Etablering, vedlikehold, differensiering, genetisk manipulasjon og transplantasjon av mus og humane lakrimale kjertelorganoider

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan man etablerer, vedlikeholder, genetisk modifiserer, differensierer, funksjonelt karakteriserer og transplanterer lacrimal kjertelorganoider avledet fra primærmus og humant vev.

Abstract

Lakrimalkjertelen er et viktig organ for okulær overflatehomeostase. Ved å produsere den vandige delen av tårefilmen, beskytter den øyet mot uttørkingsstress og eksterne fornærmelser. Lite er kjent om tårekjertelen (pato)fysiologi på grunn av mangel på tilstrekkelige in vitro-modeller . Organoidteknologi har vist seg som en nyttig eksperimentell plattform for flere organer. Her deler vi en protokoll for å etablere og vedlikeholde mus og humane lacrimal kjertelorganoider som starter fra lacrimal kjertelbiopsier. Ved å endre kulturforholdene, forbedrer vi lacrimal kjertelorganoid funksjonalitet. Organoid funksjonalitet kan undersøkes gjennom en "gråtende" analyse, som innebærer å utsette lacrimal kjertelorganoider til utvalgte nevrotransmittere for å utløse tårefrigjøring i lumen. Vi forklarer hvordan vi kan avbilde og kvantifisere dette fenomenet. For å undersøke rollen som gener av interesse i lacrimal kjertel homeostase, kan disse bli genetisk modifisert. Vi beskriver grundig hvordan man genetisk modifiserer lacrimal kjertelorganoider ved hjelp av base redaktører - fra guide RNA design til organoid klon genotyping. Til slutt viser vi hvordan man kan undersøke det regenerative potensialet til humane lacrimal kjertelorganoider ved ortotopisk implantasjon i musen. Sammen gir dette omfattende verktøysettet ressurser til å bruke mus og humane lacrimal kjertelorganoider for å studere lacrimal kjertel (pato) fysiologi.

Introduction

Lakrimalkjertelen er kjertelepitelet som er ansvarlig for å produsere det meste av det vandige laget av tårfilmen¹. Det vandige laget av tårefilmen inneholder ikke bare vann for å smøre den okulære overflaten, men også et stort repertoar av antimikrobielle komponenter som beskytter den okulære overflaten mot infeksjoner². Når lacrimal kjertelen er skadet eller betent, oppstår tørr øyesykdom, noe som resulterer i ubehag for pasienter og kan til slutt føre til tap av syn³. Gjennom årene har modellsystemer for å studere tårekjertelen, spesielt den menneskelige kjertelen, vært begrenset ^4,5,6. Dette har bidratt til et kunnskapshull om tårekjertelfunksjon under fysiologiske og patologiske forhold.

Nylig har in vitro-modeller blitt utviklet for å studere lacrimal kjertelen i en tallerken ^7,8,9. Disse lacrimal kjertelorganoider er avledet fra voksne stamceller dyrket som tredimensjonale strukturer i en ekstracellulær matrise supplert med en cocktail av vekstfaktorer som opprettholder deres regenerative kapasiteter in vitro⁷. Fordelen med voksne stamcelle (ASC) -avledede organoider er at de kan opprettholdes i svært lang tid mens de rekapitulerer sunne vevsfunksjoner. Denne typen organoid består utelukkende av epitelceller, i motsetning til induserte pluripotente stamceller (iPSC) -avledede organoider, som også kan inneholde stromale celler, for eksempel. I motsetning til pluripotente stamceller (PSC)-avledede organoider, etableres ASC-organoider direkte fra voksent vev og krever ingen genetiske modifikasjoner for å bli utvidet. ASC-organoider uttrykker voksne egenskaper¹⁰.

Denne protokollen inneholder en verktøykasse for å utlede lacrimal kjertelorganoider fra mus og humant primærvev. Protokollen beskriver hvordan man ytterligere kan forbedre organoidenes funksjonalitet ved enkel tilbaketrekking av vekstfaktor og hvordan man provoserer organoidene til å utskille tårevæske ved å utføre en hevelsesanalyse. Denne protokollen inkluderer i tillegg en elektroporasjonsbasert transfeksjonsmetode for genetisk manipulering av museorganoider ved hjelp av CRISPR-avledede baseredigerere. I motsetning til konvensjonell Cas9 tillater bruk av baseredigerere modifisering av enkeltbaser i genomet uten å generere et dobbeltstrenget brudd^11,12. Til slutt beskrives ortotopisk transplantasjon av humane tårekjertelorganoider til immundefekte mus og den påfølgende histologiske vurderingen av transplantasjonen. Dette lacrimal kjertel organoid verktøykasse kan brukes i forskning på lacrimal kjertel regenerering og funksjon og for genetisk og inflammatorisk sykdom modellering.

Protocol

Museforsøkene ble godkjent av Animal Ethics Committee of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) under prosjektlisens AVD8010020151. Organoidene ble avledet fra overskuddsmateriale fra mus. Biopsiene fra tårekjertelen hos mennesker ble samlet inn fra avfallsmaterialet til pasienter som ble operert ved University Medical Centre Utrecht (UMCU) etter godkjenning av medisinsk etisk komité under protokollnummer 18-740. Protokollen inneholder flere avsnitt som er skissert i figur 1.

Figur 1: Oversikt over protokollen. Denne figuren fremhever de forskjellige trinnene i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

MERK: Alle medium- og buffersammensetninger er beskrevet i tilleggstabell 1.

