Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إنشاء وصيانة وتمايز والتلاعب الجيني وزرع عضويات الغدة الدمعية البشرية والفأر

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/65040
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), University Medical Center Utrecht, 2Oncode Institute, Hubrecht Institute

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء عضويات الغدة الدمعية المشتقة من الفئران الأولية والأنسجة البشرية وصيانتها وتعديلها وراثيا وتمييزها وظيفيا وتوصيفها وظيفيا.

Abstract

الغدة الدمعية عضو أساسي في الاتزان الداخلي لسطح العين. من خلال إنتاج الجزء المائي من الفيلم المسيل للدموع ، فإنه يحمي العين من إجهاد الجفاف والشتائم الخارجية. لا يعرف سوى القليل عن فسيولوجيا الغدة الدمعية (المرضية) بسبب عدم وجود نماذج كافية في المختبر . أثبتت تقنية Organoid نفسها كمنصة تجريبية مفيدة لأعضاء متعددة. هنا ، نشارك بروتوكولا لإنشاء وصيانة عضويات الفئران والغدة الدمعية البشرية بدءا من خزعات الغدة الدمعية. من خلال تعديل ظروف الاستزراع ، نقوم بتعزيز وظائف الغدة الدمعية العضوية. يمكن فحص وظائف العضوي من خلال فحص "البكاء" ، والذي يتضمن تعريض عضويات الغدة الدمعية لناقلات عصبية مختارة لتحفيز إطلاق الدموع في تجويفها. نفسر كيفية تصوير هذه الظاهرة وقياسها. لدراسة دور الجينات المهمة في الاتزان الداخلي للغدة الدمعية، يمكن تعديلها وراثيا. نحن نصف بدقة كيفية تعديل عضويات الغدة الدمعية وراثيا باستخدام المحررين الأساسيين - من تصميم دليل الحمض النووي الريبي إلى التنميط الجيني للاستنساخ العضوي. أخيرا ، نوضح كيفية التحقيق في الإمكانات التجديدية لعضويات الغدة الدمعية البشرية عن طريق زرع تقويم العظام في الفأر. توفر مجموعة الأدوات الشاملة هذه معا موارد لاستخدام عضويات الفئران والغدد الدمعية البشرية لدراسة فسيولوجيا الغدة الدمعية (المرضية).

Introduction

الغدة الدمعية هي الظهارة الغدية المسؤولة عن إنتاج معظم الطبقة المائية للفيلم المسيل للدموع1. لا تحتوي الطبقة المائية من الفيلم المسيل للدموع على الماء لتليين سطح العين فحسب ، بل تحتوي أيضا على ذخيرة كبيرة من المكونات المضادة للميكروبات التي تحمي سطح العين من العدوى2. عندما تتلف الغدة الدمعية أو تلتهبها ، يحدث مرض جفاف العين ، مما يؤدي إلى عدم الراحة للمرضى ويمكن أن يؤدي في النهاية إلى فقدان الرؤية3. على مر السنين ، كانت الأنظمة النموذجية لدراسة الغدة الدمعية ، وخاصة الغدة البشرية ، محدودة4،5،6. وقد ساهم ذلك في حدوث فجوة معرفية فيما يتعلق بوظيفة الغدة الدمعية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نماذج في المختبر لدراسة الغدة الدمعية في طبق7،8،9. تستمد عضويات الغدة الدمعية هذه من الخلايا الجذعية البالغة التي تزرع كهياكل ثلاثية الأبعاد في مصفوفة خارج الخلية تكملها مجموعة من عوامل النمو التي تحافظ على قدراتها التجديدية في المختبر7. تتمثل ميزة الكائنات العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة (ASC) في أنه يمكن الحفاظ عليها لفترة طويلة جدا مع تلخيص ميزات الأنسجة السليمة. يتكون هذا النوع من الكائنات العضوية فقط من الخلايا الظهارية ، على عكس الكائنات العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) ، والتي قد تحتوي أيضا على خلايا انسجة ، على سبيل المثال. على عكس الكائنات العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSC) ، يتم إنشاء عضويات ASC مباشرة من الأنسجة البالغة ولا تتطلب أي تعديلات وراثية لتوسيعها. تعبر عضويات ASC عن خصائص البالغين10.

يحتوي هذا البروتوكول على صندوق أدوات لاشتقاق عضويات الغدة الدمعية من الفئران والأنسجة الأولية البشرية. يصف البروتوكول كيفية زيادة تعزيز وظائف المواد العضوية عن طريق الانسحاب البسيط لعامل النمو وكيفية إثارة الكائنات العضوية لإفراز السائل المسيل للدموع عن طريق إجراء فحص التورم. يتضمن هذا البروتوكول أيضا طريقة نقل تعتمد على التثقيب الكهربائي لهندسة عضويات الفئران وراثيا باستخدام برامج تحرير القواعد المشتقة من كريسبر. على عكس Cas9 التقليدي ، يسمح استخدام برامج التحرير الأساسية بتعديل القواعد الفردية في الجينوم دون توليد كسر مزدوج تقطعت بهم السبل11,12. أخيرا ، يتم وصف زرع الأعضاء التناسلية للغدة الدمعية البشرية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة والتقييم النسيجي اللاحق للتطعيم. يمكن استخدام مجموعة الأدوات العضوية للغدة الدمعية هذه في البحث عن تجديد الغدة الدمعية ووظيفتها ونمذجة الأمراض الوراثية والالتهابية.

Protocol

تمت الموافقة على تجارب الفئران من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان التابعة للأكاديمية الملكية الهولندية للفنون والعلوم (KNAW) بموجب ترخيص المشروع AVD8010020151. تم اشتقاق المواد العضوية من المواد الفائضة للفئران. تم جمع خزعات الغدة الدمعية البشرية من فضلات المرضى الذين يخضعون لعملية جراحية في المركز الطبي الجامعي في أوتريخت (UMCU) بعد موافقة لجنة الأخلاقيات الطبية بموجب البروتوكول رقم 18-740. يحتوي البروتوكول على عدة أقسام موضحة في الشكل 1.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول. يسلط هذا الشكل الضوء على الخطوات المختلفة للبروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملاحظة: جميع التراكيب المتوسطة والعازلة موصوفة في الجدول التكميلي 1.

1. إنشاء عضويات من الفئران والغدد الدمعية البشرية

  1. تشريح الغدة الدمعية للفأر
    1. قم بإعداد أدوات التشريح ، بما في ذلك المقص والملقط ومنصات التشريح. القتل الرحيم للفأر عن طريق استنشاق O2 / CO2 13.
    2. ضع الفأر الرحيم على بطنه على وسادة التشريح ، وقم بتثبيت أطرافه. بلل الشعر الموجود بين آذان الماوس وعلى الجبهة باستخدام 70٪ إيثانول.
    3. باستخدام مقص التشريح ، قم بعمل فتحة خلف الجمجمة بين الأذنين. مد هذه الفتحة على الجبهة حتى الأنف. لا يزال يستخدم المقص ، وقطع الجلد خلف الأذنين لتوليد اثنين من اللوحات.
    4. اسحب السديلات باتجاه الأنف بقوة حتى تنكشف الغدد الدمعية، كما هو موضح في الشكل 2 أ. ثبت اللوحات على وسادة التشريح. باستخدام المقص ، قم بعمل شق صغير في الغشاء الموجود فوق الغدة الدمعية لكشف الغدة الدمعية تماما.
    5. باستخدام ملقط ، وسحب الغدة الدمعية. يجب أن يكون هناك بعض المقاومة حتى تمزق القناة الدمعية الرئيسية. إذا كنت تفضل ذلك ، قم بقطع القناة الدمعية الرئيسية مباشرة بالمقص.
    6. ضع الغدة الدمعية للفأر في برنامج تلفزيوني من درجة زراعة الأنسجة حتى تتم معالجة أخرى. المضي قدما في معالجة الغدة الدمعية في غضون 2-4 ساعات للحد من موت الخلايا. إذا استغرق ذلك وقتا أطول ، ضع الغدة الدمعية للفأر في وسط جمع الخزعة (الجدول التكميلي 1).
      ملاحظة: يمكن تجميع العديد من الغدد الدمعية إذا كانت هناك حاجة إلى أعداد كبيرة من الكائنات العضوية على الفور.
  2. جمع خزعات الغدة الدمعية البشرية
    1. قبل الجراحة ، قم بإعداد حصص 20 مل من وسط جمع الخزعة (الجدول التكميلي 1) في أنبوب سعة 50 مل ، وأعطها للجراح قبل الجراحة. يمكن الاحتفاظ بهذه الوسيلة عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
    2. في يوم الجراحة ، دع الجراح يأخذ عينة من قطعة من الغدة الدمعية (عادة <1 مم3) ، وقم بتخزينها في وسط جمع الخزعة (الجدول التكميلي 1) عند 4 درجات مئوية.
    3. جمع الخزعة لمعالجتها في أقرب وقت ممكن. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون هذا في نفس اليوم خلال 2 ساعة من أخذ عينات الخزعة.
  3. الاشتقاق العضوي
    1. قم بإعداد ما يلي مسبقا: مصفوفة مذابة خارج الخلية (ECM) ، فأر درجة حرارة الغرفة (RT) أو وسط تمدد بشري (الجدول التكميلي 1) ، كولاجيناز مذاب ، وسط أساسي (الجدول التكميلي 1) ، مشرطان ، طبق بتري 10 سم ، مصفاة 70 ميكرومتر مثبتة على أنبوب سعة 15 مل ، وألواح تعليق 12 بئرا مسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. تحضير وسط الهضم من خلال الجمع بين جميع المكونات الموضحة في الجدول التكميلي 1. بلل المشارط مسبقا في هذه الوسيلة لتجنب التصاق قطع الأنسجة بها.
    3. استرجع أنسجة الفأر أو الغدة الدمعية البشرية من الوسط ، وضعها في طبق بتري.
    4. باستخدام المشارط المبللة مسبقا ، قم بفرم الأنسجة. بمجرد أن تصبح قطع الأنسجة صغيرة جدا (أي <0.5 مم3) ، ضعها في وسط الهضم عن طريق كشطها من طبق بتري بالمشرط. إذا كانت الخزعة البشرية صغيرة جدا بالفعل ، فضعها مباشرة في وسط الهضم دون فرمها لتجنب فقدان الأنسجة.
    5. احتضان قطع المناديل لمدة تصل إلى 15 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية. اقلب الأنبوب سعة 15 مل بانتظام لإعادة تعليق القطع. راقب تفكك الخلايا تحت مجهر منضدة حتى لا تفرط في هضم الأنسجة.
    6. في غضون ذلك ، قم بتضييق ماصة باستور عن طريق وضع طرفها في اللهب أثناء الدوران ، وقم بترطيبها مسبقا في الوسط الأساسي. لفصل الأنسجة بكفاءة ، تأكد من أن الثقب أصغر قليلا من أكبر قطع الأنسجة المتبقية. لتسهيل عملية التفكك ، قم بسحب الخليط لأعلى ولأسفل كل 5 دقائق باستخدام ماصة باستور الضيقة المبللة مسبقا.
    7. عندما تكون العديد من الخلايا المفردة والكتل الصغيرة مرئية تحت المجهر ، أوقف التفكك بإضافة 10 مل من الوسط الأساسي. تدور لأسفل في 400 × غرام لمدة 5 دقائق لبيليه الخلايا.
    8. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من الوسط الأساسي لتكرار الغسيل. قم بترشيحه من خلال مصفاة 70 ميكرومتر لإزالة قطع الأنسجة الكبيرة غير المهضومة وألياف الكولاجين المتبقية ، مما يمنع البلمرة الكافية ل ECM. أدر الشطف عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: تشير حبيبات الخلايا الحمراء إلى وجود خلايا الدم الحمراء ، والتي عادة لا تعيق اشتقاق الكائنات العضوية. ومع ذلك ، بالنسبة لبعض التطبيقات ، مثل قياس التدفق الخلوي ، يجب تحليل خلايا الدم الحمراء. لذلك ، احتضان الخلايا في 5 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء الطازجة في RT لمدة 5 دقائق ، وحبيبات الخلايا عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
    9. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من ECM البارد للغدة الدمعية لفأر واحد وفي 50 ميكرولتر من ECM البارد لخزعة بشرية. عند إعادة الضبط ، كن حذرا حتى لا تصنع فقاعات ، لأنها ستؤثر أيضا على بلمرة ECM واستقرارها.
    10. بذر ما يصل إلى 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر من لوحة تعليق 12 بئرا. استخدم P200 لعمل قطرات ~ 20 ميكرولتر في البئر. كلما كانت القطرات أصغر ، كان انتشار عوامل النمو والمواد المغذية أفضل من خلال المصفوفة.
    11. ضع اللوحة رأسا على عقب في حاضنة مرطبة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة للسماح ل ECM بالتصلب.
    12. بمجرد ترسيخ ECM ، أضف ~ 1 مل من ماوس RT أو وسيط التمدد البشري لكل بئر من 12 لوحة بئر. قم بتحديث الوسط كل 2-3 أيام حتى تصل المواد العضوية إلى حجم 300 ميكرومتر. لذلك ، قم بشفط الوسط في البئر ، وأضف وسط التمدد برفق على جانب البئر دون لمس قطرات ECM حتى لا تعطلها.
      ملاحظة: يمكن إضافة بريموسين (100 مجم / مل ؛ 1: 1000 من المخزون التجاري) عند العزل في حالة حدوث تلوث بكتيري. ومع ذلك ، نظرا لأنه يبطئ نمو الأعضاء أيضا ، فمن الأفضل عدم إضافته أو إزالته بعد مرور واحد أو مقطعين.

2. توسيع الفأر وعضويات الغدة الدمعية البشرية

  1. بعد ~ 7 أيام لعضويات الماوس و ~ 10 أيام للعضويات البشرية ، عندما تصل المواد العضوية إلى حجم ~ 300 ميكرومتر ، قم بإزالة وسط الاستزراع.
  2. أعد تعليق قطرات ECM التي تحتوي على المواد العضوية في 1 مل من محلول التربسين عن طريق السحب بقوة لأعلى ولأسفل باستخدام P1,000 حتى تنهار القطرات. انقل هذا الخليط إلى أنبوب سعة 15 مل ، واحتضنه لفترة وجيزة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  3. بعد 2-3 دقائق ، استخدم ماصة باستور الضيقة والمبللة مسبقا لسحب التعليق العضوي لأعلى ولأسفل 10x-15x. تحقق من حالة تفكك المواد العضوية تحت المجهر على الطاولة ؛ يجب الحصول على كتل صغيرة من ~ 20 خلية. احتضن لفترة أطول في حمام مائي 37 درجة مئوية ، وكرر خطوة السحب حتى يصبح التفكك مرضيا.
    ملاحظة: قد تستغرق هذه الخطوة وقتا أطول للعضويات البشرية لأنها متعددة الطبقات. سيتم إنشاء خلايا مفردة. هذا لا يؤثر على النمو العضوي طالما أن معظم تعليق العضو يتكون من كتل صغيرة.
  4. أوقف التفكك بإضافة 10 مل من الوسط الأساسي. ثم, بيليه الخلايا في 400 × غرام لمدة 5 دقائق.
  5. بعد إزالة المادة الطافية و ECM التي قد توضع فوق المواد العضوية (طبقة شفافة تشبه الهلام بدون عضويات) ، أعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من ECM البارد قبل الطلاء في لوحة تعليق ، كما هو موضح في الخطوة 1.3.10.
    ملاحظة: بشكل عام ، يتم تقسيم الكائنات العضوية الدمعية للفأر بنسبة 1: 5 والكائنات العضوية البشرية بنسبة 1: 3. هذا يعني أنه عند البدء بالمواد العضوية الموجودة في 100 ميكرولتر من ECM ، يجب إعادة تعليقها في 500 ميكرولتر و 300 ميكرولتر ، على التوالي ، بعد الانقسام.
  6. احتضن اللوحة رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية حتى تصلب ECM لمدة 30 دقيقة ، وقم بتغطية الكائنات العضوية بالماوس أو وسط التمدد البشري في RT.

3. حفظ الفئران وعضويات الغدة الدمعية البشرية بالتبريد

  1. للحفاظ على المواد العضوية بالتبريد ، قم أولا بتقسيم الكائنات العضوية في وسط التمدد وفقا للتعليمات الواردة في القسم 2.
  2. بعد حوالي 3-4 أيام ، عندما تكون الكائنات العضوية في مرحلة النمو ، قم بإزالة الوسط ، وأعد تعليق 100 ميكرولتر من المواد العضوية المحتوية على ECM في 10 مل من وسط القاعدة الباردة. احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق للمساعدة في فصل ECM. اقلب الأنبوب بانتظام لتسهيل هذه العملية.
  3. بيليه المواد العضوية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات العضوية في 1 مل من وسط الحفظ بالتبريد (بقايا ECM لا تضعف الحفظ بالتبريد). انقل المعلق العضوي إلى المبرد وعلى الفور إلى الفريزر -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: عند استخدام وسيط الحفظ بالتبريد الموصوف في جدول المواد ، يمكن الاحتفاظ بالتبريد إلى أجل غير مسمى في مجمد -80 درجة مئوية. إذا تم استخدام وسيط آخر للحفظ بالتبريد ، فقم بنقل المبرد إلى خزان النيتروجين السائل بعد 24 ساعة لضمان الحفظ الأمثل.
  4. لإذابة المواد العضوية ، استرجع المبرد من الفريزر ، وانقله على ثلج جاف إلى حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. امسك المبرد في الماء حتى تذوب معظم محتوياته. انقل المحتويات إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من الوسط الأساسي ، وقم بتدوير الخلايا لأسفل عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
  5. قم بطلاء المواد العضوية في 100 ميكرولتر من ECM بوسط التمدد ، كما هو موضح في الخطوة 2.5 والخطوة 2.6.

4. التمييز بين عضويات الغدة الدمعية وتقييم وظائفها

  1. التمايز العضوي
    1. للتمييز بين عضويات الغدة الدمعية ، قم أولا بتقسيم الكائنات العضوية في وسط التمدد وفقا للتعليمات الواردة في القسم 2.
    2. بعد يومين، استبدل وسيط التمدد بالماوس أو وسيط التمايز البشري كما هو موضح في الخطوة 1.3.12. قم بتحديث الوسط كل 2-3 أيام للحفاظ على عضويات الماوس لمدة 5 أيام في هذا الوسط والكائنات العضوية البشرية لمدة 9 أيام.
    3. لتقييم التمايز العضوي بعد 5 أيام أو 9 أيام في وسط التمايز ، اجمع 100 ميكرولتر من ECM تحتوي على عضويات لاستخراج الحمض النووي الريبي. للقيام بذلك ، أعد تعليق قطرات ECM في 1 مل من الوسط الموجود في البئر باستخدام P1,000 ، ونقل التعليق العضوي في 3 مل من وسط قاعدة الجليد البارد. بيليه المواد العضوية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق.
    4. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي الريبي. قم بإجراء استخراج الحمض النووي الريبي في اتجاه مجرى النهر وفقا لتعليمات مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي. استخدم الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه ، على سبيل المثال ، لتحليل RT-qPCR للتعبير عن الخلايا الجذعية (TP63 ، KRT5 ، KRT14) وعلامات الخلايا المتمايزة (LCN2 ، WFDC2 ، AQP5 ، LTF ، ACTA2 ...) 14.
      ملاحظة: للحصول على تحليل التعبير ذي الصلة ، قم بقياس تعبير العلامات المختارة في عينة واحدة أو عدة عينات من الأنسجة. تميل المواد العضوية المستزرعة في ظل ظروف التمايز إلى احتواء كمية أقل من الحمض النووي الريبي.
  2. مقايسة التورم الوظيفي
    ملاحظة: بالنسبة لهذا الجزء من البروتوكول ، استخدم عضويات الغدة الدمعية البشرية التي تم تمييزها لمدة 7 أيام على الأقل. الحد الأدنى للوقت المطلوب هو 7 أيام لضمان تعبير علامة كافية للتمزق الوظيفي. يشكل كل بئر من صفيحة 12 بئرا شرطا واحدا. الحد الأدنى لعدد الشروط هو ثلاثة: عنصر تحكم إيجابي ، وتحكم سلبي ، وحالة اختبار.
    1. تحضير طازج 1 مل من وسط التمايز البشري الذي يحتوي على مكونات فردية تحفز إفراز عضويات الغدة الدمعية. على سبيل المثال ، أضف 100 ميكرومتر نورادرينالين و 1 ميكرومتر فورسكولين ، واخلطها جيدا.
      ملاحظة: فورسكولين بمثابة السيطرة الإيجابية التي عادة ما تؤدي إلى أقصى قدر من التورم.
    2. في مجهر الفاصل الزمني الآلي برايت فيلد ، قم بإعداد المواضع المراد تصويرها في اللوحة ، والفاصل الزمني (5 دقائق) ، والمدة (4 ساعات). تأكد من أن قطرة ECM كاملة مرئية في كل موضع.
    3. قبل البدء في التصوير مباشرة ودون تحريك اللوحة من المجهر ، قم بإزالة وسط الاستزراع من الآبار التي سيتم تصويرها ، واستبدلها بالوسط المعاد تعليقه جيدا المعد في الخطوة 4.2.1. قم بتضمين بئر مع استبدال وسط التمايز بوسط التمايز فقط كعنصر تحكم سلبي ، حيث قد يؤدي المرطبات المتوسطة إلى بعض التورم العضوي.
    4. بعد ما يصل إلى 4 ساعات ، انتهى فحص التورم. تحليل النتائج.
      ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوات باستخدام مجهر EVOS M7000 الذي يسمح بالتصوير الآلي بفاصل زمني ساطع. للحصول على هذا المجهر ، راجع دليل الشركة المصنعة التفصيلي لإعداد تصوير الفاصل الزمني. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن استخدام أي مجهر آخر له خصائص مماثلة.
    5. لتحديد التورم العضوي ، قم بقياس قطر كل عضو فردي عند 0 ساعة و 4 ساعات. افتح صور قطرة عضوية واحدة عند 0 h و 4 h في ImageJ.
    6. انقر على أيقونة الخط المستقيم في شريط الأدوات ، وارسم أولا قطر العضو العضوي عند 0 ساعة. بعد ذلك ، استخدم أداة القياس في ImageJ (تحليل > قياس) لقياس طول هذا الخط ، وبالتالي قطر العضو قبل التورم. كرر العملية على نفس العضو العضوي في 4 ساعات للحصول على قطر العضو بعد التورم.
    7. قم بقياس القطر العضوي ل ~ 20 عضويا لكل حالة قبل وبعد فحص التورم.

5. بناء البلازميد لضرب Pax6

  1. تصميم gRNA للضربة القاضية Pax6 باستخدام برامج تحرير قاعدة C > T
    ملاحظة: هناك الكثير من البرامج المتاحة لتصميم gRNA. هنا ، تم استخدام Benchling لأن هذا يسمح بتصميم gRNA المتكامل والتعليق التوضيحي ومحاذاة آثار Sanger. وبالتالي ، يمكن أيضا تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة باستخدام برامج بديلة.
    1. ابدأ عملية تصميم gRNA عن طريق تصور الجين المستهدف في Benchling بالنقر فوق جديد (+) > تسلسل الحمض النووي > استيراد تسلسلات الحمض النووي.
    2. في علامة التبويب استيراد من قاعدة البيانات ، اكتب الجين محل الاهتمام ، Pax6 ، واضغط على بحث.
    3. حدد أحدث إصدار من الجينوم المرجعي للماوس GRCm38 (mm10 ، Mus musculus) ، واضغط على استيراد.
    4. حدد exon حيث يمكن تصميم gRNA بالضربة القاضية من خلال الالتزام بالقواعد التالية:
      1. تجنب وضع gRNA في إكسون الترميز الأول ، لأن مواقع البدء البديلة في الإكسونات اللاحقة قد تستخدمها الخلية للتحايل على كودون التوقف المستحث المبكر.
      2. صمم gRNAs في exons الموجودة في جميع النصوص البديلة التي يمكن أن تحدث عن طريق ربط Pax6 mRNA. لضمان ذلك ، تصور Pax6 في متصفح جينوم Ensembl ، وحدد exon المستخدم في جميع النصوص.
      3. لمزيد من التحايل على الربط البديل ، استهدف إكسون يحتوي على كودون غير مكتمل (قاعدة أو قاعدتان متبقيتان من ثلاثة توائم). هذا أقل أهمية ولكنه يعطي مزيدا من اليقين حول تأثيرات indels المستحثة. بالنسبة إلى Pax6 ، يعد exon 4 إلى exon 11 هدفا جيدا. بالإضافة إلى ذلك ، اختر إكسون يحتوي على بقايا التربتوفان (W) أو الجلوتامين (Q) أو الأرجينين (R).
        ملاحظة: تحتوي برامج تحرير قاعدة C > T القياسية التي تستخدم SpCas9 على نافذة تحرير تمتد من النوكليوتيدات 4 إلى النوكليوتيدات 8 من بداية gRNA (الأبعد عن PAM). يمكن لمحرري قاعدة C > T إدخال كودونات التوقف على جميع بقايا التربتوفان (W) (TGG إلى TGA أو TAG أو TAA) مع gRNA على الشريط العكسي ، وعلى بقايا الجلوتامين (Q) (CAG إلى TAG أو CAA إلى TAA) ، وأخيرا ، على بقايا الأرجينين (R) (CGA إلى TGA) على الشريط الأمامي.
    5. حدد exon + 20 قاعدة المنبع والمصب. انقر على الجانب الأيمن من الشاشة على علامة الهدف كريسبر ، وانقر على أدلة التصميم والتحليل.
    6. في القائمة المفتوحة حديثا ، ضمن علامة التبويب نوع التصميم ، حدد أدلة "التحرير الأساسي" (Komor et al. ، 2016). حافظ على طول الدليل عند 20 نيوكليوتيد ، وتحت جينوم الماوس ، حدد GRCm38 (mm10 ، Mus musculus).
    7. بعد النقر فوق علامة + الخضراء ، سيكتشف البرنامج تلقائيا جميع تسلسلات الشكل المجاور للفضاء الأولي (PAM) ، وعلى الجانب الأيمن من الشاشة ، يقوم بإنشاء قائمة بجميع gRNAs المحتملة في المنطقة المحيطة ب exon محل الاهتمام.
    8. قم بالتمرير خلال القائمة حتى علامة كودون التوقف (*) في مربع أحمر ، والتي تشير إلى gRNA الذي يمكن أن يحول الحمض الأميني إلى كودون توقف ، وبالتالي يؤدي إلى خروج قاضي.
    9. في العمود الأول على يمين تسلسل gRNA ، لكل هدف "C" حول نافذة التحرير ، يتم حساب كفاءات التحرير المتوقعة في السيليكو . تأكد من أن تحرير C > T الذي ينتج عنه كودون التوقف لديه كفاءة تحرير لا تقل عن ~ 10.
    10. انقر فوق القيمة الموجودة في عمود خارج الهدف للتحقق من المواقع خارج الهدف التي يمكن أن يرتبط بها gRNA. تجنب اختيار gRNA الذي يرتبط بأي جينات إضافية لزيادة النوعية. على سبيل المثال ، يستهدف gRNA الجيد لتحرير Pax6 باستخدام محرر قاعدة C > T exon 7 وهو 5'-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3'.
    11. قم بإنشاء تعليق توضيحي في ملف Benchling بالنقر فوق رمز التعليقات التوضيحية في أعلى يمين الشاشة ، متبوعا بتعليق توضيحي جديد. قم بتسمية التعليق التوضيحي ، وتأكد من تحديد اتجاه gRNA الصحيح في القائمة المنسدلة Strand .
  2. جيل البلازميد gRNA
    ملاحظة: هناك العديد من النواقل المتاحة لتوصيل gRNA إلى المواد العضوية. تم استخدام البلازميد التالي كقاعدة لبناء gRNA: pFYF1320 (Addgene # 47511 ، هدية لطيفة من كيث جونغ).
    1. لاستنساخ gRNAs في pFYF1320 ، قم بتنفيذ إستراتيجية PCR معكوسة باستخدام التمهيدي الأمامي القياسي: "/ 5phos / GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. لتصميم التمهيدي العكسي ، الصق المكمل العكسي لتسلسل فاصل gRNA (تحقق مرة أخرى من اتجاه gRNA [+ أو - حبلا]) أمام جزء التمهيدي العكسي العالمي التالي: CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. لاستهداف exon 7 من الماوس Pax6 باستخدام محرر قاعدة C > T ، يكون التمهيدي العكسي كما يلي: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. طلب كل من الاشعال.
    2. قم بتشغيل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي باستخدام 1 نانوغرام من pFYF1320 كقالب باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة لمدة 35 دورة عند درجة حرارة تلدين تبلغ 61 درجة مئوية.
    3. قم بتشغيل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام أغاروز 1٪ في المخزن المؤقت TAE عند 100 فولت لمدة ~ 45 دقيقة لتصور الجزء المتوقع من 2281 زوجا أساسيا (bp). قم بإجراء تنظيف جل باستخدام المجموعة المفضلة.
    4. قم بإعداد تفاعل الربط التالي: 100 نانوغرام من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل النظيف ، وإنزيم Dpn1 لإزالة الحمض النووي الأولي لقالب pFYF1320 ، و T4 ligase. احتضان المزيج لمدة 15 دقيقة عند 20 درجة مئوية ، و 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، و 20 دقيقة عند 80 درجة مئوية.
    5. قم بتحويل مزيج التفاعل إلى بكتيريا DH5α المختصة كيميائيا ، وانشر البكتيريا على ألواح أجار تحتوي على الأمبيسلين15.
    6. في اليوم التالي ، اختر وقم بتوسيع ثلاث مستعمرات فردية في 3 مل من وسط مرق الليزوجيني (LB) المكمل ب 50 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين.
    7. في اليوم التالي ، قم بإجراء miniprep على 1 مل من كل من الثقافات الصغيرة الثلاث باستخدام مجموعة miniprep ، وقم بتخزين الباقي في درجة حرارة 4 درجات مئوية. إخضاع البلازميد الذي تم الحصول عليه لتسلسل سانجر باستخدام التمهيدي U6_Forward لضمان إدخال gRNA بشكل صحيح في المتجه16.
    8. بعد تحديد مستعمرة بكتيرية واحدة مع البلازميد الصحيح ، قم بتلقيح 500 ميكرولتر من الثقافة المصغرة المقابلة في 50 مل من LB المكمل بالأمبيسلين لتضخيم الحمض النووي للبلازميد بين عشية وضحاها. قم بإجراء إعداد ميدي في اليوم التالي لاستخدام مجموعة midiprep. سيتم استخدام هذا البلازميد للتثقيب الكهربائي في القسم 6.

6. جيل من استنساخ Pax6 KO

  1. التثقيب الكهربائي العضوي
    1. ابدأ بعضويات الماوس التي تم تقسيمها قبل 5 أيام على الأكثر حتى تكون في حالة تكاثري. استخدم ~ 300-400 ميكرولتر من قطرات الأعضاء لكل ضربة قاضية. قم بتضمين شرط إضافي لاختيار عنصر تحكم سلبي سيتم كهربه بدون أي بلازميد.
    2. نفذ الخطوات 2.1-2.4 لفصل الكائنات العضوية ، ولكن افصل الكائنات العضوية لفترة أطول بحيث تكون خلايا مفردة. تخلص من المادة الطافية.
    3. أعد تعليق الخلايا في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي.
    4. في أنبوب سعة 1.5 مل ، قم بإعداد البلازميدات التالية بحد أقصى 20 ميكرولتر: 2.5 ميكروغرام من بلازميد pFYF1320-gRNA ، 2.8 ميكروغرام من البلازميد المحتوي على الترانسبوزاز ، 7.2 ميكروغرام من البلازميد المحتوي على الترانسبوزون المقاوم للهيجروميسين ، و 7.5 ميكروغرام من pCMV_ABEmax_P2A_GFP.
      ملاحظة: يقوم بلازميد pFYF1320-gRNA بتشفير gRNA المصمم مسبقا ، والذي يوجه المحرر الأساسي إلى الموضع المستهدف. يقوم pCMV_ABEmax_P2A_GFP البلازميد بتشفير المحرر الأساسي ، بالإضافة إلى مراسل GFP ، والذي يمكن استخدامه لمراقبة الخلايا التي تعبر عن المحرر الأساسي بعد التثقيب الكهربائي. يشفر البلازميد المحتوي على الترانسبوزاز الترانسبوزاز ، الذي يلصق الكاسيت المقاوم للرطوبة الذي توفره مقاومة الترانسبوزون المحتوي على الترانسبوزون في مكان ما بشكل عشوائي في الجينوم. تصبح الخلايا التي أدرجت هذا الكاسيت في جينومها مقاومة للهيجروميسين ويمكن اختيارها بشكل إيجابي عن طريق إضافة الهيجروميسين. نظرا لأن الدمج المشترك للعديد من البلازميدات أمر محتمل للغاية ، فإن مقاومة الهيجروميسين تشكل اختيارا وظيفيا لإثراء الخلايا التي تم تحريرها ل Pax6.
    5. أضف البلازميدات إلى الخلايا ، واخلطها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
    6. قم بإعداد جهاز الحفر الكهربائي باستخدام المعلمات التالية لنبض المسام (الجهد: 175 فولت ؛ طول النبض: 5 مللي ثانية ؛ الفاصل الزمني للنبض: 50 مللي ثانية ؛ عدد النبضات: 2 ؛ معدل الاضمحلال: 10٪ ؛ القطبية: +) ولنقل النبض (الجهد: 20 فولت ؛ طول النبض: 50 مللي ثانية ؛ فاصل النبض: 50 مللي ثانية ؛ عدد النبضات: 5 ؛ معدل الاضمحلال: 40٪ ؛ القطبية: +/-).
    7. ضع الخلايا مع البلازميدات في كوفيت التثقيب الكهربائي. قم على الفور بقياس المقاومة (Ω) ، والتي يجب أن تكون بين 0.30 A و 0.55 A ، والكهرباء على الفور. يلزم تنفيذ هذه الخطوة بسرعة لتجنب استقرار الخلايا في الجزء السفلي من الكوفيت وتقليل كفاءة التثقيب الكهربائي.
    8. انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 1.5 مل ، وأضف 400 ميكرولتر من محلول التثقيب الكهربائي المكمل بمثبط رو كيناز. اسمح للخلايا بالتعافي في RT لمدة 30 دقيقة.
    9. قم بإذابة الخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وقم بطلاء الخلايا في 200 ميكرولتر من ECM. بعد التصلب ، أضف وسيط توسيع الماوس.
    10. العضوية الكيسية تنمو بعد 2-3 أيام. راقب إشارة GFP ، التي تكشف عن وجود محرر قاعدة C > T ، يوميا.
  2. اختيار العضوية
    1. بعد ~ 3 أيام ، عندما تتعافى الكائنات العضوية ، أضف 100 ميكروغرام / مل من الهيجروميسين إلى وسط تمدد الماوس لتحديد المواد العضوية التي دمجت كاسيت مقاومة الهيجروميسين. هناك احتمال كبير أن الخلايا التي تمتص بلازميد واحد سوف تمتص عدة بلازميدات. من خلال اختيار المواد العضوية المقاومة للهيجروميسين ، يتم إثراء الكائنات العضوية المحررة على موضع Pax6 .
    2. عندما تكون جميع الخلايا في السيطرة السلبية ميتة وتكون الكائنات العضوية الباقية ~ 300 ميكرومتر ، اختر الكائنات العضوية المقاومة للهيجروميسين.
  3. قطف الأعضاء والتنميط الجيني
    1. قم بإعداد أطراف P20 معقمة بجوار المجهر وأنابيب 1.5 مل تحتوي على 100 ميكرولتر من محلول التربسين على الجليد.
    2. ثني طرف P20 بالملقط. راقب اللوحة التي تحتوي على المواد العضوية الباقية على مجهر منضدة. عندما يكون العضو العضوي الباقي على قيد الحياة في بؤرة التركيز ، قم بإزالة غطاء اللوحة. باستخدام طرف P20 المثني ولا يزال تحت المجهر ، قم بنضح كل عضو على قيد الحياة على حدة ، وضع كل منها في أنبوب منفصل يحتوي على محلول التربسين.
    3. التقاط ما يصل إلى 20 استنساخ. يعتمد عدد الحيوانات المستنسخة التي سيتم اختيارها على عدد الحيوانات المستنسخة المطلوبة لكل تصميم تجريبي وعلى كفاءة التحرير ، والتي تختلف باختلاف كل gRNA والموقع.
    4. عندما يتم التقاط جميع الحيوانات المستنسخة ، ضع أنابيب 1.5 مل في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 دقائق. دوامة كل أنبوب بانتظام لزيادة سرعة التفكك ، والتحقق من المواد العضوية تحت المجهر فوق الطاولة. عندما يتم فصل الكائنات العضوية إلى كتل صغيرة و / أو خلايا مفردة ، أوقف عملية الهضم بإضافة 1 مل من الوسط الأساسي.
    5. لكل نسخة يتم اختيارها ، احتفظ ب ~ 400 ميكرولتر للنمط الجيني في أنبوب منفصل سعة 1.5 مل. قم بتدوير ~ 600 ميكرولتر اليسار عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 20 ميكرولتر من ECM ، وقم بوضعها كقطرة واحدة في بئر من صفيحة 24 بئرا ، وأضف وسيط تمدد الماوس بدون hygromycin.
    6. للتنميط الجيني للمستنسخات ، قم بتدوير الأنابيب التي تحتوي على ~ 400 ميكرولتر من تعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي.
    7. احتضان الخلايا على الفور على النحو التالي: 6 دقائق عند 60 درجة مئوية ، دوامة ، و 4 دقائق عند 95 درجة مئوية. يمكن الاحتفاظ بهذا الحمض النووي لمدة تصل إلى 7 أيام عند -20 درجة مئوية ، ولكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل النهائي على الفور هو الأمثل.
    8. لتضخيم الموضع المستهدف بالنيوكلياز ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على 2 ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج باستخدام بادئات التنميط الجيني المناسبة المطلوبة مسبقا وبوليميراز منخفض الدقة. بادئات التنميط الجيني هي AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) و TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). يجب أن يبدأ amplicon حوالي 100 نقطة أساس من الموضع المحرر المتوقع لضمان تسلسله بكفاءة.
    9. قم بتشغيل منتج PCR على هلام الأغاروز لتقييم كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، كما هو مذكور في الخطوة 5.2.3. عند اكتشاف شريط بالحجم الصحيح ، قم بقصه من الجل لإجراء استخراج هلام الحمض النووي باستخدام مجموعة.
    10. تسلسل الحمض النووي المستخرج من كل استنساخ عضوي تم اختياره مسبقا باستخدام بادئات التنميط الجيني.
    11. قم بمحاذاة التسلسلات التي تم الحصول عليها مع جين Pax6 في Benchling. افتح تسلسل الجينات المستوردة من الخطوة 4.1. انقر فوق المحاذاة على الجانب الأيمن ، ثم على إنشاء محاذاة جديدة. قم بتحميل ملفات .ab1 التي تم الحصول عليها من موفر التسلسل ، وحدد DNA كنوع نيوكليوتيد ، واضغط على التالي.
    12. في النافذة التالية ، حدد متعدد التسلسلات وبرنامج المحاذاة تلقائي (MAFFT) قبل النقر فوق إنشاء محاذاة.
    13. حدد الأنماط الجينية التي تحتوي على كودون توقف سابق لأوانه متماثل الزيجوت (كما تم الحصول عليه باستخدام محرري القاعدة) على كلا الأليلين. احتفظ بالنسخ المستنسخة العضوية المقابلة للتوسع ، واحفظها بالتبريد لمزيد من التحليل. من الناحية المثالية ، يجب تحليل ثلاثة استنساخ عضوي مختلف جنبا إلى جنب للتحايل على التأثيرات المحتملة للنيوكلياز خارج الهدف.

7. زرع تقويم العظام من عضويات الغدة الدمعية البشرية في الفئران NSG

  1. إعداد عضوي
    1. يجب تقسيم عضويات الغدة الدمعية البشرية ~ 3 أيام قبل يوم الزرع ، كما هو موضح في القسم 2. في يوم الزرع ، تأكد من أن الكائنات العضوية في المرحلة التكاثرية لزيادة فرص النقش.
    2. لاستخراج المواد العضوية من ECM ، أضف dispase إلى وسط الاستزراع للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.125 وحدة / مل. باستخدام P1000 ، أعد تعليق قطرات ECM تماما لتعطيلها ، ثم ضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. حجم 100 ميكرولتر من ECM يكفي لحقن ~ 10 غدد دمعية.
    3. أعد تعليق المواد العضوية في 10 مل من الوسط الأساسي لغسل الإنزيم. بيليه الخلايا في 400 × غرام لمدة 5 دقائق.
    4. إعادة تعليق الخلايا (~ 1,500,000) في 50 ميكرولتر من وسط التمدد البشري البارد المكمل ب 5٪ ECM. ضع التعليق العضوي على الجليد ، وانتقل فورا إلى عملية الزرع.
  2. زرع تقويم العظام في الفئران
    1. في منشأة الحيوانات ، لديك تعليق عضوي وإبر الأنسولين على الجليد. نضح تعليق عضوي في إبرة الأنسولين الباردة.
    2. قم بتخدير فأر NOD scid gamma (NSG) الذي يعاني من نقص المناعة مع 3٪ إيزوفلوران لبدء التخدير. عندما يكون الماوس نائما ، ضعه بسرعة على جانبه مع إمكانية الوصول إلى الغدة الدمعية الرئيسية (الموجودة في منتصف الطريق بين العين والأذن).
    3. حقن 5 ميكرولتر من المعلق العضوي مباشرة من خلال الجلد في الغدة الدمعية. الحد الأقصى للحجم الذي يمكن أن تحتويه الغدة الدمعية للفأر هو 5 ميكرولتر.
    4. اسمح للفأر بالتعافي ، ومراقبة الماوس كل يوم لتقييم وجود أي إزعاج يتعلق بعملية الزرع ، خاصة على العين.
  3. تقييم النقش
    1. التضحية بالفأر باستنشاق O 2 / CO2 بعد ما يصل إلى 90 يوما اعتمادا على ما إذا كان يجب تقييم النقش قصير الأجل أو طويل الأجل13.
    2. تشريح الغدة الدمعية كما هو موضح في القسم 1. إصلاحه في 4 ٪ الفورمالين لمدة 24 ساعة في RT.
    3. ضع الغدة الدمعية في كاسيت. تجفيف الغدة الدمعية عن طريق حضنها على النحو التالي: 2 ساعة في 70٪ إيثانول ، 2 ساعة في 96٪ إيثانول ، 1 ساعة في 100٪ إيثانول (2x) ، 2 ساعة في الزيلين ، وبين عشية وضحاها في البارافين السائل عند 58 درجة مئوية في الفرن.
    4. في اليوم التالي ، قم بتوجيه الغدة الدمعية كما هو مفضل في قالب معدني ، وقم بتعبئتها بالبارافين السائل ، واترك الكتلة تتصلب على سطح بارد. من الأفضل تنفيذ هذه العملية باستخدام آلة التضمين.
    5. عندما تكون كتلة البارافين صلبة ، قم بتقطيع الكتلة بأكملها إلى أقسام 4-5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم. احتفظ بجميع الأقسام (على شكل شرائط) في بيئة جافة وخالية من التيارات الهوائية. يمكن الاحتفاظ بالأقسام إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة.
    6. عينة واحدة من كل 10 أقسام تغطي الكتلة بأكملها.
      1. قم بتركيب الأقسام على شريحة على النحو التالي: ضع قطرة ماء على الشريحة ، ضع القسم في الأعلى ، واتركه يرتاح لمدة ~ 2 دقيقة للسماح له بالتمدد على لوح تسخين 42 درجة مئوية ، وقم بإزالة الماء برفق بالورق.
      2. ضع الشرائح لتجف طوال الليل في فرن على حرارة 58 درجة مئوية. يمكن الاحتفاظ بالشرائح إلى أجل غير مسمى في RT بعد هذه المرحلة.
    7. لتمييز الخلايا البشرية عن خلايا الفأر ، قم بإجراء تلطيخ المستضد النووي البشري على هذه الأقسام. أعد ترطيب الأقسام عن طريق إجراء الغسلات التالية: 3 دقائق في الزيلين (2x) ، 1 دقيقة في 100٪ إيثانول (2x) ، 1 دقيقة لكل منهما 96٪ إيثانول ، 90٪ إيثانول ، 80٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول ، 60٪ إيثانول ، و 25٪ إيثانول ، وأخيرا ، 1 دقيقة في ماء ديمي (2x).
    8. احتضان الشرائح لمدة 15 دقيقة في مخزن PO المؤقت (الجدول التكميلي 1). اغسل الشرائح 3x في ماء فائق النقاء.
    9. إجراء استرجاع مستضد قائم على السيترات في الأوتوكلاف:
      1. ضع الشرائح في حامل منزلق مقاوم للأوتوكلاف في سلة مملوءة بمخزن سترات مؤقت (الجدول التكميلي 1). ضع السلة في الأوتوكلاف ، وقم بتشغيل دورة الأوتوكلاف (الضغط: 10 رطل لكل بوصة مربعة ؛ درجة الحرارة: 121 درجة مئوية ؛ الوقت: 15 دقيقة).
      2. عندما يتم إزالة الضغط من الأوتوكلاف ، استرجع السلة التي تحتوي على الشرائح ، وضعها في حمام مائي RT لإحضار الشرائح إلى RT.
        ملاحظة: تعتمد استراتيجية استرجاع المستضد على الجسم المضاد المستخدم. ارجع إلى ورقة بيانات الموفر لإجراء استرجاع المستضد الأكثر ملاءمة.
    10. ضع الشرائح أفقيا ، بحيث يكون جانب القسم لأعلى ، على صينية حضانة. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 1٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في PBS في الأعلى ، واحتضانه لمدة 1 ساعة. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر.
    11. قم بإعداد محلول الجسم المضاد عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من الجسم المضاد للمستضد النووي البشري إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لكل شريحة يتم تلوينها. أضف محلول الأجسام المضادة إلى كل شريحة. احتضان طوال الليل في صينية حضانة رطبة على حرارة 4 درجات مئوية.
    12. في اليوم التالي ، اغسل الشرائح 3x في برنامج تلفزيوني. احتضان الشرائح بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر HRP غير مخفف لمدة 45 دقيقة. اغسل الشرائح 3x في برنامج تلفزيوني.
      أنذر. في غطاء كيميائي ، قم بإعداد المخزن المؤقت DAB (الجدول التكميلي 1). احتضان الشرائح مع العازلة DAB لمدة 10 دقائق. تخلص من أي نفايات في حاويات النفايات السائلة الكيميائية العضوية.
    13. اغسل الشرائح بالماء. احتضان الشرائح لمدة 2 دقيقة في الهيماتوكسيلين لمقاومة النوى. اغسل الشرائح في ماء الصنبور الجاري لمدة 10 دقائق.
    14. قم بتجفيف الشرائح عن طريق احتضانها لمدة دقيقة واحدة في كل منها 50٪ إيثانول ، 60٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول ، 80٪ إيثانول ، 90٪ إيثانول ، 1 دقيقة في 96٪ إيثانول (2x) ، 1 دقيقة في 100٪ إيثانول (2x) ، و 1 دقيقة في زيلين (2x).
    15. أرفق الشرائح بوسيط تثبيت وقسيمة غطاء. بعد التجفيف لمدة 20 دقيقة ، راقب الشرائح تحت المجهر.
    أنا>

Representative Results

بعد تشريح الغدة الدمعية للفأر (الشكل 2 أ) ، ولد الهضم الأنزيمي والميكانيكي شظايا صغيرة من الأنسجة ، من بينها العنيبات والقنوات (الشكل 2 ب). الأجزاء الكبيرة المتبقية من الأنسجة من شأنها أن تزعزع استقرار ECM ، مما يقلل من النمو العضوي الأولي. كان اشتقاق الغدة الدمعية للفأر ناجحا عندما تم العثور على عضويات كيسي بقطر ~ 500 ميكرومتر بعد ~ 7 أيام ، وهي المرحلة التي كانت فيها الكائنات العضوية جاهزة للانقسام (الشكل 2C). حتى لو كان الاشتقاق العضوي الكلي ناجحا ، فقد تبدأ بعض الكائنات العضوية في النمو قبل التوقف في النهاية. نمت عضويات الغدة الدمعية البشرية كأكياس في غضون 3-4 أيام ووصلت إلى الحجم الكامل النمو في 10-14 يوما بعد عزل الأنسجة (الشكل 2 د). بالنسبة لكل من الفئران والبشر ، فشل الاشتقاق العضوي في بعض الأحيان ، مع عدم نمو أو عدد قليل من الكائنات العضوية. كان هذا بشكل عام بسبب الإفراط في هضم الأنسجة. يمكن تمرير عضويات الغدة الدمعية للفأر 40x على الأقل والكائنات العضوية البشرية 20x على الأقل. تم تمرير كل 7-10 أيام في المتوسط ، وهذا يتوقف على النمو العضوي.

Figure 2
الشكل 2: تكوين عضويات الفأر والغدة الدمعية البشرية. أ: صور فوتوغرافية للمراحل المختلفة لتشريح الغدة الدمعية للفأر. يشير السهم إلى الغدة الدمعية تحت غشاءها الواقي. (ب) صور برايتفيلد لخلايا الغدة الدمعية للفأر بعد هضم الأنسجة مباشرة، مع وجود أجزاء داخلية توضح العنيب والقناة. (ج) صور برايتفيلد لاشتقاق عضوي ناجح وغير ناجح للغدة الدمعية للفأر. د: صور برايتفيلد لنمو عضوي بشري على مدار 14 يوما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحتوي عضويات الغدة الدمعية على نسبة كبيرة من الخلايا الجذعية عند زراعتها في وسط التمدد. لزيادة مستوى تمايزها ، قمنا بإعداد ماوس ووسيط تمايز بشري مع محتوى عامل نمو منخفض. بعد 5 أيام و 7 أيام ، على التوالي ، في وسط التمايز ، أصبحت عضويات الفأر والغدة الدمعية البشرية أكثر كثافة (الشكل 3A-B). يرتبط هذا التغيير المورفولوجي بزيادة الخصائص الوظيفية. أدى تطبيق منشط AMP الدوري فورسكولين أو الناقل العصبي بافراز إلى تورم عضوي (أي إفراز الماء القمي) في أقل من 3 ساعات (الشكل 3C). عندما استغرق التورم وقتا أطول من 3-4 ساعات ، يشير ذلك إلى أن المواد العضوية لم تكن متمايزة بما فيه الكفاية و / أو لم تعبر عن علامات وظيفية ، مثل مستقبلات الناقلات العصبية.

Figure 3
الشكل 3: تمايز عضويات الفأر والغدة الدمعية البشرية ومقايسة التورم الوظيفي في العضويات البشرية. (أ) صور برايتفيلد لعضويات الغدة الدمعية للفأر المستزرعة في وسط التمدد لمدة 7 أيام وفي وسط التمايز لمدة 5 أيام بعد 2 أيام في وسط التمدد. (ب) صور برايتفيلد لعضويات الغدة الدمعية البشرية المستزرعة في وسط التمدد لمدة 11 يوما وفي وسط التمايز لمدة 9 أيام بعد يومين في وسط التمدد. (ج) صور برايتفيلد لعضويات الغدة الدمعية البشرية المتمايزة المعرضة لوسط تمايز جديد (تحكم) ، إلى 1 ميكرومتر فورسكولين ، و 100 ميكرومتر نورإبينفرين على مدار 3 ساعات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

لضرب Pax6 في عضويات الغدة الدمعية للفأر ، تم إنشاء بلازميد يحتوي على gRNA الذي يستهدف Pax6 المختار بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل والربط (الشكل 4 أ). تم تكريب هذا البلازميد المحتوي على gRNA جنبا إلى جنب مع بلازميدات Piggy-Bac (البلازميدات المحتوية على الترانسبوزون المحتوية على الترانسبوزون والترانسبوزاز) ومحرر قاعدة C > T Cas9 في عضويات الغدة الدمعية للفأر المنفصلة إلى خلايا مفردة. بعد 3 أيام ، عندما تعافت الكائنات العضوية ، تعرضوا للهيجروميسين لاختيار الحيوانات المستنسخة التي تضمنت كاسيت مقاومة الهيجروميسين. في التثقيب الكهربائي الناجح ، نمت المواد العضوية المقاومة للهيجروميسين (الشكل 4 ب). تم اختيار الحيوانات المستنسخة العضوية المتنامية التي كانت أكبر من ~ 300 ميكرومتر ، من الناحية المثالية قبل أن تبدأ في التمايز تلقائيا (الشكل 4C). تم استخراج الحمض النووي من جزء من العضو العضوي مع الحفاظ على الباقي في الثقافة. أسفر تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لموضع Pax6 المستهدف بواسطة gRNA عن نطاق 367 bp لكل من الحيوانات المستنسخة التي تم اختيارها (الشكل 4D). بعد تسلسل الموضع المضخم ، تم الاحتفاظ بالنسخ المستنسخة التي تم تحريرها بشكل متماثل C > T (n = 1). من ناحية أخرى ، تم تجاهل الحيوانات المستنسخة التي لم يتم تحريرها (n = 4) ، أو تم تحريرها بشكل غير متجانس ، أو تم تحريرها بشكل خاطئ (n = 1) (الشكل 4E). بشكل عام ، باستخدام هذا gRNA الذي يستهدف Pax6 ، تم الحصول على نسخة واحدة من الغدة الدمعية للفأر متماثل الزيجوت من أصل ستة متتابعة. نمت بعض الحيوانات المستنسخة بشكل جيد ، لكن بعض الحيوانات المستنسخة العضوية فقدت بعد قطفها أو بدأت في التمايز (الشكل 4F). من بين 10 استنساخ عضوي تم اختياره ، نمت 7 بشكل جيد.

Figure 4
الشكل 4: الضربة القاضية بوساطة تحرير القاعدة ل Pax6 في عضويات الغدة الدمعية للفأر. (أ) تتبع تسلسل سانجر ل pFYF1320 بعد التكامل الصحيح ل gRNA الذي يستهدف موضع Pax6. (ب) صور برايتفيلد لعضويات الغدة الدمعية للفأر بعد 5 أيام من التعرض للهيجروميسين بعد التثقيب الكهربائي. تم استزراع المواد العضوية في وسط تمدد الفئران. على اليسار مثال على فشل التثقيب الكهربائي ، مع عدم وجود استنساخ مقاوم للهيجروميسين ينمو. على اليمين مثال على التثقيب الكهربائي الناجح ، مع بقاء العديد من الحيوانات المستنسخة العضوية المقاومة للهيجروميسين. (ج) صور برايتفيلد للمستنسخات التي يجب قطفها والحيوانات المستنسخة التي لا ينبغي قطفها. (د) هلام الأغاروز يوضح تضخيم موضع Pax6 المستهدف بالحمض النووي الريبوزي الريبوزي (gRNA). باللون الأخضر ، يتم تمييز النطاق بالحجم المتوقع البالغ 367 نقطة أساس. ه: تتبع تسلسل سانجر لثلاث مستنسخات عضوية مقاومة للهيجروميسين. الاستنساخ العلوي غير محرر. الاستنساخ الأوسط هو إصدار C > T متماثل الزيجوت ، وبالتالي ، خروج المغلوب متماثل الزيجوت. يقدم الاستنساخ السفلي طفرتين نقطيتين متغايرة الزيجوت وهو إما خروج المغلوب غير المتجانس أو استنساخ مختلط وقد تم تحريره بشكل خاطئ. (F) صور برايتفيلد للمستنسخات العضوية المنتقاة بمستويات مختلفة من النمو. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أخيرا ، لإجراء عملية زرع تقويم الغدة الدمعية البشرية في الفئران ، تم استخدام المواد العضوية التي تم تقسيمها قبل 3 أيام (< 100 ميكرومتر في القطر). تم تأكيد النقش العضوي بعد شهر 1 من حقن المواد العضوية في الغدة الدمعية للفأر عن طريق تلطيخ علامة خاصة بالإنسان ، المستضد النووي البشري (الشكل 5). يشير عدم وجود تلطيخ نقطي من جميع أقسام الغدة الدمعية للفأر إلى نقص النقش العضوي البشري.

Figure 5
الشكل 5: زرع عضويات الغدة الدمعية في الإنسان في الغدة الدمعية للفأر. تلطيخ الغدد الدمعية للفأر المزروعة لعلامة النواة البشرية لمراقبة engraftment 1 شهر بعد الزرع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: تكوين وسائط الإعلام والمخازن المؤقتة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

يصف هذا البروتوكول إنشاء واستخدام عضويات الغدة الدمعية للمقايسات الوظيفية ونمذجة الطفرات والزرع. عند إنشاء عضويات الغدة الدمعية للفأر والإنسان ، فإن تفكك الأنسجة أمر بالغ الأهمية. إذا لم يتم هضم الأنسجة بشكل كاف ، فسيكون العائد العضوي منخفضا. إذا تم هضم الأنسجة بشكل مفرط ، ستموت الخلايا ولن تنمو كعضويات. يجب هضم كل نسيج بإنزيم معين لفترة محددة لضمان النمو العضوي الأمثل14،17،18. الغدة الدمعية هي نسيج رخو إلى حد ما يكون فيه هضم كولاجيناز من 5-10 دقائق مع التفكك الميكانيكي القائم على السحب كافيا لعزل قطع صغيرة من الأنسجة. إذا كانت هناك حاجة للحصول على خلايا مفردة لتطبيقات مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، فيمكن إجراء التفكك لفترة أطول حتى يتم الوصول إلى مرحلة الخلية الواحدة ، ولكن يجب إيقاف التفكك بمجرد الحصول على خلايا مفردة للحد من أي انخفاض في الجدوى. نظرا لأن تفكك الأنسجة أمر بالغ الأهمية ، فإن الإفراط في الهضم هو السبب الأكثر ترجيحا لفشل إنشاء الغدة الدمعية العضوية.

الصيانة المناسبة لعضويات الغدة الدمعية مهمة لاستخدامها. الصيانة طويلة الأجل هي السمة المميزة لعضويات الغدة الدمعية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة ، مقارنة بالكائنات العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثةمتعددة القدرات 7,17. لتحقيق صيانة طويلة الأجل ، يجب إجراء تقسيم عضوي منتظم وتغييرات متوسطة. بدون ذلك ، تبدأ الكائنات العضوية في التمايز وتطوير إمكانات الخلايا الجذعية المنخفضة ، مما يعيق صيانتها على المدى الطويل7. في هذه الخطوة مرة أخرى ، يمكن أن يؤدي الإفراط في الهضم إلى قتل الخلايا الجذعية وإضعاف صيانة المواد العضوية. للصيانة الدورية ، لا يلزم تفكك الأعضاء في خلايا مفردة. ومع ذلك ، لتوليد خطوط عضوية نسيلية بالضربة القاضية ، من الأهمية بمكان البدء بخلايا مفردة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فسوف تتكون الكائنات العضوية من فسيفساء من الخلايا ذات الخلفيات الجينية المختلفة ، مما يجعل تحليل تأثير طفرة واحدة محددة مستحيلا. نصف هنا استخدام محرر قاعدة C > T لتوليد كودونات الإيقاف. يعتمد محرر الجينوم هذا على وجود كودونات الأرجينين أو الجلوتامين أو التربتوفان داخل 12-18 قاعدة من NGG PAM. عندما لا يتم استيفاء هذه الشروط في تصميم gRNA ، يمكن استخدام محرري قاعدة Cas9 أو C >T التقليدية مع PAMs البديلة 7,18. ومع ذلك ، يقدم Cas9 التقليدي فواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل تؤدي إلى indels عند الإصلاح11. وبما أن كلا الأليلين قد يحتويان على إندلات مختلفة، فإن التنميط الجيني المستنسخ يتطلب مزيدا من الحذر. يجب إجراء إزالة الالتفاف للتعديلات التي تم إدخالها للتأكد من أن كلا الأليلين يحتويان على إندل خارج الإطار ، وبالتالي ، يتم التخلص من الحيوانات المستنسخة العضوية للجين المستهدف19. تكمن ميزة محررات قاعدة C > T في حقيقة أنه يمكن استخدامها لنمذجة الطفرات النقطية التي لا تؤدي بالضرورة إلى كودونات التوقف. على سبيل المثال ، يمكن استخدامها لنمذجة طفرات Pax6 المحددة الموجودة في المرضى الذين يعانون من الأنيريديا لدراسة تأثيرها على فسيولوجيا الغدة الدمعية20.

تفرز الغدة الدمعية الجزء المائي من الفيلم المسيل للدموع1. يمكن تلخيص إفراز الدموع في الكائنات العضوية البشرية بعد التمايز بوساطة انسحاب عامل النمو وتثبيط NOTCH. في ظل هذه الظروف ، تخضع المواد العضوية للتمايز النهائي ولا يمكن الحفاظ عليها. ومع ذلك ، يمكن أن توجه عضويات الغدة الدمعية المتمايزة تطوير الأدوية التي تحفز التمزق في سياق مرض جفاف العين ، وربما في شاشات عالية الإنتاجية. مقايسة التمزق المقدمة في هذا البروتوكول هي التي تعطي حاليا أكبر تغيير في حجم الأعضاء في فترة زمنية قصيرة ، مما يسهل القياس الكمي في سياق شاشة الدواء7،9،17.

العلاج بالخلايا الجذعية يحمل وعدا كبيرا لتجديد الغدة الدمعية في مرض جفاف العين21. يمكن أن تكون عضويات الغدة الدمعية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة مادة مصدر لمثل هذه التطبيقات. ينتج عن البروتوكول المقدم هنا تطعيم عضوي للغدة الدمعية البشرية ، في الغالب على شكل خراجات. يمكن أن ينشأ النقش العضوي المنخفض بسبب حقن المواد العضوية في الموقع الخطأ. يسمح تدريب إجراء الحقن بصبغة بتتبع موقع الحقن ، وفي النهاية يحسن دقة الحقن. بدلا من ذلك ، يمكن شق بشرة الفأر للوصول المباشر إلى الغدة الدمعية ، كما هو الحال في الفئران قبل22. تستغرق هذه الطريقة وقتا أطول ولكنها قد تكون أكثر دقة. من ناحية أخرى ، مع البروتوكول الحالي ، لم تندمج الكائنات العضوية وظيفيا في الغدة الدمعية للفأر. وقد لوحظت نتائج مماثلة لتطعيم الغدة الدمعيةالمشتقة من iPSC 22. يمكن تحسين طريقة الزرع بشكل أكبر عن طريق جرح الغدة الدمعية مسبقا ، باستخدام نموذج فأر العين الجافة ، و / أو حقن الكائنات العضوية كخلايا مفردة أو كتل صغيرة. ومع ذلك ، يمكن أن تكون عضويات الغدة الدمعية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة ومجموعة الأدوات ذات الصلة أساسا للتطبيقات المستقبلية في أبحاث الغدة الدمعية والطب التجديدي.

Disclosures

هانز كليفرز هو رئيس أبحاث الأدوية والتطوير المبكر في روش ، بازل ، ويحمل العديد من براءات الاختراع المتعلقة بتكنولوجيا المواد العضوية.

Acknowledgments

نشكر يوريك بوست على التطوير الأولي للبروتوكول. تم دعم هذا العمل جزئيا بجائزة من التحدي الكبير لأبحاث السرطان في المملكة المتحدة (C6307 / A29058) ومؤسسة مارك لأبحاث السرطان لفريق SPECIFICANCER.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL safe-lock centrifuge tubes Eppendorf EP0030 120.094
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB) Sigma-Aldrich D5637 CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 °C
5x green GoTaq Flexi buffer Promega M891A Store at -20 °C
A83-01 Tocris 2939 Store at -20 °C, stock at 30 mM, 10000x
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 store at 4 °C
Agar plates containing Ampicillin Hubrecht Institute
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Autoclave VAPOUR-Line lite VWR chemicals
B27 supplement Invitrogen 17504-044 Store at -20 °C, 50x
BD Micro-Fine insulin needle 1 mL BD Bioscience 324825
Benchtop microscope DMI1 Leica
Bovine serum albumine (BSA) MP biomedicals 160069 Store at 4 °C
BTXpress BTX MDS450805
C57BL/6 mice Hubrecht Institute
Cassettes Klinipath 410-02S
CellBanker 1 amsbio 11910 Cryopreservation medium, adhere to instructions
Centrifuge Eppendorf
Citric acid monohydrate J.T. Baker 0088 CAS: 5949-29-1
Collagenase I Sigma Aldrich C9407 Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 °C
Conical tubes 15 mL Greiner Bio-One 5618-8271
Conical tubes 50 mL Corning CLS430828-500EA
Coverslips 24 mm x 50 mm Menzel-Gläzer BB024050S1
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix R&D Systems, Bio-Techne 3533-001-02 Store at -20 °C, keep at 4 °C for up to 1 month
DAPT Sigma Aldrich D5942 Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x
Disodium hydrogen phosphate anhydrous VWR chemicals 28026.292 CAS: 7558-79-4
Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate Sigma-Aldrich 71643 CAS:10028-24-7
Dispase ThermoFisher Scientific 17105-041 Aliquots at 50 U/mL, store at -20 °C until use, 400x
Disposable Scalpel Sterile N° 10 Swann Morton 3033838
DM4000 microscope Leica
dNTPs 25 mM Promega U1420 Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 °C
Dpn1 New England Biolabs R0176
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) Gibco 14190144 1x
Easy strainers 70 µm Greiner 542170
Electroporation cuvette Nepagene EC002S
EnVision+/HRP mouse Agilent K400111-2
Ethanol 100% BOOM 84045206;5000 CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions
Ethanol 70% BOOM 84010059.5000 CAUTION
Ethanol 96% BOOM 84050065.5000 CAUTION
EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System ThermoFisher Scientific Live-imaging brightfield microscrope
FGF10 Peprotech 100-26 Store at -20 °C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x
Fiji NIH, Fiji developers
Formaldehyde solution 4% Sigma-Aldrich 1.00496 CAS: 50-00-0, CAUTION
Forskolin Tocris 1099 Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x
Glutamax Gibco 35050-061 100x
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase Promega M7805 Store at -20 °C
Haematoxylin VWR chemicals 10047105 Store at room temperature
HEPES Gibco 15630-080 Store at 4 °C, 100x
Histocore H and C, Tissue embedding machine Leica
Hot plate Meidax
Human nucleolar antigen antibody Abcam ab-190710
Hydrochloric acid 5 N ThermoFisher Scientific 10605882 CAS: 7647-01-0, CAUTION
Hydrogen peroxyde 30% Chem-lab CL00.2308.1000 CAS: 7722-84-1, CAUTION
Hygromycin B-gold InvivoGen ant-hg Stock at 100 mg/µL, 1000x
Hygromycin resistance cassette-containing plasmid Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
IsoFlo 100% Mecan 5960501
LB medium Hubrecht Institute
MgCl2 25 mM Promega A351H Store at -20 °C
Microtome RM2235 Leica
Midiprep DNA isolation kit ThermoFisher Scientific K210005
Miniprep DNA isolation kit ThermoFisher scientific K210003
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165 Store at -20 °C, stock at 500 mM, 400x
NEPA21 electroporator Nepagene
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636 Store at -20 °C, stock at 1M, 100x
NOD Scid Gamma (NSG) mice Hubrecht Institute colony
Noggin conditioned medium U-Protein Express Custom order Store at -20 °C
Noradrenaline Sigma Aldrich A7257 Store at -20 °C, stock at 100 mM
Oven Memmert Set at 58 °C
P20, P200 and P1000 pipettes Gilson
Paraffin VWR chemicals 10048502
Pasteur pipettes, glass plugged ThermoFisher Scientific 1150-6973
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG  IDT
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC  IDT
pCMV_ABEmax_P2A_GFP Addgene 112101
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 Store at -20 °C
Pertex Klinipath AM-08010
pFYF1320  Addgene 47511
Primocin InvivoGen ant-pm-1 1000X, store at -20 °C
Prostaglandin E2 (PGE2) Tocris 2296 Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x
Petri dish, 10 cm Greiner 633102
Q5 buffer New England Biolabs B9027S
Q5 high-fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0491S
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen QE09050 Store aliquots at -20 °C
R-spondin 3 conditioned medium U-Protein Express Custom order Store at -20 °C
sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG IDT
Slides StarFrost MBB-0302-55A Adhesive, ground
Sodium azide Merck 8.22335.1000 CAS: 26628-22-8, CAUTION
Sodium cytrate dihydrate J.T. Baker 0280 CAS: 6132-04-3
Standard Forward Primer: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
TTAAAATAAGGC		 IDT
Subcloning efficiency competent cells DH5alpha Invitrogen 18265-017
Suspension cell culture plates (24-well) Greiner Bio-One 662102 24-well
Suspension cell culture plates (12-well) Greiner Bio-One 665102 12-well
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
TAE buffer ThermoFisher Scientific B49 Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water
Transposase-containing plasmid Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
TrypLE Express Enzyme Invitrogen 12605-028 store at 4 °C
U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT IDT
UltraPure Agarose 1000 Invitrogen 16550
Water bath Tulabo
Xylene Klinipath 4055-9005 CAS: 1330-20-7, CAUTION
Y-27632 Abmole Bioscience Y-27632 dihydrochloride Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garg, A., Zhang, X. Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine. Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).
  2. Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. Resistance to infection of the external eye: The role of tears. Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).
  3. Messmer, E. M. The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease. Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).
  4. Massie, I., et al. Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).
  5. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PloS One. 7 (1), 29458 (2012).
  6. Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).
  7. Bannier-Hélaouët, M., et al. Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).
  8. Hayashi, R., et al. Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells. Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).
  9. Jeong, S. Y., et al. Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 247 (2021).
  10. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).
  11. Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing. Frontiers in Genetics. 12, 728520 (2021).
  12. Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
  13. Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
  14. Driehuis, E., et al. Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy. Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).
  15. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
  16. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  17. Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids. Journal of Visualized Experiments. (180), e62438 (2022).
  18. Lõhmussaar, K., et al. Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer. Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).
  19. Bloh, K., et al. Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data. The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).
  20. Latta, L., et al. Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions. The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).
  21. Veernala, I., et al. Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy. The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).
  22. Hayashi, R., et al. Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells. Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).

Tags

التراجع ، العدد 192 ، الغدة الدمعية ، المواد العضوية ، المحررات الأساسية ، الزرع ، مقايسة البكاء
إنشاء وصيانة وتمايز والتلاعب الجيني وزرع عضويات الغدة الدمعية البشرية والفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bannier-Hélaouët, M.,… More

Bannier-Hélaouët, M., Geurts, M. H., Korving, J., Begthel, H., Clevers, H. Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids. J. Vis. Exp. (192), e65040, doi:10.3791/65040 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter