Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fare ve İnsan Lakrimal Bezi Organoidlerinin Kurulması, Bakımı, Farklılaşması, Genetik Manipülasyonu ve Transplantasyonu

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/65040
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), University Medical Center Utrecht, 2Oncode Institute, Hubrecht Institute

Summary

Bu protokol, birincil fare ve insan dokusundan türetilen lakrimal bez organoidlerinin nasıl kurulacağını, sürdürüleceğini, genetik olarak değiştirileceğini, farklılaştırılacağını, fonksiyonel olarak karakterize edileceğini ve nakledileceğini açıklar.

Abstract

Lakrimal bez oküler yüzey homeostazı için gerekli bir organdır. Gözyaşı filminin sulu kısmını üreterek gözü kuruma stresinden ve dış hakaretlerden korur. Yeterli in vitro modellerin bulunmaması nedeniyle lakrimal bez (pato) fizyolojisi hakkında çok az şey bilinmektedir. Organoid teknolojisi, birden fazla organ için yararlı bir deneysel platform olarak kendini kanıtlamıştır. Burada, lakrimal bez biyopsilerinden başlayarak fare ve insan lakrimal bezi organoidlerini oluşturmak ve sürdürmek için bir protokol paylaşıyoruz. Kültür koşullarını değiştirerek, lakrimal bez organoid işlevselliğini arttırıyoruz. Organoid işlevselliği, lakrimal bez organoidlerinin lümenlerinde gözyaşı salınımını tetiklemek için seçilen nörotransmitterlere maruz bırakılmasını içeren bir "ağlama" testi ile araştırılabilir. Bu fenomenin nasıl görüntüleneceğini ve ölçüleceğini açıklıyoruz. Lakrimal bez homeostazında ilgilenilen genlerin rolünü araştırmak için, bunlar genetik olarak değiştirilebilir. Kılavuz RNA tasarımından organoid klon genotiplemesine kadar baz editörleri kullanarak lakrimal bez organoidlerinin genetik olarak nasıl değiştirileceğini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Son olarak, fareye ortotopik implantasyon ile insan lakrimal bezi organoidlerinin rejeneratif potansiyelinin nasıl araştırılacağını gösteriyoruz. Birlikte, bu kapsamlı araç seti, lakrimal bez (pato) fizyolojisini incelemek için fare ve insan lakrimal bezi organoidlerini kullanmak için kaynaklar sağlar.

Introduction

Lakrimal bez, gözyaşı filmi1'in sulu tabakasının çoğunun üretilmesinden sorumlu glandüler epiteldir. Gözyaşı filminin sulu tabakası sadece oküler yüzeyi yağlamak için su içermez, aynı zamanda oküler yüzeyi enfeksiyonlardan koruyan geniş bir antimikrobiyal bileşen repertuarıiçerir 2. Lakrimal bez hasar gördüğünde veya iltihaplandığında, kuru göz hastalığı oluşur, bu da hastalar için rahatsızlığa neden olur ve sonunda görme kaybına yol açabilir3. Yıllar geçtikçe, lakrimal bezi, özellikle de insan bezini incelemek için model sistemler 4,5,6 ile sınırlandırılmıştır. Bu, fizyolojik ve patolojik koşullar altında lakrimal bez fonksiyonu ile ilgili bilgi boşluğuna katkıda bulunmuştur.

Son zamanlarda, bir tabaktaki lakrimal bezi incelemek için in vitro modeller geliştirilmiştir 7,8,9. Bu lakrimal bez organoidleri, in vitro7 rejeneratif kapasitelerini sürdüren bir büyüme faktörleri kokteyli ile desteklenmiş, hücre dışı bir matrikste üç boyutlu yapılar olarak yetiştirilen yetişkin kök hücrelerden türetilir. Yetişkin kök hücre (ASC) kaynaklı organoidlerin avantajı, sağlıklı doku özelliklerini özetlerken çok uzun süre korunabilmeleridir. Bu tip organoid, örneğin stromal hücreler de içerebilen indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı organoidlerin aksine, yalnızca epitel hücrelerinden oluşur. Pluripotent kök hücre (PSC) türevi organoidlerin aksine, ASC organoidleri doğrudan yetişkin dokudan kurulur ve genişletilmesi için herhangi bir genetik modifikasyon gerektirmez. ASC organoidleri yetişkin özelliklerini ifade eder10.

Bu protokol, fare ve insan birincil dokusundan lakrimal bez organoidlerini türetmek için bir araç kutusu içerir. Protokol, basit büyüme faktörü çekilmesi ile organoidlerin işlevselliğinin nasıl daha da artırılacağını ve bir şişme testi yaparak organoidlerin gözyaşı sıvısı salgılaması için nasıl kışkırtılacağını açıklar. Bu protokol ayrıca, CRISPR türevi baz editörlerini kullanarak fare organoidlerini genetik olarak mühendislik yapmak için elektroporasyon tabanlı bir transfeksiyon yöntemi içerir. Geleneksel Cas9'dan farklı olarak, baz editörlerinin kullanımı, çift sarmallı bir kırılma11,12 üretmeden genomdaki tek bazların modifikasyonuna izin verir. Son olarak, insan lakrimal bezi organoidlerinin immün yetmezlikli farelere ortotopik transplantasyonu ve ardından engraftmanın histolojik değerlendirmesi anlatılmaktadır. Bu lakrimal bez organoid araç kiti, lakrimal bez rejenerasyonu ve fonksiyonu ile ilgili araştırmalarda ve genetik ve enflamatuar hastalık modellemesinde kullanılabilir.

Protocol

Fare deneyleri, Hollanda Kraliyet Sanat ve Bilim Akademisi (KNAW) Hayvan Etik Komitesi tarafından AVD8010020151 proje lisansı altında onaylandı. Organoidler fare fazlası materyalden türetilmiştir. İnsan lakrimal bez biyopsileri, 18-740 protokol numarası altında tıbbi etik kurul tarafından onaylandıktan sonra Utrecht Üniversitesi Tıp Merkezi'nde (UMCU) ameliyat edilen hastaların atık materyallerinden toplandı. Protokol, Şekil 1'de özetlenen birkaç bölüm içerir.

Figure 1
Şekil 1: Protokole genel bakış. Bu şekil, protokolün farklı adımlarını vurgulamaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

NOT: Tüm ortam ve tampon bileşimleri Ek Tablo 1'de açıklanmıştır.