1. Etablering av organoider fra mus og humane lacrimal kjertler

1. Dissekere ut musen lacrimal kjertel
   1. Forbered disseksjonsverktøyene, inkludert saks, tang og disseksjonsputer. Avlive en mus ved O 2 / CO₂ inhalasjon¹³.
   2. Plasser den avlivede musen på magen på disseksjonsputepen, og fest lemmer. Våt håret som ligger mellom museørene og på pannen ved hjelp av 70% etanol.
   3. Bruk disseksjonssaks, lag en åpning bak skallen mellom ørene. Forleng denne åpningen over pannen opp til nesen. Fortsatt bruker saks, klipp huden bak ørene for å generere to klaffer.
   4. Trekk klaffene bestemt mot nesen til tårekjertlene er eksponert, som vist i figur 2A. Fest klaffene til disseksjonsputen. Bruk saks, gjør et lite snitt i membranen som ligger over lacrimal kjertelen for å fullstendig eksponere lacrimal kjertelen.
   5. Bruk tangen, trekk lacrimal kjertelen. Det bør være litt motstand til hovedtårekanalen er revet. Hvis foretrukket, kutt hovedtårekanalen direkte med saks.
   6. Plasser musen lacrimal kjertel i vev kultur-grade PBS inntil videre behandling. Fortsett med å behandle lacrimal kjertelen innen 2-4 timer for å begrense celledød. Hvis dette tar lengre tid, plasser tårekjertelen hos musen i biopsioppsamlingsmediet (tilleggstabell 1).
      MERK: Flere lacrimal kjertler kan slås sammen hvis et stort antall organoider er nødvendig umiddelbart.
2. Samle humane lacrimal kjertel biopsier
   1. Før operasjonen, klargjør 20 ml alikoter biopsioppsamlingsmedium (tilleggstabell 1) i et 50 ml rør, og gi dette til kirurgen i forkant av operasjonen. Dette mediet kan oppbevares ved 4 °C i flere måneder.
   2. På operasjonsdagen skal kirurgen ta prøver av en bit av tårekjertelen (vanligvis <1 mm³) og oppbevare den i biopsioppsamlingsmediet (tilleggstabell 1) ved 4 °C.
   3. Samle biopsien for å behandle den så snart som mulig. Ideelt sett bør dette være samme dag innen 2 timer med biopsiprøvetaking.
3. Organoid derivasjon
   1. Forbered følgende på forhånd: tint ekstracellulær matriks (ECM), romtemperert (RT) mus eller humant ekspansjonsmedium (tilleggstabell 1), tint kollagenase, basemedium (tilleggstabell 1), to skalpeller, en petriskål på 10 cm, en 70 μm sil montert på et 15 ml rør og 12-brønns opphengsplater forvarmet ved 37 °C i 30 minutter.
   2. Forbered fordøyelsesmediet ved å kombinere alle komponentene vist i tilleggstabell 1. Forvåt skalpellene i dette mediet for å unngå at vevbiter fester seg til dem.
   3. Hent musen eller humant tårekjertelvev fra mediet, og legg det i petriskålen.
   4. Bruk de forfuktede skalpellene, hakk vevet. Når vevstykkene er svært små (dvs. <0,5 mm³), plasser dem i fordøyelsesmediet ved å skrape dem av petriskålen med skalpellen. Hvis den menneskelige biopsien allerede er svært liten, plasser den direkte i fordøyelsesmediet uten hakking for å unngå vevstap.
   5. Inkuber vevstykkene i opptil 15 minutter i et vannbad på 37 °C. Snu 15 ml røret regelmessig for å resuspendere bitene. Overvåk celledissosiasjonen under et stasjonkmikroskop for ikke å fordøye vevet for mye.
   6. I mellomtiden smalner du en Pasteur-pipette ved å plassere spissen i en flamme mens du svinger, og forvåt den i basismediet. For å effektivt dissosiere vevet, sørg for at hullet er litt mindre enn de største vevstykkene som er igjen. For å lette dissosiasjonsprosessen, pipet blandingen opp og ned hvert 5. minutt med den forfuktede innsnevrede Pasteur-pipetten.
   7. Når mange enkeltceller og små klumper er synlige under mikroskopet, stopp dissosiasjonen ved å legge til 10 ml av basismediet. Spinn ned ved 400 x g i 5 min for å pelletere cellene.
   8. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml av basemediet for å gjenta vasken. Filtrer den gjennom en 70 μm sil for å fjerne de store ufordøyde vevstykkene og gjenværende kollagenfibre, noe som vil forhindre tilstrekkelig polymerisering av ECM. Spinn eluatet på 400 x g i 5 minutter.
      MERK: En rød cellepellet indikerer tilstedeværelsen av røde blodlegemer, som normalt ikke hemmer organoid avledning. For noen applikasjoner, for eksempel flowcytometri, bør imidlertid de røde blodcellene lyseres. For det, inkuber cellene i 5 ml fersk rød blodcelle lysisbuffer ved RT i 5 minutter, og pellet cellene ved 400 x g i 5 minutter.
   9. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 100 μL kald ECM for en enkelt mus lacrimal kjertel og i 50 μL kald ECM for en human biopsi. Når du resuspenderer, vær forsiktig så du ikke lager bobler, da disse også vil påvirke ECM-polymerisasjonen og stabiliteten.
   10. Frø opptil 100 μL celler per brønn av en 12-brønns suspensjonsplate. Bruk en P200 til å lage ~ 20 μL dråper i brønnen. Jo mindre dråpene er, desto bedre er diffusjonen av vekstfaktorene og næringsstoffene gjennom matrisen.
   11. Plasser platen opp ned i en fuktet inkubator ved 37 °C i 20-30 minutter for å la ECM stivne.
   12. Når ECM er størknet, legg til ~ 1 ml RT-mus eller menneskelig ekspansjonsmedium per brønn på en 12-brønnplate. Oppdater mediet hver 2-3 dag til organoidene når en størrelse på 300 μm. For det, aspirer mediet i brønnen, og tilsett forsiktig ekspansjonsmedium på siden av brønnen uten å berøre ECM-dråpene for ikke å forstyrre dem.
       MERK: Primocin (100 mg / ml; 1: 1,000 fra kommersielt lager) kan tilsettes ved isolasjon hvis bakteriell forurensning oppstår. Men fordi det bremser organoidveksten også, er det å foretrekke å ikke legge det til eller fjerne det etter en eller to passasjer.

2. Utvide musen og humane lacrimal kjertelorganoider

1. Etter ~7 dager for museorganoider og ~10 dager for humane organoider, når organoidene når en størrelse på ~ 300 μm, fjern kulturmediet.
2. Resuspender ECM-dråpene som inneholder organoider i 1 ml trypsinoppløsning ved kraftig pipettering opp og ned med en P1000 til dråpene faller fra hverandre. Overfør denne blandingen til et 15 ml rør, og inkuber den kort i et vannbad på 37 °C.
3. Etter 2-3 minutter, bruk en innsnevret og forfuktet Pasteur-pipette for å pipe organoidfjæringen opp og ned 10x-15x. Kontroller dissosiasjonsstatusen til organoider under et benkmikroskop; Små klumper av ~ 20 celler skal oppnås. Inkuber lenger i vannbadet på 37 °C, og gjenta pipetteringstrinnet til dissosiasjonen er tilfredsstillende.
   MERK: Dette trinnet kan ta lengre tid for menneskelige organoider, da de er flerlags. Enkeltceller vil bli generert; Dette påvirker ikke organoid utvekst så lenge det meste av organoidsuspensjonen består av små klumper.
4. Stopp dissosiasjonen ved å tilsette 10 ml av basismediet. Deretter pelleterer du cellene ved 400 x g i 5 minutter.
5. Etter å ha fjernet supernatanten og ECM som kan ligge på toppen av organoidene (gjennomsiktig, geléaktig lag uten organoider), resuspenderes cellene i et passende volum kald ECM før plating i en suspensjonsplate, som angitt i trinn 1.3.10.
   MERK: Vanligvis er mus lacrimal organoider delt i forholdet 1: 5 og humane organoider i forholdet 1: 3. Dette betyr at når man starter med organoider inneholdt i 100 μL ECM, må de resuspenderes i henholdsvis 500 μL og 300 μL etter splittelsen.
6. Inkuber platen opp ned i en 37 ° C inkubator til størkning av ECM i 30 minutter, og dekk organoider med mus eller menneskelig ekspansjonsmedium ved RT.

3. Cryopreserving musen og humane lacrimal kjertelorganoider

1. For å kryokonservere organoidene, splitt først organoidene i ekspansjonsmediet i henhold til instruksjonene gitt i avsnitt 2.
2. Omtrent 3-4 dager senere, når organoidene er i en vekstfase, fjern mediet og resuspender 100 μL av ECM-holdige organoider i 10 ml kaldt basemedium. Inkuber på is i 10 minutter for å bidra til å dissosiere ECM. Vend røret regelmessig for å lette denne prosessen.
3. Pellet organoidene ved 500 x g i 5 minutter. Fjern supernatanten og resuspender den organoide pelleten i 1 ml kryopreserveringsmedium (ECM-rester svekker ikke kryopreservering). Overfør organoidsuspensjonen til en kryovial og umiddelbart til en fryser på −80 °C.
   MERK: Når du bruker kryopreserveringsmediet beskrevet i materialfortegnelsen, kan kryovialene oppbevares på ubestemt tid i en fryser på -80 °C. Hvis et annet kryopreserveringsmedium brukes, overfør kryovialet til en flytende nitrogentank etter 24 timer for å sikre optimal bevaring.
4. For å tine organoidene, hent kryovialet fra fryseren og transporter det på tørris til et vannbad på 37 °C. Hold kryovialet i vannet til det meste av innholdet er tint. Overfør innholdet til et 15 ml rør inneholdende 10 ml basemedium, og spinn ned cellene ved 400 x g i 5 minutter.
5. Plate organoidene i 100 μL ECM med ekspansjonsmediet, som beskrevet i trinn 2.5 og trinn 2.6.

