Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Etablering, vedligeholdelse, differentiering, genetisk manipulation og transplantation af mus- og humane tårekirtelorganoider

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/65040
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), University Medical Center Utrecht, 2Oncode Institute, Hubrecht Institute

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man etablerer, vedligeholder, genetisk modificerer, differentierer, funktionelt karakteriserer og transplanterer lacrimalkirtelorganoider afledt af primært muse- og humant væv.

Abstract

Lacrimalkirtlen er et vigtigt organ for okulær overfladehomeostase. Ved at producere den vandige del af tårefilmen beskytter den øjet mod udtørringsstress og eksterne fornærmelser. Lidt er kendt om lacrimal kirtel (pato) fysiologi på grund af manglen på tilstrækkelige in vitro modeller. Organoidteknologi har vist sig som en nyttig eksperimentel platform for flere organer. Her deler vi en protokol til etablering og vedligeholdelse af mus- og humane lacrimalkirtelorganoider startende fra lacrimalkirtelbiopsier. Ved at ændre dyrkningsbetingelserne forbedrer vi lacrimalkirtelorganoidfunktionaliteten. Organoid funktionalitet kan undersøges gennem en "grædende" assay, som indebærer at udsætte lacrimalkirtelorganoiderne for udvalgte neurotransmittere for at udløse tårefrigivelse i deres lumen. Vi forklarer, hvordan man afbilder og kvantificerer dette fænomen. For at undersøge rollen af gener af interesse i lacrimalkirtelhomeostase, kan disse genetisk modificeres. Vi beskriver grundigt, hvordan man genetisk modificerer lacrimalkirtelorganoider ved hjælp af baseeditorer - fra guide RNA-design til organoid klongenotypning. Endelig viser vi, hvordan man undersøger det regenerative potentiale af humane lacrimalkirtelorganoider ved ortopisk implantation i musen. Sammen giver dette omfattende værktøjssæt ressourcer til at bruge mus- og humane lacrimalkirtelorganoider til at studere lacrimalkirtel (pato)fysiologi.

Introduction

Lacrimalkirtlen er kirtelepitelet, der er ansvarlig for at producere det meste af det vandige lag af tårefilmen1. Det vandige lag af tårefilmen indeholder ikke kun vand til smøring af den okulære overflade, men også et stort repertoire af antimikrobielle komponenter, der beskytter den okulære overflade mod infektioner2. Når lacrimalkirtlen er beskadiget eller betændt, opstår tørre øjne, hvilket resulterer i ubehag for patienterne og i sidste ende kan føre til tab af syn3. I årenes løb har modelsystemer til undersøgelse af lacrimalkirtlen, især den menneskelige kirtel, været begrænset 4,5,6. Dette har bidraget til et videnshul vedrørende tårekirtelfunktion under fysiologiske og patologiske tilstande.

For nylig er der udviklet in vitro-modeller til at studere lacrimalkirtlen i en skål 7,8,9. Disse lacrimalkirtelorganoider stammer fra voksne stamceller dyrket som tredimensionelle strukturer i en ekstracellulær matrix suppleret med en cocktail af vækstfaktorer, der opretholder deres regenerative kapacitet in vitro7. Fordelen ved voksne stamceller (ASC) afledte organoider er, at de kan opretholdes i meget lang tid, mens de rekapitulerer sunde vævsfunktioner. Denne type organoid består udelukkende af epitelceller, i modsætning til inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte organoider, som også kan indeholde stromale celler, for eksempel. I modsætning til pluripotente stamcelleorganoider (PSC) er ASC-organoider etableret direkte fra voksent væv og kræver ingen genetiske modifikationer, der skal udvides. ASC-organoider udtrykker voksne egenskaber10.

Denne protokol indeholder en værktøjskasse til at udlede lacrimalkirtelorganoider fra mus og humant primærvæv. Protokollen beskriver, hvordan man yderligere forbedrer organoidernes funktionalitet ved simpel vækstfaktortilbagetrækning, og hvordan man provokerer organoiderne til at udskille tårevæske ved at udføre et hævelsesassay. Denne protokol inkluderer desuden en elektroporationsbaseret transfektionsmetode til genetisk manipulation af museorganoider ved hjælp af CRISPR-afledte baseredaktører. I modsætning til konventionel Cas9 tillader brugen af baseeditorer modifikation af enkeltbaser i genomet uden at generere et dobbeltstrenget brud11,12. Endelig beskrives den ortotopiske transplantation af humane lacrimalkirtelorganoider til immundefekte mus og den efterfølgende histologiske vurdering af engraftmentet. Denne lacrimal kirtel organoid værktøjssæt kan bruges i forskning på lacrimal kirtel regenerering og funktion og til genetisk og inflammatorisk sygdom modellering.

Protocol

Museforsøgene blev godkendt af Animal Ethics Committee of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) under projektlicens AVD8010020151. Organoiderne blev afledt af museoverskudsmateriale. De humane tårekirtelbiopsier blev indsamlet fra affaldsmaterialet fra patienter, der blev opereret på University Medical Centre Utrecht (UMCU) efter godkendelse af det medicinske etiske udvalg under protokolnummer 18-740. Protokollen indeholder flere afsnit, der er skitseret i figur 1.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over protokollen. Denne figur fremhæver de forskellige trin i protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.

BEMÆRK: Alle substrat- og buffersammensætninger er beskrevet i supplerende tabel 1.

1. Etablering af organoider fra mus og humane tårekirtler

  1. Dissekering af musens lacrimalkirtel
    1. Forbered dissektionsværktøjerne, herunder saks, tang og dissektionspuder. Aflive en mus ved indånding afO2/CO2 13.
    2. Placer den aflivede mus på maven på dissektionspuden og fastgør dens lemmer. Våd håret placeret mellem museørerne og på panden ved hjælp af 70% ethanol.
    3. Brug dissektionssaks til at lave en åbning bag kraniet mellem ørerne. Forlæng denne åbning over panden op til næsen. Brug stadig en saks, klip huden bag ørerne for at generere to klapper.
    4. Træk klapperne fast mod næsen, indtil tårekirtlerne er blottet, som vist i figur 2A. Fastgør klapperne til dissektionspude. Brug en saks til at lave et lille snit i membranen placeret over lacrimalkirtlen for fuldstændigt at udsætte lacrimalkirtlen.
    5. Brug tangen til at trække lacrimalkirtlen. Der skal være en vis modstand, indtil hovedlacrimalkanalen er revet. Hvis det foretrækkes, skal du klippe hovedlacrimalkanalen direkte med en saks.
    6. Placer musens lacrimalkirtel i PBS af vævskulturkvalitet indtil videre behandling. Fortsæt med at behandle lacrimalkirtlen inden for 2-4 timer for at begrænse celledød. Hvis dette tager længere tid, placeres musens tårekirtel i biopsamlingsmediet (supplerende tabel 1).
      BEMÆRK: Flere lacrimalkirtler kan samles, hvis der er behov for et stort antal organoider med det samme.
  2. Indsamling af humane lacrimalkirtelbiopsier
    1. Før operationen fremstilles 20 ml alikvoter af biopsiopsamlingsmediet (supplerende tabel 1) i et 50 ml rør, og dette gives til kirurgen forud for operationen. Dette medium kan opbevares ved 4 °C i flere måneder.
    2. Lad kirurgen på operationsdagen tage prøver af et stykke af tårekirtlen (normalt <1 mm3) og opbevare det i biopsiopsamlingsmediet (supplerende tabel 1) ved 4 °C.
    3. Saml biopsien for at behandle den så hurtigt som muligt. Ideelt set bør dette være den samme dag inden for 2 timer efter biopsiprøvetagning.
  3. Organoid afledning
    1. På forhånd fremstilles følgende: optøet ekstracellulær matrix (ECM), mus ved stuetemperatur (RT) eller humant ekspansionsmedium (supplerende tabel 1), optøet collagenase, basismedium (supplerende tabel 1), to skalpeller, en petriskål på 10 cm, en 70 μm si monteret på et 15 ml rør og ophængningsplader med 12 brønde, der er forvarmet ved 37 °C i 30 minutter.
    2. Fordøjelsessubstratet fremstilles ved at kombinere alle de komponenter, der er vist i supplerende tabel 1. Forvåd skalpellerne i dette medium for at undgå, at vævsstykker klæber til dem.
    3. Hent musen eller det humane lacrimalkirtelvæv fra mediet, og læg det i petriskålen.
    4. Brug de forfugtede skalpeller til at hakke vævet. Når vævsstykkerne er meget små (dvs. <0,5 mm3), skal du placere dem i fordøjelsesmediet ved at skrabe dem af petriskålen med skalpellen. Hvis den menneskelige biopsi allerede er meget lille, skal du placere den direkte i fordøjelsesmediet uden hakning for at undgå vævstab.
    5. Vævsstykkerne inkuberes i op til 15 minutter i et 37 °C vandbad. Vend 15 ml røret regelmæssigt for at ophænge stykkerne. Overvåg celledissociationen under et benchtopmikroskop for ikke at overfordøje vævet.
    6. I mellemtiden indsnævres en Pasteur-pipette ved at placere spidsen i en flamme, mens den drejes, og forvæde den i basismediet. For effektivt at adskille vævet skal du sikre dig, at hullet er lidt mindre end de største stykker væv, der er tilbage. For at lette dissociationsprocessen pipetteres blandingen op og ned hvert 5. minut med den forvædede indsnævrede Pasteur-pipette.
    7. Når mange enkeltceller og små klumper er synlige under mikroskopet, skal du stoppe dissociationen ved at tilføje 10 ml basismedium. Spin ned ved 400 x g i 5 minutter for at pelletere cellerne.
    8. Supernatanten fjernes, og pelletpen resuspenderes i 10 ml basissubstrat for at gentage vasken. Filtrer det gennem en 70 μm sil for at fjerne de store ufordøjede vævsstykker og resterende kollagenfibre, hvilket forhindrer tilstrækkelig polymerisering af ECM. Drej eluatet ved 400 x g i 5 min.
      BEMÆRK: En pille med røde blodlegemer indikerer tilstedeværelsen af røde blodlegemer, som normalt ikke hæmmer organoidafledning. For nogle applikationer, såsom flowcytometri, skal de røde blodlegemer imidlertid lyseres. Til det inkuberes cellerne i 5 ml frisk røde blodlegemer lysebuffer ved RT i 5 minutter og pellet cellerne ved 400 x g i 5 minutter.
    9. Supernatanten fjernes, og cellepelletsen resuspenderes i 100 μl koldt ECM for en enkelt muselacrimalkirtel og i 50 μl koldt ECM for en human biopsi. Når du resuspenderer, skal du være forsigtig med ikke at lave bobler, da disse også vil påvirke ECM-polymerisationen og stabiliteten.
    10. Der frøes op til 100 μL celler pr. hul i en ophængningsplade med 12 brønde. Brug en P200 til at lave ~ 20 μL dråber i brønden. Jo mindre dråberne er, desto bedre er diffusionen af vækstfaktorerne og næringsstoffer gennem matrixen.
    11. Pladen anbringes på hovedet i en befugtet inkubator ved 37 °C i 20-30 minutter, så ECM kan størkne.
    12. Når ECM er størknet, tilsættes ~ 1 ml RT-mus eller menneskeligt ekspansionsmedium pr. Brønd på en 12 brøndplade. Opdater mediet hver 2-3 dage, indtil organoiderne når en størrelse på 300 μm. Til det skal du aspirere mediet i brønden og forsigtigt tilføje ekspansionsmedium på siden af brønden uden at røre ECM-dråberne for ikke at forstyrre dem.
      BEMÆRK: Primocin (100 mg/ml; 1:1.000 fra kommercielt lager) kan tilsættes ved isolering, hvis der forekommer bakteriel kontaminering. Men fordi det bremser organoid vækst også, er det bedst ikke at tilføje det eller fjerne det efter en eller to passager.

2. Udvidelse af musen og humane lacrimalkirtelorganoider

  1. Efter ~7 dage for museorganoider og ~10 dage for humane organoider, når organoiderne når en størrelse på ~300 μm, fjernes dyrkningsmediet.
  2. Resuspender ECM-dråberne indeholdende organoiderne i 1 ml trypsinopløsning ved kraftigt pipettering op og ned med en P1.000, indtil dråberne falder fra hinanden. Denne blanding overføres til et 15 ml glas, og den inkuberes kortvarigt i et 37 °C vandbad.
  3. Efter 2-3 minutter skal du bruge en indsnævret og forvædet Pasteur-pipette til at pipettere organoidsuspensionen op og ned 10x-15x. Kontroller dissociationsstatus for organoiderne under et bordmikroskop; Små klumper på ~ 20 celler skal opnås. Der inkuberes længere tid i 37 °C vandbad, og pipetteringstrinnet gentages, indtil dissociationen er tilfredsstillende.
    BEMÆRK: Dette trin kan tage længere tid for humane organoider, da de er flerlagede. Enkeltceller vil blive genereret; Dette påvirker ikke organoid udvækst, så længe det meste af organoid suspension består af små klumper.
  4. Stop dissociationen ved at tilføje 10 ml basismedium. Pellet derefter cellerne ved 400 x g i 5 min.
  5. Efter fjernelse af supernatanten og ECM, der kan ligge oven på organoiderne (gennemsigtigt, gelélignende lag uden organoider), resuspenderes cellerne i en passende mængde koldt ECM, inden de pletteres i en ophængningsplade som angivet i trin 1.3.10.
    BEMÆRK: Generelt opdeles musens lacrimale organoider i forholdet 1: 5 og humane organoider i forholdet 1: 3. Dette betyder, at når de startes med organoider indeholdt i 100 μL ECM, skal de resuspenderes i henholdsvis 500 μL og 300 μL efter opdelingen.
  6. Pladen inkuberes på hovedet i en 37 °C inkubator indtil ECM størkner i 30 minutter, og organoiderne dækkes med musen eller det humane ekspansionsmedium ved RT.

3. Kryokonservering af organoider i mus og human lacrimalkirtel

  1. For at kryopræservere organoiderne skal organoiderne først opdeles i ekspansionsmediet i overensstemmelse med instruktionerne i punkt 2.
  2. Ca. 3-4 dage senere, når organoiderne er i en vækstfase, fjernes mediet, og 100 μL af ECM-indeholdende organoider resuspenderes i 10 ml koldt basemedium. Inkuber på is i 10 minutter for at hjælpe med at adskille ECM. Vend røret regelmæssigt for at lette denne proces.
  3. Pellet organoiderne ved 500 x g i 5 min. Supernatanten fjernes, og den organoide pellet resuspenderes i 1 ml kryopræserveringsmedium (rester af ECM forringer ikke kryopræservering). Den organoide suspension overføres til en cryovial og straks til en -80 °C fryser.
    BEMÆRK: Ved brug af kryopræserveringsmediet beskrevet i materialetabellen kan kryoialerne opbevares på ubestemt tid i en -80 °C fryser. Hvis der anvendes et andet kryopræserveringsmedium, overføres kryovialet til en flydende nitrogentank efter 24 timer for at sikre optimal konservering.
  4. For at tø organoiderne op, hentes kryovialet ud af fryseren og transporteres på tøris til et 37 °C vandbad. Hold cryovial i vandet, indtil det meste af indholdet er optøet. Overfør indholdet til et 15 ml rør indeholdende 10 ml basemedium, og drej cellerne ned ved 400 x g i 5 minutter.
  5. Organoiderne forsynes med ekspansionssubstratet i 100 μl ECM som beskrevet i trin 2.5 og 2.6.

4. Differentiering af lacrimalkirtelorganoider og vurdering af deres funktionalitet

  1. Organoid differentiering
    1. For at differentiere lacrimalkirtelorganoider opdeles organoiderne først i ekspansionsmediet i henhold til instruktionerne i afsnit 2.
    2. Efter 2 dage udskiftes ekspansionsmediet med et differentieringsmedium med mus eller mennesker som beskrevet i trin 1.3.12. Opdater mediet hver 2-3 dage for at opretholde museorganoiderne i 5 dage i det medium og de menneskelige organoider i 9 dage.
    3. For at vurdere organoiddifferentiering efter 5 dage eller 9 dage i differentieringsmediet indsamles 100 μL ECM indeholdende organoider for at ekstrahere RNA'et. For at gøre dette skal du resuspendere ECM-dråberne i 1 ml medium indeholdt i brønden ved hjælp af en P1.000 og overføre organoidsuspensionen i 3 ml iskoldt basemedium. Pellet organoiderne ved 500 x g i 5 min.
    4. Supernatanten kasseres, og pellet resuspenderes i RNA-ekstraktionsbufferen. Udfør nedstrøms RNA-ekstraktionen i henhold til instruktionerne fra RNA-ekstraktionssættet. Brug det opnåede RNA til RT-qPCR-analyse af ekspressionen af stamceller (TP63, KRT5, KRT14) og differentierede cellemarkører (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2...) 14.
      BEMÆRK: For at opnå den relevante ekspressionsanalyse måles ekspressionen af de valgte markører i en eller flere vævsprøver. Organoider dyrket under differentieringsbetingelser har tendens til at indeholde mindre RNA.
  2. Funktionel hævelsesanalyse
    BEMÆRK: Til denne del af protokollen skal du bruge humane lacrimalkirtelorganoider, der er blevet differentieret i mindst 7 dage. Den krævede minimumstid er 7 dage for at sikre tilstrækkelig markørekspression til funktionel rivning. Hver brønd i en 12-brønds plade udgør en betingelse. Det mindste antal betingelser er tre: en positiv kontrol, en negativ kontrol og en testbetingelse.
    1. Frisklavet 1 ml humant differentieringsmedium indeholdende individuelle komponenter, der inducerer sekretion af lacrimalkirtelorganoiderne. For eksempel tilsættes 100 μM noradrenalin og 1 μM forskolin, og blandes grundigt.
      BEMÆRK: Forskolin tjener som en positiv kontrol, der normalt inducerer maksimal hævelse.
    2. Ved et automatiseret brightfield time-lapse-mikroskop skal du indstille de positioner, der skal afbildes i pladen, tidsintervallet (5 min) og varigheden (4 timer). Sørg for, at en hel ECM-dråbe er synlig i hver position.
    3. Lige før du begynder at tage billeder og uden at flytte pladen fra mikroskopet, skal du fjerne kulturmediet fra de brønde, der skal afbildes, og erstatte det med det godt ophængte medium, der er fremstillet i trin 4.2.1. Medtag som negativ kontrol en brønd med differentieringsmedium kun erstattet af differentieringsmedium, da medium forfriskning kan udløse en vis organoid hævelse.
    4. Efter op til 4 timer er hævelsesanalysen forbi. Analyser resultaterne.
      BEMÆRK: Disse trin udføres med et EVOS M7000-mikroskop, der giver mulighed for automatisk brightfield time-lapse-billeddannelse. For dette mikroskop henvises til den detaljerede producentens manual for at konfigurere time-lapse-billeddannelsen. Bemærk, at ethvert andet mikroskop med lignende egenskaber kan anvendes.
    5. For at kvantificere organoid hævelse måles diameteren af hver enkelt organoid ved 0 timer og 4 timer. Åbn billederne af en enkelt organoid dråbe ved 0 timer og 4 timer i ImageJ.
    6. Klik på ikonet Lige linje i værktøjslinjen, og tegn først diameteren på en organoid ved 0 timer. Brug derefter måleværktøjet i ImageJ (Analyze > Measure) til at måle længden af denne linje og dermed organoiddiameteren før hævelse. Gentag processen på den samme organoid ved 4 timer for at opnå organoiddiameteren efter hævelse.
    7. Mål organoiddiameteren på ~ 20 organoider pr. Tilstand før og efter hævelsesanalysen.

5. Konstruktion af et plasmid for at slå Pax6 ud

  1. gRNA-design til knockout Pax6 ved hjælp af C > T-baseeditorer
    BEMÆRK: Der er masser af softwareprogrammer til rådighed til gRNA-design. Her blev Benchling brugt, da dette giver mulighed for integreret gRNA-design, annotering og justering af Sanger-spor. Alle efterfølgende trin kan således også udføres ved hjælp af alternative softwareprogrammer.
    1. Start gRNA-designprocessen ved at visualisere målgenet i Benchling ved at klikke på Ny (+) > DNA-sekvens > Importer DNA-sekvenser.
    2. Skriv det interessante gen Pax6 under fanen Importer fra database, og tryk på Søg.
    3. Vælg den nyeste build af musereferencegenomet GRCm38 (mm10, Mus musculus), og tryk på Importer.
    4. Vælg exonen, hvor knock-out gRNA'et kan designes ved at overholde følgende regler:
      1. Undgå at sætte et gRNA i den første kodende exon, fordi alternative startsteder i efterfølgende exoner kan bruges af cellen til at omgå det tidligt inducerede stopkodon.
      2. Design gRNA'er i exoner, der er til stede i alle de alternative transkripter, der kan forekomme ved splejsning af Pax6 mRNA. For at sikre dette skal du visualisere Pax6 i Ensembl genom-browseren og vælge den exon, der bruges i alle udskrifter.
      3. For yderligere at omgå alternativ splejsning skal du målrette mod en exon, der har et ufuldstændigt codon (en eller to resterende baser af en triplet). Dette er af mindre betydning, men giver større sikkerhed med hensyn til virkningerne af inducerede indels. For Pax6 er exon 4 til exon 11 et godt mål. Derudover skal du vælge en exon, der indeholder tryptofan (W), glutamin (Q) eller arginin (R) rester.
        BEMÆRK: Standard C- > T-baseeditorer, der bruger SpCas9, har et redigeringsvindue, der spænder fra nukleotid 4 til nukleotid 8 fra starten af gRNA'et (længst væk fra PAM). C- > T-baseredaktører kan introducere stopkodoner på alle tryptofan (W) rester (TGG til TGA, TAG eller TAA) med et gRNA på den omvendte streng, på glutamin (Q) rester (CAG til TAG eller CAA til TAA) og endelig på arginin (R) rester (CGA til TGA) på den forreste streng.
    5. Vælg exon + 20 baser opstrøms og nedstrøms. Klik på højre side af skærmen på måltegnet CRISPR, og klik på Design og analyser guider.
    6. I den nyåbnede menu under fanen Designtype skal du markere Vejledninger til "basisredigering" (Komor et al., 2016). Hold føringslængden på 20 nukleotider, og vælg GRCm38 (mm10, Mus musculus) under Genom for mus.
    7. Når du har klikket på det grønne + tegn, registrerer softwareprogrammet automatisk alle protospacer tilstødende motivsekvenser (PAM) og opretter på højre side af skærmen en liste over alle de potentielle gRNA'er i området omkring exon af interesse.
    8. Rul gennem listen indtil stopkodontegnet (*) i en rød boks, som signalerer for et gRNA, der potentielt kan omdanne en aminosyre til et stopkodon og dermed resultere i en knock-out.
    9. I den første kolonne til højre for gRNA-sekvensen beregnes de in silico-forudsagte redigeringseffektivitetsgevinster for hvert mål "C" omkring redigeringsvinduet. Sørg for, at C- > T-redigeringen, der resulterer i stopkodonet, har en redigeringseffektivitet på mindst ~10.
    10. Klik på værdien i kolonnen Off-Target for at kontrollere, hvilke off-target loci gRNA'et kan binde til. Undgå at vælge et gRNA, der binder til yderligere gener for at øge specificiteten. For eksempel er et godt gRNA til redigering af Pax6 med en C > T-baseeditor målrettet mod exon 7 og er 5'-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3'.
    11. Opret en kommentar i Benchling-filen ved at klikke på ikonet Annoteringer øverst til højre på skærmen efterfulgt af Ny kommentar. Navngiv annotationen, og sørg for, at den rigtige gRNA-retning er valgt i rullemenuen Strand .
  2. generering af gRNA-plasmid
    BEMÆRK: Der er forskellige vektorer tilgængelige til gRNA-levering til organoider. Følgende plasmid blev brugt som base for gRNA-konstruktion: pFYF1320 (Addgene #47511, en venlig gave fra Keith Joung).
    1. For at klone gRNA'erne i pFYF1320 skal du implementere en invers PCR-strategi ved hjælp af standard forward primer: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. For at designe den omvendte primer skal du indsætte det omvendte komplement af gRNA-afstandssekvensen (dobbelttjek gRNA-orienteringen [+ eller - streng]) foran følgende universelle omvendte primerdel: CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. For at målrette exon 7 af mus Pax6 ved hjælp af C > T-baseeditoren er den omvendte primer som følger: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTCCACAAG. Bestil begge primere.
    2. Kør en invers PCR-reaktion ved hjælp af 1 ng pFYF1320 som skabelon ved hjælp af en high-fidelity DNA-polymerase i 35 cyklusser ved en udglødningstemperatur på 61 °C.
    3. Kør PCR-reaktionen på en 1% agarosegel i TAE-buffer ved 100 V i ~45 min for at visualisere det forventede fragment af 2.281 basepar (bp). Udfør en geloprydning ved hjælp af det valgte sæt.
    4. Opsæt følgende ligeringsreaktion: 100 ng renset PCR-produkt, Dpn1-enzym for at fjerne det oprindelige pFYF1320-skabelon-DNA og T4-ligase. Inkuber blandingen i 15 minutter ved 20 °C, 30 min ved 37 °C og 20 min ved 80 °C.
    5. Omdan reaktionsblandingen til kemisk kompetente DH5α-bakterier, og spred bakterierne på agarplader indeholdende ampicillin15.
    6. Den næste dag plukkes og udvides tre individuelle kolonier i 3 ml lysogeny bouillon (LB) medium suppleret med 50 μg / ml ampicillin.
    7. Dagen efter udføres en miniprep på 1 ml af hver af de tre minikulturer ved hjælp af et miniprep-sæt, og resten opbevares ved 4 °C. Udsæt det opnåede plasmid for Sanger-sekventering med den U6_Forward primer for at sikre, at gRNA'et indsættes korrekt i vektoren16.
    8. Efter identifikation af en enkelt bakteriekoloni med det korrekte plasmid podes 500 μL af den tilsvarende minikultur i 50 ml LB suppleret med ampicillin for at amplificere plasmid-DNA'et natten over. Udfør en midi-prep dagen efter brug af et midiprep-sæt. Dette plasmid vil blive anvendt til elektroporationen i afsnit 6.

6. Generation af Pax6 KO-kloner

  1. Organoid elektroporation
    1. Start med museorganoider, der blev delt højst 5 dage før, så de er i en proliferativ tilstand. Brug ~ 300-400 μL organoiddråber pr. Knock-out. Medtag en yderligere betingelse for valg af en negativ kontrol, der vil blive elektroporeret uden plasmid.
    2. Udfør trin 2.1-2.4 for at adskille organoiderne, men dissociere organoiderne længere, så de er enkeltceller. Supernatanten kasseres.
    3. Cellerne resuspenderes i 80 μL af elektroporationsbufferen.
    4. I et 1,5 ml glas fremstilles følgende plasmider til maksimalt 20 μL: 2,5 μg pFYF1320-gRNA-plasmid, 2,8 μg transposaseholdigt plasmid, 7,2 μg hygromycinresistenstransposonholdigt plasmid og 7,5 μg pCMV_ABEmax_P2A_GFP.
      BEMÆRK: pFYF1320-gRNA-plasmidet koder for det tidligere designede gRNA, som guider baseeditoren til målstedet. Det pCMV_ABEmax_P2A_GFP plasmid koder for basiseditoren samt en GFP-reporter, som kan bruges til at overvåge de celler, der udtrykker baseeditoren efter elektroporation. Det transposaseholdige plasmid koder for transposasen, som indsætter hygromycinresistenskassetten tilvejebragt af det hygromycinresistenstransposonholdige plasmid et eller andet sted tilfældigt ind i genomet. Celler, der har inkorporeret denne kassette i deres genom, bliver resistente over for hygromycin og kan vælges positivt ved tilsætning af hygromycin. Da co-inkorporering af flere plasmider er meget sandsynligt, udgør hygromycinresistens en funktionel udvælgelse til berigelse for celler, der er blevet redigeret til Pax6.
    5. Tilsæt plasmiderne til cellerne, og bland godt ved pipettering op og ned.
    6. Indstil elektroporatoren med følgende parametre for poringpuls (spænding: 175 V; pulslængde: 5 ms; pulsinterval: 50 ms; antal impulser: 2; henfaldshastighed: 10%; polaritet: +) og for overførselspuls (spænding: 20 V; pulslængde: 50 ms; pulsinterval: 50 ms; antal impulser: 5; henfaldshastighed: 40%; polaritet: +/-).
    7. Placer cellerne med plasmiderne i en elektroporationskuvette. Mål straks modstanden (Ω), som skal være mellem 0,30 A og 0,55 A, og elektroporat med det samme. Det er nødvendigt at udføre dette trin hurtigt for at undgå, at cellerne sætter sig i bunden af kuvetten og reducerer elektroporationseffektiviteten.
    8. Overfør cellerne til et 1,5 ml rør, og tilsæt 400 μL elektroporationsbuffer suppleret med en Rho-kinasehæmmer. Lad cellerne komme sig ved RT i 30 minutter.
    9. Pellet cellerne ved 500 x g i 5 min, kassér supernatanten, og pladerne cellerne i 200 μL ECM. Efter størkning tilsættes musens ekspansionsmedium.
    10. Cystiske organoider vokser ud efter 2-3 dage. Overvåg GFP-signalet, som afslører tilstedeværelsen af C > T-baseeditor, dagligt.
  2. Valg af organoid
    1. Efter ~3 dage, når organoiderne er kommet sig, tilsættes 100 μg/ml hygromycin til museekspansionsmediet for at vælge organoider, der har integreret hygromycinresistenskassetten. Der er stor sandsynlighed for, at celler, der optager et plasmid, vil optage flere plasmider. Ved at vælge hygromycinresistente organoider beriges redigerede organoider på Pax6-locus .
    2. Når alle cellerne i den negative kontrol er døde og overlevende organoider er ~ 300 μm, skal du vælge de hygromycinresistente organoider.
  3. Organoid plukning og genotypebestemmelse
    1. Forbered sterile P20-spidser ved siden af mikroskopet og 1,5 ml rør indeholdende 100 μL trypsinopløsning hver på is.
    2. Bøj en P20-spids med pincet. Overhold pladen indeholdende de overlevende organoider på et bordplademikroskop. Når en overlevende organoid er i fokus, skal du fjerne låget på pladen. Brug den bøjede P20-spids og stadig under mikroskopet til at aspirere hver overlevende organoid individuelt og placere hver af disse i et separat rør indeholdende trypsinopløsning.
    3. Vælg op til 20 kloner. Antallet af kloner, der skal vælges, afhænger af antallet af kloner, der kræves til hvert eksperimentelt design, og af redigeringseffektiviteten, som varierer afhængigt af hvert gRNA og locus.
    4. Når alle kloner er plukket, anbringes 1,5 ml rørene i et 37 °C vandbad i op til 5 min. Vortex hvert rør regelmæssigt for at øge dissociationshastigheden, og kontroller organoiderne under bordplademikroskopet. Når organoiderne dissocieres i små klumper og / eller enkeltceller, skal fordøjelsen stoppes ved at tilføje 1 ml basismedium.
    5. For hver klon plukket, hold ~ 400 μL til genotype i et separat 1,5 ml rør. Drej ~600 μL tilbage ved 500 x g i 5 min, fjern supernatanten, resuspender cellerne i 20 μL ECM, plade dem som en enkelt dråbe i en brønd med en plade med 24 huller, og tilsæt museekspansionsmedium uden hygromycin.
    6. For at genotypebestemme klonerne drejes rørene indeholdende ~400 μL cellesuspension ned ved 500 x g i 5 minutter, supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 50 μL DNA-ekstraktionsbuffer for at ekstrahere DNA'et.
    7. Cellerne inkuberes straks på følgende måde: 6 min ved 60 °C, hvirvel og 4 min ved 95 °C. Dette DNA kan opbevares i op til 7 dage ved -20 °C, men det er mest optimalt at udføre nedstrøms PCR med det samme.
    8. For at forstærke det sted, der er målrettet mod nukleasen, udføres en PCR på 2 μL af det ekstraherede DNA ved hjælp af passende genotypeprimere bestilt på forhånd og en lav-fidelity-polymerase. Genotypeprimerne er AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) og TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). Amplikon skal starte ca. 100 bp fra det forventede redigerede locus for at sikre, at det sekventeres effektivt.
    9. PCR-produktet køres på en agarosegel for at vurdere PCR-effektiviteten som nævnt i trin 5.2.3. Når der opdages et bånd af den korrekte størrelse, skal du skære det ud af gelen for at udføre en DNA-gelekstraktion ved hjælp af et sæt.
    10. Sekvens det ekstraherede DNA fra hver organoid klon, der tidligere er plukket med genotypeprimerne.
    11. Juster sekvenserne opnået til Pax6-genet i Benchling. Åbn den importerede gensekvens fra trin 4.1. Klik på Justeringer i højre side og derefter på Opret ny justering. Upload .ab1-filerne, der er hentet fra sekventeringsudbyderen, vælg DNA som nukleotidtype, og tryk på Næste.
    12. I det følgende vindue skal du vælge Multisekvens og justeringsprogrammet Auto (MAFFT), før du klikker på Opret justering.
    13. Identificer de genotyper, der har et homozygot for tidligt stopcodon (som opnået med baseredaktører) på begge alleler. Hold de tilsvarende organoide kloner for at ekspandere, og kryopræserver disse til yderligere analyse. Ideelt set bør tre forskellige organoide kloner analyseres side om side for at omgå potentielle nuklease uden for målet.

7. Ortopisk transplantation af humane lacrimalkirtelorganoider i NSG-mus

  1. Organoid forberedelse
    1. Humane tårekirtelorganoider skal deles ~3 dage før transplantationsdagen, som beskrevet i punkt 2. På transplantationsdagen skal du sikre dig, at organoiderne er i proliferativ fase for at øge chancerne for engraftment.
    2. For at ekstrahere organoiderne fra ECM tilsættes dispase til dyrkningsmediet for at nå en endelig koncentration på 0,125 U / ml. Brug en P1.000 til at resuspendere ECM-dråberne grundigt for at forstyrre dem, og læg pladen tilbage i 37 °C-inkubatoren i 30 minutter. Et volumen på 100 μL ECM er tilstrækkeligt til at injicere ~ 10 lacrimalkirtler.
    3. Resuspender organoiderne i 10 ml basemedium for at vaske enzymet ud. Pillecellerne ved 400 x g i 5 min.
    4. Resuspender cellerne (~ 1.500.000) i 50 μL koldt humant ekspansionsmedium suppleret med 5% ECM. Placer organoidsuspensionen på is, og fortsæt straks til transplantationen.
  2. Ortopisk transplantation hos mus
    1. I dyreanlægget skal du have organoidsuspensionen og insulinnålene på is. Opsug den organoide suspension i en kold insulinnål.
    2. Bedat en NOD scid gamma (NSG) immundefekt mus med 3% isofluran for at starte anæstesi. Når musen sover, skal du hurtigt placere den på sin side med hovedlacrimalkirtlen (placeret halvvejs mellem øjet og øret) tilgængelig.
    3. 5 μL af organoidsuspensionen injiceres direkte gennem huden ind i lacrimalkirtlen. Det maksimale volumen, som en musens tårekirtel kan indeholde, er 5 μL.
    4. Lad musen komme sig, og overvåg musen hver dag for at vurdere tilstedeværelsen af ubehag i forbindelse med transplantationen, især på øjet.
  3. Vurder engraftment
    1. Ofring af musen medO2/CO2 inhalation efter op til 90 dage afhængigt af, om kortvarig eller langvarig indkapsling skal vurderes13.
    2. Dissekerer tårekirtlen som beskrevet i punkt 1. Fix det i 4% formalin i 24 timer ved RT.
    3. Placer lacrimalkirtlen i en kassette. Lacrimalkirtlen dehydreres ved at inkubere den på følgende måde: 2 timer i 70% ethanol, 2 timer i 96% ethanol, 1 time i 100% ethanol (2x), 2 timer i xylen og natten over i flydende paraffin ved 58 °C i ovnen.
    4. Den næste dag orienteres lacrimalkirtlen som foretrukket i en metallisk form, fylder den op med flydende paraffin, og lad blokken størkne på en kold overflade. Denne proces udføres bedst med en indlejringsmaskine.
    5. Når paraffinblokken er fast, skæres hele blokken i 4-5 μm sektioner ved hjælp af et mikrotom. Opbevar alle sektioner (i form af bånd) i et tørt, trækfrit miljø. Sektionerne kan opbevares på ubestemt tid ved stuetemperatur.
    6. Prøv en ud af hver 10 sektioner, der spænder over hele blokken.
      1. Monter sektionerne på et dias som følger: Sæt en dråbe vand på diaset, placer sektionen ovenpå, lad den hvile i ~ 2 minutter for at lade den strække sig på en 42 ° C kogeplade, og fjern vandet forsigtigt med papir.
      2. Anbring rutsjebanerne til tørring natten over i en ovn på 58 °C. Lysbillederne kan opbevares på ubestemt tid på RT forbi dette stadium.
    7. For at skelne humane celler fra museceller skal du udføre human nuklear antigenfarvning på disse sektioner. Rehydrer sektionerne ved at udføre følgende vaske: 3 min i xylen (2x), 1 min i 100% ethanol (2x), 1 min hver i 96% ethanol, 90% ethanol, 80% ethanol, 70% ethanol, 60% ethanol og 25% ethanol og endelig 1 min i demi vand (2x).
    8. Inkuber diasene i 15 minutter i PO-buffer (supplerende tabel 1). Vask rutsjebanerne 3x i ultrarent vand.
    9. Udfør en citratbaseret antigenhentning i autoklaven:
      1. Anbring diasene i en autoklavesikker diasholder i en kurv fyldt med citratbuffer (supplerende tabel 1). Placer kurven i autoklaven, og kør en autoklavecyklus (tryk: 10 PSI; temperatur: 121 °C; tid: 15 min).
      2. Når autoklaven er trykløs, skal du hente kurven, der indeholder diasene, og placere den i et RT-vandbad for at bringe diasene til RT.
        BEMÆRK: Antigenudtagningsstrategien afhænger af det anvendte antistof. Se udbyderens datablad for at udføre den mest passende antigenhentning.
    10. Placer diasene vandret med sektionssiden opad på en inkubationsbakke. Ovenpå tilsættes 500 μL blokerende buffer indeholdende 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS og inkuberes i 1 time. Fjern blokeringsbufferen.
    11. Antistofopløsningen fremstilles ved at tilsætte 1 μL humant nukleolært antigenantistof til 500 μL blokerende buffer pr. objektglas, der skal farves. Tilføj antistofopløsningen til hvert dias. Der inkuberes natten over i en befugtet inkubationsbakke ved 4 °C.
    12. Næste dag vaskes diasene 3x i PBS. Inkuber objektglassene med ufortyndet HRP anti-mus sekundært antistof i 45 min. Vask diasene 3x i PBS.
      FORSIGTIGHED. I en kemisk hætte fremstilles DAB-bufferen (supplerende tabel 1). Inkuber diasene med DAB-buffer i 10 min. Kassér alt affaldsmateriale i beholdere til organisk kemisk flydende affald.
    13. Vask diasene med vand. Inkuber diasene i 2 minutter i hæmatoxylin for at modvirke plettering af kernerne. Vask rutsjebanerne i rindende postevand i 10 min.
    14. Dehydrer objektglassene ved at inkubere dem i 1 min hver i 50% ethanol, 60% ethanol, 70% ethanol, 80% ethanol og 90% ethanol, 1 min i 96% ethanol (2x), 1 min i 100% ethanol (2x) og 1 min i xylen (2x).
    15. Vedlæg diasene med monteringsmedium og en dæksel. Efter tørring i ca. 20 minutter observeres diasene under et mikroskop.
    i>

Representative Results

Efter dissektionen af musens lacrimalkirtel (figur 2A) genererede den enzymatiske og mekaniske fordøjelse små vævsfragmenter, blandt hvilke acini og kanaler kunne skelnes (figur 2B). De resterende store stykker væv ville destabilisere ECM, hvilket ville reducere den oprindelige organoidudvækst. Musens lacrimalkirtelorganoidafledning var vellykket, når cystiske organoider med ~ 500 μm diameter blev fundet efter ~ 7 dage, det stadium, hvor organoiderne var klar til at blive delt (figur 2C). Selvom den samlede organoidafledning er vellykket, kan nogle organoider begynde at vokse, før de stopper til sidst. Humane lacrimalkirtelorganoider voksede ud som cyster inden for 3-4 dage og nåede fuldvoksen størrelse på 10-14 dage efter vævsisolering (figur 2D). For både mus og mennesker mislykkedes organoidafledning undertiden, hvor ingen eller få organoider voksede ud; Dette var generelt forårsaget af overfordøjelse af vævet. Musens lacrimalkirtelorganoider kunne passeres mindst 40x og de humane organoider mindst 20x. Passaging blev udført hver 7-10 dage i gennemsnit afhængigt af organoidvæksten.

Figure 2
Figur 2: Etablering af musens og menneskers tårekirtelorganoider. (A) Fotografier af de forskellige stadier af muselacrimalkirteldissektion. Pilen peger på lacrimalkirtlen under dens beskyttende membran. (B) Brightfield-billeder af muselacrimalkirtelceller lige efter vævsfordøjelse, med indsatser, der viser en acinus og en kanal. (C) Brightfield-billeder af en vellykket og mislykket organoid afledning af muselacrimalkirtelorganoid. (D) Brightfield-billeder af menneskelig organoidvækst i løbet af 14 dage. Klik her for at se en større version af denne figur.

Lacrimalkirtelorganoiderne indeholder en stor del stamceller, når de dyrkes i ekspansionsmediet. For at øge deres differentieringsniveau opsatte vi en mus og et menneskeligt differentieringsmedium med reduceret vækstfaktorindhold. Efter henholdsvis 5 dage og 7 dage i differentieringsmediet blev musen og humane lacrimalkirtelorganoider tættere (figur 3A-B). Denne morfologiske ændring korrelerede med øgede funktionelle egenskaber. Anvendelse af den cykliske AMP-aktivator forskolin eller neurotransmitteren noradrenalin resulterede i organoid hævelse (dvs. apikal vandsekretion) inden for mindre end 3 timer (figur 3C). Når hævelsen tog længere tid end 3-4 timer, antydede dette, at organoiderne ikke var differentierede nok og / eller ikke udtrykte funktionelle markører, såsom receptorer for neurotransmittere.

Figure 3
Figur 3: Differentiering af mus- og humane tårekirtelorganoider og funktionel hævelsesanalyse i humane organoider. (A) Brightfield-billeder af musens tårekirtelorganoider dyrket i ekspansionsmedium i 7 dage og i differentieringsmedium i 5 dage efter 2 dage i ekspansionsmedium. (B) Brightfield-billeder af humane lacrimalkirtelorganoider dyrket i ekspansionsmedium i 11 dage og i differentieringsmedium i 9 dage efter 2 dage i ekspansionsmedium. (C) Brightfield-billeder af differentierede humane lacrimalkirtelorganoider udsat for frisk differentieringsmedium (kontrol), til 1 μM forskolin, og til 100 μM noradrenalin i løbet af 3 timer. Klik her for at se en større version af denne figur.

For at slå Pax6 ud i muselacrimalkirtelorganoider blev et plasmid indeholdende det valgte Pax6-målrettede gRNA genereret ved PCR og ligering (figur 4A). Dette gRNA-holdige plasmid blev elektroporeret sammen med Piggy-Bac-plasmiderne (hygromycinresistenstransposonholdige og transposaseholdige plasmider) og C> T-baseeditoren Cas9 i muselacrimalkirtelorganoider dissocieret i enkeltceller. Efter 3 dage, da organoiderne var kommet sig, blev de udsat for hygromycin for at vælge kloner, der havde inkorporeret hygromycinresistenskassetten. I vellykkede elektroporationer voksede organoider, der var resistente over for hygromycin, ud (figur 4B). De voksende organoide kloner, der var større end ~ 300 μm, blev plukket, ideelt før de begyndte at spontant differentiere (figur 4C). DNA blev ekstraheret fra en del af organoiden, mens resten blev holdt i kultur. PCR-amplifikationen af Pax6-locus, der var målrettet mod gRNA'et, gav et 367 bp-bånd for hver af de valgte kloner (figur 4D). Efter sekventering af det forstærkede locus blev kloner, der var homozygously C > T redigeret (n = 1), bevaret. På den anden side blev kloner, der ikke blev redigeret (n = 4), heterozygt redigeret eller forkert redigeret (n = 1), kasseret (figur 4E). Samlet set blev der ved hjælp af dette gRNA rettet mod Pax6 opnået en homozygot knock-out muselacrimalkirtelklon ud af seks sekventerede. Nogle kloner voksede godt ud, men nogle organoide kloner gik tabt efter plukning eller begyndte at differentiere (figur 4F). Ud af de 10 organoide kloner, der blev valgt, voksede 7 godt ud.

Figure 4
Figur 4: Baseredigeringsmedieret knock-out af Pax6 i muselacrimalkirtelorganoider. (A) Sanger-sekventeringsspor af pFYF1320 efter korrekt integration af gRNA'et rettet mod Pax6-locus. (B) Brightfield-billeder af musens tårekirtelorganoider 5 dage efter eksponering for hygromycin efter elektroporation. Organoiderne blev dyrket i museekspansionsmedium. Til venstre er et eksempel på en mislykket elektroporation, hvor ingen klon er resistent over for hygromycin, der vokser ud. Til højre er et eksempel på en vellykket elektroporation, hvor flere hygromycinresistente organoide kloner overlever. (C) Brightfield-billeder af kloner, der skal plukkes, og kloner, der ikke skal plukkes. (D) Agarosegel, der viser amplifikationen af Pax6-locus målrettet med gRNA'et. I grønt fremhæves båndet med den forventede størrelse på 367 bp. (E) Sanger-sekventeringsspor af tre organoidkloner, der var resistente over for hygromycin. Den øverste klon er uredigeret. Den midterste klon er en homozygot C > T-udgave og dermed en homozygot knock-out. Den nederste klon præsenterer to heterozygote punktmutationer og er enten en heterozygot knock-out eller en blandet klon og er blevet forkert redigeret. (F) Brightfield-billeder af de plukkede organoidkloner med forskellige niveauer af udvækst. Klik her for at se en større version af denne figur.

Endelig blev organoider, der blev delt 3 dage i forvejen (< 100 μm i diameter) anvendt til at udføre human lacrimalkirtel organoid ortotopisk transplantation hos mus. Organoid engraftment blev bekræftet 1 måned efter injektion af organoiderne i musens lacrimalkirtel ved farvning for en humanspecifik markør, det humane nukleolære antigen (figur 5). Fraværet af punktfarvning fra alle sektioner af musens lacrimalkirtel betød mangel på human organoid engraftment.

Figure 5
Figur 5: Transplantation af humane lacrimalkirtelorganoider i musens lacrimalkirtel. Farvning af transplanterede muselacrimalkirtler til den humane nukleolære markør til overvågning af engraftment 1 måned efter transplantation. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende tabel 1: Mediets og buffernes sammensætning. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Denne protokol beskriver etablering og anvendelse af lacrimalkirtelorganoider til funktionelle assays, mutationsmodellering og transplantation. Ved etablering af mus- og humane lacrimalkirtelorganoider er vævsdissociation afgørende. Hvis vævet ikke fordøjes tilstrækkeligt, vil organoidudbyttet være lavt. Hvis vævet er overfordøjet, vil cellerne dø og ikke vokse ud som organoider. Hvert væv skal fordøjes med et specifikt enzym i et bestemt tidsrum for at sikre optimal organoid udvækst14,17,18. Lacrimalkirtlen er et ret blødt væv, hvor en kollagenasefordøjelse på 5-10 min kombineret med pipetteringsbaseret mekanisk dissociation er tilstrækkelig til at isolere små stykker væv. Hvis enkeltceller skal opnås til applikationer såsom enkeltcelle RNA-sekventering, kan dissociationen udføres i længere tid, indtil enkeltcellestadiet er nået, men dissociation bør stoppes, så snart enkeltceller opnås for at begrænse ethvert fald i levedygtigheden. Da vævsdissociation er så afgørende, er overfordøjelse den mest sandsynlige årsag til svigt i lacrimalkirtelorganoidetablering.

Den passende vedligeholdelse af lacrimalkirtelorganoider er vigtig for deres anvendelse. Langsigtet vedligeholdelse er et kendetegn ved voksne stamcelleafledte lacrimalkirtelorganoider sammenlignet med inducerede pluripotente stamcelleafledte organoider 7,17. For at opnå langvarig vedligeholdelse skal der udføres regelmæssig organoidopdeling og mediumændringer. Uden dette begynder organoider at differentiere og udvikle nedsat stamcellepotentiale, hvilket hæmmer deres langsigtede vedligeholdelse7. På dette trin igen kan overfordøjelse dræbe stamcellerne og forringe organoid vedligeholdelse. Til regelmæssig vedligeholdelse er organoid dissociation i enkeltceller ikke påkrævet. For at generere klonale knock-out organoide linjer er det imidlertid afgørende at begynde med enkeltceller. Hvis ikke, vil organoiderne bestå af en mosaik af celler med forskellige genetiske baggrunde, hvilket gør det umuligt at analysere effekten af en enkelt, defineret mutation. Her beskriver vi brugen af en C- > T-baseeditor til at generere stopkodoner. Denne genomeditor er afhængig af tilstedeværelsen af arginin-, glutamin- eller tryptophankodoner inden for 12-18 baser fra en NGG PAM. Når disse betingelser ikke er opfyldt ved design af et gRNA, kan konventionelle Cas9- eller C->-baseeditorer med alternative PAM'er anvendes 7,18. Imidlertid introducerer konventionel Cas9 dobbeltstrengede brud, der resulterer i indels ved reparation11. Da begge alleler kan have forskellige indels, kræver klongenotypning yderligere forsigtighed. Dekonvolution af de indførte modifikationer bør udføres for at sikre, at begge alleler indeholder indels uden for rammen, og dermed at organoidkloner slås ud for det gen, der er målrettet19. Fordelen ved C- > T-baseeditorer ligger i, at de kan bruges til at modellere punktmutationer, der ikke nødvendigvis resulterer i stopkodoner. For eksempel kan de bruges til at modellere specifikke Pax6-mutationer, der findes hos patienter med aniridi for at studere deres indvirkning på lacrimalkirtelfysiologi20.

Lacrimalkirtlen udskiller den vandige del af tårefilmen1. Tåresekretion kan rekapituleres i humane organoider efter differentiering medieret af vækstfaktortilbagetrækning og NOTCH-hæmning. Under disse forhold gennemgår organoider terminal differentiering og kan ikke opretholdes yderligere. Alligevel kan differentierede lacrimalkirtelorganoider styre udviklingen af tårefremkaldende lægemidler i forbindelse med tørre øjne, potentielt i skærme med høj kapacitet. Riveanalysen præsenteret i denne protokol er den, der i øjeblikket giver den største ændring i organoidstørrelse på kort tid, hvilket gør det lettere at kvantificere i forbindelse med en lægemiddelskærm 7,9,17.

Stamcelleterapi har et stort løfte om regenerering af tårekirtlen ved tørre øjne21. Voksne stamcelleafledte lacrimalkirtelorganoider kan være et kildemateriale til sådanne anvendelser. Protokollen, der præsenteres her, resulterer i human lacrimalkirtelorganoid engraftment, hovedsagelig som cyster. Lav organoid engraftment kan opstå på grund af organoider, der injiceres på det forkerte sted. Træning af injektionsproceduren med et farvestof gør det muligt at spore injektionsstedet og forbedrer i sidste ende injektionsnøjagtigheden. Alternativt kan museepidermis skæres for at have direkte adgang til lacrimalkirtlen, som det gøres hos rotter før22. Denne metode tager længere tid, men kan være mere nøjagtig. På den anden side integrerede organoiderne med den nuværende protokol ikke funktionelt i musens lacrimalkirtel. Lignende resultater er blevet observeret for iPSC-afledt lacrimalkirtelindkapsling22. Transplantationsmetoden kan forbedres yderligere ved at såre tårekirtlen på forhånd, bruge en musemodel med tørre øjne og/eller injicere organoiderne som enkeltceller eller små klumper. Ikke desto mindre kan voksne stamcelleafledte lacrimalkirtelorganoider og det relaterede værktøjssæt danne grundlag for fremtidige anvendelser inden for lacrimalkirtelforskning og regenerativ medicin.

Disclosures

Hans Clevers er leder af Pharma Research and Early Development hos Roche, Basel, og har flere patenter relateret til organoidteknologi.

Acknowledgments

Vi takker Yorick Post for den indledende udvikling af protokollen. Dette arbejde blev delvist støttet af en pris fra Cancer Research UK Grand Challenge (C6307/A29058) og Mark Foundation for Cancer Research til SPECIFICANCER-teamet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL safe-lock centrifuge tubes Eppendorf EP0030 120.094
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB) Sigma-Aldrich D5637 CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 °C
5x green GoTaq Flexi buffer Promega M891A Store at -20 °C
A83-01 Tocris 2939 Store at -20 °C, stock at 30 mM, 10000x
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 store at 4 °C
Agar plates containing Ampicillin Hubrecht Institute
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Autoclave VAPOUR-Line lite VWR chemicals
B27 supplement Invitrogen 17504-044 Store at -20 °C, 50x
BD Micro-Fine insulin needle 1 mL BD Bioscience 324825
Benchtop microscope DMI1 Leica
Bovine serum albumine (BSA) MP biomedicals 160069 Store at 4 °C
BTXpress BTX MDS450805
C57BL/6 mice Hubrecht Institute
Cassettes Klinipath 410-02S
CellBanker 1 amsbio 11910 Cryopreservation medium, adhere to instructions
Centrifuge Eppendorf
Citric acid monohydrate J.T. Baker 0088 CAS: 5949-29-1
Collagenase I Sigma Aldrich C9407 Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 °C
Conical tubes 15 mL Greiner Bio-One 5618-8271
Conical tubes 50 mL Corning CLS430828-500EA
Coverslips 24 mm x 50 mm Menzel-Gläzer BB024050S1
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix R&D Systems, Bio-Techne 3533-001-02 Store at -20 °C, keep at 4 °C for up to 1 month
DAPT Sigma Aldrich D5942 Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x
Disodium hydrogen phosphate anhydrous VWR chemicals 28026.292 CAS: 7558-79-4
Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate Sigma-Aldrich 71643 CAS:10028-24-7
Dispase ThermoFisher Scientific 17105-041 Aliquots at 50 U/mL, store at -20 °C until use, 400x
Disposable Scalpel Sterile N° 10 Swann Morton 3033838
DM4000 microscope Leica
dNTPs 25 mM Promega U1420 Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 °C
Dpn1 New England Biolabs R0176
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) Gibco 14190144 1x
Easy strainers 70 µm Greiner 542170
Electroporation cuvette Nepagene EC002S
EnVision+/HRP mouse Agilent K400111-2
Ethanol 100% BOOM 84045206;5000 CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions
Ethanol 70% BOOM 84010059.5000 CAUTION
Ethanol 96% BOOM 84050065.5000 CAUTION
EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System ThermoFisher Scientific Live-imaging brightfield microscrope
FGF10 Peprotech 100-26 Store at -20 °C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x
Fiji NIH, Fiji developers
Formaldehyde solution 4% Sigma-Aldrich 1.00496 CAS: 50-00-0, CAUTION
Forskolin Tocris 1099 Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x
Glutamax Gibco 35050-061 100x
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase Promega M7805 Store at -20 °C
Haematoxylin VWR chemicals 10047105 Store at room temperature
HEPES Gibco 15630-080 Store at 4 °C, 100x
Histocore H and C, Tissue embedding machine Leica
Hot plate Meidax
Human nucleolar antigen antibody Abcam ab-190710
Hydrochloric acid 5 N ThermoFisher Scientific 10605882 CAS: 7647-01-0, CAUTION
Hydrogen peroxyde 30% Chem-lab CL00.2308.1000 CAS: 7722-84-1, CAUTION
Hygromycin B-gold InvivoGen ant-hg Stock at 100 mg/µL, 1000x
Hygromycin resistance cassette-containing plasmid Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
IsoFlo 100% Mecan 5960501
LB medium Hubrecht Institute
MgCl2 25 mM Promega A351H Store at -20 °C
Microtome RM2235 Leica
Midiprep DNA isolation kit ThermoFisher Scientific K210005
Miniprep DNA isolation kit ThermoFisher scientific K210003
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165 Store at -20 °C, stock at 500 mM, 400x
NEPA21 electroporator Nepagene
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636 Store at -20 °C, stock at 1M, 100x
NOD Scid Gamma (NSG) mice Hubrecht Institute colony
Noggin conditioned medium U-Protein Express Custom order Store at -20 °C
Noradrenaline Sigma Aldrich A7257 Store at -20 °C, stock at 100 mM
Oven Memmert Set at 58 °C
P20, P200 and P1000 pipettes Gilson
Paraffin VWR chemicals 10048502
Pasteur pipettes, glass plugged ThermoFisher Scientific 1150-6973
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG  IDT
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC  IDT
pCMV_ABEmax_P2A_GFP Addgene 112101
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 Store at -20 °C
Pertex Klinipath AM-08010
pFYF1320  Addgene 47511
Primocin InvivoGen ant-pm-1 1000X, store at -20 °C
Prostaglandin E2 (PGE2) Tocris 2296 Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x
Petri dish, 10 cm Greiner 633102
Q5 buffer New England Biolabs B9027S
Q5 high-fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0491S
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen QE09050 Store aliquots at -20 °C
R-spondin 3 conditioned medium U-Protein Express Custom order Store at -20 °C
sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG IDT
Slides StarFrost MBB-0302-55A Adhesive, ground
Sodium azide Merck 8.22335.1000 CAS: 26628-22-8, CAUTION
Sodium cytrate dihydrate J.T. Baker 0280 CAS: 6132-04-3
Standard Forward Primer: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
TTAAAATAAGGC		 IDT
Subcloning efficiency competent cells DH5alpha Invitrogen 18265-017
Suspension cell culture plates (24-well) Greiner Bio-One 662102 24-well
Suspension cell culture plates (12-well) Greiner Bio-One 665102 12-well
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
TAE buffer ThermoFisher Scientific B49 Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water
Transposase-containing plasmid Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
TrypLE Express Enzyme Invitrogen 12605-028 store at 4 °C
U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT IDT
UltraPure Agarose 1000 Invitrogen 16550
Water bath Tulabo
Xylene Klinipath 4055-9005 CAS: 1330-20-7, CAUTION
Y-27632 Abmole Bioscience Y-27632 dihydrochloride Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garg, A., Zhang, X. Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine. Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).
  2. Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. Resistance to infection of the external eye: The role of tears. Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).
  3. Messmer, E. M. The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease. Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).
  4. Massie, I., et al. Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).
  5. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PloS One. 7 (1), 29458 (2012).
  6. Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).
  7. Bannier-Hélaouët, M., et al. Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).
  8. Hayashi, R., et al. Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells. Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).
  9. Jeong, S. Y., et al. Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 247 (2021).
  10. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).
  11. Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing. Frontiers in Genetics. 12, 728520 (2021).
  12. Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
  13. Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
  14. Driehuis, E., et al. Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy. Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).
  15. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
  16. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  17. Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids. Journal of Visualized Experiments. (180), e62438 (2022).
  18. Lõhmussaar, K., et al. Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer. Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).
  19. Bloh, K., et al. Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data. The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).
  20. Latta, L., et al. Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions. The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).
  21. Veernala, I., et al. Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy. The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).
  22. Hayashi, R., et al. Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells. Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).

Tags

Retraktion udgave 192 Lacrimalkirtel organoider baseredaktører transplantation grædende analyse
Etablering, vedligeholdelse, differentiering, genetisk manipulation og transplantation af mus- og humane tårekirtelorganoider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bannier-Hélaouët, M.,… More

Bannier-Hélaouët, M., Geurts, M. H., Korving, J., Begthel, H., Clevers, H. Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids. J. Vis. Exp. (192), e65040, doi:10.3791/65040 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter