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Biology

माउस और मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स की स्थापना, रखरखाव, भेदभाव, आनुवंशिक हेरफेर, और प्रत्यारोपण

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/65040
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), University Medical Center Utrecht, 2Oncode Institute, Hubrecht Institute

Summary

यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि प्राथमिक माउस और मानव ऊतक से प्राप्त लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स को कैसे स्थापित किया जाए, बनाए रखा जाए, आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जाए, अंतर किया जाए, कार्यात्मक रूप से चिह्नित किया जाए और प्रत्यारोपण किया जाए।

Abstract

लैक्रिमल ग्रंथि ओकुलर सतह होमियोस्टैसिस के लिए एक आवश्यक अंग है। आंसू फिल्म के जलीय भाग का निर्माण करके, यह आंखों को निर्जलीकरण तनाव और बाहरी अपमान से बचाता है। पर्याप्त इन विट्रो मॉडल की कमी के कारण लैक्रिमल ग्रंथि (पैथो) फिजियोलॉजी के बारे में बहुत कम जानकारी है। ऑर्गनॉइड तकनीक ने खुद को कई अंगों के लिए एक उपयोगी प्रयोगात्मक मंच के रूप में साबित किया है। यहां, हम लैक्रिमल ग्रंथि बायोप्सी से शुरू होने वाले माउस और मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स को स्थापित करने और बनाए रखने के लिए एक प्रोटोकॉल साझा करते हैं। संस्कृति की स्थिति को संशोधित करके, हम लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनॉइड कार्यक्षमता को बढ़ाते हैं। ऑर्गेनोइड कार्यक्षमता को "रोने" परख के माध्यम से जांच की जा सकती है, जिसमें लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स को चयनित न्यूरोट्रांसमीटर में उजागर करना शामिल है ताकि उनके लुमेन में आंसू रिलीज हो सके। हम समझाते हैं कि इस घटना को कैसे चित्रित और निर्धारित किया जाए। लैक्रिमल ग्रंथि होमियोस्टैसिस में रुचि के जीन की भूमिका की जांच करने के लिए, इन्हें आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है। हम पूरी तरह से वर्णन करते हैं कि आधार संपादकों का उपयोग करके आनुवंशिक रूप से लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स को कैसे संशोधित किया जाए- गाइड आरएनए डिजाइन से ऑर्गेनॉइड क्लोन जीनोटाइपिंग तक। अंत में, हम दिखाते हैं कि माउस में ऑर्थोटोपिक आरोपण द्वारा मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स की पुनर्योजी क्षमता की जांच कैसे करें। साथ में, यह व्यापक टूलसेट लैक्रिमल ग्रंथि (पैथो) शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए माउस और मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करने के लिए संसाधन प्रदान करता है।

Introduction

लैक्रिमल ग्रंथि ग्रंथियों का उपकला है जो आंसू फिल्म1 की अधिकांश जलीय परत के उत्पादन के लिए जिम्मेदार है। आंसू फिल्म की जलीय परत में न केवल ओकुलर सतह को चिकनाई देने के लिए पानी होता है, बल्कि रोगाणुरोधी घटकों का एक बड़ा प्रदर्शन भी होता है जो ओकुलर सतह को संक्रमण सेबचाता है। जब लैक्रिमल ग्रंथि क्षतिग्रस्त या सूजन हो जाती है, तो सूखी आंख की बीमारी होती है, जिसके परिणामस्वरूप रोगियों को असुविधा होती है और अंततः दृष्टि 3 का नुकसान हो सकताहै। वर्षों से, लैक्रिमल ग्रंथि, विशेष रूप से मानव ग्रंथि का अध्ययन करने के लिए मॉडल सिस्टम 4,5,6 तक सीमित रहे हैं। इसने शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों के तहत लैक्रिमल ग्रंथि समारोह के बारे में ज्ञान अंतर में योगदान दिया है।

हाल ही में, इन विट्रो मॉडल को एक डिश 7,8,9 में लैक्रिमल ग्रंथि का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। ये लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड वयस्क स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं जो एक बाह्य मैट्रिक्स में त्रि-आयामी संरचनाओं के रूप में उगाए जाते हैं, जो विकास कारकों के कॉकटेल के साथ पूरक होते हैं जो विट्रो 7 में उनकी पुनर्योजी क्षमताओं को बनाए रखते हैं। वयस्क स्टेम सेल (एएससी) -व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स का लाभ यह है कि उन्हें स्वस्थ ऊतक विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करते हुए बहुत लंबे समय तक बनाए रखा जा सकता है। इस प्रकार के ऑर्गेनॉइड में केवल उपकला कोशिकाएं होती हैं, प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) -व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के विपरीत, जिसमें स्ट्रोमल कोशिकाएं भी हो सकती हैं, उदाहरण के लिए। प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) -व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के विपरीत, एएससी ऑर्गेनोइड सीधे वयस्क ऊतक से स्थापित होते हैं और विस्तारित करने के लिए किसी भी आनुवंशिक संशोधनों की आवश्यकता नहीं होती है। एएससी ऑर्गेनोइड वयस्क विशेषताओं को व्यक्त करतेहैं 10.

इस प्रोटोकॉल में माउस और मानव प्राथमिक ऊतक से लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड प्राप्त करने के लिए एक टूलबॉक्स होता है। प्रोटोकॉल बताता है कि सरल विकास कारक वापसी द्वारा ऑर्गेनोइड्स की कार्यक्षमता को कैसे बढ़ाया जाए और सूजन परख करके आंसू द्रव का स्राव करने के लिए ऑर्गेनोइड्स को कैसे उकसाया जाए। इस प्रोटोकॉल में सीआरआईएसपीआर-व्युत्पन्न बेस संपादकों का उपयोग करके आनुवंशिक रूप से माउस ऑर्गेनोइड्स को इंजीनियर करने के लिए एक इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित अभिकर्मक विधि भी शामिल है। पारंपरिक कैस 9 के विपरीत, बेस संपादकों का उपयोग डबल-फंसे ब्रेक11,12 उत्पन्न किए बिना जीनोम में एकल आधारों के संशोधन की अनुमति देता है। अंत में, इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों में मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण और बाद में एनग्राफमेंट के हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन का वर्णन किया गया है। इस लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनॉइड टूलकिट का उपयोग लैक्रिमल ग्रंथि पुनर्जनन और कार्य पर अनुसंधान और आनुवंशिक और भड़काऊ रोग मॉडलिंग के लिए किया जा सकता है।

Protocol

माउस प्रयोगों को परियोजना लाइसेंस AVD8010020151 के तहत रॉयल नीदरलैंड्स एकेडमी ऑफ आर्ट्स एंड साइंसेज (KNAW) की पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। ऑर्गेनोइड माउस अधिशेष सामग्री से प्राप्त किए गए थे। प्रोटोकॉल संख्या 18-740 के तहत चिकित्सा नैतिक समिति द्वारा अनुमोदन के बाद यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर यूट्रेक्ट (यूएमसीयू) में सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों के अपशिष्ट पदार्थ से मानव लैक्रिमल ग्रंथि बायोप्सी एकत्र की गई थी। प्रोटोकॉल में कई अनुभाग हैं जो चित्रा 1 में उल्लिखित हैं।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का अवलोकन। यह आंकड़ा प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों पर प्रकाश डालता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नोट: सभी मध्यम और बफर रचनाओं को पूरक तालिका 1 में वर्णित किया गया है।

1. माउस और मानव लैक्रिमल ग्रंथियों से ऑर्गेनोइड्स की स्थापना

  1. माउस लैक्रिमल ग्रंथि को विच्छेदित करना
    1. कैंची, फोर्सऔर विच्छेदन पैड सहित विच्छेदन उपकरण तैयार करें। O2/CO2 इनहेलेशन13 द्वारा एक माउस को इच्छामृत्यु करें।
    2. विच्छेदन पैड पर अपने पेट पर इच्छामृत्यु माउस रखें, और उसके अंगों को पिन करें। 70% इथेनॉल का उपयोग करके माउस कानों के बीच और माथे पर स्थित बालों को गीला करें।
    3. विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, कानों के बीच खोपड़ी के पीछे एक उद्घाटन बनाएं। इस उद्घाटन को माथे पर नाक तक बढ़ाएं। अभी भी कैंची का उपयोग करके, दो फ्लैप उत्पन्न करने के लिए कानों के पीछे की त्वचा को काट लें।
    4. फ्लैप को नाक की ओर मजबूती से खींचें जब तक कि लैक्रिमल ग्रंथियां उजागर न हों, जैसा कि चित्र 2 ए में दिखाया गया है। फ्लैप को विच्छेदन पैड पर पिन करें। कैंची का उपयोग करके, लैक्रिमल ग्रंथि को पूरी तरह से उजागर करने के लिए लैक्रिमल ग्रंथि के ऊपर स्थित झिल्ली में एक छोटा सा चीरा लगाएं।
    5. बल का उपयोग करके, लैक्रिमल ग्रंथि को खींचें। जब तक मुख्य लैक्रिमल वाहिनी फट न जाए तब तक कुछ प्रतिरोध होना चाहिए। यदि पसंद किया जाता है, तो मुख्य लैक्रिमल वाहिनी को सीधे कैंची से काट लें।
    6. आगे की प्रक्रिया तक माउस लैक्रिमल ग्रंथि को ऊतक संस्कृति-ग्रेड पीबीएस में रखें। कोशिका मृत्यु को सीमित करने के लिए 2-4 घंटे के भीतर लैक्रिमल ग्रंथि को संसाधित करने के साथ आगे बढ़ें। यदि इसमें अधिक समय लगता है, तो माउस लैक्रिमल ग्रंथि को बायोप्सी संग्रह माध्यम (पूरक तालिका 1) में रखें।
      नोट: कई लैक्रिमल ग्रंथियों को पूल किया जा सकता है यदि बड़ी संख्या में ऑर्गेनोइड्स की तुरंत आवश्यकता होती है।
  2. मानव लैक्रिमल ग्रंथि बायोप्सी एकत्र करना
    1. सर्जरी से पहले, 50 एमएल ट्यूब में बायोप्सी संग्रह माध्यम (पूरक तालिका 1) के 20 एमएल एलिकोट तैयार करें, और सर्जरी से पहले सर्जन को दें। इस माध्यम को कई महीनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
    2. सर्जरी के दिन, सर्जन को लैक्रिमल ग्रंथि (आमतौर पर <1 मिमी3) के एक टुकड़े का नमूना लेने दें, और इसे बायोप्सी संग्रह माध्यम (पूरक तालिका 1) में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. इसे जल्द से जल्द संसाधित करने के लिए बायोप्सी एकत्र करें। आदर्श रूप से, यह बायोप्सी नमूनाकरण के 2 घंटे के भीतर उसी दिन होना चाहिए।
  3. ऑर्गेनॉइड व्युत्पत्ति
    1. निम्नलिखित को पहले से तैयार करें: पिघला हुआ बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम), कमरे का तापमान (आरटी) माउस या मानव विस्तार माध्यम (पूरक तालिका 1), पिघला हुआ कोलेजनेज, बेस माध्यम (पूरक तालिका 1), दो स्केलपेल, एक 10 सेमी पेट्री डिश, 15 एमएल ट्यूब पर फिट किया गया 70 किमी स्ट्रेनर, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 12-वेल सस्पेंशन प्लेट्स।
    2. अनुपूरक तालिका 1 में दर्शाए गए सभी घटकों को मिलाकर पाचन माध्यम तैयार करें। ऊतक के टुकड़ों से चिपकने से बचने के लिए इस माध्यम में स्केलपेल को पहले से गीला करें।
    3. माध्यम से माउस या मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऊतक को पुनः प्राप्त करें, और इसे पेट्री डिश में रखें।
    4. पहले से गीले स्केलपेल का उपयोग करके, ऊतक को छोटा करें। एक बार जब ऊतक के टुकड़े बहुत छोटे हो जाते हैं (यानी, <0.5 मिमी3), तो उन्हें स्केलपेल के साथ पेट्री डिश से स्क्रैप करके पाचन माध्यम में रखें। यदि मानव बायोप्सी पहले से ही बहुत छोटी है, तो ऊतक हानि से बचने के लिए इसे सीधे पाचन माध्यम में रखें।
    5. ऊतक के टुकड़ों को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 15 मिनट तक इनक्यूबेट करें। टुकड़ों को फिर से निलंबित करने के लिए नियमित रूप से 15 एमएल ट्यूब को उलट दें। एक बेंचटॉप माइक्रोस्कोप के तहत सेल पृथक्करण की निगरानी करें ताकि ऊतक को अधिक न पचाया जा सके।
    6. इस बीच, एक पाश्चर पिपेट को मोड़ते समय अपनी नोक को लौ में रखकर संकीर्ण करें, और इसे आधार माध्यम में पहले से गीला करें। ऊतक को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए, सुनिश्चित करें कि छेद ऊतक के सबसे बड़े टुकड़ों से थोड़ा छोटा है। पृथक्करण प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए, मिश्रण को हर 5 मिनट में पूर्व-गीले संकुचित पाश्चर पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइप करें।
    7. जब माइक्रोस्कोप के नीचे कई एकल कोशिकाएं और छोटे झुरमुट दिखाई देते हैं, तो आधार माध्यम के 10 एमएल जोड़कर पृथक्करण को रोकें। कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 5 मिनट के लिए 400 x g पर स्पिन करें।
    8. सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और धोने को दोहराने के लिए आधार माध्यम के 10 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। बड़े अनपचे हुए ऊतक के टुकड़ों और शेष कोलेजन फाइबर को हटाने के लिए इसे 70 μm छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें, जो ईसीएम के पर्याप्त पोलीमराइजेशन को रोक देगा। 5 मिनट के लिए 400 x g पर एल्यूएट को घुमाएं।
      नोट: एक लाल कोशिका गोली लाल रक्त कोशिकाओं की उपस्थिति को इंगित करती है, जो आमतौर पर ऑर्गेनॉइड व्युत्पत्ति में बाधा नहीं डालती है। हालांकि, कुछ अनुप्रयोगों के लिए, जैसे कि फ्लो साइटोमेट्री, लाल रक्त कोशिकाओं को लाइसिस किया जाना चाहिए। इसके लिए, कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए आरटी पर ताजा लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के 5 एमएल में इनक्यूबेट करें, और 5 मिनट के लिए 400 x g पर कोशिकाओं को गोली मार दें।
    9. सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और मानव बायोप्सी के लिए एकल माउस लैक्रिमल ग्रंथि के लिए ठंडे ईसीएम के 100 μL में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें और मानव बायोप्सी के लिए 50 μL ठंडे ईसीएम में। पुन: निलंबन करते समय, बुलबुले न बनाने के लिए सतर्क रहें, क्योंकि ये ईसीएम पोलीमराइजेशन और स्थिरता को भी प्रभावित करेंगे।
    10. 12-वेल सस्पेंशन प्लेट के प्रति कुएं में 100 μL तक कोशिकाओं का बीज लें। कुएं में ~ 20 μL बूंदें बनाने के लिए P200 का उपयोग करें। बूंदें जितनी छोटी होती हैं, मैट्रिक्स के माध्यम से विकास कारकों और पोषक तत्वों का प्रसार उतना ही बेहतर होता है।
    11. ईसीएम को जमने की अनुमति देने के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में उल्टा रखें।
    12. एक बार ईसीएम ठोस हो जाने के बाद, 12 वेल-प्लेट के प्रति कुएं में आरटी माउस या मानव विस्तार माध्यम का ~ 1 एमएल जोड़ें। हर 2-3 दिनों में माध्यम को ताज़ा करें जब तक कि ऑर्गेनोइड ्स 300 μm के आकार तक न पहुंच जाएं। इसके लिए, कुएं में माध्यम को एस्पिरेट करें, और ईसीएम बूंदों को छूने के बिना धीरे से कुएं के किनारे विस्तार माध्यम जोड़ें ताकि उन्हें बाधित न किया जा सके।
      नोट: बैक्टीरिया संदूषण होने पर प्रिमोसिन (100 मिलीग्राम / एमएल; वाणिज्यिक स्टॉक से 1: 1,000) को अलगाव पर जोड़ा जा सकता है। हालांकि, क्योंकि यह ऑर्गेनोइड विकास को भी धीमा कर देता है, इसलिए इसे जोड़ना या एक या दो अंशों के बाद इसे हटाना बेहतर होता है।

2. माउस और मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड का विस्तार

  1. माउस ऑर्गेनोइड्स के लिए ~ 7 दिनों और मानव ऑर्गेनोइड्स के लिए ~ 10 दिनों के बाद, जब ऑर्गेनोइड ~ 300 μm के आकार तक पहुंच जाते हैं, तो संस्कृति माध्यम को हटा दें।
  2. ट्रिप्सिन घोल के 1 एमएल में ऑर्गेनोइड्स युक्त ईसीएम बूंदों को पी 1,000 के साथ जोर से ऊपर और नीचे करके फिर से निलंबित करें जब तक कि बूंदें अलग न हो जाएं। इस मिश्रण को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में संक्षेप में इनक्यूबेट करें।
  3. 2-3 मिनट के बाद, ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन को 10x-15x ऊपर और नीचे पाइप करने के लिए एक संकुचित और पूर्व-गीले पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। बेंचटॉप माइक्रोस्कोप के तहत ऑर्गेनोइड्स की पृथक्करण स्थिति की जांच करें; ~ 20 कोशिकाओं के छोटे झुरमुट प्राप्त किए जाने चाहिए। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में लंबे समय तक इनक्यूबेट करें, और पृथक्करण संतोषजनक होने तक पाइपिंग चरण को दोहराएं।
    नोट: यह कदम मानव ऑर्गेनोइड्स के लिए अधिक समय ले सकता है क्योंकि वे बहु-स्तरीय हैं। एकल कोशिकाएं उत्पन्न होंगी; यह ऑर्गेनॉइड आउटग्रोथ को प्रभावित नहीं करता है जब तक कि अधिकांश ऑर्गेनॉइड निलंबन में छोटे झुरमुट होते हैं।
  4. आधार माध्यम के 10 एमएल जोड़कर पृथक्करण बंद करें। फिर, 5 मिनट के लिए 400 x g पर कोशिकाओं को गोली मार दें।
  5. सुपरनैटेंट और ईसीएम को हटाने के बाद जो ऑर्गेनोइड्स (ऑर्गेनोइड्स के बिना पारदर्शी, जेली जैसी परत) के शीर्ष पर हो सकते हैं, निलंबन प्लेट में चढ़ाने से पहले कोशिकाओं को ठंडे ईसीएम की उचित मात्रा में पुन: निलंबित करें, जैसा कि चरण 1.3.10 में दर्शाया गया है।
    नोट: आम तौर पर, माउस लैक्रिमल ऑर्गेनोइड्स को 1: 5 अनुपात में और मानव ऑर्गेनोइड्स को 1: 3 अनुपात में विभाजित किया जाता है। इसका मतलब यह है कि, जब ईसीएम के 100 μL में निहित ऑर्गेनोइड्स के साथ शुरू होता है, तो उन्हें विभाजन के बाद क्रमशः 500 μL और 300 μL में पुन: निलंबित करने की आवश्यकता होती है।
  6. 30 मिनट के लिए ईसीएम के जमने तक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट को उल्टा-सीधा इनक्यूबेट करें, और आरटी पर माउस या मानव विस्तार माध्यम के साथ ऑर्गेनोइड्स को कवर करें।

3. क्रायोप्रिजर्विंग माउस और मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स

  1. ऑर्गेनोइड्स को क्रायोप्रिजर्व करने के लिए, पहले सेक्शन 2 में दिए गए निर्देशों के अनुसार ऑर्गेनोइड्स को विस्तार माध्यम में विभाजित करें।
  2. लगभग 3-4 दिन बाद, जब ऑर्गेनोइड्स विकास चरण में होते हैं, तो माध्यम को हटा दें, और 10 एमएल कोल्ड बेस माध्यम में ऑर्गेनोइड युक्त ईसीएम के 100 μL को फिर से निलंबित करें। ईसीएम को अलग करने में मदद करने के लिए 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए ट्यूब को नियमित रूप से फ्लिप करें।
  3. 5 मिनट के लिए 500 x g पर ऑर्गेनोइड्स को पेलेट करें। सुपरनैटेंट को हटा दें, और क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम के 1 एमएल में ऑर्गेनॉइड पेलेट को फिर से निलंबित करें (बचा हुआ ईसीएम क्रायोप्रिजर्वेशन को खराब नहीं करता है)। ऑर्गेनॉइड निलंबन को क्रायोवियल में स्थानांतरित करें और तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें।
    नोट: सामग्री की तालिका में वर्णित क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम का उपयोग करते समय, क्रायोवियल्स को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में अनिश्चित काल तक रखा जा सकता है। यदि एक और क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम का उपयोग किया जाता है, तो इष्टतम संरक्षण सुनिश्चित करने के लिए 24 घंटे के बाद क्रायोवियल को तरल नाइट्रोजन टैंक में स्थानांतरित करें।
  4. ऑर्गेनोइड्स को पिघलाने के लिए, फ्रीजर से क्रायोवियल को पुनः प्राप्त करें, और इसे सूखी बर्फ पर 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ले जाएं। क्रायोवियल को पानी में तब तक रखें जब तक कि इसकी अधिकांश सामग्री पिघल न जाए। सामग्री को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 10 एमएल बेस माध्यम होता है, और 5 मिनट के लिए 400 x g पर कोशिकाओं को घुमाएं।
  5. विस्तार माध्यम के साथ ईसीएम के 100 μL में ऑर्गेनोइड्स को प्लेट करें, जैसा कि चरण 2.5 और चरण 2.6 में वर्णित है।

4. लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स को अलग करना और उनकी कार्यक्षमता का आकलन करना

  1. ऑर्गेनॉइड भेदभाव
    1. लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स को अलग करने के लिए, पहले खंड 2 में दिए गए निर्देशों के अनुसार विस्तार माध्यम में ऑर्गेनोइड्स को विभाजित करें।
    2. 2 दिनों के बाद, चरण 1.3.12 में वर्णित माउस या मानव भेदभाव माध्यम के साथ विस्तार माध्यम को बदलें। उस माध्यम में 5 दिनों के लिए माउस ऑर्गेनोइड्स और 9 दिनों के लिए मानव ऑर्गेनोइड्स को बनाए रखने के लिए हर 2-3 दिनों में माध्यम को ताज़ा करें।
    3. विभेदन माध्यम में 5 दिनों या 9 दिनों के बाद ऑर्गेनॉइड भेदभाव का आकलन करने के लिए, आरएनए को निकालने के लिए ऑर्गेनोइड युक्त ईसीएम के 100 μL एकत्र करें। ऐसा करने के लिए, पी 1,000 का उपयोग करके कुएं में निहित माध्यम के 1 एमएल में ईसीएम बूंदों को फिर से निलंबित करें, और ऑर्गेनॉइड निलंबन को 3 एमएल बर्फ-ठंडे आधार माध्यम में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 500 x g पर ऑर्गेनोइड्स को पेलेट करें।
    4. सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और आरएनए निष्कर्षण बफर में गोली को फिर से निलंबित करें। आरएनए निष्कर्षण किट के निर्देशों के अनुसार डाउनस्ट्रीम आरएनए निष्कर्षण करें। उदाहरण के लिए, स्टेम कोशिकाओं (टीपी 63, केआरटी 5, केआरटी 14) और विभेदित सेल मार्करों (एलसीएन 2, डब्ल्यूएफडीसी 2, एक्यूपी 5, एलटीएफ, एसीटीए 2 ...) की अभिव्यक्ति के आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए प्राप्त आरएनए का उपयोग करें। 14.
      नोट: प्रासंगिक अभिव्यक्ति विश्लेषण प्राप्त करने के लिए, एक या कई ऊतक नमूनों में चुने गए मार्करों की अभिव्यक्ति को मापें। विभेदन स्थितियों के तहत संवर्धित ऑर्गेनोइड्स में कम आरएनए होता है।
  2. कार्यात्मक सूजन परख
    नोट: प्रोटोकॉल के इस हिस्से के लिए, मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करें जिन्हें कम से कम 7 दिनों के लिए विभेदित किया गया है। कार्यात्मक फाड़ने के लिए पर्याप्त मार्कर अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक न्यूनतम समय 7 दिन है। 12-वेल प्लेट का प्रत्येक कुआं एक शर्त का गठन करता है। शर्तों की न्यूनतम संख्या तीन है: एक सकारात्मक नियंत्रण, एक नकारात्मक नियंत्रण और एक परीक्षण की स्थिति।
    1. मानव विभेदन माध्यम के 1 एमएल को ताजा तैयार करें जिसमें व्यक्तिगत घटक होते हैं जो लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स द्वारा स्राव को प्रेरित करते हैं। उदाहरण के लिए, 100 μM नॉरएड्रेनालाईन और 1 μM forskolin जोड़ें, और अच्छी तरह मिलाएं।
      नोट: फोर्सकोलिन एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है जो आमतौर पर अधिकतम सूजन को प्रेरित करता है।
    2. एक स्वचालित ब्राइटफील्ड टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोप पर, प्लेट, समय अंतराल (5 मिनट), और अवधि (4 घंटे) में चित्रित किए जाने वाले पदों को सेट करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक स्थिति में एक संपूर्ण ईसीएम बूंद दिखाई दे रही है।
    3. छवि शुरू करने से ठीक पहले और माइक्रोस्कोप से प्लेट को स्थानांतरित किए बिना, चित्रित किए जाने वाले कुओं से संस्कृति माध्यम को हटा दें, और इसे चरण 4.2.1 में तैयार अच्छी तरह से निलंबित माध्यम से बदलें। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में केवल विभेदन माध्यम द्वारा प्रतिस्थापित भेदभाव माध्यम के साथ एक कुएं को शामिल करें, क्योंकि मध्यम जलपान कुछ ऑर्गेनोइड सूजन को ट्रिगर कर सकता है।
    4. 4 घंटे तक, सूजन परख खत्म हो जाती है। परिणामों का विश्लेषण करें।
      नोट: ये चरण एक ईवीओएस एम 7000 माइक्रोस्कोप के साथ किए जाते हैं जो स्वचालित ब्राइटफील्ड टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। उस माइक्रोस्कोप के लिए, टाइम-लैप्स इमेजिंग सेट करने के लिए विस्तृत निर्माता के मैनुअल को देखें। ध्यान दें, समान विशेषताओं वाले किसी भी अन्य माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जा सकता है।
    5. ऑर्गेनोइड सूजन को मापने के लिए, 0 घंटे और 4 घंटे पर प्रत्येक व्यक्तिगत ऑर्गनॉइड के व्यास को मापें। ImageJ में 0 घंटे और 4 घंटे पर एक एकल ऑर्गनॉइड बूंद की छवियों को खोलें।
    6. टूलबार में सीधी रेखा आइकन पर क्लिक करें, और पहले 0 घंटे पर एक ऑर्गेनॉइड का व्यास खींचें। फिर, इस रेखा की लंबाई को मापने के लिए इमेजजे (विश्लेषण > माप) में माप उपकरण का उपयोग करें और इसलिए, सूजन से पहले ऑर्गेनॉइड व्यास। सूजन के बाद ऑर्गेनॉइड व्यास प्राप्त करने के लिए 4 घंटे पर उसी ऑर्गेनॉइड पर प्रक्रिया को दोहराएं।
    7. सूजन परख से पहले और बाद में प्रति स्थिति ~ 20 ऑर्गेनोइड के ऑर्गेनोइड व्यास को मापें।

5. पैक्स 6 को बाहर निकालने के लिए एक प्लास्मिड का निर्माण

  1. जीआरएनए डिजाइन नॉकआउट तक Pax6 सी > टी आधार संपादकों का उपयोग करना
    नोट: जीआरएनए डिजाइन के लिए बहुत सारे सॉफ्टवेयर प्रोग्राम उपलब्ध हैं। यहां, बेंचलिंग का उपयोग किया गया था क्योंकि यह एकीकृत जीआरएनए डिजाइन, एनोटेशन और सेंगर निशान के संरेखण की अनुमति देता है। इस प्रकार, बाद के सभी चरणों को वैकल्पिक सॉफ्टवेयर कार्यक्रमों का उपयोग करके भी किया जा सकता है।
    1. डीएनए अनुक्रम आयात करने के लिए नए (+) > डीएनए अनुक्रम पर क्लिक करके बेंचलिंग में लक्ष्य जीन की कल्पना करके जीआरएनए डिजाइन प्रक्रिया शुरू >।
    2. डेटाबेस से आयात टैब में, रुचि का जीन, Pax6 लिखें, और खोज दबाएँ.
    3. माउस संदर्भ जीनोम GRCm38 (mm10, Mus musculus) के नवीनतम निर्माण का चयन करें, और आयात दबाएँ।
    4. एक्सॉन का चयन करें जहां नॉक-आउट जीआरएनए को निम्नलिखित नियमों का पालन करके डिज़ाइन किया जा सकता है:
      1. पहले कोडिंग एक्सॉन में जीआरएनए डालने से बचें, क्योंकि बाद के एक्सॉन में वैकल्पिक स्टार्ट साइटों का उपयोग सेल द्वारा प्रारंभिक प्रेरित स्टॉप कोडन को दरकिनार करने के लिए किया जा सकता है।
      2. एक्सॉन में जीआरएनए डिजाइन करें जो सभी वैकल्पिक प्रतिलिपियों में मौजूद हैं जो पैक्स 6 एमआरएनए के स्प्लिसिंग द्वारा हो सकते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए, Ensembl जीनोम ब्राउज़र में Pax6 की कल्पना करें, और एक्सॉन का चयन करें जो सभी प्रतिलिपियों में उपयोग किया जाता है।
      3. वैकल्पिक स्प्लिसिंग को और दरकिनार करने के लिए, एक एक्सॉन को लक्षित करें जिसमें एक अपूर्ण कोडन (ट्रिपल के एक या दो शेष आधार) हैं। यह कम महत्व का है लेकिन प्रेरित इंडेल के प्रभावों के बारे में अधिक निश्चितता देता है। पैक्स 6 के लिए, एक्सॉन 4 से एक्सॉन 11 एक अच्छा लक्ष्य हैं। इसके अलावा, एक एक्सॉन चुनें जिसमें ट्रिप्टोफैन (डब्ल्यू), ग्लूटामाइन (क्यू), या आर्जिनिन (आर) अवशेष हों।
        नोट: मानक सी > टी बेस संपादक जो एसपीकेएएस 9 का उपयोग करते हैं, उनके पास एक संपादन विंडो है जो जीआरएनए की शुरुआत से न्यूक्लियोटाइड 4 से न्यूक्लियोटाइड 8 तक फैली हुई है (पीएएम से सबसे दूर)। सी > टी बेस संपादक रिवर्स स्ट्रैंड पर जीआरएनए के साथ सभी ट्रिप्टोफैन (डब्ल्यू) अवशेषों (टीजीजी से टीजीए, टीएजी या टीएए) पर स्टॉप कोडन पेश कर सकते हैं, ग्लूटामाइन (क्यू) अवशेषों (सीएजी से टीएजी या सीएए से टीएए), और अंत में, आगे स्ट्रैंड पर आर्जिनिन (आर) अवशेषों (सीजीए से टीजीए) पर।
    5. अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम एक्सॉन + 20 बेस का चयन करें। लक्ष्य चिह्न CRISPR पर स्क्रीन के दाईं ओर क्लिक करें, और डिज़ाइन और विश्लेषण गाइड पर क्लिक करें।
    6. नए खोले गए मेनू में, टैब डिज़ाइन प्रकार के तहत, "आधार संपादन" (कोमोर एट अल. 2016) के लिए गाइड को टिक करें। गाइड की लंबाई 20 न्यूक्लियोटाइड पर रखें, और माउस के लिए जीनोम के तहत, जीआरसीएम 38 (मिमी 10, मस्कुलस) का चयन करें।
    7. हरे + चिह्न पर क्लिक करने के बाद, सॉफ्टवेयर प्रोग्राम स्वचालित रूप से सभी प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) अनुक्रमों का पता लगाएगा और स्क्रीन के दाईं ओर, रुचि के एक्सॉन के आसपास के क्षेत्र में सभी संभावित जीआरएनए की एक सूची बनाएगा।
    8. सूची के माध्यम से स्क्रॉल करें जब तक कि एक लाल बॉक्स में स्टॉप कोडन संकेत (*) न हो, जो एक जीआरएनए के लिए संकेत देता है जो संभावित रूप से एक एमिनो एसिड को स्टॉप कोडन में बदल सकता है और इस प्रकार, नॉक-आउट का परिणाम होता है।
    9. जीआरएनए अनुक्रम के दाईं ओर पहले कॉलम में, संपादन विंडो के चारों ओर प्रत्येक लक्ष्य "सी" के लिए, सिलिको अनुमानित संपादन क्षमता की गणना की जाती है। सुनिश्चित करें कि स्टॉप कोडन में परिणाम देने वाले सी > टी संपादन में कम से कम ~ 10 की संपादन दक्षता है।
    10. यह जांचने के लिए ऑफ-टारगेट कॉलम में मान पर क्लिक करें कि जीआरएनए किस ऑफ-टारगेट लोकी से जुड़ सकता है। विशिष्टता बढ़ाने के लिए किसी भी अतिरिक्त जीन को बांधने वाले जीआरएनए को चुनने से बचें। उदाहरण के लिए, पैक्स 6 को सी > टी बेस एडिटर के साथ संपादित करने के लिए एक अच्छा जीआरएनए एक्सॉन 7 को लक्षित करता है और 5 '-AAGCACAGATGGGCGCAGA-3' है।
    11. स्क्रीन के ऊपरी दाईं ओर एनोटेशन आइकन पर क्लिक करके बेंचलिंग फ़ाइल में एक एनोटेशन बनाएं, इसके बाद नया एनोटेशन। एनोटेशन को नाम दें, और सुनिश्चित करें कि स्ट्रैंड ड्रॉप-डाउन मेनू में सही जीआरएनए अभिविन्यास का चयन किया गया है।
  2. जीआरएनए प्लास्मिड उत्पादन
    नोट: ऑर्गेनोइड्स में जीआरएनए वितरण के लिए विभिन्न वैक्टर उपलब्ध हैं। निम्नलिखित प्लास्मिड का उपयोग जीआरएनए निर्माण के लिए एक आधार के रूप में किया गया था: पीएफवाईएफ 1320 (एडजीन # 47511, कीथ जौंग से एक प्रकार का उपहार)।
    1. pFYF1320 में GRNA को क्लोन करने के लिए, मानक फॉरवर्ड प्राइमर का उपयोग करके एक व्युत्क्रम पीसीआर रणनीति लागू करें: "/5phos / GTTTTAGAGCTAGAAGATAGCAAGTAAAGAGGC। रिवर्स प्राइमर को डिजाइन करने के लिए, निम्नलिखित सार्वभौमिक रिवर्स प्राइमर भाग के सामने जीआरएनए स्पेसर अनुक्रम (जीआरएनए अभिविन्यास [+ या - स्ट्रैंड]) के रिवर्स पूरक को पेस्ट करें: सीजीजीटीजीटीटीटीसीसीएएजी। सी > टी बेस संपादक का उपयोग करके माउस पैक्स 6 के एक्सॉन 7 को लक्षित करने के लिए, रिवर्स प्राइमर निम्नानुसार है: TCTGCCCCTGTTGTTCTTCGGTGTTTCTCCAAG। दोनों प्राइमर ऑर्डर करें।
    2. 61 डिग्री सेल्सियस के एनीलिंग तापमान पर 35 चक्रों के लिए उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके एक टेम्पलेट के रूप में पीएफवाईएफ 1320 के 1 एनजी का उपयोग करके एक उलटा पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएं।
    3. 2,281 बेस जोड़े (बीपी) के अपेक्षित टुकड़े की कल्पना करने के लिए ~ 45 मिनट के लिए टीएई बफर में 1% एगारोस जेल पर पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएं। पसंद की किट का उपयोग करके जेल क्लीन-अप करें।
    4. निम्नलिखित लिगेशन प्रतिक्रिया सेट करें: 100 एनजी क्लीन-अप पीसीआर उत्पाद, प्रारंभिक पीएफवाईएफ 1320 टेम्पलेट डीएनए को हटाने के लिए डीपीएन 1 एंजाइम, और टी 4 लिगेज। मिश्रण को 20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट और 80 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. प्रतिक्रिया मिश्रण को रासायनिक रूप से सक्षम डीएच 5 बैक्टीरिया में बदलें, और एम्पीसिलीन 15 युक्त आगरप्लेटों पर बैक्टीरिया फैलाएं।
    6. अगले दिन, 3 एमएल लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) माध्यम में तीन अलग-अलग कॉलोनियों को चुनें और विस्तारित करें, जो 50 μg / mL एम्पीसिलिन के साथ पूरक हैं।
    7. अगले दिन, एक मिनीप्रेप किट का उपयोग करके तीन मिनी-संस्कृतियों में से प्रत्येक के 1 एमएल पर एक मिनीप्रेप करें, और बाकी को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्राप्त प्लास्मिड को U6_Forward प्राइमर के साथ सेंगर अनुक्रमण के अधीन करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि जीआरएनए वेक्टर16 में सही ढंग से डाला गया है।
    8. सही प्लास्मिड के साथ एक एकल जीवाणु कॉलोनी की पहचान करने के बाद, प्लास्मिड डीएनए को रात भर बढ़ाने के लिए एम्पीसिलीन के साथ पूरक एलबी के 50 एमएल में संबंधित मिनी-कल्चर के 500 μL का टीकाकरण करें। मिडिप्रेप किट का उपयोग करने के अगले दिन मिडी-प्रेप करें। इस प्लास्मिड का उपयोग धारा 6 में इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए किया जाएगा।

6. पैक्स 6 केओ क्लोन की पीढ़ी

  1. ऑर्गेनॉइड इलेक्ट्रोपोरेशन
    1. माउस ऑर्गेनोइड्स से शुरू करें जो अधिकतम 5 दिन पहले विभाजित किए गए थे ताकि वे एक प्रोलिफेरेटिव अवस्था में हों। प्रति नॉक-आउट ऑर्गेनॉइड बूंदों के ~ 300-400 μL का उपयोग करें। एक नकारात्मक नियंत्रण का चयन करने के लिए एक अतिरिक्त शर्त शामिल करें जिसे किसी भी प्लास्मिड के बिना इलेक्ट्रोपोरेट किया जाएगा।
    2. ऑर्गेनोइड्स को अलग करने के लिए चरण 2.1-2.4 करें, लेकिन ऑर्गेनोइड्स को लंबे समय तक अलग करें ताकि वे एकल कोशिकाएं हों। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    3. इलेक्ट्रोपोरेशन बफर के 80 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया।
    4. 1.5 एमएल ट्यूब में, अधिकतम 20 μL के लिए निम्नलिखित प्लास्मिड तैयार करें: 2.5 μg pFYF1320-gRNA प्लास्मिड, 2.8 μg ट्रांसपोसेस युक्त प्लास्मिड, 7.2 μg हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोध ट्रांसपोसन युक्त प्लास्मिड, और 7.5μg pCMV_ABEmax_P2A_GFP।
      नोट: pFYF1320-gRNA प्लास्मिड पहले से डिज़ाइन किए गए जीआरएनए को एन्कोड करता है, जो बेस एडिटर को लक्ष्य स्थान पर मार्गदर्शन करता है। pCMV_ABEmax_P2A_GFP प्लास्मिड बेस एडिटर, साथ ही एक जीएफपी रिपोर्टर को एन्कोड करता है, जिसका उपयोग उन कोशिकाओं की निगरानी के लिए किया जा सकता है जो इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद बेस एडिटर को व्यक्त करते हैं। ट्रांसपोसेज युक्त प्लास्मिड ट्रांसपोसेज को एन्कोड करता है, जो हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोध ट्रांसपोसन युक्त प्लास्मिड द्वारा प्रदान किए गए हाइग्रोमाइसिन-प्रतिरोध कैसेट को जीनोम में यादृच्छिक रूप से पेस्ट करता है। जिन कोशिकाओं ने इस कैसेट को अपने जीनोम में शामिल किया है, वे हाइग्रोमाइसिन के लिए प्रतिरोधी हो जाते हैं और हाइग्रोमाइसिन के अतिरिक्त सकारात्मक रूप से चुने जा सकते हैं। चूंकि कई प्लास्मिड का सह-समावेश बहुत संभावना है, हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोध उन कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए एक कार्यात्मक चयन का गठन करता है जिन्हें पैक्स 6 के लिए संपादित किया गया है।
    5. प्लास्मिड को कोशिकाओं में जोड़ें, और ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    6. पोरिंग पल्स (वोल्टेज: 175 वी; पल्स लंबाई: 5 एमएस; पल्स अंतराल: 50 एमएस; दालों की संख्या: 2; क्षय दर: 10%; ध्रुवीयता: +) और ट्रांसफर पल्स (वोल्टेज: 20 वी; पल्स लंबाई: 50 एमएस; पल्स अंतराल: 50 एमएस; दालों की संख्या: 5; क्षय दर: 40%; ध्रुवीयता: +/-) के लिए निम्नलिखित मापदंडों के साथ इलेक्ट्रोपोरेटर सेट करें।
    7. प्लास्मिड के साथ कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट में रखें। प्रतिरोध (Ω) को तुरंत मापें, जो 0.30 ए और 0.55 ए के बीच होना चाहिए, और तुरंत इलेक्ट्रोपोरेट करें। इस चरण को जल्दी से करने के लिए कोशिकाओं को क्यूवेट के तल पर बसने से बचने और इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता को कम करने की आवश्यकता होती है।
    8. कोशिकाओं को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और एक रो-काइनेज अवरोधक के साथ पूरक इलेक्ट्रोपोरेशन बफर के 400 μL जोड़ें। कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए आरटी पर ठीक होने दें।
    9. कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 500 x g पर पेलेट करें, सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और कोशिकाओं को 200 μL ईसीएम में प्लेट करें। जमने के बाद, माउस विस्तार माध्यम जोड़ें।
    10. सिस्टिक ऑर्गेनोइड 2-3 दिनों के बाद बढ़ते हैं। जीएफपी सिग्नल की निगरानी करें, जो दैनिक सी > टी बेस एडिटर की उपस्थिति का खुलासा करता है।
  2. ऑर्गेनॉइड चयन
    1. ~ 3 दिनों के बाद, जब ऑर्गेनोइड ठीक हो जाते हैं, तो माउस विस्तार माध्यम में 100 μg / mL हाइग्रोमाइसिन जोड़ें ताकि ऑर्गेनोइड्स का चयन किया जा सके जिन्होंने हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोध कैसेट को एकीकृत किया है। एक उच्च संभावना है कि कोशिकाएं जो एक प्लास्मिड लेती हैं, वे कई प्लास्मिड लेंगी। हाइग्रोमाइसिन-प्रतिरोधी ऑर्गेनोइड्स का चयन करके, पैक्स 6 लोकस पर संपादित ऑर्गेनोइड समृद्ध होते हैं।
    2. जब नकारात्मक नियंत्रण में सभी कोशिकाएं मृत हो जाती हैं और जीवित ऑर्गेनोइड ~ 300 μm होते हैं, तो हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोधी ऑर्गेनोइड चुनें।
  3. ऑर्गेनॉइड पिकिंग और जीनोटाइपिंग
    1. माइक्रोस्कोप के बगल में बाँझ पी 20 युक्तियां तैयार करें और बर्फ पर प्रत्येक पर 100 μL ट्रिप्सिन समाधान वाले 1.5 एमएल ट्यूब।
    2. एक पी 20 टिप को बल के साथ मोड़ें। बेंचटॉप माइक्रोस्कोप पर जीवित ऑर्गेनोइड्स युक्त प्लेट का निरीक्षण करें। जब एक जीवित ऑर्गेनॉइड फोकस में होता है, तो प्लेट के ढक्कन को हटा दें। मुड़े हुए पी 20 टिप का उपयोग करके और अभी भी माइक्रोस्कोप के नीचे, प्रत्येक जीवित ऑर्गनॉइड को व्यक्तिगत रूप से एस्पिरेट करें, और इनमें से प्रत्येक को ट्रिप्सिन समाधान युक्त एक अलग ट्यूब में रखें।
    3. 20 क्लोन तक उठाएं। चुने जाने वाले क्लोनों की संख्या प्रत्येक प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए आवश्यक क्लोनों की संख्या और संपादन दक्षता पर निर्भर करती है, जो प्रत्येक जीआरएनए और लोकस के आधार पर भिन्न होती है।
    4. जब सभी क्लोन चुन लिए जाते हैं, तो 1.5 एमएल ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 5 मिनट तक रखें। पृथक्करण गति बढ़ाने के लिए नियमित रूप से प्रत्येक ट्यूब को भंवर करें, और बेंचटॉप माइक्रोस्कोप के तहत ऑर्गेनोइड्स की जांच करें। जब ऑर्गेनोइड्स को छोटे झुरमुट और / या एकल कोशिकाओं में अलग कर दिया जाता है, तो 1 एमएल बेस माध्यम जोड़कर पाचन को रोक दें।
    5. चुने गए प्रत्येक क्लोन के लिए, एक अलग 1.5 एमएल ट्यूब में जीनोटाइप के लिए ~ 400 μL रखें। 5 मिनट के लिए 500 x g पर छोड़े गए ~ 600 μL को घुमाएं, सुपरनैटेंट को हटा दें, कोशिकाओं को ईसीएम के 20 μL में फिर से निलंबित करें, उन्हें 24-वेल प्लेट के कुएं में एकल बूंद के रूप में प्लेट करें, और हाइग्रोमाइसिन के बिना माउस विस्तार माध्यम जोड़ें।
    6. क्लोनों को जीनोटाइप करने के लिए, 5 मिनट के लिए 500 x g पर ~ 400 μL सेल सस्पेंशन युक्त ट्यूबों को घुमाएं, सुपरनैटेंट को हटा दें, और डीएनए निकालने के लिए डीएनए निष्कर्षण बफर के 50 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    7. कोशिकाओं को तुरंत निम्नानुसार इनक्यूबेट करें: 60 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट, भंवर, और 95 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट। इस डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों तक रखा जा सकता है, लेकिन डाउनस्ट्रीम पीसीआर को तुरंत करना सबसे इष्टतम है।
    8. न्यूक्लियस के साथ लक्षित टिड्डी को बढ़ाने के लिए, निकाले गए डीएनए के 2 μL पर पहले से ऑर्डर किए गए पर्याप्त जीनोटाइपिंग प्राइमर और कम-निष्ठा पोलीमरेज़ का उपयोग करके पीसीआर करें। जीनोटाइपिंग प्राइमरों में एजीएसीटीजीटीटीसीसीएजीसीटीजी (Pax6_C>T_F) और टीसीटीसीसीटीएजीजीटीएजीजीएजीसी (Pax6_C>T_R) शामिल हैं। एम्प्लिकॉन को अपेक्षित संपादित स्थान से लगभग 100 बीपी शुरू करना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह कुशलता से अनुक्रमित है।
    9. पीसीआर दक्षता का आकलन करने के लिए पीसीआर उत्पाद को एक अगारोस जेल पर चलाएं, जैसा कि चरण 5.2.3 में उल्लेख किया गया है। जब सही आकार के बैंड का पता चलता है, तो किट का उपयोग करके डीएनए जेल निष्कर्षण करने के लिए इसे जेल से काट लें।
    10. जीनोटाइपिंग प्राइमरों के साथ पहले उठाए गए प्रत्येक ऑर्गेनॉइड क्लोन से निकाले गए डीएनए को अनुक्रमित करें।
    11. बेंचलिंग में पैक्स 6 जीन के लिए प्राप्त अनुक्रमों को संरेखित करें। चरण 4.1 से आयातित जीन अनुक्रम खोलें। दाईं ओर संरेखण पर क्लिक करें, और फिर नया संरेखण बनाएँ पर। अनुक्रमण प्रदाता से प्राप्त .ab1 फ़ाइलों को अपलोड करें, न्यूक्लियोटाइड प्रकार के रूप में डीएनए का चयन करें, और अगला दबाएं।
    12. निम्न विंडो में, संरेखण बनाएँ पर क्लिक करने से पहले मल्टीसीक्वेंस और संरेखण प्रोग्राम ऑटो (MAFFT) का चयन करें।
    13. उन जीनोटाइप की पहचान करें जिनमें दोनों एलील्स पर होमोजीगस प्रीमैच्योर स्टॉप कोडन (जैसा कि बेस एडिटर्स के साथ प्राप्त किया गया है) है। संबंधित ऑर्गनॉइड क्लोन को विस्तार ति करने के लिए रखें, और आगे के विश्लेषण के लिए इन्हें क्रायोप्रिजर्व करें। आदर्श रूप से, संभावित न्यूक्लियस ऑफ-टारगेट प्रभावों को दरकिनार करने के लिए तीन अलग-अलग ऑर्गेनॉइड क्लोनों का साथ-साथ विश्लेषण किया जाना चाहिए।

7. एनएसजी चूहों में मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स का ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण

  1. ऑर्गेनॉइड की तैयारी
    1. मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स को प्रत्यारोपण के दिन से 3 दिन पहले विभाजित किया जाना चाहिए, जैसा कि खंड 2 में वर्णित है। प्रत्यारोपण के दिन, सुनिश्चित करें कि ऑर्गेनोइड्स एनग्राफ्टमेंट की संभावना बढ़ाने के लिए प्रोलिफेरेटिव चरण में हैं।
    2. ईसीएम से ऑर्गेनोइड्स निकालने के लिए, 0.125 यू / एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए संस्कृति माध्यम में डिस्पेस जोड़ें। पी 1,000 का उपयोग करके, उन्हें बाधित करने के लिए ईसीएम बूंदों को पूरी तरह से पुन: निलंबित करें, और प्लेट को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस रखें। ईसीएम की 100 μL की मात्रा ~ 10 लैक्रिमल ग्रंथियों को इंजेक्ट करने के लिए पर्याप्त है।
    3. एंजाइम को धोने के लिए 10 एमएल बेस माध्यम में ऑर्गेनोइड्स को पुन: निलंबित करें। 5 मिनट के लिए 400 x g पर कोशिकाओं को गोली मार दें।
    4. 5% ईसीएम के साथ पूरक ठंडे मानव विस्तार माध्यम के 50 μL में कोशिकाओं (~ 1,500,000) को पुन: निलंबित किया गया। ऑर्गेनॉइड निलंबन को बर्फ पर रखें, और प्रत्यारोपण के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
  2. चूहों में ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण
    1. पशु सुविधा में, बर्फ पर ऑर्गेनोइड निलंबन और इंसुलिन सुइयों का उपयोग करें। ठंडे इंसुलिन सुई में ऑर्गेनॉइड निलंबन को एस्पिरेट करें।
    2. एनेस्थीसिया शुरू करने के लिए 3% आइसोफ्लुरेन के साथ एनओडी स्सिड गामा (एनएसजी) इम्यूनोडेफिशिएंसी माउस को सेडेट करें। जब माउस सो रहा हो, तो जल्दी से इसे मुख्य लैक्रिमल ग्रंथि (आंख और कान के बीच आधे रास्ते में स्थित) के साथ इसके किनारे रखें।
    3. ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन के 5 μL को सीधे त्वचा के माध्यम से लैक्रिमल ग्रंथि में इंजेक्ट करें। एक माउस लैक्रिमल ग्रंथि में अधिकतम मात्रा 5 μL हो सकती है।
    4. माउस को ठीक होने दें, और प्रत्यारोपण से संबंधित किसी भी असुविधा की उपस्थिति का आकलन करने के लिए हर दिन माउस की निगरानी करें, खासकर आंख पर।
  3. Engraftment का आकलन करें
    1. 90 दिनों के बाद ओ2/सीओ2 इनहेलेशन के साथ माउस का त्याग करें, यह इस बात पर निर्भर करता है कि अल्पकालिक या दीर्घकालिक एनग्राफ्टमेंट का मूल्यांकन किया जाना चाहिएया नहीं।
    2. खंड 1 में वर्णित लैक्रिमल ग्रंथि का विच्छेदन करें। आरटी पर 24 घंटे के लिए इसे 4% फॉर्मलिन में ठीक करें।
    3. लैक्रिमल ग्रंथि को एक कैसेट में रखें। लैक्रिमल ग्रंथि को निम्नानुसार इनक्यूबेट करके निर्जलित करें: 70% इथेनॉल में 2 घंटे, 96% इथेनॉल में 2 घंटे, 100% इथेनॉल (2x) में 1 घंटे, जाइलीन में 2 घंटे, और ओवन में 58 डिग्री सेल्सियस पर तरल पैराफिन में रात भर।
    4. अगले दिन, लैक्रिमल ग्रंथि को धातु के सांचे में पसंदीदा के रूप में उन्मुख करें, इसे तरल पैराफिन के साथ ऊपर रखें, और ब्लॉक को ठंडी सतह पर जमने दें। यह प्रक्रिया एक एम्बेडिंग मशीन के साथ सबसे अच्छा प्रदर्शन किया जाता है।
    5. जब पैराफिन ब्लॉक ठोस होता है, तो माइक्रोटोम का उपयोग करके पूरे ब्लॉक को 4-5 μm वर्गों में काट लें। सभी वर्गों (रिबन के आकार में) को शुष्क, मसौदा मुक्त वातावरण में रखें। अनुभागों को कमरे के तापमान पर अनिश्चित काल तक रखा जा सकता है।
    6. पूरे ब्लॉक में फैले प्रत्येक 10 खंडों में से एक का नमूना लें।
      1. स्लाइड पर अनुभागों को निम्नानुसार माउंट करें: स्लाइड पर पानी की एक बूंद डालें, अनुभाग को शीर्ष पर रखें, इसे ~ 2 मिनट के लिए आराम करने दें ताकि यह 42 डिग्री सेल्सियस गर्म प्लेट पर फैल सके, और कागज के साथ धीरे से पानी निकालें।
      2. स्लाइड्स को 58 डिग्री सेल्सियस ओवन में रात भर सूखने के लिए रखें। स्लाइड्स को इस चरण से पहले आरटी पर अनिश्चित काल तक रखा जा सकता है।
    7. माउस कोशिकाओं से मानव कोशिकाओं को अलग करने के लिए, इन वर्गों पर मानव परमाणु एंटीजन धुंधला पन करें। निम्नलिखित वॉश करके अनुभागों को पुन: हाइड्रेट करें: जाइलीन (2x) में 3 मिनट, 100% इथेनॉल (2x) में 1 मिनट, 96% इथेनॉल में 1 मिनट, 90% इथेनॉल, 80% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, 60% इथेनॉल, और 25% इथेनॉल, और अंत में, डेमी पानी में 1 मिनट (2x)।
    8. पीओ बफर में 15 मिनट के लिए स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें (पूरक तालिका 1)। अल्ट्राप्योर पानी में स्लाइड्स को 3 गुना धो लें।
    9. आटोक्लेव में साइट्रेट-आधारित एंटीजन पुनर्प्राप्ति करें:
      1. स्लाइड्स को साइट्रेट बफर (पूरक तालिका 1) से भरी टोकरी में एक ऑटोक्लेव-प्रूफ स्लाइड होल्डर में रखें। टोकरी को ऑटोक्लेव में रखें, और एक ऑटोक्लेव चक्र चलाएं (दबाव: 10 पीएसआई; तापमान: 121 डिग्री सेल्सियस; समय: 15 मिनट)।
      2. जब आटोक्लेव का दबाव कम हो जाता है, तो स्लाइड वाली टोकरी को पुनः प्राप्त करें, और स्लाइड को आरटी में लाने के लिए इसे आरटी पानी के स्नान में रखें।
        नोट: एंटीजन पुनर्प्राप्ति रणनीति उपयोग किए गए एंटीबॉडी पर निर्भर करती है। सबसे पर्याप्त एंटीजन पुनर्प्राप्ति करने के लिए प्रदाता के डेटाशीट को देखें।
    10. स्लाइड्स को क्षैतिज रूप से, अनुभाग-साइड में, इनक्यूबेशन ट्रे पर रखें। शीर्ष पर पीबीएस में 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) युक्त ब्लॉकिंग बफर का 500 μL जोड़ें, और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। ब्लॉकिंग बफर को हटा दें।
    11. मानव न्यूक्लियोलर एंटीजन-एंटीबॉडी के 1 μL को प्रति स्लाइड अवरुद्ध करने के 500 μL को जोड़कर एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। प्रत्येक स्लाइड में एंटीबॉडी समाधान जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेशन ट्रे में रात भर इनक्यूबेट करें।
    12. अगले दिन, पीबीएस में स्लाइड्स को 3x धो लें। 45 मिनट के लिए बिना पतला एचआरपी एंटी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें। पीबीएस में स्लाइड्स को 3x धो लें।
      सावधानी। रासायनिक हुड में, डीएबी बफर तैयार करें (पूरक तालिका 1)। 10 मिनट के लिए डीएबी बफर के साथ स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें। कार्बनिक रासायनिक तरल अपशिष्ट कंटेनरों में किसी भी अपशिष्ट पदार्थ को फेंक दें।
    13. स्लाइड्स को पानी से धो लें। नाभिक को रोकने के लिए हेमेटॉक्सिलिन में 2 मिनट के लिए स्लाइड को इनक्यूबेट करें। स्लाइड्स को बहते नल के पानी में 10 मिनट के लिए धो लें।
    14. स्लाइड्स को 50% इथेनॉल, 60% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, 80% इथेनॉल और 90% इथेनॉल में 1 मिनट, 96% इथेनॉल (2x) में 1 मिनट, 100% इथेनॉल में 1 मिनट (2x), और जाइलीन में 1 मिनट (2x) में इनक्यूबेट करके स्लाइड्स को निर्जलित करें।
    15. स्लाइड्स को माउंटिंग मीडियम और कवरस्लिप के साथ संलग्न करें। लगभग 20 मिनट तक सूखने के बाद, एक माइक्रोस्कोप के नीचे स्लाइड्स का निरीक्षण करें।
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Representative Results

माउस लैक्रिमल ग्रंथि (चित्रा 2 ए) के विच्छेदन के बाद, एंजाइमेटिक और यांत्रिक पाचन ने छोटे ऊतक टुकड़े उत्पन्न किए, जिनके बीच एसिनी और नलिकाओं को अलग किया जा सकता है (चित्रा 2 बी)। ऊतक के शेष बड़े टुकड़े ईसीएम को अस्थिर कर देंगे, जो प्रारंभिक ऑर्गेनॉइड आउटग्रोथ को कम करेगा। माउस लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनॉइड व्युत्पत्ति सफल रही जब ~ 7 दिनों के बाद ~ 500 μm व्यास के सिस्टिक ऑर्गेनोइड पाए गए, जिस चरण में ऑर्गेनोइड विभाजित होने के लिए तैयार थे (चित्रा 2 सी)। यहां तक कि अगर समग्र ऑर्गेनोइड व्युत्पत्ति सफल होती है, तो कुछ ऑर्गेनोइड अंततः रुकने से पहले बढ़ना शुरू कर सकते हैं। मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड 3-4 दिनों के भीतर अल्सर के रूप में विकसित हुए और ऊतक अलगाव के बाद 10-14 दिनों में पूर्ण विकसित आकार तक पहुंच गए (चित्रा 2 डी)। चूहों और मनुष्यों दोनों के लिए, ऑर्गेनोइड व्युत्पत्ति कभी-कभी विफल हो जाती है, जिसमें कोई या कुछ ऑर्गेनोइड नहीं बढ़ते हैं; यह आम तौर पर ऊतक के अति-पाचन के कारण होता था। माउस लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स को कम से कम 40x और मानव ऑर्गेनोइड्स को कम से कम 20x पारित किया जा सकता है। ऑर्गेनॉइड विकास के आधार पर औसतन हर 7-10 दिनों में पासिंग की गई थी।

Figure 2
चित्र 2: माउस और मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स की स्थापना। (ए) माउस लैक्रिमल ग्रंथि विच्छेदन के विभिन्न चरणों की तस्वीरें। तीर अपनी सुरक्षात्मक झिल्ली के नीचे लैक्रिमल ग्रंथि पर इंगित करता है। (बी) ऊतक पाचन के ठीक बाद माउस लैक्रिमल ग्रंथि कोशिकाओं की उज्ज्वल क्षेत्र छवियां, जिसमें इनसेट एक एसिनस और एक वाहिनी दिखाते हैं। (सी) एक सफल और एक असफल माउस लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनॉइड व्युत्पत्ति की ब्राइटफील्ड छवियां। (डी) 14 दिनों के दौरान मानव ऑर्गेनॉइड आउटग्रोथ की ब्राइटफील्ड छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

विस्तार माध्यम में सुसंस्कृत होने पर लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स में स्टेम कोशिकाओं का एक बड़ा अनुपात होता है। उनके भेदभाव स्तर को बढ़ाने के लिए, हमने कम विकास कारक सामग्री के साथ एक माउस और एक मानव भेदभाव माध्यम स्थापित किया। क्रमशः 5 दिनों और 7 दिनों के बाद, विभेदन माध्यम में, माउस और मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड घने हो गए (चित्रा 3 ए-बी)। यह रूपात्मक परिवर्तन बढ़े हुए कार्यात्मक गुणों के साथ सहसंबद्ध है। चक्रीय एएमपी एक्टिवेटर फोरस्कोलिन या न्यूरोट्रांसमीटर नॉरपेनेफ्रिन को लागू करने से 3 घंटे से कम समय के भीतर ऑर्गेनोइड सूजन (यानी, एपिकल पानी का स्राव) हुआ (चित्रा 3 सी)। जब सूजन में 3-4 घंटे से अधिक समय लगा, तो इससे पता चला कि ऑर्गेनोइड्स पर्याप्त विभेदित नहीं थे और / या कार्यात्मक मार्करों को व्यक्त नहीं करते थे, जैसे कि न्यूरोट्रांसमीटर के लिए रिसेप्टर्स।

Figure 3
चित्र 3: माउस और मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स का विभेदन और मानव ऑर्गेनोइड्स में कार्यात्मक सूजन परख। (A) माउस लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स की ब्राइटफील्ड छवियों को विस्तार माध्यम में 7 दिनों के लिए विस्तार माध्यम में और 2 दिनों के बाद 5 दिनों के लिए विभेदन माध्यम में। (बी) मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स की ब्राइटफील्ड छवियां विस्तार माध्यम में 11 दिनों के लिए और विभेदन माध्यम में 2 दिनों के बाद 9 दिनों के लिए विभेदन माध्यम में सुसंस्कृत होती हैं। (C) 3 घंटे के दौरान ताजा विभेदन माध्यम (नियंत्रण) के संपर्क में आने वाले विभेदित मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स की ब्राइटफील्ड छवियां, 1 μM forskolin, और 100 μM नॉरपेनेफ्रिन के संपर्क में। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

माउस लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स में पैक्स 6 को बाहर निकालने के लिए, पीसीआर और लिगेशन (चित्रा 4 ए) द्वारा चुने हुए पैक्स 6-टारगेटिंग जीआरएनए युक्त एक प्लास्मिड उत्पन्न किया गया था। इस जीआरएनए युक्त प्लास्मिड को पिगी-बैक प्लास्मिड (हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोध ट्रांसपोसन युक्त और ट्रांसपोसेज युक्त प्लास्मिड) और माउस लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स में सी > टी बेस एडिटर कैस 9 के साथ इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था। 3 दिनों के बाद, जब ऑर्गेनोइड्स ठीक हो गए थे, तो उन्हें क्लोन के लिए चयन करने के लिए हाइग्रोमाइसिन के संपर्क में लाया गया था जिसमें हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोध कैसेट शामिल था। सफल इलेक्ट्रोपोरेशन में, हाइग्रोमाइसिन के प्रतिरोधी ऑर्गेनोइड ्स बाहर निकल आए (चित्रा 4 बी)। बढ़ते ऑर्गेनॉइड क्लोन जो ~ 300 μm से बड़े थे, आदर्श रूप से उन्हें सहज रूप से अंतर करना शुरू करने से पहले चुना गया था (चित्रा 4 सी)। शेष को संस्कृति में रखते हुए ऑर्गेनॉइड के हिस्से से डीएनए निकाला गया था। जीआरएनए द्वारा लक्षित पैक्स 6 लोकस के पीसीआर प्रवर्धन ने चुने गए प्रत्येक क्लोन के लिए 367 बीपी बैंड प्राप्त किया (चित्रा 4 डी)। प्रवर्धित स्थान को अनुक्रमित करने के बाद, क्लोन जो होमोजीगस सी > टी संपादित (एन = 1) थे, उन्हें रखा गया था। दूसरी ओर, क्लोन जो संपादित नहीं किए गए थे (एन = 4), विषम रूप से संपादित, या गलत तरीके से संपादित (एन = 1) को छोड़ दिया गया था (चित्रा 4 ई)। कुल मिलाकर, पैक्स 6 को लक्षित करने वाले इस जीआरएनए का उपयोग करके, छह अनुक्रमों में से एक होमोजीगोस नॉक-आउट माउस लैक्रिमल ग्रंथि क्लोन प्राप्त किया गया था। कुछ क्लोन अच्छी तरह से बढ़े, लेकिन कुछ ऑर्गेनोइड क्लोन चुनने के बाद खो गए या अंतर करना शुरू कर दिया (चित्रा 4 एफ)। चुने गए 10 ऑर्गेनोइड क्लोनों में से 7 अच्छी तरह से बढ़े।

Figure 4
चित्रा 4: माउस लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स में पैक्स 6 के बेस एडिटिंग-मध्यस्थता नॉक-आउट। (ए) पैक्स 6 लोकस को लक्षित करने वाले जीआरएनए के सही एकीकरण के बाद पीएफवाईएफ 1320 का सेंगर अनुक्रमण ट्रेस। (बी) इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद हाइग्रोमाइसिन के संपर्क में आने के 5 दिन बाद माउस लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स की ब्राइटफील्ड छवियां। ऑर्गेनोइड्स को माउस विस्तार माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था। बाईं ओर एक असफल इलेक्ट्रोपोरेशन का एक उदाहरण है, जिसमें हाइग्रोमाइसिन के लिए कोई क्लोन प्रतिरोधी नहीं है। दाईं ओर एक सफल इलेक्ट्रोपोरेशन का एक उदाहरण है, जिसमें कई हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोधी ऑर्गेनॉइड क्लोन जीवित हैं। (सी) क्लोन की ब्राइटफील्ड छवियां जिन्हें चुना जाना चाहिए और क्लोन जिन्हें नहीं चुना जाना चाहिए। (डी) जीआरएनए के साथ लक्षित पैक्स 6 लोकस के प्रवर्धन को दर्शाने वाला अगारोस जेल। हरे रंग में, 367 बीपी के अपेक्षित आकार के बैंड पर प्रकाश डाला गया है। (ई) सेंगर अनुक्रमण तीन ऑर्गेनोइड क्लोनों का पता लगाता है जो हाइग्रोमाइसिन के प्रतिरोधी थे। शीर्ष क्लोन असंपादित है। मध्य क्लोन एक होमोजीगोस सी > टी संस्करण है और इसलिए, एक होमोजीगोस नॉक-आउट है। निचला क्लोन दो विषम बिंदु उत्परिवर्तन प्रस्तुत करता है और या तो एक विषम नॉक-आउट या एक मिश्रित क्लोन है और इसे गलत तरीके से संपादित किया गया है। (एफ) विभिन्न स्तरों के आउटग्रोथ के साथ चुने गए ऑर्गेनोइड क्लोन की ब्राइटफील्ड छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अंत में, चूहों में मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनॉइड ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण करने के लिए, ऑर्गेनोइड्स जो 3 दिन पहले विभाजित किए गए थे (< 100 μm व्यास) का उपयोग किया गया था। मानव-विशिष्ट मार्कर, मानव न्यूक्लियोलर एंटीजन (चित्रा 5) के लिए धुंधला करके माउस लैक्रिमल ग्रंथि में ऑर्गेनोइड्स को इंजेक्ट करने के 1 महीने बाद ऑर्गेनोइड एनग्राफमेंट की पुष्टि की गई थी। माउस लैक्रिमल ग्रंथि के सभी वर्गों से पुंटेट धुंधलापन की अनुपस्थिति ने मानव ऑर्गेनोइड एनग्राफमेंट की कमी को दर्शाया।

Figure 5
चित्र 5: माउस लैक्रिमल ग्रंथि में मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स का प्रत्यारोपण। प्रत्यारोपण के 1 महीने बाद मानव न्यूक्लियोलर मार्कर के लिए प्रत्यारोपित माउस लैक्रिमल ग्रंथियों का धुंधला होना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 1: मीडिया और बफर की संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह प्रोटोकॉल कार्यात्मक परख, उत्परिवर्तन मॉडलिंग और प्रत्यारोपण के लिए लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स की स्थापना और उपयोग का वर्णन करता है। माउस और मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स की स्थापना करते समय, ऊतक पृथक्करण महत्वपूर्ण है। यदि ऊतक पर्याप्त रूप से पच नहीं ता है, तो ऑर्गेनोइड उपज कम होगी। यदि ऊतक अधिक पच जाता है, तो कोशिकाएं मर जाएंगी और ऑर्गेनोइड्स के रूप में नहीं बढ़ेंगी। प्रत्येक ऊतक को एक विशिष्ट समय के लिए एक विशिष्ट एंजाइम के साथ पचाया जाना चाहिए ताकि इष्टतम ऑर्गेनॉइड आउटग्रोथ 14,17,18 सुनिश्चित किया जा सके। लैक्रिमल ग्रंथि एक नरम ऊतक है जिसके लिए 5-10 मिनट का कोलेजनेज पाचन पाइपिंग-आधारित यांत्रिक पृथक्करण के साथ संयुक्त ऊतक के छोटे टुकड़ों को अलग करने के लिए पर्याप्त है। यदि एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण जैसे अनुप्रयोगों के लिए एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने की आवश्यकता होती है, तो पृथक्करण को एकल-कोशिका चरण तक पहुंचने तक लंबे समय तक किया जा सकता है, लेकिन व्यवहार्यता में किसी भी कमी को सीमित करने के लिए एकल कोशिकाओं को प्राप्त करते ही पृथक्करण को रोक दिया जाना चाहिए। चूंकि ऊतक पृथक्करण इतना महत्वपूर्ण है, अति-पाचन लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनॉइड स्थापना की विफलता का सबसे संभावित कारण है।

लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स का उचित रखरखाव उनके उपयोग के लिए महत्वपूर्ण है। लंबे समय तक रखरखाव वयस्क स्टेम सेल-व्युत्पन्न लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स की एक पहचान है, प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स 7,17 की तुलना में। दीर्घकालिक रखरखाव प्राप्त करने के लिए, नियमित ऑर्गेनोइड विभाजन और मध्यम परिवर्तन किए जाने चाहिए। इसके बिना, ऑर्गेनोइड्स स्टेम सेल क्षमता में कमी और विकास करना शुरू कर देते हैं, जो उनके दीर्घकालिक रखरखावमें बाधा डालता है। इस चरण में फिर से, अति-पाचन स्टेम कोशिकाओं को मार सकता है और ऑर्गेनोइड रखरखाव को खराब कर सकता है। नियमित रखरखाव के लिए, एकल कोशिकाओं में ऑर्गेनोइड पृथक्करण की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, क्लोनल नॉक-आउट ऑर्गेनॉइड लाइनों को उत्पन्न करने के लिए, एकल कोशिकाओं से शुरू करना महत्वपूर्ण है। यदि नहीं, तो ऑर्गेनोइड्स को विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि वाली कोशिकाओं के मोज़ेक से गठित किया जाएगा, जिससे एकल, परिभाषित उत्परिवर्तन के प्रभाव का विश्लेषण असंभव हो जाएगा। यहां, हम स्टॉप कोडन उत्पन्न करने के लिए सी > टी बेस एडिटर के उपयोग का वर्णन करते हैं। यह जीनोम संपादक एक एनजीजी पीएएम से 12-18 आधारों के भीतर आर्गिनिन, ग्लूटामाइन या ट्रिप्टोफेन कोडन की उपस्थिति पर निर्भर करता है। जब जीआरएनए डिजाइन करने में इन शर्तों को पूरा नहीं किया जाता है, तो वैकल्पिक पीएएम के साथ पारंपरिक कैस 9 या सी >टी आधार संपादकों का उपयोग 7,18 किया जा सकता है। हालांकि, पारंपरिक कैस 9 डबल-फंसे हुए ब्रेक का परिचय देता है जिसके परिणामस्वरूप मरम्मत 11 पर इंडेलहोते हैं। चूंकि दोनों एलील अलग-अलग इंडेल को परेशान कर सकते हैं, क्लोन जीनोटाइपिंग को अतिरिक्त सावधानी की आवश्यकता होती है। पेश किए गए संशोधनों का डीकन्वोल्यूशन यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि दोनों एलील्स में आउट-ऑफ-फ्रेम इंडेल होते हैं और इसलिए, ऑर्गेनोइड क्लोन को लक्षितजीन 19 के लिए बाहर कर दिया जाता है। सी > टी बेस संपादकों का लाभ इस तथ्य में निहित है कि उनका उपयोग बिंदु उत्परिवर्तन को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है जिसके परिणामस्वरूप आवश्यक रूप से स्टॉप कोडन नहीं होते हैं। उदाहरण के लिए, उनका उपयोग एनिरिडिया वाले रोगियों में पाए जाने वाले विशिष्ट पैक्स 6 उत्परिवर्तन को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है ताकि लैक्रिमल ग्रंथिशरीर विज्ञान 20 पर उनके प्रभाव का अध्ययन किया जा सके।

लैक्रिमल ग्रंथि आंसू फिल्म1 के जलीय भाग का स्राव करती है। विकास कारक वापसी और नॉच अवरोध द्वारा मध्यस्थता के बाद मानव ऑर्गेनोइड्स में आंसू स्राव को पुन: उत्पन्न किया जा सकता है। इन स्थितियों के तहत, ऑर्गेनोइड टर्मिनल भेदभाव से गुजरते हैं और आगे बनाए नहीं रखा जा सकता है। फिर भी, विभेदित लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स सूखी आंख की बीमारी के संदर्भ में फाड़-उत्प्रेरण दवाओं के विकास का मार्गदर्शन कर सकते हैं, संभवतः उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन में। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत फाड़ परख वह है जो वर्तमान में कम समय में ऑर्गेनॉइड आकार में सबसे बड़ा बदलाव देता है, जिससे दवा स्क्रीन 7,9,17 के संदर्भ में मात्रा निर्धारित करना आसान हो जाता है।

स्टेम सेल थेरेपी सूखी आंख की बीमारी में लैक्रिमल ग्रंथि पुनर्जनन के लिए बहुत वादा करतीहै। वयस्क स्टेम सेल-व्युत्पन्न लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स ऐसे अनुप्रयोगों के लिए एक स्रोत सामग्री हो सकती है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप मानव लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनॉइड एनग्राफमेंट होता है, ज्यादातर अल्सर के रूप में। गलत साइट पर ऑर्गेनोइड्स इंजेक्ट किए जाने के कारण कम ऑर्गेनोइड एनग्राफमेंट उत्पन्न हो सकता है। डाई के साथ इंजेक्शन प्रक्रिया को प्रशिक्षित करने से इंजेक्शन साइट की ट्रैकिंग की अनुमति मिलती है और अंततः, इंजेक्शन सटीकता में सुधार होता है। वैकल्पिक रूप से, माउस एपिडर्मिस को लैक्रिमल ग्रंथि तक सीधी पहुंच के लिए इंजेक्ट किया जा सकता है, जैसा कि22 से पहले चूहों में किया गया था। इस विधि में अधिक समय लगता है लेकिन अधिक सटीक हो सकता है। दूसरी ओर, वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ, ऑर्गेनोइड्स कार्यात्मक रूप से माउस लैक्रिमल ग्रंथि में एकीकृत नहीं हुए। आईपीएससी-व्युत्पन्न लैक्रिमल ग्रंथि एनग्राफमेंट22 के लिए इसी तरह के परिणाम देखे गए हैं। प्रत्यारोपण विधि को लैक्रिमल ग्रंथि को पहले से घायल करके, सूखी आंख माउस मॉडल का उपयोग करके, और / या ऑर्गेनोइड्स को एकल कोशिकाओं या छोटे झुरमुट के रूप में इंजेक्ट करके और बेहतर बनाया जा सकता है। फिर भी, वयस्क स्टेम सेल-व्युत्पन्न लैक्रिमल ग्रंथि ऑर्गेनोइड्स और संबंधित टूलकिट लैक्रिमल ग्रंथि अनुसंधान और पुनर्योजी चिकित्सा में भविष्य के अनुप्रयोगों का आधार हो सकते हैं।

Disclosures

हंस क्लेवर्स रोश, बेसल में फार्मा रिसर्च एंड अर्ली डेवलपमेंट के प्रमुख हैं, और ऑर्गेनॉइड तकनीक से संबंधित कई पेटेंट रखते हैं।

Acknowledgments

हम प्रोटोकॉल के प्रारंभिक विकास के लिए योरिक पोस्ट को धन्यवाद देते हैं। इस काम को कैंसर रिसर्च यूके ग्रैंड चैलेंज (सी 6307/ ए 2 9 058) और मार्क फाउंडेशन फॉर कैंसर रिसर्च से विशिष्ट टीम के लिए एक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL safe-lock centrifuge tubes Eppendorf EP0030 120.094
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB) Sigma-Aldrich D5637 CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 °C
5x green GoTaq Flexi buffer Promega M891A Store at -20 °C
A83-01 Tocris 2939 Store at -20 °C, stock at 30 mM, 10000x
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 store at 4 °C
Agar plates containing Ampicillin Hubrecht Institute
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Autoclave VAPOUR-Line lite VWR chemicals
B27 supplement Invitrogen 17504-044 Store at -20 °C, 50x
BD Micro-Fine insulin needle 1 mL BD Bioscience 324825
Benchtop microscope DMI1 Leica
Bovine serum albumine (BSA) MP biomedicals 160069 Store at 4 °C
BTXpress BTX MDS450805
C57BL/6 mice Hubrecht Institute
Cassettes Klinipath 410-02S
CellBanker 1 amsbio 11910 Cryopreservation medium, adhere to instructions
Centrifuge Eppendorf
Citric acid monohydrate J.T. Baker 0088 CAS: 5949-29-1
Collagenase I Sigma Aldrich C9407 Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 °C
Conical tubes 15 mL Greiner Bio-One 5618-8271
Conical tubes 50 mL Corning CLS430828-500EA
Coverslips 24 mm x 50 mm Menzel-Gläzer BB024050S1
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix R&D Systems, Bio-Techne 3533-001-02 Store at -20 °C, keep at 4 °C for up to 1 month
DAPT Sigma Aldrich D5942 Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x
Disodium hydrogen phosphate anhydrous VWR chemicals 28026.292 CAS: 7558-79-4
Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate Sigma-Aldrich 71643 CAS:10028-24-7
Dispase ThermoFisher Scientific 17105-041 Aliquots at 50 U/mL, store at -20 °C until use, 400x
Disposable Scalpel Sterile N° 10 Swann Morton 3033838
DM4000 microscope Leica
dNTPs 25 mM Promega U1420 Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 °C
Dpn1 New England Biolabs R0176
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) Gibco 14190144 1x
Easy strainers 70 µm Greiner 542170
Electroporation cuvette Nepagene EC002S
EnVision+/HRP mouse Agilent K400111-2
Ethanol 100% BOOM 84045206;5000 CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions
Ethanol 70% BOOM 84010059.5000 CAUTION
Ethanol 96% BOOM 84050065.5000 CAUTION
EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System ThermoFisher Scientific Live-imaging brightfield microscrope
FGF10 Peprotech 100-26 Store at -20 °C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x
Fiji NIH, Fiji developers
Formaldehyde solution 4% Sigma-Aldrich 1.00496 CAS: 50-00-0, CAUTION
Forskolin Tocris 1099 Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x
Glutamax Gibco 35050-061 100x
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase Promega M7805 Store at -20 °C
Haematoxylin VWR chemicals 10047105 Store at room temperature
HEPES Gibco 15630-080 Store at 4 °C, 100x
Histocore H and C, Tissue embedding machine Leica
Hot plate Meidax
Human nucleolar antigen antibody Abcam ab-190710
Hydrochloric acid 5 N ThermoFisher Scientific 10605882 CAS: 7647-01-0, CAUTION
Hydrogen peroxyde 30% Chem-lab CL00.2308.1000 CAS: 7722-84-1, CAUTION
Hygromycin B-gold InvivoGen ant-hg Stock at 100 mg/µL, 1000x
Hygromycin resistance cassette-containing plasmid Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
IsoFlo 100% Mecan 5960501
LB medium Hubrecht Institute
MgCl2 25 mM Promega A351H Store at -20 °C
Microtome RM2235 Leica
Midiprep DNA isolation kit ThermoFisher Scientific K210005
Miniprep DNA isolation kit ThermoFisher scientific K210003
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165 Store at -20 °C, stock at 500 mM, 400x
NEPA21 electroporator Nepagene
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636 Store at -20 °C, stock at 1M, 100x
NOD Scid Gamma (NSG) mice Hubrecht Institute colony
Noggin conditioned medium U-Protein Express Custom order Store at -20 °C
Noradrenaline Sigma Aldrich A7257 Store at -20 °C, stock at 100 mM
Oven Memmert Set at 58 °C
P20, P200 and P1000 pipettes Gilson
Paraffin VWR chemicals 10048502
Pasteur pipettes, glass plugged ThermoFisher Scientific 1150-6973
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG  IDT
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC  IDT
pCMV_ABEmax_P2A_GFP Addgene 112101
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 Store at -20 °C
Pertex Klinipath AM-08010
pFYF1320  Addgene 47511
Primocin InvivoGen ant-pm-1 1000X, store at -20 °C
Prostaglandin E2 (PGE2) Tocris 2296 Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x
Petri dish, 10 cm Greiner 633102
Q5 buffer New England Biolabs B9027S
Q5 high-fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0491S
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen QE09050 Store aliquots at -20 °C
R-spondin 3 conditioned medium U-Protein Express Custom order Store at -20 °C
sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG IDT
Slides StarFrost MBB-0302-55A Adhesive, ground
Sodium azide Merck 8.22335.1000 CAS: 26628-22-8, CAUTION
Sodium cytrate dihydrate J.T. Baker 0280 CAS: 6132-04-3
Standard Forward Primer: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
TTAAAATAAGGC		 IDT
Subcloning efficiency competent cells DH5alpha Invitrogen 18265-017
Suspension cell culture plates (24-well) Greiner Bio-One 662102 24-well
Suspension cell culture plates (12-well) Greiner Bio-One 665102 12-well
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
TAE buffer ThermoFisher Scientific B49 Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water
Transposase-containing plasmid Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
TrypLE Express Enzyme Invitrogen 12605-028 store at 4 °C
U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT IDT
UltraPure Agarose 1000 Invitrogen 16550
Water bath Tulabo
Xylene Klinipath 4055-9005 CAS: 1330-20-7, CAUTION
Y-27632 Abmole Bioscience Y-27632 dihydrochloride Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x

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References

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Bannier-Hélaouët, M., Geurts, M. H., Korving, J., Begthel, H., Clevers, H. Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids. J. Vis. Exp. (192), e65040, doi:10.3791/65040 (2023).

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