1. Fare ve insan lakrimal bezlerinden organoidlerin kurulması

  1. Fare lakrimal bezinin diseke edilmesi
    1. Makas, forseps ve diseksiyon pedleri dahil olmak üzere diseksiyon aletlerini hazırlayın. Bir fareyi O2 / CO2 inhalasyon13 ile ötenazi yapın.
    2. Ötanazi fareyi diseksiyon pedindeki karnına yerleştirin ve uzuvlarını sabitleyin. Fare kulakları arasında ve alnında bulunan saçları% 70 etanol kullanarak ıslatın.
    3. Diseksiyon makası kullanarak, kulaklar arasında kafatasının arkasında bir açıklık açın. Bu açıklığı alnın üzerinden buruna kadar uzatın. Hala makas kullanarak, iki kanat oluşturmak için cildi kulakların arkasından kesin.
    4. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, lakrimal bezler açığa çıkana kadar flepleri buruna doğru sıkıca çekin. Kanatları diseksiyon pedine sabitleyin. Makas kullanarak, lakrimal bezi tamamen açığa çıkarmak için lakrimal bezin üzerinde bulunan zarda küçük bir kesi yapın.
    5. Forsepsleri kullanarak lakrimal bezi çekin. Ana lakrimal kanal yırtılana kadar biraz direnç gösterilmelidir. İsterseniz, ana lakrimal kanalı doğrudan makasla kesin.
    6. Fare lakrimal bezini daha sonraki işlemlere kadar doku kültürü sınıfı PBS'ye yerleştirin. Hücre ölümünü sınırlamak için lakrimal bezi 2-4 saat içinde işlemeye devam edin. Bu daha uzun sürerse, fare lakrimal bezini biyopsi toplama ortamına yerleştirin (Ek Tablo 1).
      NOT: Çok sayıda organoide hemen ihtiyaç duyulursa birkaç lakrimal bez havuzlanabilir.
  2. İnsan lakrimal bezi biyopsilerinin toplanması
    1. Ameliyattan önce, 50 mL'lik bir tüpte 20 mL alikot biyopsi toplama ortamı (Ek Tablo 1) hazırlayın ve bunu ameliyattan önce cerraha verin. Bu ortam birkaç ay boyunca 4 ° C'de tutulabilir.
    2. Ameliyat gününde, cerrahın lakrimal bezin bir parçasını (genellikle <1 mm3) örneklemesine ve 4 ° C'de biyopsi toplama ortamında (Ek Tablo 1) saklamasına izin verin.
    3. En kısa sürede işlemek için biyopsiyi toplayın. İdeal olarak, bu biyopsi örneklemesinden sonraki 2 saat içinde aynı gün olmalıdır.
  3. Organoid türetme
    1. Aşağıdakileri önceden hazırlayın: çözülmüş hücre dışı matris (ECM), oda sıcaklığı (RT) fare veya insan genleşme ortamı (Ek Tablo 1), çözülmüş kollajenaz, taban ortamı (Ek Tablo 1), iki neşter, bir adet 10 cm'lik Petri kabı, 15 mL'lik bir tüpe takılı 70 μm'lik bir süzgeç ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de önceden ısıtılmış 12 kuyucuklu süspansiyon plakaları.
    2. Ek Tablo 1'de gösterilen tüm bileşenleri birleştirerek sindirim ortamını hazırlayın. Doku parçalarının yapışmasını önlemek için neşterleri bu ortamda önceden ıslatın.
    3. Fare veya insan lakrimal bez dokusunu ortamdan alın ve Petri kabına yerleştirin.
    4. Önceden ıslatılmış neşterleri kullanarak dokuyu kıyın. Doku parçaları çok küçük olduğunda (yani, <0,5 mm3), neşterle Petri kabından kazıyarak sindirim ortamına yerleştirin. İnsan biyopsisi zaten çok küçükse, doku kaybını önlemek için kıyma yapmadan doğrudan sindirim ortamına yerleştirin.
    5. Doku parçalarını 37 ° C'lik bir su banyosunda 15 dakikaya kadar inkübe edin. Parçaları yeniden askıya almak için 15 mL'lik tüpü düzenli olarak ters çevirin. Dokuyu aşırı sindirmemek için hücre ayrışmasını tezgah üstü mikroskop altında izleyin.
    6. Bu arada, bir Pasteur pipetini, dönerken ucunu bir aleve yerleştirerek daraltın ve taban ortamında önceden ıslatın. Dokuyu verimli bir şekilde ayrıştırmak için, deliğin kalan en büyük doku parçalarından biraz daha küçük olduğundan emin olun. Ayrışma işlemini kolaylaştırmak için, karışımı her 5 dakikada bir, önceden ıslatılmış daraltılmış Pasteur pipet ile yukarı ve aşağı doğru pipetin.
    7. Mikroskop altında birçok tek hücre ve küçük kümeler göründüğünde, baz ortamın 10 mL'sini ekleyerek ayrışmayı durdurun. Hücreleri pelet etmek için 5 dakika boyunca 400 x g'de döndürün.
    8. Süpernatanı çıkarın ve yıkamayı tekrarlamak için pelet baz ortamın 10 mL'sinde tekrar askıya alın. ECM'nin yeterli polimerizasyonunu önleyecek büyük sindirilmemiş doku parçalarını ve kalan kollajen liflerini çıkarmak için 70 μm'lik bir süzgeçten geçirin. Elüatı 5 dakika boyunca 400 x g'de döndürün.
      NOT: Kırmızı hücre peleti, normalde organoid türetmeyi engellemeyen kırmızı kan hücrelerinin varlığını gösterir. Bununla birlikte, akış sitometrisi gibi bazı uygulamalar için, kırmızı kan hücreleri lize edilmelidir. Bunun için, hücreleri 5 dakika boyunca RT'de 5 mL taze kırmızı kan hücresi lizis tamponunda inkübe edin ve hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g'de pelet edin.
    9. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini tek bir fare lakrimal bezi için 100 μL soğuk ECM'de ve insan biyopsisi için 50 μL soğuk ECM'de yeniden askıya alın. Yeniden askıya alırken, kabarcıklar yapmamaya dikkat edin, çünkü bunlar ECM polimerizasyonunu ve stabilitesini de etkiler.
    10. 12 delikli bir süspansiyon plakasının kuyucuğu başına 100 μL'ye kadar hücre tohumu. Kuyuda ~ 20 μL damlacıklar yapmak için bir P200 kullanın. Damlacıklar ne kadar küçük olursa, büyüme faktörlerinin ve besin maddelerinin matris boyunca difüzyonu o kadar iyi olur.
    11. ECM'nin katılaşmasını sağlamak için plakayı 20-30 dakika boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre baş aşağı yerleştirin.
    12. ECM katılaştıktan sonra, 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğu başına ~1 mL RT fare veya insan genleşme ortamı ekleyin. Organoidler 300 μm'lik bir boyuta ulaşana kadar ortamı her 2-3 günde bir yenileyin. Bunun için, ortamı kuyuya aspire edin ve ECM damlacıklarına dokunmadan kuyunun yan tarafına yavaşça genleşme ortamı ekleyin, böylece onları bozmayın.
      NOT: Primosin (100 mg/mL; ticari stoktan 1:1.000), bakteriyel kontaminasyon meydana gelirse izolasyon üzerine eklenebilir. Bununla birlikte, organoid büyümesini de yavaşlattığı için, bir veya iki pasajdan sonra eklenmemesi veya çıkarılması tercih edilir.

2. Fare ve insan lakrimal bezi organoidlerinin genişletilmesi

  1. Fare organoidleri için ~ 7 gün ve insan organoidleri için ~ 10 gün sonra, organoidler ~ 300 μm'lik bir boyuta ulaştığında, kültür ortamını çıkarın.
  2. Organoidleri içeren ECM damlacıklarını 1 mL tripsin çözeltisinde, damlacıklar parçalanana kadar bir P1.000 ile kuvvetli bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyerek tekrar askıya alın. Bu karışımı 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda kısa bir süre inkübe edin.
  3. 2-3 dakika sonra, organoid süspansiyonu 10x-15x yukarı ve aşağı borulamak için daraltılmış ve önceden ıslatılmış bir Pasteur pipet kullanın. Organoidlerin ayrışma durumunu bir tezgah üstü mikroskop altında kontrol edin; ~ 20 hücreden oluşan küçük kümeler elde edilmelidir. 37 °C su banyosunda daha uzun süre inkübe edin ve ayrışma tatmin edici olana kadar pipetleme adımını tekrarlayın.
    NOT: Bu adım, çok katmanlı oldukları için insan organoidleri için daha uzun sürebilir. Tek hücreler üretilecek; Bu, organoid süspansiyonun çoğu küçük kümelerden oluştuğu sürece organoid büyümesini etkilemez.
  4. Baz ortamın 10 mL'sini ekleyerek ayrışmayı durdurun. Daha sonra, hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g'de pelet haline getirin.
  5. Organoidlerin üzerine uzanabilecek süpernatant ve ECM'yi (organoidler olmadan şeffaf, jöle benzeri tabaka) çıkardıktan sonra, adım 1.3.10'da belirtildiği gibi bir süspansiyon plakasına kaplamadan önce hücreleri uygun bir soğuk ECM hacminde yeniden askıya alın.
    NOT: Genel olarak, fare lakrimal organoidleri 1: 5 oranında ve insan organoidleri 1: 3 oranında bölünür. Bu, 100 μL ECM'de bulunan organoidlerle başlarken, bölünmeden sonra sırasıyla 500 μL ve 300 μL'de yeniden askıya alınmaları gerektiği anlamına gelir.
  6. ECM'nin katılaşmasına kadar plakayı 37 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca baş aşağı inkübe edin ve organoidleri RT'de fare veya insan genleşme ortamı ile örtün.

3. Fare ve insan lakrimal bezi organoidlerini koruyan kriyopreservasyon

  1. Organoidleri kriyoproteksiyona tabi tutmak için, önce genleşme ortamındaki organoidleri bölüm 2'de verilen talimatlara göre bölün.
  2. Yaklaşık 3-4 gün sonra, organoidler büyüme aşamasındayken, ortamı çıkarın ve 10 mL soğuk baz ortamında organoidler içeren ECM'nin 100 μL'sini yeniden askıya alın. ECM'nin ayrışmasına yardımcı olmak için 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bu işlemi kolaylaştırmak için tüpü düzenli olarak çevirin.
  3. Organoidleri 5 dakika boyunca 500 x g'de peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve organoid peleti 1 mL kriyoprezervasyon ortamında yeniden askıya alın (artık ECM kriyoprezervasyonu bozmaz). Organoid süspansiyonu bir kriyoviyal ve hemen -80 ° C'lik bir dondurucuya aktarın.
    NOT: Malzeme Tablosunda açıklanan kriyoprezervasyon ortamını kullanırken, kriyovyaller süresiz olarak -80 ° C'lik bir dondurucuda tutulabilir. Başka bir kriyoprezervasyon ortamı kullanılıyorsa, optimum korumayı sağlamak için kriyoviyal 24 saat sonra bir sıvı azot tankına aktarın.
  4. Organoidleri çözmek için, kriyoviyal dondurucudan alın ve kuru buz üzerinde 37 ° C'lik bir su banyosuna taşıyın. İçeriğinin çoğu çözülene kadar kriyoviyal suda tutun. İçeriği 10 mL baz ortamı içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g'de döndürün.
  5. Organoidleri, adım 2.5 ve adım 2.6'da açıklandığı gibi, genleşme ortamı ile 100 μL ECM'de kaplayın.