4. Differensiering av lacrimal kjertelorganoider og vurdering av funksjonaliteten

1. Organoid differensiering
   1. For å skille mellom organoider i tårekjertelen må du først dele organoidene i ekspansjonsmediet i henhold til instruksjonene i avsnitt 2.
   2. Etter 2 dager erstattes ekspansjonsmediet med mus eller humant differensieringsmedium som beskrevet i trinn 1.3.12. Oppdater mediet hver 2-3 dag for å opprettholde museorganoidene i 5 dager i det mediet og de menneskelige organoidene i 9 dager.
   3. For å vurdere organoid differensiering etter 5 dager eller 9 dager i differensieringsmediet, samle 100 μL ECM-holdige organoider for å trekke ut RNA. For å gjøre dette, resuspender ECM-dråpene i 1 ml medium inneholdt i brønnen ved hjelp av en P1,000, og overfør organoidsuspensjonen i 3 ml iskaldt basemedium. Pellet organoidene ved 500 x g i 5 minutter.
   4. Kast supernatanten, og resuspender pelleten i RNA-ekstraksjonsbuffer. Utfør nedstrøms RNA-ekstraksjon i henhold til instruksjonene i RNA-ekstraksjonssettet. Bruk det oppnådde RNA, for eksempel for RT-qPCR-analyse av ekspresjonen av stamceller (TP63, KRT5, KRT14) og differensierte cellemarkører (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2 ...) ¹⁴.
      MERK: For å oppnå den relevante ekspresjonsanalysen, måle uttrykket av de valgte markørene i en eller flere vevsprøver. Organoider dyrket under differensieringsforhold har en tendens til å inneholde mindre RNA.
2. Funksjonell hevelsesanalyse
   MERK: For denne delen av protokollen, bruk humane lacrimal kjertelorganoider som har blitt differensiert i minst 7 dager. Minimumstiden som kreves er 7 dager for å sikre tilstrekkelig markøruttrykk for funksjonell rivning. Hver brønn på en 12-brønns plate utgjør en betingelse. Minste antall betingelser er tre: en positiv kontroll, en negativ kontroll og en testbetingelse.
   1. Tilbered ferskt 1 ml humant differensieringsmedium som inneholder individuelle komponenter som induserer sekresjon av lacrimal kjertelorganoider. For eksempel, tilsett 100 μM noradrenalin og 1 μM forskolin, og bland godt.
      MERK: Forskolin fungerer som en positiv kontroll som vanligvis induserer maksimal hevelse.
   2. På et automatisk brightfield time-lapse-mikroskop, sett opp posisjonene som skal avbildes i platen, tidsintervallet (5 min) og varigheten (4 timer). Sørg for at en hel ECM-dråpe er synlig i hver posisjon.
   3. Rett før du begynner å avbilde og uten å flytte platen fra mikroskopet, fjern dyrkningsmediet fra brønnene som skal avbildes, og erstatt det med det godt resuspenderte mediet utarbeidet i trinn 4.2.1. Inkluder som en negativ kontroll en brønn med differensieringsmedium erstattet av kun differensieringsmedium, da middels forfriskning kan utløse noe organoid hevelse.
   4. Etter opptil 4 timer er hevelsesanalysen over. Analyser resultatene.
      MERK: Disse trinnene utføres med et EVOS M7000-mikroskop som muliggjør automatisk time-lapse-avbildning av lysfelt. For det mikroskopet, se den detaljerte produsentens håndbok for å sette opp time-lapse-avbildningen. Merk at ethvert annet mikroskop med lignende egenskaper kan brukes.
   5. For å kvantifisere organoid hevelse måles diameteren til hver enkelt organoid ved 0 timer og 4 timer. Åpne bildene av en enkelt organoiddråpe ved 0 timer og 4 timer i ImageJ.
   6. Klikk på ikonet Rett linje i verktøylinjen, og tegn først diameteren på en organoid ved 0 timer. Bruk deretter måleverktøyet i ImageJ (Analyser > mål) til å måle lengden på denne linjen og dermed organoiddiameteren før hevelse. Gjenta prosessen på samme organoid ved 4 timer for å oppnå organoiddiameteren etter hevelse.
   7. Mål organoiddiameteren på ~ 20 organoider per tilstand før og etter hevelsesanalysen.

5. Konstruere et plasmid for å slå ut Pax6

1. gRNA-design til knockout Pax6 ved hjelp av C > T base redaktører
   MERK: Det er mange programmer tilgjengelig for gRNA-design. Her ble Benchling brukt da dette muliggjør integrert gRNA-design, merknad og justering av Sanger-spor. Alle påfølgende trinn kan dermed også utføres ved hjelp av alternative programmer.
   1. Start gRNA-designprosessen ved å visualisere målgenet i Benchling ved å klikke på Ny (+) > DNA-sekvens > Importer DNA-sekvenser.
   2. I fanen Importer fra database skriver du inn genet av interesse, Pax6, og trykker på Søk.
   3. Velg den nyeste versjonen av musereferansegenomet GRCm38 (mm10, Mus musculus), og trykk på Importer.
   4. Velg eksonen der knock-out gRNA kan utformes ved å følge følgende regler:
      1. Unngå å sette et gRNA i det første kodende eksonet, fordi alternative startsteder i etterfølgende eksoner kan brukes av cellen til å omgå det tidlig induserte stoppkodonet.
      2. Design gRNA i eksoner som er tilstede i alle alternative transkripsjoner som kan oppstå ved spleising av Pax6 mRNA. For å sikre dette, visualiser Pax6 i Ensembl-genomleseren , og velg eksonet som brukes i alle transkripsjoner.
      3. For ytterligere å omgå alternativ skjøting, målrett mot en ekson som har et ufullstendig kodon (en eller to gjenværende baser av en triplett). Dette er av mindre betydning, men gir mer sikkerhet om effekten av induserte indels. For Pax6 er ekson 4 til ekson 11 et godt mål. I tillegg velger du et ekson som inneholder tryptofan (W), glutamin (Q) eller arginin (R) rester.
         MERK: Standard C- > T-baseredigerere som bruker SpCas9, har et redigeringsvindu som spenner fra nukleotid 4 til nukleotid 8 fra starten av gRNA (lengst unna PAM). C > T-baseredaktører kan introdusere stoppkodoner på alle tryptofan (W) rester (TGG til TGA, TAG eller TAA) med et gRNA på den bakre strengen, på glutamin (Q) rester (CAG til TAG eller CAA til TAA), og til slutt på arginin (R) rester (CGA til TGA) på den fremre strengen.
   5. Velg ekson + 20 baser oppstrøms og nedstrøms. Klikk på høyre side av skjermen på måltegnet CRISPR, og klikk på Design og analyser guider.
   6. I den nyåpnede menyen, under fanen Design Type, kryss av for Guides for "base editing" (Komor et al., 2016). Hold guidelengden på 20 nukleotider, og velg GRCm38 (mm10, Mus musculus) under Genom for mus.
   7. Etter å ha klikket på det grønne + tegnet, vil programvaren automatisk oppdage alle protospacer tilstøtende motiv (PAM) sekvenser og, på høyre side av skjermen, lage en liste over alle potensielle gRNA i området rundt eksonen av interesse.
   8. Bla gjennom listen til stoppkodontegnet (*) i en rød boks, som signaliserer for et gRNA som potensielt kan gjøre en aminosyre til et stoppkodon og dermed resultere i en knock-out.
   9. I den første kolonnen til høyre for gRNA-sekvensen, for hvert mål "C" rundt redigeringsvinduet, beregnes den in-silico predikerte redigeringseffektiviteten. Forsikre deg om at C > T-redigeringen som resulterer i stoppkodonet har en redigeringseffektivitet på minst ~ 10.
   10. Klikk på verdien i kolonnen Utenfor mål for å sjekke hvilket off-target-loci gRNA kan binde seg til. Unngå å velge et gRNA som binder seg til eventuelle ekstra gener for å øke spesifisiteten. For eksempel er et godt gRNA for å redigere Pax6 med en C > T-baseredigerer rettet mot ekson 7 og er 5'-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3'.
   11. Opprett en merknad i Benchling-filen ved å klikke på Merknader-ikonet øverst til høyre på skjermen, etterfulgt av Ny merknad. Navngi merknaden, og sørg for at riktig gRNA-retning er valgt i rullegardinmenyen Strand .
2. generering av gRNA-plasmid
   MERK: Det er forskjellige vektorer tilgjengelig for gRNA-levering til organoider. Følgende plasmid ble brukt som base for gRNA-konstruksjon: pFYF1320 (Addgene #47511, en snill gave fra Keith Joung).
   1. For å klone gRNAene i pFYF1320, implementer en invers PCR-strategi ved å bruke standard fremoverprimer: "/ 5phos / GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. For å designe omvendt primer, lim inn omvendt komplement av gRNA-avstandsstykkesekvensen (dobbeltsjekk gRNA-retningen [+ eller - streng]) foran følgende universelle omvendte primerdel: CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. For å målrette ekson 7 av musen Pax6 ved hjelp av C > T base editor, er omvendt primer som følger: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Bestill begge primerne.
   2. Kjør en invers PCR-reaksjon ved bruk av 1 ng pFYF1320 som en mal ved bruk av en hi-fidelity DNA-polymerase i 35 sykluser ved en glødetemperatur på 61 ° C.
   3. Kjør PCR-reaksjonen på en 1% agarosegel i TAE-buffer ved 100 V i ~ 45 minutter for å visualisere det forventede fragmentet av 2,281 basepar (bp). Utfør en gelrengjøring ved hjelp av det valgte settet.
   4. Sett opp følgende ligeringsreaksjon: 100 ng renset PCR-produkt, Dpn1-enzym for å fjerne det opprinnelige pFYF1320-mal-DNAet og T4-ligasen. Inkuber blandingen i 15 minutter ved 20 °C, 30 minutter ved 37 °C og 20 minutter ved 80 °C.
   5. Omdanne reaksjonsblandingen til kjemisk kompetente DH5a-bakterier, og spre bakteriene på agarplater som inneholder ampicillin¹⁵.
   6. Neste dag, plukk og utvid tre individuelle kolonier i 3 ml lysogen buljong (LB) medium supplert med 50 μg / ml ampicillin.
   7. Dagen etter utfører du en miniprep på 1 ml av hver av de tre minikulturene ved hjelp av et miniprep-sett, og oppbevarer resten ved 4 °C. Emne det oppnådde plasmidet til Sanger-sekvensering med U6_Forward-primeren for å sikre at gRNA er riktig satt inn i^{vektoren 16}.
   8. Etter å ha identifisert en enkelt bakteriekoloni med riktig plasmid, inokuler 500 μL av den tilsvarende minikulturen i 50 ml LB supplert med ampicillin for å amplifisere plasmid-DNA over natten. Utfør en midi-prep dagen etter bruk av et midiprep-sett. Dette plasmidet vil bli brukt til elektroporering i avsnitt 6.

6. Generasjon av Pax6 KO-kloner

1. Organoid elektroporering
   1. Start med museorganoider som ble delt maksimalt 5 dager før, slik at de er i en proliferativ tilstand. Bruk ~300-400 μL organoide dråper per utslag. Inkluder en ekstra betingelse for å velge en negativ kontroll som skal elektroporeres uten plasmid.
   2. Utfør trinn 2.1-2.4 for å dissosiere organoider, men dissosiere organoidene lenger slik at de er enkeltceller. Kast supernatanten.
   3. Resuspender cellene i 80 μL av elektroporeringsbufferen.
   4. I et 1,5 ml rør, lag følgende plasmider for maksimalt 20 μL: 2,5 μg pFYF1320-gRNA-plasmid, 2,8 μg transposaseholdig plasmid, 7,2 μg hygromycinresistens transposonholdig plasmid og 7,5 μg pCMV_ABEmax_P2A_GFP.
      MERK: pFYF1320-gRNA-plasmidet koder for det tidligere designede gRNA, som leder basiseditoren til mållokuset. Det pCMV_ABEmax_P2A_GFP plasmidet koder baseeditoren, samt en GFP-reporter, som kan brukes til å overvåke cellene som uttrykker baseeditoren etter elektroporering. Det transposaseholdige plasmidet koder for transposasen, som limer inn hygromycinresistenskassetten levert av hygromycinresistenstransposonholdig plasmid et tilfeldig sted inn i genomet. Celler som har innlemmet denne kassetten i deres genom, blir resistente mot hygromycin og kan velges positivt ved tilsetning av hygromycin. Siden samtidig inkorporering av flere plasmider er svært sannsynlig, utgjør hygromycinresistens et funksjonelt utvalg for å berike for celler som er redigert for Pax6.
   5. Legg plasmidene til cellene, og bland godt ved å pipettere opp og ned.
   6. Sett opp elektroporatoren med følgende parametere for porepuls (spenning: 175 V; pulslengde: 5 ms; pulsintervall: 50 ms; antall pulser: 2; forfallshastighet: 10%; polaritet: +) og for overføringspuls (spenning: 20 V; pulslengde: 50 ms; pulsintervall: 50 ms; antall pulser: 5; forfallshastighet: 40%; polaritet: +/-).
   7. Plasser cellene med plasmidene i en elektroporeringskuvett. Mål umiddelbart motstanden (Ω), som skal være mellom 0,30 A og 0,55 A, og elektroporer med en gang. Det er nødvendig å utføre dette trinnet raskt for å unngå at cellene legger seg i bunnen av kyvetten og reduserer elektroporasjonseffektiviteten.
   8. Overfør cellene til et 1,5 ml rør, og tilsett 400 μL elektroporasjonsbuffer supplert med en Rho-kinasehemmer. La cellene gjenopprette ved RT i 30 minutter.
   9. Pellet cellene ved 500 x g i 5 minutter, kast supernatanten og plate cellene i 200 μL ECM. Etter størkning, legg til museutvidelsesmediet.
   10. Cystiske organoider vokser ut etter 2-3 dager. Overvåk GFP-signalet, som avslører tilstedeværelsen av C > T-baseredigerer, daglig.
2. Organoid seleksjon
   1. Etter ~3 dager, når organoidene har gjenopprettet, tilsett 100 μg / ml hygromycin til museekspansjonsmediet for å velge organoider som har integrert hygromycinresistenskassetten. Det er stor sannsynlighet for at celler som tar opp ett plasmid vil ta opp flere plasmider. Ved å velge for hygromycinresistente organoider, berikes redigerte organoider på Pax6-lokuset .
   2. Når alle cellene i den negative kontrollen er døde og overlevende organoider er ~ 300 μm, velg de hygromycinresistente organoider.
3. Organoidplukking og genotyping
   1. Forbered sterile P20-spisser ved siden av mikroskopet og 1,5 ml rør som inneholder 100 μl trypsinoppløsning hver på is.
   2. Bøy en P20-spiss med tang. Observer platen som inneholder de overlevende organoider på et stasjonært mikroskop. Når en overlevende organoid er i fokus, fjern lokket på platen. Bruk den bøyde P20-spissen og fortsatt under mikroskopet, aspirer hver overlevende organoid individuelt, og plasser hver av disse i et separat rør som inneholder trypsinløsning.
   3. Plukk opptil 20 kloner. Antall kloner som skal plukkes, avhenger av antall kloner som kreves for hvert eksperimentelt design og på redigeringseffektiviteten, som varierer avhengig av hvert gRNA og lokus.
   4. Når alle klonene er plukket, plasser 1,5 ml rørene i et vannbad på 37 °C i opptil 5 minutter. Vortex hvert rør regelmessig for å øke dissosiasjonshastigheten, og sjekk organoider under benkemikroskopet. Når organoidene dissosieres i små klumper og/eller enkeltceller, stopp fordøyelsen ved å tilsette 1 ml basemedium.
   5. For hver klon som velges, hold ~400 μL til genotype i et separat 1,5 ml rør. Spinn ~600 μL igjen ved 500 x g i 5 minutter, fjern supernatanten, resuspender cellene i 20 μL ECM, plate dem som en enkelt dråpe i en brønn på en 24-brønnsplate, og tilsett museekspansjonsmedium uten hygromycin.
   6. For å genotype klonene, spinn ned rørene som inneholder ~ 400 μL cellesuspensjon ved 500 x g i 5 minutter, fjern supernatanten og resuspender cellene i 50 μL DNA-ekstraksjonsbuffer for å trekke ut DNA.
   7. Inkuber cellene umiddelbart som følger: 6 min ved 60 °C, virvel og 4 min ved 95 °C. Dette DNA-et kan oppbevares i opptil 7 dager ved -20 °C, men det er mest optimalt å utføre nedstrøms PCR umiddelbart.
   8. For å amplifisere lokuset som er målrettet med nukleasen, utfør en PCR på 2 μL av det ekstraherte DNA ved bruk av tilstrekkelige genotypingsprimere bestilt på forhånd og en lav-fidelity-polymerase. Genotypingsprimerne er AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) og TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). Amplikonen bør starte ca. 100 bp fra forventet redigert locus for å sikre at den sekvenseres effektivt.
   9. Kjør PCR-produktet på en agarosegel for å vurdere PCR-effektiviteten, som nevnt i trinn 5.2.3. Når et bånd av riktig størrelse oppdages, kutt det ut av gelen for å utføre en DNA-gelekstraksjon ved hjelp av et sett.
   10. Sekvenser det ekstraherte DNA fra hver organoidklon som tidligere ble valgt med genotypingsprimerne.
   11. Juster sekvensene oppnådd til Pax6-genet i Benchling. Åpne den importerte gensekvensen fra trinn 4.1. Klikk på Justeringer på høyre side, og deretter på Opprett ny justering. Last opp .ab1-filene hentet fra sekvenseringsleverandøren, velg DNA som nukleotidtype, og trykk på Neste.
   12. I det følgende vinduet velger du Multisequence og justeringsprogrammet Auto (MAFFT) før du klikker på Create alignment.
   13. Identifiser genotypene som har et homozygot prematur stoppkodon (som oppnådd med baseredaktører) på begge alleler. Behold de tilsvarende organoide klonene for å ekspandere, og kryokonservere disse for videre analyse. Ideelt sett bør tre forskjellige organoide kloner analyseres side om side for å omgå potensielle nuklease off-target effekter.

7. Ortotopisk transplantasjon av humane lacrimal kjertelorganoider i NSG-mus

1. Organoid forberedelse
   1. Humane organoider for tårekjertelen må deles ~3 dager før transplantasjonsdagen, som beskrevet i avsnitt 2. På transplantasjonsdagen må du sørge for at organoidene er i den proliferative fasen for å øke sjansene for engraftment.
   2. For å trekke ut organoider fra ECM, tilsett dispase til kulturmediet for å nå en endelig konsentrasjon på 0,125 U / ml. Bruk en P1 000 til å resuspendere ECM-dråpene grundig for å forstyrre dem, og plasser platen tilbake i 37 °C-inkubatoren i 30 minutter. Et volum på 100 μL ECM er tilstrekkelig til å injisere ~10 tårekjertler.
   3. Resuspender organoidene i 10 ml basemedium for å vaske ut enzymet. Pellet cellene ved 400 x g i 5 minutter.
   4. Resuspender cellene (~ 1.500.000) i 50 μL kaldt humant ekspansjonsmedium supplert med 5% ECM. Plasser organoidsuspensjonen på is, og fortsett umiddelbart til transplantasjonen.
2. Ortotopisk transplantasjon hos mus
   1. I dyreavdelingen, ha organoid suspensjon og insulinnåler på is. Aspirer organoidsuspensjonen i en kald insulinnål.
   2. Sedere en NOD scid gamma (NSG) immundefekt mus med 3% isofluran for å initiere anestesi. Når musen sover, plasser den raskt på siden med hovedtårekjertelen (plassert halvveis mellom øyet og øret) tilgjengelig.
   3. Injiser 5 μL av den organoide suspensjonen direkte gjennom huden inn i lacrimal kjertelen. Det maksimale volumet en mus lacrimal kjertel kan inneholde er 5 μL.
   4. La musen komme seg, og overvåk musen hver dag for å vurdere tilstedeværelsen av ubehag relatert til transplantasjonen, spesielt på øyet.
3. Vurder engraftment
   1. Ofre musen med O 2 / CO₂ -innånding etter opptil 90 dager, avhengig av om kortsiktig eller langvarig engraftment skal vurderes¹³.
   2. Dissekere tårekjertelen som beskrevet i avsnitt 1. Fiks det i 4% formalin i 24 timer på RT.
   3. Legg lacrimal kjertelen i en kassett. Dehydrer tårekjertelen ved å inkubere den som følger: 2 timer i 70% etanol, 2 timer i 96% etanol, 1 time i 100% etanol (2x), 2 timer i xylen og over natten i flytende parafin ved 58 ° C i ovnen.
   4. Neste dag, orienter lacrimal kjertelen som foretrukket i en metallisk form, fyll den opp med flytende parafin, og la blokken størkne på en kald overflate. Denne prosessen utføres best med en innebyggingsmaskin.
   5. Når parafinblokken er solid, kutt hele blokken i 4-5 μm seksjoner ved hjelp av en mikrotom. Hold alle delene (i form av bånd) i et tørt, trekkfritt miljø. Seksjonene kan holdes på ubestemt tid ved romtemperatur.
   6. Prøv en av hver 10 seksjoner som spenner over hele blokken.
      1. Monter seksjonene på et lysbilde som følger: legg en dråpe vann på lysbildet, plasser delen på toppen, la den hvile i ~ 2 min for å la den strekke seg på en 42 ° C kokeplate, og fjern vannet forsiktig med papir.
      2. Plasser skliene til tørk over natten i en ovn på 58 °C. Lysbildene kan holdes på ubestemt tid på RT forbi dette stadiet.
   7. For å skille humane celler fra museceller, utfør human nukleær antigenfarging på disse seksjonene. Rehydrer seksjonene ved å utføre følgende vasker: 3 min i xylen (2x), 1 min i 100% etanol (2x), 1 min hver i 96% etanol, 90% etanol, 80% etanol, 70% etanol, 60% etanol og 25% etanol, og til slutt, 1 min i demi vann (2x).
   8. Inkuber lysbildene i 15 minutter i PO-buffer (tilleggstabell 1). Vask lysbildene 3x i ultrarent vann.
   9. Utfør en sitratbasert antigenhenting i autoklaven:
      1. Plasser lysbildene i en autoklavsikker glideholder i en kurv fylt med citratbuffer (tilleggstabell 1). Plasser kurven i autoklaven, og kjør en autoklavsyklus (trykk: 10 PSI; temperatur: 121 ° C; tid: 15 min).
      2. Når autoklaven er trykkavlastet, hent kurven som inneholder lysbildene, og plasser den i et RT-vannbad for å bringe lysbildene til RT.
         MERK: Antigenhentingsstrategien avhenger av antistoffet som brukes. Se leverandørens datablad for å utføre den mest adekvate antigenhentingen.
   10. Plasser lysbildene horisontalt, med snittsiden opp, på en inkubasjonsskuff. Tilsett 500 μL blokkeringsbuffer inneholdende 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS på toppen, og inkuber i 1 time. Fjern blokkeringsbufferen.
   11. Forbered antistoffoppløsningen ved å tilsette 1 μL humant nukleolært antigenantistoff til 500 μL blokkeringsbuffer per lysbilde som skal farges. Legg til antistoffløsningen til hvert lysbilde. Inkuber over natten i et fuktet inkubasjonsbrett ved 4 °C.
   12. Neste dag, vask lysbildene 3x i PBS. Inkuber lysbildene med ufortynnet HRP anti-mus sekundært antistoff i 45 minutter. Vask lysbildene 3x i PBS.
       FORSIKTIGHET. Klargjør DAB-bufferen i en kjemisk ventilator (tilleggstabell 1). Inkuber lysbildene med DAB-buffer i 10 min. Kast avfall i beholdere for organisk kjemisk, flytende avfall.
   13. Vask lysbildene med vann. Inkuber lysbildene i 2 minutter i hematoksylin for å motvirke kjernene. Vask lysbildene i rennende vann fra springen i 10 min.
   14. Dehydrer lysbildene ved å inkubere dem i 1 min hver i 50% etanol, 60% etanol, 70% etanol, 80% etanol og 90% etanol, 1 min i 96% etanol (2x), 1 min i 100% etanol (2x) og 1 min i xylen (2x).
   15. Legg ved lysbildene med monteringsmedium og et deksel. Etter tørking i ca 20 minutter, følg lysbildene under et mikroskop.
   Jeg>

Representative Results

Etter disseksjon av musens tårekjertelen (figur 2A) genererte den enzymatiske og mekaniske fordøyelsen små vevsfragmenter, blant hvilke acini og kanaler kunne skilles (figur 2B). De resterende store vevsbitene ville destabilisere ECM, noe som ville redusere den første organoidutveksten. Musens lacrimal kjertelorganoidavledning var vellykket når cystiske organoider med ~ 500 μm diameter ble funnet etter ~ 7 dager, stadiet der organoidene var klare til å bli delt (figur 2C). Selv om den samlede organoidavledningen er vellykket, kan noen organoider begynne å vokse før de til slutt stopper. Humane lacrimal kjertelorganoider vokste ut som cyster innen 3-4 dager og nådde fullvoksen størrelse i 10-14 dager etter vevsisolering (figur 2D). For både mus og mennesker mislyktes organoid derivasjon noen ganger, med ingen eller få organoider som vokste ut; Dette var vanligvis forårsaket av overfordøyelse av vevet. Musens lacrimal kjertelorganoider kan passeres minst 40x og de menneskelige organoider minst 20x. Passasje ble gjort hver 7-10 dager i gjennomsnitt, avhengig av organoid vekst.

Figur 2 Etablering av organoider i tårekjertelen hos mus og mennesker. (A) Fotografier av de forskjellige stadier av mus lacrimal kjertel disseksjon. Pilen peker på lacrimal kjertelen under sin beskyttende membran. (B) Brightfield bilder av mus lacrimal kjertel celler rett etter vev fordøyelse, med innsatser som viser en acinus og en kanal. (C) Brightfield bilder av en vellykket og en mislykket mus lacrimal kjertel organoid derivasjon. (D) Brightfield-bilder av menneskelig organoidutvekst i løpet av 14 dager. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Lakrimalkjertelorganoidene inneholder en stor andel stamceller når de dyrkes i ekspansjonsmediet. For å øke differensieringsnivået satte vi opp en mus og et menneskelig differensieringsmedium med redusert vekstfaktorinnhold. Etter henholdsvis 5 dager og 7 dager, i differensieringsmediet, ble musen og humane lacrimal kjertelorganoider tettere (figur 3A-B). Denne morfologiske endringen korrelerte med økte funksjonelle egenskaper. Bruk av den sykliske AMP-aktivatoren forskolin eller nevrotransmitteren noradrenalin resulterte i organoid hevelse (dvs. apikal vannsekresjon) innen mindre enn 3 timer (figur 3C). Når hevelsen tok lengre tid enn 3-4 timer, tydet dette på at organoidene ikke var differensiert nok og/eller ikke uttrykte funksjonelle markører, slik som reseptorer for nevrotransmittere.

Figur 3: Differensiering av mus og humane lacrimal kjertelorganoider og funksjonell hevelsesanalyse i humane organoider. (A) Brightfield-bilder av mus lacrimal kjertelorganoider dyrket i ekspansjonsmedium i 7 dager og i differensieringsmedium i 5 dager etter 2 dager i ekspansjonsmedium. (B) Brightfield-bilder av humane lacrimal kjertelorganoider dyrket i ekspansjonsmedium i 11 dager og i differensieringsmedium i 9 dager etter 2 dager i ekspansjonsmedium. (C) Brightfield-bilder av differensierte humane tårekjertelorganoider utsatt for ferskt differensieringsmedium (kontroll), til 1 μM forskolin og til 100 μM noradrenalin i løpet av 3 timer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å slå ut Pax6 i musens lacrimal kjertelorganoider, ble et plasmid som inneholdt det valgte Pax6-målrettede gRNA generert ved PCR og ligering (figur 4A). Dette gRNA-holdige plasmidet ble elektroporert sammen med Piggy-Bac-plasmidene (hygromycinresistens transposonholdige og transposaseholdige plasmider) og C > T-baseredaktøren Cas9 i musens lacrimal kjertelorganoider dissosiert til enkeltceller. Etter 3 dager, da organoidene hadde gjenopprettet, ble de utsatt for hygromycin for å velge kloner som hadde innlemmet hygromycinresistenskassetten. I vellykkede elektroporasjoner vokste organoider som var resistente mot hygromycin ut (figur 4B). De voksende organoidklonene som var større enn ~ 300 μm ble plukket, ideelt sett før de begynte å spontant differensiere (figur 4C). DNA ble ekstrahert fra en del av organoiden mens resten ble holdt i kultur. PCR-amplifiseringen av Pax6-lokuset målrettet av gRNA ga et 367 bp-bånd for hver av klonene som ble valgt (figur 4D). Etter sekvensering av det forsterkede locus ble kloner som var homozygt C > T redigert (n = 1) beholdt. På den annen side ble kloner som ikke var redigert (n = 4), heterozygt redigert eller feilredigert (n = 1) kassert (figur 4E). Samlet sett, ved hjelp av dette gRNA rettet mot Pax6, ble det oppnådd en homozygot knock-out mus lacrimal kjertel klon av seks sekvenserte. Noen kloner vokste godt ut, men noen organoide kloner gikk tapt etter plukking eller begynte å differensiere (figur 4F). Av de 10 organoidklonene som ble plukket ut, vokste 7 godt ut.

Figur 4: Base editing-mediert knock-out av Pax6 i mus lacrimal kjertel organoider. (A) Sanger-sekvenseringsspor av pFYF1320 etter korrekt integrering av gRNA rettet mot Pax6-lokuset. (B) Brightfield-bilder av musens tårekjertelorganoider 5 dager etter eksponering for hygromycin etter elektroporering. Organoidene ble dyrket i museekspansjonsmedium. Til venstre er et eksempel på en mislykket elektroporering, uten klon som er resistent mot hygromycin som vokser ut. Til høyre er et eksempel på en vellykket elektroporering, med flere hygromycinresistente organoide kloner som overlever. (C) Brightfield-bilder av kloner som bør velges og kloner som ikke skal velges. (D) Agarosegel som viser forsterkningen av Pax6-lokuset målrettet med gRNA. I grønt er båndet med forventet størrelse på 367 bp uthevet. (E) Sanger-sekvenseringsspor av tre organoide kloner som var resistente mot hygromycin. Den øverste klonen er uredigert. Den midterste klonen er en homozygot C > T-utgave og dermed en homozygot knock-out. Den nederste klonen presenterer to heterozygote punktmutasjoner og er enten en heterozygot knock-out eller en blandet klone og har blitt feilredigert. (F) Brightfield-bilder av de plukkede organoidklonene med forskjellige nivåer av utvekst. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Til slutt, for å utføre human lacrimal kjertel organoid ortotopisk transplantasjon hos mus, ble organoider som ble delt 3 dager i forveien (< 100 μm i diameter) brukt. Organoid transplantasjon ble bekreftet 1 måned etter injeksjon av organoidene i musens lacrimal kjertel ved farging for en humanspesifikk markør, det humane nukleolære antigenet (figur 5). Fraværet av punktert farging fra alle delene av musens lacrimal kjertel betydde mangel på menneskelig organoid engraftment.

Figur 5: Transplantasjon av humane lakrimalkjertelorganoider i musens tårekjertel. Farging av transplanterte mus lacrimal kjertler for den humane nukleolære markøren for å overvåke engraftment 1 måned etter transplantasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggstabell 1: Mediesammensetning og buffere. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Denne protokollen beskriver etablering og bruk av lacrimal kjertelorganoider for funksjonelle analyser, mutasjonsmodellering og transplantasjon. Når du etablerer mus og humane lacrimal kjertelorganoider, er vevsdissosiasjon avgjørende. Hvis vevet ikke er tilstrekkelig fordøyd, vil organoidutbyttet være lavt. Hvis vevet er overfordøyd, vil cellene dø og ikke vokse ut som organoider. Hvert vev skal fordøyes med et spesifikt enzym i en bestemt tid for å sikre optimal organoid utvekst^14,17,18. Lakrimalkjertelen er et ganske mykt vev for hvilket en kollagenasefordøyelse på 5-10 minutter kombinert med pipetteringsbasert mekanisk dissosiasjon er tilstrekkelig til å isolere små biter av vev. Hvis enkeltceller må oppnås for applikasjoner som enkeltcelle RNA-sekvensering, kan dissosiasjonen utføres lenger til enkeltcellestadiet er nådd, men dissosiasjon bør stoppes så snart enkeltceller er oppnådd for å begrense enhver reduksjon i levedyktighet. Siden vevsdissosiasjon er så avgjørende, er overfordøyelse den mest sannsynlige årsaken til svikt i lacrimal kjertelorganoid etablering.

Riktig vedlikehold av lacrimal kjertelorganoider er viktig for deres bruk. Langsiktig vedlikehold er et kjennetegn på voksne stamcelleavledede lacrimal kjertelorganoider, sammenlignet med induserte pluripotente stamcelleavledede organoider ^7,17. For å oppnå langsiktig vedlikehold bør regelmessig organoidsplitting og middels endringer utføres. Uten dette begynner organoider å differensiere og utvikle redusert stamcellepotensial, noe som hemmer deres langsiktige vedlikehold⁷. På dette trinnet igjen, kan over-fordøyelsen drepe stamceller og svekke organoid vedlikehold. For regelmessig vedlikehold er det ikke nødvendig med organoid dissosiasjon i enkeltceller. For å generere klonale knock-out organoide linjer er det imidlertid viktig å begynne med enkeltceller. Hvis ikke, vil organoidene bestå av en mosaikk av celler med forskjellig genetisk bakgrunn, noe som gjør det umulig å analysere effekten av en enkelt, definert mutasjon. Her beskriver vi bruken av en C- > T-baseeditor for å generere stoppkodoner. Denne genomeditoren er avhengig av tilstedeværelsen av arginin-, glutamin- eller tryptofankodoner innen 12-18 baser fra en NGG PAM. Når disse betingelsene ikke er oppfylt ved utforming av et gRNA, kan konvensjonelle Cas9- eller C >T-baseredigerere med alternative PAM-er brukes ^7,18. Imidlertid introduserer konvensjonell Cas9 dobbeltstrengede brudd som resulterer i indels ved reparasjon¹¹. Siden begge allelene kan ha forskjellige indels, krever klonegenotyping ekstra forsiktighet. Dekonvolusjon av de innførte modifikasjonene bør utføres for å sikre at begge allelene inneholder indels utenfor rammen, og dermed at organoidklonene blir slått ut for genet som er målrettet¹⁹. Fordelen med C- > T-baseredaktører ligger i det faktum at de kan brukes til å modellere punktmutasjoner som ikke nødvendigvis resulterer i stoppkodoner. For eksempel kan de brukes til å modellere spesifikke Pax6-mutasjoner funnet hos pasienter med aniridia for å studere deres innvirkning på lacrimal kjertelfysiologi²⁰.

Lakrimalkjertelen utskiller den vandige delen av tårfilmen¹. Tåresekresjon kan rekapituleres i humane organoider etter differensiering mediert av vekstfaktoruttak og NOTCH-hemming. Under disse forholdene gjennomgår organoider terminal differensiering og kan ikke opprettholdes ytterligere. Likevel kan differensierte lacrimal kjertelorganoider lede utviklingen av tårefremkallende stoffer i sammenheng med tørr øyesykdom, potensielt i skjermbilder med høy gjennomstrømning. Riveanalysen som presenteres i denne protokollen er den som for tiden gir den største endringen i organoidstørrelse på kort tid, noe som gjør det lettere å kvantifisere i sammenheng med en narkotikaskjerm ^7,9,17.

Stamcellebehandling har stort løfte om lacrimal kjertel regenerering i tørr øyesykdom²¹. Voksne stamcelleavledede lacrimal kjertelorganoider kan være et kildemateriale for slike applikasjoner. Protokollen som presenteres her resulterer i human lacrimal gland organoid engraftment, hovedsakelig som cyster. Lav organoid engraftment kan oppstå på grunn av organoider som injiseres på feil sted. Trening av injeksjonsprosedyren med et fargestoff gjør det mulig å spore injeksjonsstedet og til slutt forbedre injeksjonsnøyaktigheten. Alternativt kan musepidermis snittes til å ha direkte tilgang til tårekjertelen, slik det gjøres hos rotter før²². Denne metoden tar lengre tid, men kan være mer nøyaktig. På den annen side, med den nåværende protokollen, ble organoidene ikke funksjonelt integrert i musens lacrimal kjertel. Lignende resultater er observert for iPSC-derivert tårekjerteltransplantasjon²². Transplantasjonsmetoden kan forbedres ytterligere ved å skade tårekjertelen på forhånd, ved hjelp av en tørr øyemusemodell og / eller injisere organoider som enkeltceller eller små klumper. Likevel kan voksne stamcelleavledede lacrimal kjertelorganoider og tilhørende verktøykasse være grunnlaget for fremtidige anvendelser i lacrimal kjertelforskning og regenerativ medisin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL safe-lock centrifuge tubes	Eppendorf	EP0030 120.094
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637	CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 °C
5x green GoTaq Flexi buffer	Promega	M891A	Store at -20 °C
A83-01	Tocris	2939	Store at -20 °C, stock at 30 mM, 10000x
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	store at 4 °C
Agar plates containing Ampicillin	Hubrecht Institute
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Autoclave VAPOUR-Line lite	VWR chemicals
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	Store at -20 °C, 50x
BD Micro-Fine insulin needle 1 mL	BD Bioscience	324825
Benchtop microscope DMI1	Leica
Bovine serum albumine (BSA)	MP biomedicals	160069	Store at 4 °C
BTXpress	BTX	MDS450805
C57BL/6 mice	Hubrecht Institute
Cassettes	Klinipath	410-02S
CellBanker 1	amsbio	11910	Cryopreservation medium, adhere to instructions
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid monohydrate	J.T. Baker	0088	CAS: 5949-29-1
Collagenase I	Sigma Aldrich	C9407	Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 °C
Conical tubes 15 mL	Greiner Bio-One	5618-8271
Conical tubes 50 mL	Corning	CLS430828-500EA
Coverslips 24 mm x 50 mm	Menzel-Gläzer	BB024050S1
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix	R&D Systems, Bio-Techne	3533-001-02	Store at -20 °C, keep at 4 °C for up to 1 month
DAPT	Sigma Aldrich	D5942	Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x
Disodium hydrogen phosphate anhydrous	VWR chemicals	28026.292	CAS: 7558-79-4
Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate	Sigma-Aldrich	71643	CAS:10028-24-7
Dispase	ThermoFisher Scientific	17105-041	Aliquots at 50 U/mL, store at -20 °C until use, 400x
Disposable Scalpel Sterile N° 10	Swann Morton	3033838
DM4000 microscope	Leica
dNTPs 25 mM	Promega	U1420	Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 °C
Dpn1	New England Biolabs	R0176
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)	Gibco	14190144	1x
Easy strainers 70 µm	Greiner	542170
Electroporation cuvette	Nepagene	EC002S
EnVision+/HRP mouse	Agilent	K400111-2
Ethanol 100%	BOOM	84045206;5000	CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions
Ethanol 70%	BOOM	84010059.5000	CAUTION
Ethanol 96%	BOOM	84050065.5000	CAUTION
EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific		Live-imaging brightfield microscrope
FGF10	Peprotech	100-26	Store at -20 °C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x
Fiji	NIH, Fiji developers
Formaldehyde solution 4%	Sigma-Aldrich	1.00496	CAS: 50-00-0, CAUTION
Forskolin	Tocris	1099	Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x
Glutamax	Gibco	35050-061	100x
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase	Promega	M7805	Store at -20 °C
Haematoxylin	VWR chemicals	10047105	Store at room temperature
HEPES	Gibco	15630-080	Store at 4 °C, 100x
Histocore H and C, Tissue embedding machine	Leica
Hot plate	Meidax
Human nucleolar antigen antibody	Abcam	ab-190710
Hydrochloric acid 5 N	ThermoFisher Scientific	10605882	CAS: 7647-01-0, CAUTION
Hydrogen peroxyde 30%	Chem-lab	CL00.2308.1000	CAS: 7722-84-1, CAUTION
Hygromycin B-gold	InvivoGen	ant-hg	Stock at 100 mg/µL, 1000x
Hygromycin resistance cassette-containing plasmid			Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
IsoFlo 100%	Mecan	5960501
LB medium	Hubrecht Institute
MgCl2 25 mM	Promega	A351H	Store at -20 °C
Microtome RM2235	Leica
Midiprep DNA isolation kit	ThermoFisher Scientific	K210005
Miniprep DNA isolation kit	ThermoFisher scientific	K210003
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Store at -20 °C, stock at 500 mM, 400x
NEPA21 electroporator	Nepagene
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636	Store at -20 °C, stock at 1M, 100x
NOD Scid Gamma (NSG) mice	Hubrecht Institute colony
Noggin conditioned medium	U-Protein Express	Custom order	Store at -20 °C
Noradrenaline	Sigma Aldrich	A7257	Store at -20 °C, stock at 100 mM
Oven	Memmert		Set at 58 °C
P20, P200 and P1000 pipettes	Gilson
Paraffin	VWR chemicals	10048502
Pasteur pipettes, glass plugged	ThermoFisher Scientific	1150-6973
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG	IDT
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC	IDT
pCMV_ABEmax_P2A_GFP	Addgene	112101
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Store at -20 °C
Pertex	Klinipath	AM-08010
pFYF1320	Addgene	47511
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	1000X, store at -20 °C
Prostaglandin E2 (PGE2)	Tocris	2296	Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x
Petri dish, 10 cm	Greiner	633102
Q5 buffer	New England Biolabs	B9027S
Q5 high-fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0491S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QuickExtract DNA Extraction Solution	Lucigen	QE09050	Store aliquots at -20 °C
R-spondin 3 conditioned medium	U-Protein Express	Custom order	Store at -20 °C
sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG	IDT
Slides	StarFrost	MBB-0302-55A	Adhesive, ground
Sodium azide	Merck	8.22335.1000	CAS: 26628-22-8, CAUTION
Sodium cytrate dihydrate	J.T. Baker	0280	CAS: 6132-04-3
Standard Forward Primer: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC	IDT
Subcloning efficiency competent cells DH5alpha	Invitrogen	18265-017
Suspension cell culture plates (24-well)	Greiner Bio-One	662102	24-well
Suspension cell culture plates (12-well)	Greiner Bio-One	665102	12-well
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202
TAE buffer	ThermoFisher Scientific	B49	Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water
Transposase-containing plasmid			Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
TrypLE Express Enzyme	Invitrogen	12605-028	store at 4 °C
U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT	IDT
UltraPure Agarose 1000	Invitrogen	16550
Water bath	Tulabo
Xylene	Klinipath	4055-9005	CAS: 1330-20-7, CAUTION
Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dihydrochloride	Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x