Summary
该协议描述了如何建立，维持，基因修饰，分化，功能表征和移植源自原代小鼠和人体组织的泪腺类器官。
Abstract
泪腺是眼表稳态的重要器官。通过产生泪膜的水性部分，它可以保护眼睛免受干燥应力和外部侮辱。由于缺乏足够的 体外 模型，对泪腺（病理）生理学知之甚少。类器官技术已被证明是多个器官的有用实验平台。在这里，我们分享了一个从泪腺活检开始建立和维护小鼠和人泪腺类器官的方案。通过改变培养条件，我们增强了泪腺类器官的功能。类器官功能可以通过“哭泣”测定来探测，该测定涉及将泪腺类器官暴露于选定的神经递质以触发其腔中的泪液释放。我们解释了如何对这种现象进行成像和量化。为了研究感兴趣的基因在泪腺稳态中的作用，这些基因可以进行基因改造。我们彻底描述了如何使用碱基编辑器对泪腺类器官进行基因修饰 - 从指南RNA设计到类器官克隆基因分型。最后，我们展示了如何通过原位植入小鼠来探测人泪腺类器官的再生潜力。总之，这个全面的工具集提供了使用小鼠和人类泪腺类器官来研究泪腺（病理）生理学的资源。
Introduction
泪腺是负责产生泪膜大部分水层的腺上皮1。泪膜的水层不仅含有润滑眼表的水，还含有大量抗菌成分，可保护眼表免受感染2。当泪腺受损或发炎时，会发生干眼症，这会导致患者不适，并最终导致视力丧失3。多年来，研究泪腺，特别是人类腺体的模型系统一直受到限制4，5，6。这导致了关于生理和病理条件下泪腺功能的知识差距。
最近，已经开发了体外模型来研究培养皿中的泪腺7，8，9。这些泪腺类器官来源于在细胞外基质中以三维结构生长的成体干细胞，并辅以生长因子混合物，以维持其在体外的再生能力7。成体干细胞（ASC）衍生类器官的优点是它们可以维持很长时间，同时概括健康的组织特征。这种类型的类器官仅由上皮细胞组成，这与诱导多能干细胞（iPSC）衍生的类器官不同，后者也可能含有基质细胞。与多能干细胞（PSC）衍生的类器官不同，ASC类器官直接从成人组织建立，不需要任何遗传修饰即可扩增。ASC类器官表达成人特征10.
该协议包含一个工具箱，用于从小鼠和人类原代组织中提取泪腺类器官。该协议描述了如何通过简单的生长因子提取来进一步增强类器官的功能，以及如何通过进行肿胀测定来激发类器官分泌泪液。该协议还包括一种基于电穿孔的转染方法，用于使用CRISPR衍生的碱基编辑器对小鼠类器官进行基因工程。与传统的Cas9不同，使用碱基编辑器允许修饰基因组中的单个碱基，而不会产生双链断裂11，12。最后，描述了将人泪腺类器官原位移植到免疫缺陷小鼠中以及随后对植入物的组织学评估。该泪腺类器官工具包可用于泪腺再生和功能研究以及遗传和炎症疾病建模。
Protocol
小鼠实验由荷兰皇家艺术与科学院（KNAW）动物伦理委员会批准，项目许可证为AVD8010020151。类器官来源于小鼠剩余物质。人类泪腺活检是从乌得勒支大学医学中心（UMCU）接受手术的患者的废物中收集的，经医学伦理委员会批准，协议编号为18-740。该协议包含图 1 中概述的几个部分。
图 1：协议概述。 此图突出显示了协议的不同步骤。 请点击此处查看此图的大图。
注意：所有培养基和缓冲液组合物均在 补充表1中描述。
1. 从小鼠和人类泪腺建立类器官
- 解剖小鼠泪腺
- 准备解剖工具，包括剪刀、镊子和解剖垫。通过O 2 / CO2吸入对小鼠实施安乐死13。
- 将安乐死的小鼠放在腹部的解剖垫上，并将其四肢固定。使用70%乙醇润湿位于小鼠耳朵之间和额头上的头发。
- 使用解剖剪刀，在耳朵之间的颅骨后面开一个口。将此开口从前额延伸到鼻子。仍然使用剪刀，剪开耳朵后面的皮肤以产生两个皮瓣。
- 将皮瓣向鼻子用力拉，直到泪腺暴露出来，如图 2A所示。将翻盖固定在解剖垫上。用剪刀在泪腺上方的膜上做一个小切口，以完全暴露泪腺。
- 使用镊子拉动泪腺。在主泪管撕裂之前，应该有一些阻力。如果愿意，直接用剪刀剪断主泪管。
- 将小鼠泪腺放入组织培养级PBS中，直到进一步处理。在2-4小时内继续处理泪腺以限制细胞死亡。如果这需要更长的时间，将小鼠泪腺放入活检收集培养基中（补充表1）。
注意：如果立即需要大量类器官，可以汇集几个泪腺。
- 收集人泪腺活检
- 手术前，在50 mL管中准备20 mL等分试样的活检收集培养基（补充表1），并在手术前将其交给外科医生。该培养基可在4°C下保存数月。
- 在手术当天，让外科医生取一块泪腺（通常<1mm3），并将其储存在4°C的活检收集介质（补充表1）中。
- 收集活检以尽快处理。理想情况下，这应该是活检取样后 2 小时内的同一天。
- 类器官衍生
- 提前准备以下内容：解冻的细胞外基质（ECM），室温（RT）小鼠或人扩增培养基（补充表1），解冻的胶原酶，基础培养基（补充表1），两把手术刀，一个10厘米培养皿，安装在15mL管上的70μm过滤器，以及在37°C下预热30分钟的12孔悬浮板。
- 通过结合 补充表1所示的所有组分来制备消解培养基。在这种培养基中预先润湿手术刀，以避免组织碎片粘在上面。
- 从培养基中取出小鼠或人泪腺组织，并将其放入培养皿中。
- 使用预先润湿的手术刀，切碎组织。一旦组织碎片非常小（即<0.5mm3），用手术刀将它们从培养皿上刮下来，将它们放入消化培养基中。如果人活检已经很小，请将其直接放入消化培养基中，不要切碎，以避免组织损失。
- 将组织碎片在37°C水浴中孵育长达15分钟。定期倒置 15 mL 试管以重悬碎片。在台式显微镜下监测细胞解离，以免过度消化组织。