4. Lakrimal bez organoidlerinin ayırt edilmesi ve işlevselliğinin değerlendirilmesi

  1. Organoid farklılaşma
    1. Lakrimal bez organoidlerini ayırt etmek için, önce genleşme ortamındaki organoidleri bölüm 2'deki talimatlara göre bölün.
    2. 2 gün sonra, genişletme ortamını adım 1.3.12'de açıklandığı gibi fare veya insan farklılaştırma ortamıyla değiştirin. Fare organoidlerini bu ortamda 5 gün ve insan organoidlerini 9 gün boyunca korumak için ortamı her 2-3 günde bir yenileyin.
    3. Diferansiyasyon ortamında 5 gün veya 9 gün sonra organoid farklılaşmasını değerlendirmek için, RNA'yı çıkarmak için organoidler içeren 100 μL ECM toplayın. Bunu yapmak için, ECM damlacıklarını bir P1.000 kullanarak kuyuda bulunan 1 mL ortamdaki yeniden askıya alın ve organoid süspansiyonu 3 mL buz gibi soğuk baz ortamına aktarın. Organoidleri 5 dakika boyunca 500 x g'de peletleyin.
    4. Süpernatanı atın ve peleti RNA ekstraksiyon tamponunda yeniden askıya alın. Aşağı akış RNA ekstraksiyonunu, RNA ekstraksiyon kitinin talimatlarına göre gerçekleştirin. Örneğin, elde edilen RNA'yı, kök hücrelerin (TP63, KRT5, KRT14) ve farklılaşmış hücre belirteçlerinin (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2...) ekspresyonunun RT-qPCR analizi için kullanın. 14.
      NOT: İlgili ekspresyon analizini elde etmek için, seçilen belirteçlerin ekspresyonunu bir veya birkaç doku örneğinde ölçün. Farklılaşma koşulları altında kültürlenen organoidler daha az RNA içerme eğilimindedir.
  2. Fonksiyonel şişlik testi
    NOT: Protokolün bu kısmı için, en az 7 gün boyunca farklılaşmış insan lakrimal bezi organoidlerini kullanın. Fonksiyonel yırtılma için yeterli belirteç ekspresyonunu sağlamak için gereken minimum süre 7 gündür. 12 delikli bir plakanın her bir kuyusu bir koşul oluşturur. Minimum koşul sayısı üçtür: pozitif kontrol, negatif kontrol ve test koşulu.
    1. Taze olarak, lakrimal bez organoidleri tarafından salgılanmayı indükleyen bireysel bileşenler içeren 1 mL insan farklılaşma ortamı hazırlayın. Örneğin, 100 μM noradrenalin ve 1 μM forskolin ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: Forskolin, genellikle maksimum şişmeye neden olan pozitif bir kontrol görevi görür.
    2. Otomatik bir parlak alan hızlandırılmış mikroskopta, plakada görüntülenecek konumları, zaman aralığını (5 dakika) ve süreyi (4 saat) ayarlayın. ECM damlacığının tamamının her konumda görünür olduğundan emin olun.
    3. Görüntülemeye başlamadan hemen önce ve plakayı mikroskoptan hareket ettirmeden, kültür ortamını görüntülenecek kuyucuklardan çıkarın ve adım 4.2.1'de hazırlanan iyi askıya alınmış ortamla değiştirin. Negatif bir kontrol olarak, yalnızca farklılaşma ortamı ile değiştirilen farklılaşma ortamına sahip bir kuyuyu dahil edin, çünkü orta tazeleme bazı organoid şişmeyi tetikleyebilir.
    4. 4 saate kadar sonra, şişme testi biter. Sonuçları analiz edin.
      NOT: Bu adımlar, otomatik parlak alan hızlandırılmış görüntülemeye izin veren bir EVOS M7000 mikroskobu ile gerçekleştirilir. Bu mikroskop için, hızlandırılmış görüntülemeyi ayarlamak üzere ayrıntılı üreticinin el kitabına bakın. Not olarak, benzer özelliklere sahip başka herhangi bir mikroskop kullanılabilir.
    5. Organoid şişmesini ölçmek için, her bir organoidin çapını 0 saat ve 4 saatte ölçün. Tek bir organoid damlacığın görüntülerini ImageJ'de 0 saat ve 4 saatte açın.
    6. Araç çubuğundaki Düz çizgi simgesine tıklayın ve önce bir organoidin çapını 0 saatte çizin. Ardından, bu çizginin uzunluğunu ve dolayısıyla şişmeden önceki organoid çapı ölçmek için ImageJ'deki (Analiz > Ölç) Ölçüm aracını kullanın. Şişlikten sonra organoid çapını elde etmek için işlemi aynı organoid üzerinde 4 saatte tekrarlayın.
    7. Şişme tahlilinden önce ve sonra durum başına ~ 20 organoidin organoid çapını ölçün.

5. Pax6'yı nakavt etmek için bir plazmid inşa etmek

  1. nakavt etmek için gRNA tasarımı Pax6 C > T tabanlı editörleri kullanma
    NOT: gRNA tasarımı için birçok yazılım programı mevcuttur. Burada, entegre gRNA tasarımına, ek açıklamaya ve Sanger izlerinin hizalanmasına izin verdiği için Benchling kullanılmıştır. Bu nedenle, sonraki tüm adımlar alternatif yazılım programları kullanılarak da gerçekleştirilebilir.
    1. Yeni (+) > DNA Dizisi > DNA Dizilerini İçe Aktar'a tıklayarak hedef geni Benchling'de görselleştirerek gRNA tasarım sürecine başlayın.
    2. Veritabanından İçe Aktar sekmesinde, ilgilendiğiniz geni (Pax6) yazın ve Ara'ya basın.
    3. Fare referans genomu GRCm38'in (mm10, Mus musculus) en yeni yapısını seçin ve İçe Aktar'a basın.
    4. Aşağıdaki kurallara bağlı kalarak nakavt gRNA'nın tasarlanabileceği ekzonu seçin:
      1. İlk kodlama ekzonuna bir gRNA koymaktan kaçının, çünkü sonraki ekzonlardaki alternatif başlangıç bölgeleri, hücre tarafından erken indüklenen durdurma kodonunu atlatmak için kullanılabilir.
      2. Pax6 mRNA'nın eklenmesiyle oluşabilecek tüm alternatif transkriptlerde bulunan ekzonlardaki gRNA'ları tasarlayın. Bunu sağlamak için, Ensembl genom tarayıcısında Pax6'yı görselleştirin ve tüm transkriptlerde kullanılan ekzonu seçin.
      3. Alternatif eklemeyi daha da atlatmak için, tamamlanmamış bir kodona sahip bir ekzonu hedefleyin (üçlünün kalan bir veya iki tabanı). Bu daha az önemlidir, ancak indüklenmiş indellerin etkileri hakkında daha fazla kesinlik sağlar. Pax6 için, ekzon 4 ila ekzon 11 iyi bir hedeftir. Ek olarak, triptofan (W), glutamin (Q) veya arginin (R) kalıntıları içeren bir ekzon seçin.
        NOT: SpCas9 kullanan standart C > T baz editörleri, gRNA'nın başlangıcından itibaren nükleotid 4'ten nükleotid 8'e kadar uzanan bir düzenleme penceresine sahiptir (PAM'dan en uzakta). C > T baz editörleri, ters iplikçikte bir gRNA bulunan tüm triptofan (W) kalıntılarına (TGG'den TGA'ya, TAG veya TAA'ya), glutamin (Q) kalıntılarına (CAG'den TAG'a veya CAA'dan TAA'ya) ve son olarak, ileri iplikçikteki arginin (R) kalıntılarına (CGA'dan TGA'ya) durdurma kodonları uygulayabilir.
    5. Ekzon + 20 taban yukarı ve aşağı akış seçin. Hedef işareti CRISPR'de ekranın sağ tarafına tıklayın ve Tasarım ve Analiz kılavuzlarına tıklayın.
    6. Yeni açılan menüde, Tasarım Türü sekmesi altında, " temel düzenleme" için Kılavuzları işaretleyin (Komor ve ark., 2016). Kılavuz Uzunluğu'nu 20 nükleotidde tutun ve Fare için Genom altında GRCm38 (mm10, Mus musculus) öğesini seçin.
    7. Yeşil + işaretine tıkladıktan sonra, yazılım programı tüm protospacer bitişik motif (PAM) dizilerini otomatik olarak algılar ve ekranın sağ tarafında, ilgilenilen ekzonun etrafındaki alandaki tüm potansiyel gRNA'ların bir listesini oluşturur.
    8. Kırmızı bir kutudaki durdurma kodonu işaretine (*) kadar listede ilerleyin; bu, potansiyel olarak bir amino asidi bir durdurma kodonuna dönüştürebilecek ve böylece bir nakavtla sonuçlanabilecek bir gRNA'ya işaret eder.
    9. gRNA dizisinin sağındaki ilk sütunda, düzenleme penceresinin etrafındaki her hedef "C" için, in silico öngörülen düzenleme verimlilikleri hesaplanır. Durdurma kodonu ile sonuçlanan C > T düzenlemesinin en az ~ 10 düzenleme verimliliğine sahip olduğundan emin olun.
    10. gRNA'nın hangi hedef dışı lokuslara bağlanabileceğini kontrol etmek için Hedef Dışı sütunundaki değere tıklayın. Özgüllüğü artırmak için herhangi bir ek gene bağlanan bir gRNA seçmekten kaçının. Örneğin, Pax6'yı bir C > T baz editörü ile düzenlemek için iyi bir gRNA, ekzon 7'yi hedefler ve 5'-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3' dür.
    11. Ekranın sağ üst köşesindeki Ek Açıklamalar simgesine ve ardından Yeni Ek Açıklama'ya tıklayarak Benchling dosyasında bir ek açıklama oluşturun. Ek açıklamayı adlandırın ve Strand açılır menüsünde doğru gRNA yönünün seçildiğinden emin olun.
  2. gRNA plazmid üretimi
    NOT: Organoidlere gRNA iletimi için çeşitli vektörler mevcuttur. Aşağıdaki plazmid, gRNA yapımı için bir baz olarak kullanılmıştır: pFYF1320 (Addgene #47511, Keith Joung'dan bir tür hediye).
    1. pFYF1320'deki gRNA'ları klonlamak için, standart ileri astarı kullanarak ters bir PCR stratejisi uygulayın: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. Ters astarı tasarlamak için, gRNA ara parça dizisinin ters tamamlayıcısını aşağıdaki evrensel ters astar parçasının önüne yapıştırın (gRNA oryantasyonunu [+ veya - ipliği] iki kez kontrol edin): CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. C > T taban düzenleyicisini kullanarak fare Pax6'nın ekzon 7'sini hedeflemek için ters astar aşağıdaki gibidir: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Her iki astarı da sipariş edin.
    2. 61 °C'lik bir tavlama sıcaklığında 35 döngü boyunca yüksek doğrulukta bir DNA polimeraz kullanarak şablon olarak 1 ng pFYF1320 kullanarak ters bir PCR reaksiyonu çalıştırın.
    3. PCR reaksiyonunu, 2.281 baz çiftinin (bp) beklenen parçasını görselleştirmek için TAE tamponunda 100 V'ta ~ 45 dakika boyunca% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın. Tercih ettiğiniz kiti kullanarak jel temizliği yapın.
    4. Aşağıdaki ligasyon reaksiyonunu ayarlayın: 100 ng temizlenmiş PCR ürünü, ilk pFYF1320 şablon DNA'sını çıkarmak için Dpn1 enzimi ve T4 ligaz. Karışımı 20 °C'de 15 dakika, 37 °C'de 30 dakika ve 80 °C'de 20 dakika inkübe edin.
    5. Reaksiyon karışımını kimyasal olarak yetkin DH5α bakterilerine dönüştürün ve bakterileri ampisilin15 içeren agar plakalarına yayın.
    6. Ertesi gün, 50 μg / mL ampisilin ile desteklenmiş 3 mL lizojen suyu (LB) ortamında üç ayrı koloni seçin ve genişletin.
    7. Ertesi gün, bir miniprep kiti kullanarak üç mini kültürün her birinin 1 mL'sinde bir mini hazırlık gerçekleştirin ve geri kalanını 4 ° C'de saklayın. Elde edilen plazmidi, gRNA'nın vektör16'ya doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olmak için U6_Forward astarı ile Sanger dizilemesine tabi tutun.
    8. Doğru plazmid ile tek bir bakteri kolonisini tanımladıktan sonra, plazmid DNA'sını bir gecede yükseltmek için ampisilin ile desteklenmiş 50 mL LB içinde karşılık gelen mini kültürün 500 μL'sini aşılayın. Bir midiprep kiti kullandıktan sonraki gün bir midi hazırlığı gerçekleştirin. Bu plazmid, bölüm 6'daki elektroporasyon için kullanılacaktır.

6. Pax6 KO klonlarının oluşturulması

  1. Organoid elektroporasyon
    1. En fazla 5 gün önce bölünmüş fare organoidleri ile başlayın, böylece proliferatif bir durumda olurlar. Nakavt başına ~ 300-400 μL organoid damlacık kullanın. Herhangi bir plazmid olmadan elektroporate edilecek negatif bir kontrol seçmek için ek bir koşul ekleyin.
    2. Organoidleri ayırmak için 2.1-2.4 arasındaki adımları uygulayın, ancak organoidleri tek hücre olacak şekilde daha uzun süre ayırın. Supernatan'ı atın.
    3. Hücreleri elektroporasyon tamponunun 80 μL'sinde yeniden askıya alın.
    4. 1.5 mL'lik bir tüpte, aşağıdaki plazmidleri maksimum 20 μL için hazırlayın: 2.5 μg pFYF1320-gRNA plazmidi, 2.8 μg transpozaz içeren plazmid, 7.2 μg higromisin direnci transpozon içeren plazmid ve 7.5 μg pCMV_ABEmax_P2A_GFP.
      NOT: pFYF1320-gRNA plazmid, baz editörü hedef lokusa yönlendiren önceden tasarlanmış gRNA'yı kodlar. pCMV_ABEmax_P2A_GFP plazmid, baz editörünü ve elektroporasyonu takiben baz editörü ifade eden hücreleri izlemek için kullanılabilecek bir GFP muhabirini kodlar. Transpozaz içeren plazmid, higromisin direnci transpozon içeren plazmid tarafından sağlanan higromisin direnç kasetini genomun içine rastgele bir yere yapıştıran transpozazı kodlar. Bu kaseti genomlarına dahil eden hücreler higromisin'e dirençli hale gelir ve higromisin ilavesiyle pozitif olarak seçilebilir. Birkaç plazmidin birlikte birleştirilmesi çok muhtemel olduğundan, higromisin direnci, Pax6 için düzenlenmiş hücreler için zenginleştirmek için fonksiyonel bir seçim oluşturur.
    5. Plazmidleri hücrelere ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
    6. Elektroportatörü gözenekli darbe (voltaj: 175 V; darbe uzunluğu: 5 ms; darbe aralığı: 50 ms; darbe sayısı: 2; bozunma oranı: %10; polarite: +) ve transfer darbesi (voltaj: 20 V; darbe uzunluğu: 50 ms; darbe aralığı: 50 ms; darbe sayısı: 5; bozunma oranı: %40; polarite: +/-) için aşağıdaki parametrelerle ayarlayın.
    7. Hücreleri plazmidlerle birlikte bir elektroporasyon küvetine yerleştirin. Hemen 0.30 A ile 0.55 A arasında olması gereken direnci (Ω) ölçün ve hemen elektroporat yapın. Bu adımın hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi, hücrelerin küvetin dibine yerleşmesini önlemek ve elektroporasyon verimliliğini azaltmak için gereklidir.
    8. Hücreleri 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve bir Rho-kinaz inhibitörü ile desteklenmiş 400 μL elektroporasyon tamponu ekleyin. Hücrelerin RT'de 30 dakika boyunca iyileşmesine izin verin.
    9. Hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'de pelet yapın, süpernatanı atın ve hücreleri 200 μL ECM'de plakalayın. Katılaştıktan sonra, fare genişletme ortamını ekleyin.
    10. Kistik organoidler 2-3 gün sonra büyür. C > T baz editörünün varlığını ortaya çıkaran GFP sinyalini günlük olarak izleyin.
  2. Organoid seçimi
    1. ~ 3 gün sonra, organoidler iyileştiğinde, higromisin direnç kasetini entegre eden organoidleri seçmek için fare genleşme ortamına 100 μg / mL higromisin ekleyin. Bir plazmid alan hücrelerin birkaç plazmid alma olasılığı yüksektir. Higromisine dirençli organoidler seçilerek, Pax6 lokusundaki düzenlenmiş organoidler zenginleştirilir.
    2. Negatif kontroldeki tüm hücreler öldüğünde ve hayatta kalan organoidler ~ 300 μm olduğunda, higromisin dirençli organoidleri seçin.
  3. Organoid toplama ve genotipleme
    1. Mikroskobun yanında steril P20 uçları ve buz üzerinde her biri 100 μL tripsin çözeltisi içeren 1.5 mL tüpler hazırlayın.
    2. Bir P20 ucunu forseps ile bükün. Hayatta kalan organoidleri içeren plakayı tezgah üstü mikroskopta gözlemleyin. Hayatta kalan bir organoid odaktayken, plakanın kapağını çıkarın. Bükülmüş P20 ucunu kullanarak ve hala mikroskop altında, hayatta kalan her organoidi ayrı ayrı aspire edin ve bunların her birini tripsin çözeltisi içeren ayrı bir tüpe yerleştirin.
    3. En fazla 20 klon alın. Seçilecek klonların sayısı, her deneysel tasarım için gereken klon sayısına ve her gRNA ve lokusa bağlı olarak değişen düzenleme verimliliğine bağlıdır.
    4. Tüm klonlar toplandığında, 1,5 mL'lik tüpleri 5 dakikaya kadar 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Ayrışma hızını artırmak için her tüpü düzenli olarak vorteks edin ve organoidleri tezgah üstü mikroskop altında kontrol edin. Organoidler küçük kümelere ve / veya tek hücrelere ayrıldığında, 1 mL baz ortamı ekleyerek sindirimi durdurun.
    5. Seçilen her klon için, ayrı bir 1.5 mL tüpte ~ 400 μL genotipe tutun. 5 dakika boyunca 500 x g'de kalan ~ 600 μL'yi döndürün, süpernatanı çıkarın, hücreleri 20 μL ECM'de yeniden askıya alın, 24 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda tek bir damlacık olarak plakalayın ve higromisin olmadan fare genleşme ortamı ekleyin.
    6. Klonları genotiplendirmek için, 5 dakika boyunca 500 x g'de ~ 400 μL hücre süspansiyonu içeren tüpleri döndürün, süpernatanı çıkarın ve DNA'yı çıkarmak için hücreleri 50 μL DNA ekstraksiyon tamponunda yeniden askıya alın.
    7. Hücreleri hemen aşağıdaki gibi inkübe edin: 60 ° C'de 6 dakika, vorteks ve 95 ° C'de 4 dakika. Bu DNA, -20 ° C'de 7 güne kadar saklanabilir, ancak aşağı akış PCR'sini hemen gerçekleştirmek en uygunudur.
    8. Nükleaz ile hedeflenen lokusu yükseltmek için, önceden sipariş edilen yeterli genotipleme primerleri ve düşük doğruluklu bir polimeraz kullanarak ekstrakte edilen DNA'nın 2 μL'sinde bir PCR gerçekleştirin. Genotipleme primerleri AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) ve TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R) 'dir. Amplikon, verimli bir şekilde sıralandığından emin olmak için beklenen düzenlenmiş lokustan yaklaşık 100 bp başlamalıdır.
    9. Adım 5.2.3'te belirtildiği gibi PCR verimliliğini değerlendirmek için PCR ürününü bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın. Doğru boyutta bir bant tespit edildiğinde, bir kit kullanarak DNA jeli ekstraksiyonu yapmak için jelden kesin.
    10. Daha önce genotipleme primerleri ile seçilen her organoid klondan ekstrakte edilen DNA'yı dizileyin.
    11. Elde edilen dizileri Benchling'deki Pax6 geniyle hizalayın. İçe aktarılan gen dizisini adım 4.1'den açın. Sağ taraftaki Hizalamalar'a ve ardından Yeni hizalama oluştur'a tıklayın. Dizileme sağlayıcısından alınan .ab1 dosyalarını yükleyin, nükleotid türü olarak DNA'yı seçin ve İleri'ye basın.
    12. Aşağıdaki pencerede, Hizalama oluştur'a tıklamadan önce Çok Sıralı ve hizalama programı Otomatik (MAFFT) öğesini seçin.
    13. Her iki alel üzerinde homozigot prematüre durdurma kodonuna (baz editörlerle elde edildiği gibi) sahip genotipleri tanımlayın. Genişlemek için ilgili organoid klonları saklayın ve daha fazla analiz için bunları kriyoprotekte edin. İdeal olarak, potansiyel nükleaz hedef dışı etkilerini atlatmak için üç farklı organoid klonu yan yana analiz edilmelidir.

7. NSG farelerinde insan lakrimal bezi organoidlerinin ortotopik transplantasyonu

  1. Organoid preparatı
    1. İnsan lakrimal bezi organoidleri, bölüm 2'de açıklandığı gibi, transplantasyon gününden ~ 3 gün önce bölünmelidir. Transplantasyon gününde, engraftman şansını artırmak için organoidlerin proliferatif fazda olduğundan emin olun.
    2. Organoidleri ECM'den çıkarmak için, 0.125 U / mL'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için kültür ortamına dispaz ekleyin. Bir P1.000 kullanarak, ECM damlacıklarını bozmak için iyice askıya alın ve plakayı 30 dakika boyunca 37 ° C inkübatöre geri yerleştirin. 100 μL'lik bir ECM hacmi, ~ 10 lakrimal bezi enjekte etmek için yeterlidir.
    3. Enzimi yıkamak için organoidleri 10 mL baz ortamda tekrar askıya alın. Hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g'de pelet yapın.
    4. Hücreleri (~ 1.500.000) % 5 ECM ile desteklenmiş 50 μL soğuk insan genleşme ortamında yeniden askıya alın. Organoid süspansiyonu buzun üzerine yerleştirin ve hemen transplantasyona devam edin.
  2. Farelerde ortotopik transplantasyon
    1. Hayvan tesisinde, organoid süspansiyonu ve insülin iğnelerini buz üzerinde bulundurun. Organoid süspansiyonu soğuk bir insülin iğnesinde aspire edin.
    2. Anesteziyi başlatmak için NOD scid gama (NSG) immün yetmezlikli bir fareyi %3 izofluran ile yatıştırın. Fare uyurken, ana lakrimal bezin (göz ile kulak arasında yarı yolda bulunan) erişilebilir olduğu şekilde hızlı bir şekilde yan tarafına yerleştirin.
    3. 5 μL organoid süspansiyonu doğrudan deriden lakrimal beze enjekte edin. Bir fare lakrimal bezinin içerebileceği maksimum hacim 5 μL'dir.
    4. Farenin iyileşmesine izin verin ve özellikle göz üzerinde transplantasyonla ilgili herhangi bir rahatsızlığın varlığını değerlendirmek için fareyi her gün izleyin.
  3. Engraftmanı değerlendirin
    1. Kısa süreli veya uzun süreli engraftasyonun değerlendirilmesi gerekip gerekmediğine bağlı olarak 90 güne kadar O2/CO2 inhalasyonu ile fareyi kurban edin13.
    2. Lakrimal bezi bölüm 1'de tarif edildiği gibi diseke edin. RT'de 24 saat boyunca% 4 formalin içinde sabitleyin.
    3. Lakrimal bezi bir kasete yerleştirin. Lakrimal bezi aşağıdaki gibi inkübe ederek dehidrate edin:% 70 etanolde 2 saat,% 96 etanolde 2 saat,% 100 etanolde (2x) 1 saat, ksilende 2 saat ve fırında 58 ° C'de sıvı parafinde bir gece.
    4. Ertesi gün, lakrimal bezi metalik bir kalıpta tercih edildiği gibi yönlendirin, sıvı parafin ile doldurun ve bloğun soğuk bir yüzeyde katılaşmasına izin verin. Bu işlem en iyi şekilde bir gömme makinesi ile gerçekleştirilir.
    5. Parafin bloğu katı olduğunda, bir mikrotom kullanarak tüm bloğu 4-5 μm kesitlere ayırın. Tüm bölümleri (kurdele şeklinde) kuru ve cereyan etmeyen bir ortamda tutun. Bölümler oda sıcaklığında süresiz olarak tutulabilir.
    6. Tüm bloğu kapsayan her 10 bölümden birini örnekleyin.
      1. Bölümleri bir slayta aşağıdaki gibi monte edin: slaytın üzerine bir damla su koyun, bölümü üstüne yerleştirin, 42 ° C'lik bir sıcak plaka üzerinde gerilmesini sağlamak için ~ 2 dakika dinlendirin ve suyu yavaşça kağıtla çıkarın.
      2. Kızakları gece boyunca 58 °C'lik bir fırında kurumaya bırakın. Slaytlar bu aşamadan sonra RT'de süresiz olarak tutulabilir.
    7. İnsan hücrelerini fare hücrelerinden ayırt etmek için, bu bölümler üzerinde insan nükleer antijen boyaması yapın. Aşağıdaki yıkamaları yaparak bölümleri yeniden sulandırın: Ksilen (2x) içinde 3 dakika,% 100 etanol (2x) içinde 1 dakika,% 96 etanol,% 90 etanol,% 80 etanol,% 70 etanol,% 60 etanol ve% 25 etanol içinde 1 dakika ve son olarak, demi suda (2x) 1 dakika.
    8. Slaytları PO tamponunda 15 dakika boyunca inkübe edin (Ek Tablo 1). Slaytları ultra saf suda 3 kat yıkayın.
    9. Otoklavda sitrat bazlı bir antijen alımı gerçekleştirin:
      1. Slaytları otoklav geçirmez bir slayt tutucuya, sitrat tamponu ile doldurulmuş bir sepete yerleştirin (Ek Tablo 1). Sepeti otoklavın içine yerleştirin ve bir otoklav döngüsü çalıştırın (basınç: 10 PSI; sıcaklık: 121 °C; süre: 15 dakika).
      2. Otoklav basınçsızlaştırıldığında, slaytları içeren sepeti alın ve slaytları RT'ye getirmek için bir RT su banyosuna yerleştirin.
        NOT: Antijen alma stratejisi kullanılan antikora bağlıdır. En uygun antijen alımını gerçekleştirmek için sağlayıcının veri sayfasına bakın.
    10. Slaytları yatay olarak, bölüm tarafı yukarı, bir inkübasyon tepsisine yerleştirin. Üstüne PBS'de %1 sığır serum albümini (BSA) içeren 500 μL bloke edici tampon ekleyin ve 1 saat boyunca inkübe edin. Engelleme arabelleğini çıkarın.
    11. Boyanacak slayt başına 500 μL bloke edici tampona 1 μL insan nükleolar antijen-antikoru ekleyerek antikor çözeltisini hazırlayın. Her slayda antikor çözeltisi ekleyin. 4 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübasyon tepsisinde gece boyunca inkübe edin.
    12. Ertesi gün, slaytları PBS'de 3 kez yıkayın. Slaytları seyreltilmemiş HRP anti-fare sekonder antikoru ile 45 dakika boyunca inkübe edin. Slaytları PBS'de 3 kez yıkayın.
      DİKKAT. Kimyasal bir başlıkta, DAB tamponunu hazırlayın (Ek Tablo 1). Slaytları DAB tamponu ile 10 dakika boyunca inkübe edin. Herhangi bir atık malzemeyi organik kimyasal sıvı atık konteynerlerine atın.
    13. Slaytları suyla yıkayın. Çekirdekleri boyamak için slaytları hematoksilin içinde 2 dakika boyunca inkübe edin. Slaytları akan musluk suyunda 10 dakika yıkayın.
    14. Slaytları %50 etanol, %60 etanol, %70 etanol, %80 etanol ve %90 etanolde 1 dakika, %96 etanolde (2x) 1 dakika, %100 etanolde (2x) 1 dakika ve ksilende (2x) 1 dakika inkübe ederek kurutun.
    15. Kızakları montaj ortamı ve bir kapak kayması ile kapatın. Yaklaşık 20 dakika kuruduktan sonra, slaytları mikroskop altında gözlemleyin.
    i>

Representative Results

Fare lakrimal bezinin diseksiyonunu takiben (Şekil 2A), enzimatik ve mekanik sindirim, aralarında acini ve kanalların ayırt edilebildiği küçük doku parçaları üretti (Şekil 2B). Kalan büyük doku parçaları ECM'nin dengesini bozacak ve bu da başlangıçtaki organoid büyümesini azaltacaktır. Fare lakrimal bezi organoid türevi, organoidlerin bölünmeye hazır olduğu aşama olan ~7 gün sonra ~500 μm çapında kistik organoidler bulunduğunda başarılı olmuştur (Şekil 2C). Genel organoid türevi başarılı olsa bile, bazı organoidler sonunda durmadan önce büyümeye başlayabilir. İnsan lakrimal bezi organoidleri 3-4 gün içinde kist olarak büyümüş ve doku izolasyonundan 10-14 gün sonra tam büyümüş boyuta ulaşmıştır (Şekil 2D). Hem fareler hem de insanlar için, organoid türetme bazen başarısız oldu, hiç organoid yok ya da az sayıda organoid büyüyordu; Bu genellikle dokunun aşırı sindiriminden kaynaklanıyordu. Fare lakrimal bezi organoidleri en az 40x ve insan organoidleri en az 20x geçirilebilir. Geçiş, organoid büyümeye bağlı olarak ortalama 7-10 günde bir yapıldı.

Figure 2
Şekil 2: Fare ve insan lakrimal bezi organoidlerinin oluşumu. (A) Fare lakrimal bezi diseksiyonunun farklı aşamalarının fotoğrafları. Ok, koruyucu zarının altındaki lakrimal beze işaret eder. (B) Doku sindiriminden hemen sonra fare lakrimal bezi hücrelerinin parlak alan görüntüleri, bir asinus ve bir kanal gösteren girintilerle. (C) Başarılı ve başarısız bir fare lakrimal bezi organoid türevinin parlak alan görüntüleri. (D) 14 gün boyunca insan organoid büyümesinin parlak alan görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Lakrimal bez organoidleri, genişleme ortamında kültürlendiğinde büyük oranda kök hücre içerir. Farklılaşma seviyelerini artırmak için, büyüme faktörü içeriği azaltılmış bir fare ve bir insan farklılaştırma ortamı kurduk. Farklılaşma ortamında sırasıyla 5 gün ve 7 gün sonra, fare ve insan lakrimal bezi organoidleri yoğunlaşmıştır (Şekil 3A-B). Bu morfolojik değişim, artmış fonksiyonel özelliklerle korelasyon gösterdi. Siklik AMP aktivatörü forskolin veya nörotransmitter norepinefrin uygulanması, 3 saatten daha kısa bir sürede organoid şişmeye (yani apikal su sekresyonu) neden olmuştur (Şekil 3C). Şişlik 3-4 saatten uzun sürdüğünde, bu organoidlerin yeterince farklılaşmadığını ve / veya nörotransmiterler için reseptörler gibi fonksiyonel belirteçleri ifade etmediğini düşündürmektedir.

Figure 3
Şekil 3: İnsan organoidlerinde fare ve insan lakrimal bezi organoidlerinin farklılaşması ve fonksiyonel şişlik testi. (A) Fare lakrimal bezi organoidlerinin 7 gün boyunca genişleme ortamında ve genişleme ortamında 2 gün sonra 5 gün boyunca farklılaşma ortamında kültürlenen parlak alan görüntüleri. (B) Genleşme ortamında 11 gün boyunca ve genişleme ortamında 2 gün sonra 9 gün boyunca farklılaşma ortamında kültürlenen insan lakrimal bezi organoidlerinin parlak alan görüntüleri. (C) 3 saat boyunca taze farklılaşma ortamına (kontrol), 1 μM forskolin'e ve 100 μM norepinefrine maruz kalan farklılaşmış insan lakrimal bezi organoidlerinin parlak alan görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Fare lakrimal bezi organoidlerinde Pax6'yı nakavt etmek için, seçilen Pax6 hedeflemeli gRNA'yı içeren bir plazmid PCR ve ligasyon ile üretildi (Şekil 4A). Bu gRNA içeren plazmid, tek hücrelere ayrışmış fare lakrimal bezi organoidlerinde Domuzcuk-Bac plazmidleri (higromisin direnci transpozon içeren ve transpozaz içeren plazmidler) ve C > T baz editörü Cas9 ile birlikte elektropoize edildi. 3 gün sonra, organoidler iyileştiğinde, higromisin direnç kasetini içeren klonları seçmek için higromisin'e maruz bırakıldılar. Başarılı elektroporasyonlarda, higromisine dirençli organoidler büyüdü (Şekil 4B). ~ 300 μm'den daha büyük olan büyüyen organoid klonlar, ideal olarak kendiliğinden farklılaşmaya başlamadan önce seçildi (Şekil 4C). DNA, organoidin bir kısmından çıkarılırken, geri kalanını kültürde tuttu. gRNA tarafından hedeflenen Pax6 lokusunun PCR amplifikasyonu, seçilen klonların her biri için 367 bp bandı verdi (Şekil 4D). Güçlendirilmiş lokus sıralandıktan sonra, homozijik olarak C > T düzenlenmiş klonlar (n = 1) tutuldu. Öte yandan, düzenlenmemiş (n = 4), heterozigli olarak düzenlenmiş veya yanlış düzenlenmiş (n = 1) klonlar atıldı (Şekil 4E). Genel olarak, Pax6'yı hedefleyen bu gRNA kullanılarak, sıralanan altı kişiden bir homozigot nakavt fare lakrimal bezi klonu elde edildi. Bazı klonlar iyi büyüdü, ancak bazı organoid klonlar toplandıktan sonra kayboldu veya farklılaşmaya başladı (Şekil 4F). Seçilen 10 organoid klondan 7'si iyi büyüdü.

Figure 4
Şekil 4: Fare lakrimal bezi organoidlerinde Pax6'nın temel düzenleme aracılı nakavtı. (A) Pax6 lokusunu hedefleyen gRNA'nın doğru entegrasyonundan sonra pFYF1320'nin sanger dizileme izi. (B) Elektroporasyonu takiben higromisin'e maruz kaldıktan 5 gün sonra fare lakrimal bezi organoidlerinin parlak alan görüntüleri. Organoidler fare genişleme ortamında kültürlendi. Solda, higromisin büyümesine dirençli bir klon bulunmayan, başarısız bir elektroporasyon örneği vardır. Sağda, birkaç higromisin dirençli organoid klonunun hayatta kaldığı başarılı bir elektroporasyon örneği bulunmaktadır. (C) Seçilmesi gereken klonların ve seçilmemesi gereken klonların parlak alan görüntüleri. (D) gRNA ile hedeflenen Pax6 lokusunun amplifikasyonunu gösteren agaroz jeli. Yeşil renkte, beklenen 367 bp boyutundaki bant vurgulanır. (E) Sanger, higromisin'e dirençli üç organoid klonun izini diziler. Üst klon düzenlenmemiş. Orta klon homozigot C > T baskısıdır ve bu nedenle homozigot nakavttır. Alt klon iki heterozigot nokta mutasyonu sunar ve ya heterozigot bir nakavt ya da karışık bir klondur ve yanlış düzenlenmiştir. (F) Seçilen organoid klonların çeşitli büyüme seviyelerine sahip parlak alan görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Son olarak, farelerde insan lakrimal bezi organoid ortotopik transplantasyonunu gerçekleştirmek için, 3 gün önceden bölünmüş (< 100 μm çapında) organoidler kullanıldı. Organoid engraftman, organoidlerin fare lakrimal bezine enjekte edilmesinden 1 ay sonra, insana özgü bir belirteç olan insan nükleolar antijeni için boyanarak doğrulandı (Şekil 5). Fare lakrimal bezinin tüm bölümlerinden noktasal lekelenmenin olmaması, insan organoid engraftmanının eksikliğini gösteriyordu.

Figure 5
Şekil 5: İnsan lakrimal bezi organoidlerinin fare lakrimal bezine nakli. Transplantasyondan 1 ay sonra engraftmanı izlemek için insan nükleolar belirteci için nakledilen fare lakrimal bezlerinin boyanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Ortamın ve tamponların bileşimi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Bu protokol, lakrimal bez organoidlerinin fonksiyonel tahliller, mutasyon modellemesi ve transplantasyon için kurulmasını ve kullanımını açıklamaktadır. Fare ve insan lakrimal bezi organoidleri oluşturulurken, doku ayrışması çok önemlidir. Doku yeterince sindirilmezse, organoid verim düşük olacaktır. Doku aşırı sindirilirse, hücreler ölür ve organoidler olarak büyümez. Her doku, optimal organoid büyümesini sağlamak için belirli bir süre için belirli bir enzimle sindirilmelidir14,17,18. Lakrimal bez, pipetleme bazlı mekanik ayrışma ile birlikte 5-10 dakikalık bir kollajenaz sindiriminin küçük doku parçalarını izole etmek için yeterli olduğu oldukça yumuşak bir dokudur. Tek hücreli RNA dizilimi gibi uygulamalar için tek hücrelerin elde edilmesi gerekiyorsa, ayrışma tek hücreli aşamaya ulaşılana kadar daha uzun süre gerçekleştirilebilir, ancak canlılıktaki herhangi bir azalmayı sınırlamak için tek hücreler elde edilir edilmez ayrışma durdurulmalıdır. Doku ayrışması çok önemli olduğundan, aşırı sindirim lakrimal bez organoid oluşumunun başarısızlığının en olası nedenidir.

Lakrimal bez organoidlerinin uygun şekilde korunması, kullanımları için önemlidir. Uzun süreli bakım, yetişkin kök hücre kaynaklı lakrimal bez organoidlerinin, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı organoidlere kıyasla ayırt edici bir özelliğidir 7,17. Uzun süreli bakım sağlamak için düzenli organoid bölünmesi ve orta değişiklikler yapılmalıdır. Bu olmadan, organoidler farklılaşmaya ve azalmış kök hücre potansiyeli geliştirmeye başlar, bu da uzun süreli bakımlarını engeller7. Yine bu adımda, aşırı sindirim kök hücreleri öldürebilir ve organoid bakımını bozabilir. Düzenli bakım için, tek hücrelere organoid ayrışma gerekli değildir. Bununla birlikte, klonal nakavt organoid hatları oluşturmak için, tek hücrelerle başlamak çok önemlidir. Aksi takdirde, organoidler farklı genetik geçmişlere sahip bir hücre mozaiğinden oluşacak ve bu da tek, tanımlanmış bir mutasyonun etkisini analiz etmeyi imkansız hale getirecektir. Burada, durdurma kodonları oluşturmak için bir C > T baz editörünün kullanımını açıklıyoruz. Bu genom editörü, bir NGG PAM'dan 12-18 baz içinde arginin, glutamin veya triptofan kodonların varlığına dayanır. Bir gRNA tasarımında bu koşullar yerine getirilmediğinde, alternatif PAM'lere sahip geleneksel Cas9 veya C >T baz editörlerikullanılabilir 7,18. Bununla birlikte, geleneksel Cas9, onarım11 üzerine indellerle sonuçlanan çift sarmallı kırılmalar sunar. Her iki alel de farklı indelleri barındırabileceğinden, klon genotiplemesi ek dikkat gerektirir. Her iki alelin de çerçeve dışı indeller içerdiğinden ve dolayısıyla organoid klonların hedeflenengen 19 için nakavt edildiğinden emin olmak için getirilen modifikasyonların dekonvolüsyonu yapılmalıdır. C > T baz editörlerinin avantajı, mutlaka durdurma kodonları ile sonuçlanmayan nokta mutasyonlarını modellemek için kullanılabilmeleri gerçeğinde yatmaktadır. Örneğin, lakrimal bez fizyolojisi üzerindeki etkilerini incelemek için aniridi hastalarında bulunan spesifik Pax6 mutasyonlarını modellemek için kullanılabilirler20.

Lakrimal bez, gözyaşı filminin sulu kısmını salgılar1. İnsan organoidlerinde büyüme faktörü yoksunluğu ve NOTCH inhibisyonunun aracılık ettiği farklılaşmadan sonra gözyaşı sekresyonu özetlenebilir. Bu koşullar altında, organoidler terminal farklılaşmaya uğrar ve daha fazla korunamazlar. Bununla birlikte, farklılaşmış lakrimal bez organoidleri, potansiyel olarak yüksek verimli ekranlarda, kuru göz hastalığı bağlamında yırtılmaya neden olan ilaçların geliştirilmesine rehberlik edebilir. Bu protokolde sunulan yırtılma testi, şu anda organoid boyutunda kısa sürede en büyük değişikliği veren testtir ve bu da birilaç taraması bağlamında 7,9,17 oranında ölçmeyi kolaylaştırır.

Kök hücre tedavisi, kuru göz hastalığında lakrimal bez rejenerasyonu için büyük umut vaat etmektedir21. Yetişkin kök hücre kaynaklı lakrimal bez organoidleri bu tür uygulamalar için bir kaynak materyal olabilir. Burada sunulan protokol, çoğunlukla kistler olarak insan lakrimal bezi organoid engraftmanı ile sonuçlanır. Düşük organoid engraftman, organoidlerin yanlış bölgeye enjekte edilmesi nedeniyle ortaya çıkabilir. Enjeksiyon prosedürünü bir boya ile eğitmek, enjeksiyon bölgesinin izlenmesini sağlar ve sonuçta enjeksiyon doğruluğunu arttırır. Alternatif olarak, fare epidermisi,22'den önce sıçanlarda yapıldığı gibi, lakrimal beze doğrudan erişime sahip olacak şekilde kesilebilir. Bu yöntem daha uzun sürer, ancak daha doğru olabilir. Öte yandan, mevcut protokolle, organoidler fare lakrimal bezine fonksiyonel olarak entegre edilmedi. Benzer sonuçlar iPSC kaynaklı lakrimal bez engraftmanı22 için de gözlenmiştir. Transplantasyon yöntemi, lakrimal bezin önceden yaralanması, kuru göz faresi modeli kullanılması ve / veya organoidlerin tek hücre veya küçük kümeler halinde enjekte edilmesiyle daha da geliştirilebilir. Bununla birlikte, yetişkin kök hücre kaynaklı lakrimal bez organoidleri ve ilgili araç seti, lakrimal bez araştırması ve rejeneratif tıpta gelecekteki uygulamaların temeli olabilir.

Disclosures

Hans Clevers, Roche, Basel'de İlaç Araştırma ve Erken Geliştirme başkanıdır ve organoid teknolojisi ile ilgili çeşitli patentlere sahiptir.

Acknowledgments

Protokolün ilk gelişimi için Yorick Post'a teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Cancer Research UK Grand Challenge (C6307 / A29058) ve Mark Foundation for Cancer Research tarafından SPECIFICANCER ekibine verilen bir ödülle desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL safe-lock centrifuge tubes Eppendorf EP0030 120.094
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB) Sigma-Aldrich D5637 CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 °C
5x green GoTaq Flexi buffer Promega M891A Store at -20 °C
A83-01 Tocris 2939 Store at -20 °C, stock at 30 mM, 10000x
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 store at 4 °C
Agar plates containing Ampicillin Hubrecht Institute
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Autoclave VAPOUR-Line lite VWR chemicals
B27 supplement Invitrogen 17504-044 Store at -20 °C, 50x
BD Micro-Fine insulin needle 1 mL BD Bioscience 324825
Benchtop microscope DMI1 Leica
Bovine serum albumine (BSA) MP biomedicals 160069 Store at 4 °C
BTXpress BTX MDS450805
C57BL/6 mice Hubrecht Institute
Cassettes Klinipath 410-02S
CellBanker 1 amsbio 11910 Cryopreservation medium, adhere to instructions
Centrifuge Eppendorf
Citric acid monohydrate J.T. Baker 0088 CAS: 5949-29-1
Collagenase I Sigma Aldrich C9407 Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 °C
Conical tubes 15 mL Greiner Bio-One 5618-8271
Conical tubes 50 mL Corning CLS430828-500EA
Coverslips 24 mm x 50 mm Menzel-Gläzer BB024050S1
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix R&D Systems, Bio-Techne 3533-001-02 Store at -20 °C, keep at 4 °C for up to 1 month
DAPT Sigma Aldrich D5942 Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x
Disodium hydrogen phosphate anhydrous VWR chemicals 28026.292 CAS: 7558-79-4
Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate Sigma-Aldrich 71643 CAS:10028-24-7
Dispase ThermoFisher Scientific 17105-041 Aliquots at 50 U/mL, store at -20 °C until use, 400x
Disposable Scalpel Sterile N° 10 Swann Morton 3033838
DM4000 microscope Leica
dNTPs 25 mM Promega U1420 Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 °C
Dpn1 New England Biolabs R0176
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) Gibco 14190144 1x
Easy strainers 70 µm Greiner 542170
Electroporation cuvette Nepagene EC002S
EnVision+/HRP mouse Agilent K400111-2
Ethanol 100% BOOM 84045206;5000 CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions
Ethanol 70% BOOM 84010059.5000 CAUTION
Ethanol 96% BOOM 84050065.5000 CAUTION
EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System ThermoFisher Scientific Live-imaging brightfield microscrope
FGF10 Peprotech 100-26 Store at -20 °C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x
Fiji NIH, Fiji developers
Formaldehyde solution 4% Sigma-Aldrich 1.00496 CAS: 50-00-0, CAUTION
Forskolin Tocris 1099 Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x
Glutamax Gibco 35050-061 100x
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase Promega M7805 Store at -20 °C
Haematoxylin VWR chemicals 10047105 Store at room temperature
HEPES Gibco 15630-080 Store at 4 °C, 100x
Histocore H and C, Tissue embedding machine Leica
Hot plate Meidax
Human nucleolar antigen antibody Abcam ab-190710
Hydrochloric acid 5 N ThermoFisher Scientific 10605882 CAS: 7647-01-0, CAUTION
Hydrogen peroxyde 30% Chem-lab CL00.2308.1000 CAS: 7722-84-1, CAUTION
Hygromycin B-gold InvivoGen ant-hg Stock at 100 mg/µL, 1000x
Hygromycin resistance cassette-containing plasmid Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
IsoFlo 100% Mecan 5960501
LB medium Hubrecht Institute
MgCl2 25 mM Promega A351H Store at -20 °C
Microtome RM2235 Leica
Midiprep DNA isolation kit ThermoFisher Scientific K210005
Miniprep DNA isolation kit ThermoFisher scientific K210003
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165 Store at -20 °C, stock at 500 mM, 400x
NEPA21 electroporator Nepagene
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636 Store at -20 °C, stock at 1M, 100x
NOD Scid Gamma (NSG) mice Hubrecht Institute colony
Noggin conditioned medium U-Protein Express Custom order Store at -20 °C
Noradrenaline Sigma Aldrich A7257 Store at -20 °C, stock at 100 mM
Oven Memmert Set at 58 °C
P20, P200 and P1000 pipettes Gilson
Paraffin VWR chemicals 10048502
Pasteur pipettes, glass plugged ThermoFisher Scientific 1150-6973
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG  IDT
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC  IDT
pCMV_ABEmax_P2A_GFP Addgene 112101
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 Store at -20 °C
Pertex Klinipath AM-08010
pFYF1320  Addgene 47511
Primocin InvivoGen ant-pm-1 1000X, store at -20 °C
Prostaglandin E2 (PGE2) Tocris 2296 Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x
Petri dish, 10 cm Greiner 633102
Q5 buffer New England Biolabs B9027S
Q5 high-fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0491S
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen QE09050 Store aliquots at -20 °C
R-spondin 3 conditioned medium U-Protein Express Custom order Store at -20 °C
sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG IDT
Slides StarFrost MBB-0302-55A Adhesive, ground
Sodium azide Merck 8.22335.1000 CAS: 26628-22-8, CAUTION
Sodium cytrate dihydrate J.T. Baker 0280 CAS: 6132-04-3
Standard Forward Primer: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
TTAAAATAAGGC		 IDT
Subcloning efficiency competent cells DH5alpha Invitrogen 18265-017
Suspension cell culture plates (24-well) Greiner Bio-One 662102 24-well
Suspension cell culture plates (12-well) Greiner Bio-One 665102 12-well
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
TAE buffer ThermoFisher Scientific B49 Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water
Transposase-containing plasmid Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
TrypLE Express Enzyme Invitrogen 12605-028 store at 4 °C
U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT IDT
UltraPure Agarose 1000 Invitrogen 16550
Water bath Tulabo
Xylene Klinipath 4055-9005 CAS: 1330-20-7, CAUTION
Y-27632 Abmole Bioscience Y-27632 dihydrochloride Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garg, A., Zhang, X. Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine. Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).
  2. Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. Resistance to infection of the external eye: The role of tears. Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).
  3. Messmer, E. M. The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease. Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).
  4. Massie, I., et al. Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).
  5. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PloS One. 7 (1), 29458 (2012).
  6. Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).
  7. Bannier-Hélaouët, M., et al. Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).
  8. Hayashi, R., et al. Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells. Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).
  9. Jeong, S. Y., et al. Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 247 (2021).
  10. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).
  11. Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing. Frontiers in Genetics. 12, 728520 (2021).
  12. Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
  13. Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
  14. Driehuis, E., et al. Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy. Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).
  15. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
  16. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  17. Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids. Journal of Visualized Experiments. (180), e62438 (2022).
  18. Lõhmussaar, K., et al. Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer. Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).
  19. Bloh, K., et al. Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data. The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).
  20. Latta, L., et al. Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions. The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).
  21. Veernala, I., et al. Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy. The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).
  22. Hayashi, R., et al. Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells. Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).

Tags

Retraksiyon Sayı 192 Lakrimal bez organoidler baz editörleri transplantasyon ağlama tahlili
Fare ve İnsan Lakrimal Bezi Organoidlerinin Kurulması, Bakımı, Farklılaşması, Genetik Manipülasyonu ve Transplantasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bannier-Hélaouët, M.,… More

Bannier-Hélaouët, M., Geurts, M. H., Korving, J., Begthel, H., Clevers, H. Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids. J. Vis. Exp. (192), e65040, doi:10.3791/65040 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter