erreichen10. Wir haben Anti-DLD-Antikörper nicht in einer höheren Konzentration wie in früheren Studienverwendet 10, da die Möglichkeit besteht, dass injizierte Anti-Dld-Atto647N-Antikörper bei der Bindung von DeltaD-Liganden an die Membran von RGPs mit dem endogen exprimierten Notch/Delta konkurrieren und dadurch die cis- oder trans-Notch/Delta-Signaltransduktion in vivo stören. Wir fanden auch heraus, dass Blockierungspuffer, der nach der Konjugation von primären Antikörpern hinzugefügt wurde, hilfreich war, um die Spezifität des Antikörperaufnahmeassays in vivo zu erhöhen. Wie in Abbildung 2 gezeigt, internalisieren die meisten RGPs im Vorderhirn anti-Dld-Atto647N aktiv. Ohne Zugabe des Blockierungspuffers zeigen die meisten Zellen nur sehr wenige internalisierte anti-Dld-Atto647N-Endosomen (Daten nicht gezeigt).
Die Haupteinschränkung des Protokolls ist die Verfügbarkeit der Antikörper, die für den Aufnahmetest verwendet werden können. Unser Protokoll ist für die Markierung membranexprimierter Proteine geeignet, wenn ein guter Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne verfügbar ist. Für zytosolische und nukleäre Proteine ist der Antikörperaufnahmetest nicht anwendbar, da die konjugierten Antikörper die Zellmembran nicht passieren können, um an ihre intrazellulären Bindungsziele zu binden. Die Live-Bildgebung intrazellulärer Proteine hängt hauptsächlich von verschiedenen Arten von fluoreszierenden transgenen Modellen ab. In den letzten Jahrzehnten wurden mehr Fluoreszenzfarbstoffe für die Bildgebung lebender Zellen entwickelt, wie z. B. die Siliziumrhodamin-ähnliche (SiR)-Technologie, die wesentlich zur Bildgebung von DNA, RNA, Aktin und Tubulin17 in lebenden Zellen beigetragen hat. Eine Kombination verschiedener Lebendmarkierungsstrategien wäre der beste Weg, um komplexe Signalwege in lebenden Zellen zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Das Projekt wurde von NIH R01NS120218, dem UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation und Chan Zuckerberg Biohub unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
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