- 同时，通过在转动时将其尖端放在火焰中来缩小巴斯德移液器的范围，并将其预润湿在基础介质中。为了有效地解离组织，请确保孔略小于剩下的最大组织块。为了促进解离过程，每5分钟用预润湿的窄巴斯德移液管上下移液一次混合物。
- 当在显微镜下可见许多单细胞和小团块时，通过加入 10 mL 基础培养基来停止解离。以400 x g 旋转5分钟以沉淀细胞。
- 除去上清液，并将沉淀重悬于10mL的基础培养基中以重复洗涤。通过70μm过滤器过滤它以去除大的未消化组织碎片和剩余的胶原纤维，这将阻止ECM的充分聚合。将洗脱液以400 x g 旋转5分钟。
注意：红细胞沉淀表明存在红细胞，这通常不会妨碍类器官的衍生。但是，对于某些应用，例如流式细胞术，应裂解红细胞。为此，将细胞在室温下在 5 mL 新鲜红细胞裂解缓冲液中孵育 5 分钟，并以 400 x g 沉淀细胞 5 分钟。 - 取出上清液，并将细胞沉淀重悬于100μL冷ECM中（用于单个小鼠泪腺）和50μL冷ECM中以进行人活检。重悬时，请注意不要产生气泡，因为这些气泡也会影响ECM聚合和稳定性。
- 在 12 孔悬浮板的每孔中接种多达 100 μL 的细胞。使用 P200 在孔中产生 ~20 μL 液滴。液滴越小，生长因子和营养物质通过基质的扩散越好。
- 将板倒置在37°C的加湿培养箱中20-30分钟，以使ECM凝固。
- ECM 固化后，每孔 12 孔板加入 ~1 mL RT 小鼠或人扩增培养基。每2-3天刷新一次培养基，直到类器官达到300μm的大小。为此，吸出孔中的培养基，并在孔的侧面轻轻添加膨胀培养基，不要接触ECM液滴，以免破坏它们。
注意：如果发生细菌污染，可以在分离时添加伯莫星（100 mg / mL;1：1，000来自商业库存）。然而，因为它也会减缓类器官的生长，所以最好不要添加它或在一两次传代后将其移除。
2. 扩增小鼠和人泪腺类器官
- 小鼠类器官~7天后，人类器官~10天后，当类器官达到~300μm的大小时，除去培养基。
- 用 P1，000 上下剧烈移液，将含有类器官的 ECM 液滴重悬于 1 mL 胰蛋白酶溶液中，直到液滴散开。将该混合物转移到15mL管中，并在37°C水浴中短暂孵育。
- 2-3分钟后，使用变窄和预润湿的巴斯德移液器将类器官悬浮液上下移液10x-15x。在台式显微镜下检查类器官的解离状态;应获得~20个细胞的小团块。在37°C水浴中孵育更长时间，并重复移液步骤，直到解离令人满意。
注意：对于人类类器官，此步骤可能需要更长的时间，因为它们是多层的。将生成单个细胞;只要大多数类器官悬浮液由小团块组成，这不会影响类器官的生长。 - 通过加入 10 mL 基础培养基停止解离。然后，以400 x g 沉淀细胞5分钟。
- 除去上清液和可能位于类器官顶部的ECM（没有类器官的透明果冻状层）后，将细胞重悬于适当体积的冷ECM中，然后再镀入悬浮板，如步骤1.3.10所示。
注意：通常，小鼠泪液类器官以1：5的比例分裂，人类类器官以1：3的比例分裂。这意味着，当开始使用 100 μL ECM 中包含的类器官时，它们需要在分裂后分别重悬于 500 μL 和 300 μL 中。 - 将板在37°C培养箱中倒置孵育，直到ECM凝固30分钟，并在室温下用小鼠或人扩增培养基覆盖类器官。
3. 冷冻保存小鼠和人类泪腺类器官
- 为了冷冻保存类器官，首先按照第2节中给出的说明在膨胀培养基中分离类器官。
- 大约 3-4 天后，当类器官处于生长期时，取出培养基，并将 100 μL 含有类器官的 ECM 重悬于 10 mL 冷碱培养基中。在冰上孵育10分钟以帮助解离ECM。定期翻转管子以促进此过程。
- 以500× g 沉淀类器官5分钟。除去上清液，并将类器官沉淀重悬于1mL冷冻保存培养基中（剩余的ECM不会损害冷冻保存）。将类器官悬浮液转移到冷冻管中，并立即转移到-80°C冰箱中。
注意：使用 材料表中描述的冷冻保存介质时，冷冻管可以无限期地保存在-80°C的冰箱中。如果使用另一种冷冻保存培养基，请在24小时后将冷冻管转移到液氮罐中，以确保最佳保存。 - 要解冻类器官，请从冰箱中取出冷冻管，并将其在干冰上运输到37°C水浴中。将冷冻管放在水中，直到其大部分内容物解冻。将内容物转移到含有 10 mL 碱基的 15 mL 管中，并以 400 x g 离心细胞 5 分钟。
- 将类器官接种在 100 μL 带有膨胀培养基的 ECM 中，如步骤 2.5 和步骤 2.6 中所述。
4. 区分泪腺类器官并评估其功能
- 类器官分化
- 为了区分泪腺类器官，首先按照第2节中的说明在膨胀培养基中分裂类器官。
- 2天后，如步骤1.3.12所述，用小鼠或人分化培养基替换扩增培养基。每2-3天刷新一次培养基，以在该培养基中将小鼠类器官维持5天，将人类器官维持9天。
- 为了评估分化培养基中 5 天或 9 天后的类器官分化，收集 100 μL 含有类器官的 ECM 以提取 RNA。为此，使用 P1，000 将 ECM 液滴重悬于孔中包含的 1 mL 培养基中，并将类器官悬浮液转移到 3 mL 冰冷的基础培养基中。以500× g 沉淀类器官5分钟。
- 弃去上清液，并将沉淀重悬于RNA提取缓冲液中。根据RNA提取试剂盒的说明进行下游RNA提取。例如，使用获得的RNA对干细胞（TP63，KRT5，KRT14）和分化细胞标志物（LCN2，WFDC2，AQP5，LTF，ACTA2...）的表达进行RT-qPCR分析。14.
注意：要获得相关的表达分析，请测量一个或多个组织样品中所选标记物的表达。在分化条件下培养的类器官往往含有较少的RNA。
- 功能性肿胀测定
注意：对于协议的这一部分，请使用已分化至少 7 天的人泪腺类器官。最短时间为 7 天，以确保功能性撕裂所需的足够标志物表达。12孔板的每个孔构成一个条件。最小条件数为三个：阳性对照、阴性对照和测试条件。- 新鲜制备 1 mL 人分化培养基，其中含有诱导泪腺类器官分泌的单个组分。例如，加入 100 μM 去甲肾上腺素和 1 μM 佛司可林，并充分混合。
注意： 佛司可林作为阳性对照， 通常诱导最大肿胀. - 在自动明场延时显微镜下，设置要在板中成像的位置，时间间隔（5分钟）和持续时间（4小时）。确保每个位置都可以看到整个 ECM 液滴。
- 在开始成像之前，无需将板从显微镜上移开，从将要成像的孔中取出培养基，并用步骤4.2.1中制备的重悬良好的培养基代替。将仅用分化培养基代替的孔作为阴性对照，因为培养基刷新可能会引发一些类器官肿胀。
- 长达4小时后，肿胀测定结束。分析结果。
注意：这些步骤是使用 EVOS M7000 显微镜执行的，该显微镜可实现自动明场延时成像。对于该显微镜，请参阅详细的制造商手册以设置延时成像。值得注意的是，可以使用任何其他具有类似特性的显微镜。 - 为了量化类器官肿胀，请在0小时和4小时测量每个类器官的直径。在ImageJ中0小时和4小时打开单个类器官液滴的图像。
- 单击工具栏中的直线图标，首先在 0 小时处绘制类器官的直径。然后，使用 ImageJ（分析>测量）中的测量工具测量这条线的长度，从而测量膨胀前的类器官直径。在4小时对同一类器官重复该过程，以获得膨胀后的类器官直径。
- 在肿胀测定前后测量每个条件~20个类器官的类器官直径。
- 新鲜制备 1 mL 人分化培养基，其中含有诱导泪腺类器官分泌的单个组分。例如，加入 100 μM 去甲肾上腺素和 1 μM 佛司可林，并充分混合。
5. 构建质粒以敲除 Pax6
- 敲除 gRNA 设计 Pax6 使用 C > T 基本编辑器
注意：有许多软件程序可用于gRNA设计。在这里，使用了Benchling，因为它允许集成gRNA设计，注释和Sanger迹线的比对。因此，所有后续步骤也可以使用替代软件程序执行。- 通过单击“导入 DNA 序列”>“新建 （+） DNA 序列”>“导入 DNA 序列”，在 Benchling 中可视化目标基因，从而开始 gRNA 设计过程。
- 在“ 从数据库导入”选项卡中，键入感兴趣的基因 Pax6，然后按 “搜索”。
- 选择小鼠参考基因组GRCm38（mm10， Mus musculus）的最新版本，然后按 导入。
- 通过遵守以下规则选择可以设计敲除gRNA的外显子：
- 避免将gRNA放入第一个编码外显子中，因为细胞可能会使用后续外显子中的替代起始位点来规避早期诱导的终止密码子。
- 设计外显子中的gRNA，这些gRNA存在于通过剪接Pax6 mRNA可能发生的所有替代转录本中。为了确保这一点，请在 Ensembl 基因组浏览器中可视化 Pax6，并选择所有转录本中使用的外显子。
- 为了进一步规避替代剪接，靶向具有不完整密码子（三元组的一个或两个剩余碱基）的外显子。这不太重要，但对诱导插入缺失的影响提供了更多的确定性。对于 Pax6，外显子4到外显子11是一个很好的目标。此外，选择含有色氨酸 （W）、谷氨酰胺 （Q） 或精氨酸 （R） 残基的外显子。
注意：使用 SpCas9 的标准 C > T 碱基编辑器的编辑窗口从 gRNA 开始（离 PAM 最远）的核苷酸 4 到核苷酸 8。C > T 碱基编辑器可以在所有色氨酸 （W） 残基（TGG 至 TGA、TAG 或 TAA）上引入终止密码子，在反向链上引入 gRNA，在谷氨酰胺 （Q） 残基上引入终止密码子（CAG 到 TAG 或 CAA 到 TAA），最后在正链上的精氨酸 （R） 残基（CGA 到 TGA）上引入终止密码子。
- 选择上游和下游的外显子+ 20碱基。单击屏幕右侧的目标标志 CRISPR，然后单击 设计和分析指南。
- 在新打开的菜单中，在选项卡下 设计类型，勾选“基础编辑”指南（Komor 等人，2016 年）。将引导长度保持在20个核苷酸，并在小鼠基因组下选择GRCm38（mm10，肌肉）。
- 单击绿色 + 符号后，软件程序将自动检测所有原间隔相邻基序（PAM）序列，并在屏幕右侧创建感兴趣外显子周围区域所有潜在gRNA的列表。
- 滚动列表，直到红色框中的终止密码子符号 （*），该符号表示 gRNA 可能会将氨基酸转化为终止密码子，从而导致敲除。
- 在gRNA序列右侧的第一列中，对于编辑窗口周围的每个靶标“C”，计算 计算机预测的 编辑效率。确保产生终止密码子的 C > T 编辑至少具有 ~10 的编辑效率。
- 单击脱靶列中的值以检查gRNA可以与哪个 脱靶 位点结合。避免选择与任何其他基因结合以提高特异性的gRNA。例如，使用C>T碱基编辑器编辑 Pax6 的良好gRNA靶向外显子7，并且是5'-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3'。
- 在 Benchling 文件中创建注释，方法是单击屏幕右上角的 注释 图标，然后单击 “新建注释”。命名注释，并确保在 链 下拉菜单中选择正确的 gRNA 方向。
- gRNA质粒生成
注意：有多种载体可用于将gRNA递送到类器官中。以下质粒被用作gRNA构建的基础：pFYF1320（Addgene #47511，Keith Joung的一份礼物）。- 要克隆pFYF1320中的gRNA，请使用标准正向引物实施反向PCR策略：“/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAAGC。要设计反向引物，请将gRNA间隔序列的反向补体（仔细检查gRNA方向[+或-链]）粘贴在以下通用反向引物部分的前面：CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG。为了使用C>T碱基编辑器靶向小鼠 Pax6 的外显子7，反向引物如下：TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCAAG。订购两种引物。
- 使用1 ng的pFYF1320作为模板，使用高保真DNA聚合酶在61°C的退火温度下运行反向PCR反应35个循环。
- 在TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶上以100 V运行PCR反应~45分钟，以可视化2，281个碱基对（bp）的预期片段。使用所选试剂盒进行凝胶净化。
- 设置以下连接反应：100 ng 纯化的 PCR 产物、Dpn1 酶以去除初始 pFYF1320 模板 DNA 和 T4 连接酶。将混合物在20°C孵育15分钟，在37°C孵育30分钟，在80°C孵育20分钟。
- 将反应混合物转化为化学感受态的DH5α细菌，并将细菌散布在含有氨苄青霉素15的琼脂平板上。
- 第二天，在补充有 50 μg/mL 氨苄青霉素的 3 mL 溶原肉汤 （LB） 培养基中挑选并扩增三个单独的菌落。
- 第二天，使用小型制备试剂盒对三种小型培养物中的1 mL进行小型制备，并将其余物储存在4°C。 使用U6_Forward引物对获得的质粒进行Sanger测序，以确保gRNA正确插入载体16中。
- 使用正确的质粒鉴定单个细菌菌落后，将 500 μL 相应的迷你培养物接种在补充有氨苄青霉素的 50 mL LB 中，以扩增质粒 DNA 过夜。在使用 midiprep 试剂盒后的第二天进行 midi 准备。该质粒将用于第6节中的电穿孔。
6. Pax6 KO克隆的生成
- 类器官电穿孔
- 从最多5天前分裂的小鼠类器官开始，因此它们处于增殖状态。每次敲除使用 ~300-400 μL 类器官液滴。包括一个额外的条件，用于选择将在没有任何质粒的情况下电穿孔的阴性对照。
- 执行步骤 2.1-2.4 以解离类器官，但解离类器官的时间更长，以便它们是单个细胞。弃去上清液。
- 将细胞重悬于80 μL电穿孔缓冲液中。
- 在 1.5 mL 管中，制备以下质粒，最大容量为 20 μL：2.5 μg pFYF1320-gRNA 质粒、2.8 μg 含转座酶的质粒、7.2 μg 含潮霉素抗性转座子的质粒和 7.5 μg pCMV_ABEmax_P2A_GFP。
注意：pFYF1320-gRNA质粒编码先前设计的gRNA，将碱基编辑器引导至目标位点。pCMV_ABEmax_P2A_GFP质粒编码碱基编辑器以及GFP报告基因，可用于监测电穿孔后表达碱基编辑器的细胞。含转座酶的质粒编码转座酶，转座酶将含潮霉素抗性转座子的质粒提供的潮霉素抗性盒随机粘贴到基因组的某个地方。将该盒整合到其基因组中的细胞对潮霉素产生抗性，并且可以通过添加潮霉素进行阳性选择。由于几种质粒很可能共掺入，因此潮霉素抗性构成了富集已编辑为 Pax6的细胞的功能选择。 - 将质粒添加到细胞中，并通过上下移液充分混合。
- 使用以下参数设置电穿孔器，用于穿孔脉冲（电压：175 V;脉冲长度：5 ms;脉冲间隔：50 ms;脉冲数：2;衰减率：10%;极性：+）和传输脉冲（电压：20 V;脉冲长度：50 ms;脉冲间隔：50 ms;脉冲数：5;衰减率：40%;极性：+/-）。
- 将带有质粒的细胞放入电穿孔比色皿中。立即测量电阻 （Ω），电阻应在 0.30 A 和 0.55 A 之间，并立即电穿孔。需要快速执行此步骤，以避免细胞沉降在比色皿底部并降低电穿孔效率。
- 将细胞转移到 1.5 mL 管中，并加入 400 μL 电穿孔缓冲液，并补充有 Rho-激酶抑制剂。让细胞在室温下恢复30分钟。
- 以 500 x g 沉淀细胞 5 分钟，弃去上清液，并将细胞接种在 200 μL ECM 中。凝固后，加入鼠标膨胀介质。
- 囊性类器官在2-3天后生长出来。每天监测GFP信号，该信号显示C>T碱基编辑器的存在。
- 类器官选择
- ~3天后，当类器官恢复时，向小鼠扩增培养基中加入100μg/ mL潮霉素，以选择已整合水霉素抗性盒的类器官。吸收一个质粒的细胞很有可能会吸收多个质粒。通过选择潮霉素耐药类器官，富集 Pax6 位点上的编辑类器官。
- 当阴性对照中的所有细胞都死亡并且存活的类器官为~300μm时，选择潮霉素抗性类器官。
- 类器官拾取和基因分型
- 在显微镜旁边准备无菌 P20 吸头，并在冰上准备含有 100 μL 胰蛋白酶溶液的 1.5 mL 管。
- 用镊子弯曲 P20 尖端。在台式显微镜上观察含有存活类器官的板。当幸存的类器官聚焦时，取下板盖。使用弯曲的P20尖端并仍在显微镜下，单独吸出每个幸存的类器官，并将每个类器官放入含有胰蛋白酶溶液的单独管中。
- 最多拾取 20 个克隆。要挑选的克隆数量取决于每个实验设计所需的克隆数量和编辑效率，编辑效率因每个gRNA和位点而异。
- 挑选完所有克隆后，将1.5 mL管置于37°C水浴中长达5分钟。定期涡旋每个试管以提高解离速度，并在台式显微镜下检查类器官。当类器官解离成小团块和/或单细胞时，通过加入 1 mL 基础培养基停止消化。
- 对于挑选的每个克隆，将 ~400 μL 基因型保存在单独的 1.5 mL 管中。将 ~600 μL 以 500 x g 旋转 5 分钟，除去上清液，将细胞重悬于 20 μL ECM 中，将它们作为单个液滴接种在 24 孔板的孔中，并加入不含潮霉素的小鼠扩增培养基。
- 要对克隆进行基因分型，将含有~400μL细胞悬液的试管以500 x g 旋转5分钟，除去上清液，并将细胞重悬于50μLDNA提取缓冲液中以提取DNA。
- 立即孵育细胞如下：在60°C下孵育6分钟，涡旋，在95°C下孵育4分钟。 该DNA可以在-20°C下保存长达7天，但立即进行下游PCR是最理想的。
- 为了扩增核酸酶靶向位点，请使用事先订购的足够的基因分型引物和低保真聚合酶对 2 μL 提取的 DNA 进行 PCR。基因分型引物是AGACTGTTCCAGGATGGCTG（Pax6_C>T_F）和TCTCCTAGGTACTGGAAGCC（Pax6_C>T_R）。扩增子应从预期的编辑位点开始约100 bp，以确保其有效测序。
- 如步骤5.2.3所述，在琼脂糖凝胶上运行PCR产物以评估PCR效率。当检测到正确大小的条带时，将其从凝胶中切出以使用试剂盒进行DNA凝胶提取。
- 对先前使用基因分型引物挑选的每个类器官克隆中提取的DNA进行测序。
- 将获得的序列与Benchling中的 Pax6 基因对齐。打开步骤 4.1 中导入的基因序列。单击右侧的“ 对齐方式 ”，然后单击“ 创建新路线”。上传从测序提供商处获得的 .ab1 文件，选择 DNA 作为核苷酸类型，然后按 下一步。
- 在以下窗口中，选择 多序列 和对齐程序 自动 （MAFFT）， 然后单击创建 对齐。
- 鉴定在两个等位基因上具有纯合早终止密码子（使用碱基编辑器获得）的基因型。保留相应的类器官克隆以扩增，并冷冻保存这些克隆以供进一步分析。理想情况下，应并排分析三个不同的类器官克隆，以规避潜在的核酸酶脱靶效应。
7. NSG小鼠人泪腺类器官的原位移植
- 类器官制备
- 如第2节所述，人泪腺类器官必须在移植日前~3天分裂。在移植当天，确保类器官处于增殖阶段，以增加植入的机会。
- 要从ECM中提取类器官，将分散酶添加到培养基中，以达到0.125 U / mL的终浓度。使用P1，000，彻底重悬ECM液滴以破坏它们，并将板放回37°C培养箱中30分钟。100 μL ECM 的体积足以注射 ~10 个泪腺。
- 将类器官重悬于 10 mL 基础培养基中以洗出酶。以400 x g 沉淀细胞5分钟。
- 将细胞 （~1，500，000） 重悬于 50 μL 补充有 5% ECM 的冷人扩增培养基中。将类器官悬浮液放在冰上，然后立即进行移植。
- 小鼠原位移植
- 在动物设施中，将类器官悬浮液和胰岛素针头放在冰上。在冷胰岛素针中吸出类器官悬浮液。
- 用3%异氟醚镇静NOD scid γ（NSG）免疫缺陷小鼠以启动麻醉。当鼠标睡着时，快速将其侧放，主泪腺（位于眼睛和耳朵之间的中间）可触及。
- 将 5 μL 类器官悬浮液直接通过皮肤注入泪腺。小鼠泪腺可以包含的最大体积为 5 μL。
- 让小鼠恢复，并每天监测小鼠以评估是否存在与移植相关的任何不适，尤其是眼睛。
- 评估植入
- 在长达90天后用O 2 / CO2吸入处死小鼠，具体取决于是否应评估短期或长期植入13。
- 如第 1 节所述解剖泪腺。在室温下将其固定在4%福尔马林中24小时。
- 将泪腺放入盒中。泪腺脱水，使其脱水如下：在70%乙醇中孵育2小时，在96%乙醇中孵育2小时，在100%乙醇（2x）中孵育1小时，在二甲苯中孵育2小时，并在58°C的液体石蜡中在烤箱中过夜。
- 第二天，在金属模具中根据需要定向泪腺，用液体石蜡加满它，让块在冷表面上凝固。此过程最好使用嵌入机执行。
- 当石蜡块是固体时，使用切片机将整个块切成4-5μm部分。将所有部分（丝带形状）保存在干燥、无气流的环境中。这些切片可以在室温下无限期保存。
- 从跨越整个块的每 10 个部分中抽取一个。
- 将切片安装在载玻片上，如下所示：将一滴水放在载玻片上，将切片放在顶部，静置~2分钟，使其在42°C热板上拉伸，然后用纸轻轻除去水。
- 将载玻片放入58°C烤箱中干燥过夜。载玻片可以无限期地保存在RT中超过此阶段。
- 为了区分人类细胞和小鼠细胞，请在这些切片上进行人核抗原染色。通过进行以下洗涤使切片重新水化：在二甲苯（2x）中3分钟，在100%乙醇（2x）中1分钟，在96%乙醇，90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇，60%乙醇和25%乙醇中各1分钟，最后在demi水（2x）中1分钟。
- 将载玻片在PO缓冲液中孵育15分钟（补充表1）。在超纯水中清洗载玻片 3 次。
- 在高压灭菌器中进行基于柠檬酸盐的抗原修复：
- 将载玻片放在装有柠檬酸盐缓冲液的篮子中的防高压灭菌载玻片支架中（补充表1）。将篮子放入高压釜中，并运行高压釜循环（压力：10 PSI;温度：121°C;时间：15分钟）。
- 当高压釜减压时，取出装有载玻片的篮子，并将其放入室温水浴中，将载玻片带到室温。
注意：抗原修复策略取决于所使用的抗体。请参阅提供者的数据表，以执行最充分的抗原修复。
- 将载玻片水平、部分朝上放在孵育盘上。在顶部的PBS中加入500μL含有1%牛血清白蛋白（BSA）的封闭缓冲液，并孵育1小时。移除阻塞缓冲区。
- 通过向每张要染色的载玻片的 500 μL 封闭缓冲液中加入 1 μL 人核仁抗原抗体来制备抗体溶液。将抗体溶液添加到每张载玻片中。在4°C的加湿孵育盘中孵育过夜。
- 第二天，在PBS中清洗载玻片3次。将载玻片与未稀释的HRP抗小鼠二抗孵育45分钟。在PBS中清洗载玻片3次。
谨慎。在化学罩中，制备DAB缓冲液（补充表1）。将载玻片与DAB缓冲液孵育10分钟。将任何废物丢弃在有机化学液体废物容器中。 - 用水清洗载玻片。将载玻片在苏木精中孵育2分钟以复染细胞核。在流动的自来水中清洗载玻片10分钟。
- 通过在50%乙醇，60%乙醇，70%乙醇，80%乙醇和90%乙醇中孵育1分钟，在96%乙醇（2x）中孵育1分钟，在100%乙醇（2x）中孵育1分钟和在二甲苯（2x）中孵育1分钟来脱水载玻片。
- 用安装介质和盖玻片封闭载玻片。干燥约20分钟后，在显微镜下观察载玻片。
Representative Results
在解剖小鼠泪腺（图2A）后，酶和机械消化产生小组织碎片，其中可以区分腺泡和导管（图2B）。剩余的大块组织会破坏ECM的稳定性，从而减少最初的类器官生长。当在~7天后发现~500μm直径的囊性类器官时，小鼠泪腺类器官衍生成功，这是类器官准备分裂的阶段（图2C）。即使整个类器官衍生成功，一些类器官也可能在最终停止之前开始生长。人泪腺类器官在3-4天内生长为囊肿，并在组织分离后10-14天内达到完全生长的大小（图2D）。对于小鼠和人类来说，类器官的衍生有时会失败，没有或很少有类器官生长出来;这通常是由组织的过度消化引起的。小鼠泪腺类器官可以传代至少40倍，人类类器官至少传代20倍。传代平均每7-10天进行一次，具体取决于类器官的生长。
图2：小鼠和人类泪腺类器官的建立。 （A）小鼠泪腺解剖不同阶段的照片。箭头指向其保护膜下的泪腺。（B）组织消化后小鼠泪腺细胞的明场图像，插图显示腺泡和导管。（C）成功和不成功的小鼠泪腺类器官衍生的明场图像。（D）14天内人类类器官生长的明场图像。请点击此处查看此图的大图。
泪腺类器官在扩增培养基中培养时含有大比例的干细胞。为了提高它们的分化水平，我们建立了生长因子含量降低的小鼠和人类分化培养基。分别在分化培养基中5天和7天后，小鼠和人泪腺类器官变得更致密（图3A-B）。这种形态变化与功能特性的增加相关。应用环AMP激活剂佛司可林或神经递质去甲肾上腺素导致类器官肿胀（即，顶端水分泌）在不到3小时内（图3C）。当肿胀时间超过3-4小时时，这表明类器官没有足够分化和/或没有表达功能标志物，例如神经递质的受体。
图3：小鼠和人泪腺类器官的分化和人类器官的功能肿胀测定。 （A）小鼠泪腺类器官在扩增培养基中培养7天，在分化培养基中培养2天后培养5天的明场图像。（B）在扩增培养基中培养11天的人泪腺类器官的明场图像，在扩展培养基中培养2天后在分化培养基中培养9天。（C） 分化人泪腺类器官暴露于新鲜分化培养基（对照）、1 μM 佛司可林和 100 μM 去甲肾上腺素的明场图像 3 小时。 请点击此处查看此图的大图。
为了敲除小鼠泪腺类器官中的Pax6，通过PCR和连接生成含有所选Pax6靶向gRNA的质粒（图4A）。该含gRNA的质粒与Piggy-Bac质粒（含潮霉素抗性转座子和含转座酶的质粒）和C> T碱基编辑器Cas9一起在小鼠泪腺类器官中解离成单细胞。3天后，当类器官恢复时，它们暴露于潮霉素以选择包含潮霉素抗性盒的克隆。在成功的电穿孔中，生长出对潮霉素具有抗性的类器官（图4B）。挑选大于~300μm的生长类器官克隆，理想情况下在它们开始自发分化之前（图4C）。从部分类器官中提取DNA，同时将其余部分保留在培养物中。gRNA靶向的Pax6位点的PCR扩增为每个选择的克隆产生367 bp条带（图4D）。对扩增的位点进行测序后，保留纯合C>T编辑（n = 1）的克隆。另一方面，未编辑（n = 4），杂合编辑或错误编辑（n = 1）的克隆被丢弃（图4E）。总体而言，使用这种靶向Pax6的gRNA，获得了六个测序的纯合敲除小鼠泪腺克隆。一些克隆生长良好，但一些类器官克隆在采摘后丢失或开始分化（图4F）。在挑选的10个类器官克隆中，有7个生长良好。
图 4：小鼠泪腺类器官中碱基编辑介导的 Pax6 敲除。 （A）靶向Pax6位点的gRNA正确整合后pFYF1320的Sanger测序痕迹。（B）电穿孔后暴露于潮霉素5天后小鼠泪腺类器官的明场图像。将类器官在小鼠扩增培养基中培养。左边是一个电穿孔失败的例子，没有对潮霉素有抗性的克隆生长出来。右边是一个成功的电穿孔的例子，有几个耐湿霉素的类器官克隆幸存下来。（C）应选取的克隆和不应选取的克隆的明场图像。（D）琼脂糖凝胶显示gRNA靶向Pax6位点的扩增。绿色表示预期大小为 367 bp 的波段突出显示。（E）对三个对潮霉素耐药的类器官克隆进行Sanger测序。顶部克隆未编辑。中间克隆是纯合C>T版，因此是纯合基因敲除。底部克隆呈现两个杂合点突变，要么是杂合敲除，要么是混合克隆，并且被错误地编辑了。（F）具有不同生长水平的采摘类器官克隆的明场图像。请点击此处查看此图的大图。
最后，为了在小鼠中进行人泪腺类器官原位移植，使用提前3天分裂的类器官（直径<100μm）。在将类器官注射到小鼠泪腺中1个月后，通过染色人类特异性标记物人核仁抗原，确认了类器官植入（图5）。小鼠泪腺所有部分没有点状染色表明缺乏人类类器官植入。
图5：将人泪腺类器官移植到小鼠泪腺中。 移植小鼠泪腺染色以检测人核仁标志物，以监测移植后1个月的植入情况。 请点击此处查看此图的大图。
补充表1：培养基和缓冲液的组成。请按此下载此表格。
Discussion
该协议描述了泪腺类器官的建立和使用，用于功能测定，突变建模和移植。在建立小鼠和人泪腺类器官时，组织解离至关重要。如果组织没有被充分消化，类器官产量就会很低。如果组织被过度消化，细胞就会死亡，不会以类器官的形式生长出来。每个组织应用特定酶消化特定时间，以确保最佳的类器官生长14，17，18。泪腺是一种相当柔软的组织，5-10分钟的胶原酶消化结合基于移液的机械解离足以分离小块组织。如果需要获得单细胞用于单细胞RNA测序等应用，解离可以进行更长时间，直到达到单细胞阶段，但一旦获得单细胞，应立即停止解离，以限制活力的任何降低。由于组织解离至关重要，过度消化是泪腺类器官建立失败的最可能原因。
泪腺类器官的适当维护对其使用很重要。与诱导多能干细胞衍生类器官相比，长期维持是成体干细胞来源的泪腺类器官的标志7，17。为了实现长期维持，应定期进行类器官分裂和培养基更换。没有这一点，类器官开始分化并发展出降低的干细胞潜力，这阻碍了它们的长期维持7。在这一步，过度消化会杀死干细胞并损害类器官的维持。对于定期维护，不需要将类器官解离成单个细胞。然而，要产生克隆敲除类器官系，从单细胞开始至关重要。如果没有，类器官将由具有不同遗传背景的细胞马赛克组成，使得分析单个定义的突变的影响变得不可能。在这里，我们描述了使用 C > T 碱基编辑器来生成终止密码子。该基因组编辑器依赖于NGG PAM的12-18个碱基内精氨酸，谷氨酰胺或色氨酸密码子的存在。当在设计gRNA时不满足这些条件时，可以使用具有替代PAM的常规Cas9或C >T碱基编辑器7，18。然而，传统的Cas9引入了双链断裂，导致修复时产生插入缺失11。由于两个等位基因可能携带不同的插入缺失，克隆基因分型需要格外小心。应执行引入修饰的反卷积，以确保两个等位基因都包含帧外插入缺失，因此，类器官克隆针对靶向基因19进行敲除。C > T 碱基编辑器的优势在于它们可用于模拟不一定导致终止密码子的点突变。例如，它们可用于模拟在无虹膜患者中发现的特定Pax6突变，以研究它们对泪腺生理学的影响20。
泪腺分泌泪膜的水部分1。在生长因子撤出和NOTCH抑制介导的分化后，泪液分泌可以在人类器官中重现。在这些条件下，类器官经历末端分化，无法进一步维持。然而，分化的泪腺类器官可以指导干眼症背景下催泪药物的开发，可能在高通量筛查中。该协议中提出的撕裂测定是目前在短时间内类器官大小变化最大的测定，这使得在药物筛选的背景下更容易量化7，9，17。
干细胞疗法在干眼症中泪腺再生方面具有巨大前景21。成体干细胞衍生的泪腺类器官可以作为此类应用的源材料。这里介绍的方案导致人泪腺类器官植入，主要是囊肿。由于类器官被注射到错误的部位，可能会出现类器官植入率低。用染料训练注射过程可以跟踪注射部位，并最终提高注射精度。或者，可以切开小鼠表皮以直接进入泪腺，就像在22岁之前的大鼠所做的那样。此方法需要更长的时间，但可能更准确。另一方面，使用本协议，类器官在功能上没有整合到小鼠泪腺中。对于 iPSC 衍生的泪腺植入术也观察到了类似的结果22.通过提前损伤泪腺，使用干眼小鼠模型和/或将类器官作为单细胞或小团块注射，可以进一步改进移植方法。然而，成体干细胞来源的泪腺类器官和相关工具包可以成为未来在泪腺研究和再生医学中应用的基础。
Disclosures
Hans Clevers是巴塞尔罗氏制药研究和早期开发负责人，拥有多项与类器官技术相关的专利。
Acknowledgments
我们感谢Yorick Post对协议的初步开发。这项工作部分得到了英国癌症研究大挑战赛（C6307 / A29058）和马克癌症研究基金会对SPECIFICANCER团队的奖励的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 °C |
| 5x green GoTaq Flexi buffer | Promega | M891A | Store at -20 °C |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Store at -20 °C, stock at 30 mM, 10000x |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | store at 4 °C |
| Agar plates containing Ampicillin | Hubrecht Institute | ||
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclave VAPOUR-Line lite | VWR chemicals | ||
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | Store at -20 °C, 50x |
| BD Micro-Fine insulin needle 1 mL | BD Bioscience | 324825 | |
| Benchtop microscope DMI1 | Leica | ||
| Bovine serum albumine (BSA) | MP biomedicals | 160069 | Store at 4 °C |
| BTXpress | BTX | MDS450805 | |
| C57BL/6 mice | Hubrecht Institute | ||
| Cassettes | Klinipath | 410-02S | |
| CellBanker 1 | amsbio | 11910 | Cryopreservation medium, adhere to instructions |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Citric acid monohydrate | J.T. Baker | 0088 | CAS: 5949-29-1 |
| Collagenase I | Sigma Aldrich | C9407 | Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 °C |
| Conical tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
| Conical tubes 50 mL | Corning | CLS430828-500EA | |
| Coverslips 24 mm x 50 mm | Menzel-Gläzer | BB024050S1 | |
| Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix | R&D Systems, Bio-Techne | 3533-001-02 | Store at -20 °C, keep at 4 °C for up to 1 month |
| DAPT | Sigma Aldrich | D5942 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |
| Disodium hydrogen phosphate anhydrous | VWR chemicals | 28026.292 | CAS: 7558-79-4 |
| Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | CAS:10028-24-7 |
| Dispase | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | Aliquots at 50 U/mL, store at -20 °C until use, 400x |
| Disposable Scalpel Sterile N° 10 | Swann Morton | 3033838 | |
| DM4000 microscope | Leica | ||
| dNTPs 25 mM | Promega | U1420 | Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 °C |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
| Easy strainers 70 µm | Greiner | 542170 | |
| Electroporation cuvette | Nepagene | EC002S | |
| EnVision+/HRP mouse | Agilent | K400111-2 | |
| Ethanol 100% | BOOM | 84045206;5000 | CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions |
| Ethanol 70% | BOOM | 84010059.5000 | CAUTION |
| Ethanol 96% | BOOM | 84050065.5000 | CAUTION |
| EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | Live-imaging brightfield microscrope | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Store at -20 °C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x |
| Fiji | NIH, Fiji developers | ||
| Formaldehyde solution 4% | Sigma-Aldrich | 1.00496 | CAS: 50-00-0, CAUTION |
| Forskolin | Tocris | 1099 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100x |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7805 | Store at -20 °C |
| Haematoxylin | VWR chemicals | 10047105 | Store at room temperature |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | Store at 4 °C, 100x |
| Histocore H and C, Tissue embedding machine | Leica | ||
| Hot plate | Meidax | ||
| Human nucleolar antigen antibody | Abcam | ab-190710 | |
| Hydrochloric acid 5 N | ThermoFisher Scientific | 10605882 | CAS: 7647-01-0, CAUTION |
| Hydrogen peroxyde 30% | Chem-lab | CL00.2308.1000 | CAS: 7722-84-1, CAUTION |
| Hygromycin B-gold | InvivoGen | ant-hg | Stock at 100 mg/µL, 1000x |
| Hygromycin resistance cassette-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
| IsoFlo 100% | Mecan | 5960501 | |
| LB medium | Hubrecht Institute | ||
| MgCl2 25 mM | Promega | A351H | Store at -20 °C |
| Microtome RM2235 | Leica | ||
| Midiprep DNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | K210005 | |
| Miniprep DNA isolation kit | ThermoFisher scientific | K210003 | |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Store at -20 °C, stock at 500 mM, 400x |
| NEPA21 electroporator | Nepagene | ||
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Store at -20 °C, stock at 1M, 100x |
| NOD Scid Gamma (NSG) mice | Hubrecht Institute colony | ||
| Noggin conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
| Noradrenaline | Sigma Aldrich | A7257 | Store at -20 °C, stock at 100 mM |
| Oven | Memmert | Set at 58 °C | |
| P20, P200 and P1000 pipettes | Gilson | ||
| Paraffin | VWR chemicals | 10048502 | |
| Pasteur pipettes, glass plugged | ThermoFisher Scientific | 1150-6973 | |
| Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG | IDT | ||
| Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC | IDT | ||
| pCMV_ABEmax_P2A_GFP | Addgene | 112101 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Store at -20 °C |
| Pertex | Klinipath | AM-08010 | |
| pFYF1320 | Addgene | 47511 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1000X, store at -20 °C |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
| Petri dish, 10 cm | Greiner | 633102 | |
| Q5 buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | Store aliquots at -20 °C |
| R-spondin 3 conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
| sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG | IDT | ||
| Slides | StarFrost | MBB-0302-55A | Adhesive, ground |
| Sodium azide | Merck | 8.22335.1000 | CAS: 26628-22-8, CAUTION |
| Sodium cytrate dihydrate | J.T. Baker | 0280 | CAS: 6132-04-3 |
| Standard Forward Primer: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC |
IDT | ||
| Subcloning efficiency competent cells DH5alpha | Invitrogen | 18265-017 | |
| Suspension cell culture plates (24-well) | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
| Suspension cell culture plates (12-well) | Greiner Bio-One | 665102 | 12-well |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
| TAE buffer | ThermoFisher Scientific | B49 | Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water |
| Transposase-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
| TrypLE Express Enzyme | Invitrogen | 12605-028 | store at 4 °C |
| U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT | IDT | ||
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550 | |
| Water bath | Tulabo | ||
| Xylene | Klinipath | 4055-9005 | CAS: 1330-20-7, CAUTION |
| Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |
References
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