Summary
Detta protokoll beskriver hur man etablerar, underhåller, genetiskt modifierar, differentierar, funktionellt karakteriserar och transplanterar tårkörtelorganoider härrörande från primär mus- och humanvävnad.
Abstract
Lacrimalkörteln är ett viktigt organ för okulär ythomeostas. Genom att producera den vattenhaltiga delen av tårfilmen skyddar den ögat från uttorkningsstress och yttre förolämpningar. Lite är känt om tårkörtelns (pato)fysiologi på grund av bristen på adekvata in vitro-modeller . Organoidteknik har visat sig vara en användbar experimentell plattform för flera organ. Här delar vi ett protokoll för att upprätta och underhålla mus- och humana lacrimal körtelorganoider från lacrimal körtelbiopsier. Genom att modifiera odlingsförhållandena förbättrar vi tårkörtelorganoidfunktionaliteten. Organoid funktionalitet kan undersökas genom en "gråt" analys, vilket innebär att lacrimal körtelorganoider exponeras för utvalda neurotransmittorer för att utlösa tårfrisättning i deras lumen. Vi förklarar hur man avbildar och kvantifierar detta fenomen. För att undersöka rollen av gener av intresse för tårkörtelhomeostas kan dessa modifieras genetiskt. Vi beskriver grundligt hur man genetiskt modifierar tårkörtelorganoider med hjälp av basredigerare - från guide RNA-design till organoid klongenotypning. Slutligen visar vi hur man undersöker den regenerativa potentialen hos humana lacrimal körtelorganoider genom ortotopisk implantation i musen. Tillsammans ger denna omfattande verktygssats resurser för att använda mus- och humana tårkörtelorganoider för att studera tårkörtelfysiologi.
Introduction
Lacrimalkörteln är det glandulära epitelet som är ansvarigt för att producera det mesta av det vattenhaltiga skiktet i tårfilmen1. Tårfilmens vattenhaltiga skikt innehåller inte bara vatten för att smörja ögonytan utan också en stor repertoar av antimikrobiella komponenter som skyddar ögonytan från infektioner2. När tårkörteln är skadad eller inflammerad uppstår torr ögonsjukdom, vilket resulterar i obehag för patienter och kan så småningom leda till synförlust3. Under årens lopp har modellsystem för att studera tårkörteln, särskilt den mänskliga körteln, begränsats 4,5,6. Detta har bidragit till en kunskapslucka om tårkörtelns funktion under fysiologiska och patologiska tillstånd.
Nyligen har in vitro-modeller utvecklats för att studera tårkörteln i en maträtt 7,8,9. Dessa tårkörtelorganoider härrör från vuxna stamceller odlade som tredimensionella strukturer i en extracellulär matris kompletterad med en cocktail av tillväxtfaktorer som upprätthåller deras regenerativa kapacitet in vitro7. Fördelen med vuxna stamceller (ASC)-härledda organoider är att de kan bibehållas under mycket lång tid samtidigt som friska vävnadsegenskaper rekapituleras. Denna typ av organoid består enbart av epitelceller, till skillnad från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda organoider, som också kan innehålla stromaceller, till exempel. Till skillnad från pluripotenta stamcellsbaserade organoider etableras ASC-organoider direkt från vuxen vävnad och kräver inga genetiska modifieringar för att expanderas. ASC-organoider uttrycker vuxna egenskaper10.
Detta protokoll innehåller en verktygslåda för att härleda tårkörtelorganoider från mus och mänsklig primärvävnad. Protokollet beskriver hur man ytterligare förbättrar organoidernas funktionalitet genom enkel tillbakadragande av tillväxtfaktor och hur man provocerar organoiderna att utsöndra tårvätska genom att utföra en svullnadsanalys. Detta protokoll innehåller dessutom en elektroporeringsbaserad transfektionsmetod för att genetiskt manipulera musorganoider med hjälp av CRISPR-härledda basredigerare. Till skillnad från konventionella Cas9 tillåter användningen av basredigerare modifiering av enstaka baser i genomet utan att generera en dubbelsträngad brytning11,12. Slutligen beskrivs ortotopisk transplantation av humana tårkörtelorganoider till immunbristfälliga möss och den efterföljande histologiska bedömningen av engraftmentet. Denna lacrimal gland organoid toolkit kan användas i forskning om lacrimal körtel regenerering och funktion och för genetisk och inflammatorisk sjukdom modellering.
Protocol
Musförsöken godkändes av den djuretiska kommittén vid Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) under projektlicens AVD8010020151. Organoiderna härrörde från musöverskottsmaterial. De mänskliga tårkörtelbiopsierna samlades in från avfallsmaterialet från patienter som genomgick operation vid University Medical Centre Utrecht (UMCU) efter godkännande av den medicinska etiska kommittén enligt protokoll nummer 18-740. Protokollet innehåller flera avsnitt som beskrivs i figur 1.
Bild 1: Översikt över protokollet. Denna figur belyser de olika stegen i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Anm.: Alla medium- och buffertsammansättningar beskrivs i kompletterande tabell 1.
1. Etablering av organoider från mus och mänskliga tårkörtlar
- Dissekera ut musens tårkörtel
- Förbered dissektionsverktygen, inklusive sax, pincett och dissektionsdynor. Avliva en mus genom O 2 / CO2 inandning13.
- Placera den avlivade musen på buken på dissektionsdynan och fäst dess lemmar. Våt håret mellan musöronen och på pannan med 70% etanol.
- Använd dissektion sax, gör en öppning bakom skallen mellan öronen. Förläng denna öppning över pannan upp till näsan. Använd fortfarande sax, klipp huden bakom öronen för att generera två flikar.
- Dra flikarna ordentligt mot näsan tills tårkörtlarna är exponerade, såsom visas i figur 2A. Fäst flikarna på dissektionsdynan. Använd sax, gör ett litet snitt i membranet ovanför lacrimalkörteln för att helt exponera lacrimalkörteln.
- Dra lacrimalkörteln med hjälp av pincetten. Det bör finnas ett visst motstånd tills huvudlacrimalkanalen rivs. Om så önskas, skär huvudlacrimalkanalen direkt med sax.
- Placera tårkörteln hos mössen i PBS av vävnadskulturkvalitet tills vidare bearbetning. Fortsätt med bearbetning av tårkörteln inom 2-4 timmar för att begränsa celldöd. Om detta tar längre tid, placera tårkörteln hos mössen i biopsiuppsamlingsmediet (kompletterande tabell 1).
OBS: Flera tårkörtlar kan slås samman om ett stort antal organoider behövs omedelbart.
- Samla mänskliga lacrimal körtel biopsier
- Före operationen, förbered 20 ml alikvoter av biopsiuppsamlingsmedium (kompletterande tabell 1) i ett 50 ml rör och ge detta till kirurgen före operationen. Detta medium kan förvaras vid 4 °C i flera månader.
- På operationsdagen, låt kirurgen ta prov på en bit av tårkörteln (vanligtvis <1 mm3) och förvara den i biopsiuppsamlingsmediet (kompletterande tabell 1) vid 4 °C.
- Samla biopsin för att bearbeta den så snart som möjligt. Helst bör detta vara samma dag inom 2 timmar efter biopsiprovtagning.
- Organoid härledning
- Bered följande i förväg: tinad extracellulär matris (ECM), möss (rumstemperatur (RT) eller humant expansionsmedium (kompletterande tabell 1), tinat kollagenas, basmedium (kompletterande tabell 1), två skalpeller, en 10 cm petriskål, en sil på 70 μm monterad på ett 15 ml rör och upphängningsplattor med 12 brunnar förvärmda vid 37 °C i 30 minuter.
- Bered uppslutningsmediet genom att kombinera alla komponenter som visas i kompletterande tabell 1. Förblöt skalpellerna i detta medium för att undvika att vävnadsbitar fastnar på dem.
- Hämta musen eller mänsklig tårkörtelvävnad från mediet och placera den i petriskålen.
- Hacka vävnaden med de förfuktade skalpellerna. När vävnadsbitarna är mycket små (dvs <0,5 mm3), placera dem i matsmältningsmediet genom att skrapa dem från petriskålen med skalpellen. Om den mänskliga biopsin redan är mycket liten, placera den direkt i matsmältningsmediet utan att haka för att undvika vävnadsförlust.
- Inkubera vävnadsbitarna i upp till 15 minuter i ett 37 °C vattenbad. Vänd upp och ned 15 ml röret regelbundet för att återsuspendera bitarna. Övervaka celldissociationen under ett bänkmikroskop för att inte översmälta vävnaden.
- Under tiden smalnar du en Pasteur-pipett genom att placera spetsen i en låga medan du vrider och förblöter den i basmediet. För att effektivt dissociera vävnaden, se till att hålet är något mindre än de största vävnadsbitarna kvar. För att underlätta dissociationsprocessen, pipettera blandningen upp och ner var 5: e minut med den förfuktade smala Pasteurpipetten.
- När många enskilda celler och små klumpar är synliga under mikroskopet, stoppa dissociationen genom att tillsätta 10 ml av basmediet. Snurra ner vid 400 x g i 5 minuter för att pellet cellerna.
- Ta bort supernatanten och suspendera pelleten igen i 10 ml av basmediet för att upprepa tvätten. Filtrera den genom en sil på 70 μm för att avlägsna de stora osmälta vävnadsbitarna och återstående kollagenfibrer, vilket skulle förhindra adekvat polymerisation av ECM. Snurra eluatet vid 400 x g i 5 min.
OBS: En röd cellpellet indikerar närvaron av röda blodkroppar, vilket normalt inte hindrar organoid härledning. För vissa tillämpningar, såsom flödescytometri, bör dock de röda blodkropparna lyseras. För det, inkubera cellerna i 5 ml färsk röd blodkroppslysbuffert vid RT i 5 minuter och pellet cellerna vid 400 x g i 5 minuter. - Ta bort supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 100 μL kall ECM för en enda tårkörtel hos mus och i 50 μL kall ECM för en human biopsi. Var försiktig så att du inte gör bubblor när du återsuspenderar, eftersom dessa också skulle påverka ECM-polymerisationen och stabiliteten.
- Frö upp till 100 μL celler per brunn av en 12-brunns suspensionsplatta. Använd en P200 för att göra ~ 20 μL droppar i brunnen. Ju mindre dropparna desto bättre diffusion av tillväxtfaktorer och näringsämnen genom matrisen.
- Placera plattan upp och ner i en fuktad inkubator vid 37 °C i 20-30 minuter så att ECM stelnar.
- När ECM har stelnat, tillsätt ~ 1 ml RT-mus eller humant expansionsmedium per brunn på en 12-brunnsplatta. Uppdatera mediet var 2-3: e dag tills organoiderna når en storlek på 300 μm. För det, aspirera mediet i brunnen och tillsätt försiktigt expansionsmedium på sidan av brunnen utan att vidröra ECM-dropparna för att inte störa dem.
OBS: Primocin (100 mg/ml; 1:1 000 från kommersiellt ursprung) kan tillsättas vid isolering om bakteriell kontaminering inträffar. Men eftersom det saktar ner organoidtillväxten också, är det att föredra att inte lägga till det eller ta bort det efter en eller två passager.
2. Expandera musen och mänskliga lacrimal körtelorganoider
- Efter ~ 7 dagar för musorganoider och ~ 10 dagar för humana organoider, när organoiderna når en storlek på ~ 300 μm, ta bort odlingsmediet.
- Återsuspendera ECM-dropparna som innehåller organoiderna i 1 ml trypsinlösning genom att kraftigt pipettera upp och ner med en P1,000 tills dropparna faller isär. Överför blandningen till ett 15 ml rör och inkubera den kort i ett 37 °C vattenbad.
- Efter 2-3 minuter, använd en smalare och förfuktad Pasteurpipett för att pipettera organoidsuspensionen upp och ner 10x-15x. Kontrollera dissociationsstatusen för organoiderna under ett bänkmikroskop; Små klumpar av ~ 20 celler bör erhållas. Inkubera längre i vattenbadet vid 37 °C och upprepa pipettersteget tills dissociationen är tillfredsställande.
OBS: Detta steg kan ta längre tid för humana organoider eftersom de är flerskiktade. Enstaka celler kommer att genereras; Detta påverkar inte organoid utväxt så länge det mesta av organoidsuspensionen består av små klumpar. - Stoppa dissociationen genom att tillsätta 10 ml av basmediet. Pellet sedan cellerna vid 400 x g i 5 minuter.
- Efter avlägsnande av supernatanten och ECM som kan ligga ovanpå organoiderna (transparent, geléliknande skikt utan organoider), suspendera cellerna igen i en lämplig volym kall ECM innan de pläteras i en suspensionsplatta, såsom anges i steg 1.3.10.
OBS: I allmänhet delas lacrimal organoider hos möss i förhållandet 1:5 och humana organoider i förhållandet 1:3. Detta innebär att när man börjar med organoider som ingår i 100 μL ECM, måste de resuspenderas i 500 μL respektive 300 μL efter delningen. - Inkubera plattan upp och ned i en 37 °C inkubator tills ECM stelnat i 30 minuter och täck organoiderna med musen eller det mänskliga expansionsmediet vid rumstemperatur.
3. Kryokonservering av musen och mänskliga lacrimal körtelorganoider
- För att kryokonservera organoiderna, dela först organoiderna i expansionsmediet enligt instruktionerna i avsnitt 2.
- Cirka 3-4 dagar senare, när organoiderna befinner sig i en tillväxtfas, avlägsna mediet och resuspendera 100 μL av ECM innehållande organoider i 10 ml kallt basmedium. Inkubera på is i 10 minuter för att hjälpa till att dissociera ECM. Vänd röret regelbundet för att underlätta denna process.
- Pellet organoiderna vid 500 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och återsuspendera organoidpelleten i 1 ml kryokonserveringsmedium (kvarvarande ECM försämrar inte kryokonservering). Överför organoidsuspensionen till en kryovial och omedelbart till en frys på -80 °C.
OBS: Vid användning av det kryokonserveringsmedium som beskrivs i materialtabellen kan kryovialerna förvaras på obestämd tid i en frys på −80 °C. Om ett annat kryokonserveringsmedium används, överför kryovialen till en flytande kvävetank efter 24 timmar för att säkerställa optimal konservering. - För att tina organoiderna, hämta kryovialen från frysen och transportera den på torris till ett 37 ° C vattenbad. Håll kryovialen i vattnet tills det mesta av innehållet tinas. Överför innehållet till ett 15 ml rör innehållande 10 ml basmedium och snurra ner cellerna vid 400 x g i 5 minuter.
- Platta organoiderna i 100 μL ECM med expansionsmediet, enligt beskrivningen i steg 2.5 och steg 2.6.
4. Differentiera lacrimal körtelorganoider och bedöma deras funktionalitet
- Organoid differentiering
- För att differentiera tårkörtelorganoider, dela först organoiderna i expansionsmediet enligt instruktionerna i avsnitt 2.
- Efter 2 dagar ersätter du expansionsmediet med ett differentieringsmedium för mus eller människa enligt beskrivningen i steg 1.3.12. Uppdatera mediet var 2-3: e dag för att behålla musorganoiderna i 5 dagar i det mediet och de mänskliga organoiderna i 9 dagar.
- För att bedöma organoiddifferentiering efter 5 dagar eller 9 dagar i differentieringsmediet, samla 100 μL ECM innehållande organoider för att extrahera RNA. För att göra det, resuspendera ECM-dropparna i 1 ml medium som finns i brunnen med en P1 000 och överför organoidsuspensionen i 3 ml iskallt basmedium. Pellet organoiderna vid 500 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i RNA-extraktionsbuffert. Utför nedströms RNA-extraktionen enligt instruktionerna i RNA-extraktionssatsen. Använd det erhållna RNA, till exempel för RT-qPCR-analys av uttrycket av stamceller (TP63, KRT5, KRT14) och differentierade cellmarkörer (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2 ...) 14.
OBS: För att erhålla den relevanta uttrycksanalysen, mät uttrycket av de valda markörerna i ett eller flera vävnadsprover. Organoider odlade under differentieringsförhållanden tenderar att innehålla mindre RNA.
- Funktionell svullnadsanalys
OBS: För denna del av protokollet, använd humana tårkörtelorganoider som har differentierats i minst 7 dagar. Den minsta tid som krävs är 7 dagar för att säkerställa tillräckligt marköruttryck för funktionell rivning. Varje brunn på en platta med 12 brunnar utgör ett villkor. Det minsta antalet villkor är tre: en positiv kontroll, en negativ kontroll och ett testvillkor.- Förbered nyligen 1 ml humant differentieringsmedium innehållande enskilda komponenter som inducerar utsöndring av tårkörtelorganoiderna. Tillsätt till exempel 100 μM noradrenalin och 1 μM forskolin och blanda noggrant.
OBS: Forskolin fungerar som en positiv kontroll som vanligtvis inducerar maximal svullnad. - Vid ett automatiserat ljusfältstidsfördröjningsmikroskop, ställ in positionerna som ska avbildas i plattan, tidsintervallet (5 min) och varaktigheten (4 timmar). Se till att en hel ECM-droppe är synlig vid varje position.
- Strax innan du börjar avbilda och utan att flytta plattan från mikroskopet, ta bort odlingsmediet från brunnarna som ska avbildas och ersätt det med det väl återsuspenderade mediet som beretts i steg 4.2.1. Inkludera som en negativ kontroll en brunn med differentieringsmedium ersatt av endast differentieringsmedium, eftersom medium förfriskning kan utlösa viss organoid svullnad.
- Efter upp till 4 timmar är svullnadsanalysen över. Analysera resultaten.
OBS: Dessa steg utförs med ett EVOS M7000-mikroskop som möjliggör automatiserad time-lapse-avbildning av ljusfält. För det mikroskopet, se den detaljerade tillverkarens manual för att ställa in time-lapse-avbildningen. Observera att alla andra mikroskop med liknande egenskaper kan användas. - För att kvantifiera organoid svullnad, mät diametern hos varje enskild organoid vid 0 h och 4 h. Öppna bilderna av en enda organoiddroppe vid 0 h och 4 h i ImageJ.
- Klicka på ikonen Rak linje i verktygsfältet och rita först diametern på en organoid vid 0 h. Använd sedan mätverktyget i ImageJ (Analysera > mät) för att mäta längden på denna linje och därmed organoiddiametern före svullnad. Upprepa processen på samma organoid vid 4 h för att erhålla organoiddiametern efter svullnad.
- Mät organoiddiametern på ~ 20 organoider per tillstånd före och efter svullnadsanalysen.
- Förbered nyligen 1 ml humant differentieringsmedium innehållande enskilda komponenter som inducerar utsöndring av tårkörtelorganoiderna. Tillsätt till exempel 100 μM noradrenalin och 1 μM forskolin och blanda noggrant.
5. Konstruera en plasmid för att slå ut Pax6
- gRNA-design till knockout Pax6 använda C > T-basredigerare
OBS: Det finns gott om program tillgängliga för gRNA-design. Här användes Benchling eftersom detta möjliggör integrerad gRNA-design, annotering och inriktning av Sanger-spår. Alla efterföljande steg kan således också utföras med hjälp av alternativa program.- Starta gRNA-designprocessen genom att visualisera målgenen i Benchling genom att klicka på Ny (+) > DNA-sekvens > Importera DNA-sekvenser.
- På fliken Importera från databas skriver du genen av intresse, Pax6, och trycker på Sök.
- Välj den senaste versionen av musreferensgenomet GRCm38 (mm10, Mus musculus) och tryck på Importera.
- Välj exon där knock-out gRNA kan utformas genom att följa följande regler:
- Undvik att sätta ett gRNA i den första kodande exonen, eftersom alternativa startställen i efterföljande exoner kan användas av cellen för att kringgå det tidigt inducerade stoppkodonet.
- Designa gRNA i exoner som finns i alla alternativa transkript som kan uppstå genom splitsning av Pax6-mRNA . För att säkerställa detta, visualisera Pax6 i Ensembl genombläddraren och välj exon som används i alla transkriptioner.
- För att ytterligare kringgå alternativ skarvning, rikta in dig på en exon som har ett ofullständigt kodon (en eller två återstående baser av en triplett). Detta är av mindre betydelse men ger mer säkerhet om effekterna av inducerade indels. För Pax6 är exon 4 till exon 11 ett bra mål. Välj dessutom en exon som innehåller tryptofan (W), glutamin (Q) eller arginin (R) rester.
Standard C- > T-basredigerare som använder SpCas9 har ett redigeringsfönster som sträcker sig från nukleotid 4 till nukleotid 8 från början av gRNA (längst bort från PAM). C- > T-basredigerare kan införa stoppkodon på alla tryptofan (W) rester (TGG till TGA, TAG eller TAA) med ett gRNA på den bakre strängen, på glutamin (Q) rester (CAG till TAG eller CAA till TAA) och slutligen på arginin (R) rester (CGA till TGA) på den främre strängen.
- Välj exon + 20 baser uppströms och nedströms. Klicka på höger sida av skärmen på målskylten CRISPR och klicka på Designa och analysera guider.
- I den nyöppnade menyn, under fliken Designtyp, kryssar du i guiderna för "basredigering" (Komor et al., 2016). Håll guidelängden vid 20 nukleotider och välj GRCm38 (mm10, Mus musculus) under Genom för mus.
- Efter att ha klickat på det gröna + -tecknet kommer programvaran automatiskt att upptäcka alla protospacer intilliggande motivsekvenser (PAM) och på höger sida av skärmen skapa en lista över alla potentiella gRNA i området runt exon av intresse.
- Bläddra igenom listan tills stoppkodontecknet (*) i en röd ruta, som signalerar för ett gRNA som potentiellt kan förvandla en aminosyra till ett stoppkodon och därmed resultera i en knock-out.
- I den första kolumnen till höger om gRNA-sekvensen, för varje mål "C" runt redigeringsfönstret, beräknas in silico-förutsagda redigeringseffektiviteter. Se till att C > T-redigeringen som resulterar i stoppkodonet har en redigeringseffektivitet på minst ~ 10.
- Klicka på värdet i kolumnen Off-Target för att kontrollera vilka off-target-loci gRNA kan binda till. Undvik att välja ett gRNA som binder till ytterligare gener för att öka specificiteten. Till exempel riktar sig ett bra gRNA för att redigera Pax6 med en C- > T-basredigerare exon 7 och är 5'-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3'.
- Skapa en anteckning i Benchling-filen genom att klicka på ikonen Anteckningar längst upp till höger på skärmen, följt av Ny anteckning. Namnge anteckningen och se till att rätt gRNA-orientering är vald i rullgardinsmenyn Sträng.
- generering av gRNA-plasmider
OBS: Det finns olika vektorer tillgängliga för gRNA-leverans till organoider. Följande plasmid användes som bas för gRNA-konstruktion: pFYF1320 (Addgene #47511, en vänlig gåva från Keith Joung).- För att klona gRNA: erna i pFYF1320, implementera en omvänd PCR-strategi som använder standard framåtprimern: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. För att designa den omvända primern, klistra in det omvända komplementet av gRNA-distanssekvensen (dubbelkontrollera gRNA-orienteringen [+ eller - sträng]) framför följande universella omvända primerdel: CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. För att rikta in exon 7 på musen Pax6 med hjälp av C- > T-basredigeraren är den omvända primern följande: TCTGCGCCCATCTGTGTTGCTTCGGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Beställ båda primers.
- Kör en omvänd PCR-reaktion med 1 ng pFYF1320 som mall med ett DNA-polymeras med hög trohet i 35 cykler vid en glödgningstemperatur på 61 °C.
- Kör PCR-reaktionen på en 1% agarosgel i TAE-buffert vid 100 V i ~ 45 minuter för att visualisera det förväntade fragmentet av 2 281 baspar (bp). Utför en gelrengöring med valfritt kit.
- Ställ in följande ligeringsreaktion: 100 ng rengjord PCR-produkt, Dpn1-enzym för att avlägsna det ursprungliga pFYF1320-mall-DNA och T4-ligas. Inkubera blandningen i 15 min vid 20 °C, 30 min vid 37 °C och 20 min vid 80 °C.
- Omvandla reaktionsblandningen till kemiskt kompetenta DH5a-bakterier och sprid bakterierna på agarplattor som innehåller ampicillin15.
- Nästa dag, plocka och expandera tre enskilda kolonier i 3 ml lysogenbuljong (LB) medium kompletterat med 50 μg / ml ampicillin.
- Dagen efter, utför en miniprep på 1 ml av var och en av de tre minikulturerna med hjälp av ett miniprep kit och förvara resten vid 4 ° C. Utsätt den erhållna plasmiden för Sanger-sekvensering med den U6_Forward primern för att säkerställa att gRNA är korrekt införd i vektorn16.
- Efter att ha identifierat en enda bakteriekoloni med rätt plasmid, inokulera 500 μL av motsvarande minikultur i 50 ml LB kompletterat med ampicillin för att amplifiera plasmid-DNA över natten. Utför en midi-prep dagen efter att du använt ett midiprep-kit. Denna plasmid kommer att användas för elektroporering i avsnitt 6.
6. Generering av Pax6 KO-kloner
- Organoid elektroporering
- Börja med musorganoider som delades högst 5 dagar innan så att de är i ett proliferativt tillstånd. Använd ~ 300-400 μL organoiddroppar per knock-out. Inkludera ett ytterligare villkor för att välja en negativ kontroll som kommer att elektroporeras utan plasmid.
- Utför steg 2.1-2.4 för att dissociera organoiderna, men dissociera organoiderna längre så att de är enskilda celler. Kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 80 μL av elektroporationsbufferten.
- Bered följande plasmider i ett 1,5 ml rör för högst 20 μl: 2,5 μg pFYF1320-gRNA-plasmid, 2,8 μg transposasinnehållande plasmid, 7,2 μg hygromycinresistanstransposoninnehållande plasmid och 7,5 μg pCMV_ABEmax_P2A_GFP.
OBS: pFYF1320-gRNA-plasmiden kodar för det tidigare designade gRNA, som leder basredigeraren till målplatsen. Den pCMV_ABEmax_P2A_GFP plasmiden kodar basredigeraren, liksom en GFP-reporter, som kan användas för att övervaka cellerna som uttrycker basredigeraren efter elektroporering. Den transposasinnehållande plasmiden kodar för transposaset, som klistrar in hygromycinresistenskassetten som tillhandahålls av den hygromycinresistenta transposoninnehållande plasmiden någonstans slumpmässigt i genomet. Celler som har införlivat denna kassett i sitt genom blir resistenta mot hygromycin och kan selekteras positivt genom tillsats av hygromycin. Eftersom samtidig inkorporering av flera plasmider är mycket sannolik utgör hygromycinresistens ett funktionellt urval att anrika för celler som har redigerats för Pax6. - Tillsätt plasmiderna till cellerna och blanda väl genom pipettering upp och ner.
- Ställ in elektroporatorn med följande parametrar för poreringspuls (spänning: 175 V; pulslängd: 5 ms; pulsintervall: 50 ms; antal pulser: 2; sönderfallshastighet: 10%; polaritet: +) och för överföringspuls (spänning: 20 V; pulslängd: 50 ms; pulsintervall: 50 ms; antal pulser: 5; sönderfallshastighet: 40%; polaritet: +/-).
- Placera cellerna med plasmiderna i en elektroporeringskyvett. Mät omedelbart motståndet (Ω), som ska vara mellan 0,30 A och 0,55 A, och elektroporat direkt. Att utföra detta steg snabbt krävs för att undvika att cellerna sätter sig i botten av kyvetten och minskar elektroporeringseffektiviteten.
- Överför cellerna till ett 1,5 ml rör och tillsätt 400 μL elektroporeringsbuffert kompletterad med en rhokinashämmare. Låt cellerna återhämta sig vid rumstemperatur i 30 minuter.
- Pelletera cellerna vid 500 x g i 5 minuter, kassera supernatanten och platta cellerna i 200 μL ECM. Efter stelning, tillsätt musens expansionsmedium.
- Cystiska organoider växer ut efter 2-3 dagar. Övervaka GFP-signalen, som avslöjar närvaron av C > T-basredigeraren, dagligen.
- Organoid urval
- Efter ~3 dagar, när organoiderna har återhämtat sig, tillsätt 100 μg/ml hygromycin till musexpansionsmediet för att välja organoider som har integrerat hygromycinresistenskassetten. Det är hög sannolikhet att celler som tar upp en plasmid tar upp flera plasmider. Genom att selektera hygromycinresistenta organoider berikas redigerade organoider på Pax6-lokusen .
- När alla celler i den negativa kontrollen är döda och överlevande organoider är ~ 300 μm, välj de hygromycinresistenta organoiderna.
- Organoid plockning och genotypning
- Förbered sterila P20-spetsar bredvid mikroskopet och 1,5 ml rör innehållande 100 μL trypsinlösning vardera på is.
- Böj en P20-spets med pincett. Observera plattan som innehåller de överlevande organoiderna på ett bänkmikroskop. När en överlevande organoid är i fokus, ta bort locket på plattan. Använd den böjda P20-spetsen och fortfarande under mikroskopet, aspirera varje överlevande organoid individuellt och placera var och en av dessa i ett separat rör innehållande trypsinlösning.
- Plocka upp till 20 kloner. Antalet kloner som ska plockas beror på antalet kloner som krävs för varje experimentell design och på redigeringseffektiviteten, som varierar beroende på varje gRNA och locus.
- När alla kloner har plockats, placera 1,5 ml rören i ett 37 ° C vattenbad i upp till 5 minuter. Vortex varje rör regelbundet för att öka dissociationshastigheten och kontrollera organoiderna under bänkmikroskopet. När organoiderna dissocieras i små klumpar och / eller enskilda celler, stoppa matsmältningen genom att tillsätta 1 ml basmedium.
- För varje klon som plockas, behåll ~ 400 μL till genotyp i ett separat 1,5 ml rör. Snurra ~ 600 μL kvar vid 500 x g i 5 minuter, ta bort supernatanten, resuspendera cellerna i 20 μL ECM, platta dem som en enda droppe i en brunn på en 24-brunnsplatta och tillsätt musexpansionsmedium utan hygromycin.
- För att genotypa klonerna, snurra ner rören som innehåller ~ 400 μL cellsuspension vid 500 x g i 5 minuter, ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 50 μL DNA-extraktionsbuffert för att extrahera DNA.
- Inkubera cellerna omedelbart enligt följande: 6 min vid 60 °C, virvel, och 4 min vid 95 °C. Detta DNA kan förvaras i upp till 7 dagar vid −20 °C, men att utföra nedströms PCR omedelbart är mest optimalt.
- För att förstärka den plats som är riktad mot nukleaset, utför en PCR på 2 μL av det extraherade DNA:t med hjälp av adekvata genotypprimrar som beställts i förväg och ett polymeras med låg trohet. Genotypprimrarna är AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) och TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). Amplikonen bör börja ca 100 bp från den förväntade redigerade platsen för att säkerställa att den sekvenseras effektivt.
- Kör PCR-produkten på en agarosgel för att bedöma PCR-effektiviteten, som nämns i steg 5.2.3. När ett band av rätt storlek detekteras, skär det ur gelén för att utföra en DNA-gelextraktion med hjälp av ett kit.
- Sekvensera det extraherade DNA från varje organoidklon som tidigare plockats med genotypprimrarna.
- Justera sekvenserna erhållna till Pax6-genen i Benchling. Öppna den importerade gensekvensen från steg 4.1. Klicka på Justeringar på höger sida och sedan på Skapa ny justering. Ladda upp .ab1-filerna som erhållits från sekvenseringsprovidern, välj DNA som nukleotidtyp och tryck på Nästa.
- I följande fönster väljer du Multisequence och justeringsprogrammet Auto (MAFFT) innan du klickar på Skapa justering.
- Identifiera de genotyper som har ett homozygot för tidigt stoppkodon (som erhållits med basredigerare) på båda allelerna. Håll motsvarande organoidkloner för att expandera och kryokonservera dessa för vidare analys. Helst bör tre olika organoidkloner analyseras sida vid sida för att kringgå potentiella nukleaseffekter utanför målet.
7. Ortotopisk transplantation av humana tårkörtelorganoider hos NSG-möss
- Organoid beredning
- Mänskliga tårkörtelorganoider måste delas ~ 3 dagar före transplantationsdagen, som beskrivs i avsnitt 2. På transplantationsdagen, se till att organoiderna befinner sig i proliferativ fas för att öka risken för engraftment.
- För att extrahera organoiderna från ECM, tillsätt dispase till odlingsmediet för att nå en slutlig koncentration av 0,125 U / ml. Använd en P1 000, suspendera ECM-dropparna noggrant för att störa dem och placera plattan tillbaka i 37 ° C-inkubatorn i 30 minuter. En volym på 100 μL ECM är tillräcklig för att injicera ~ 10 tårkörtlar.
- Resuspendera organoiderna i 10 ml basmedium för att tvätta ut enzymet. Pellet cellerna vid 400 x g i 5 min.
- Resuspendera cellerna (~1 500 000) i 50 μL kallt humant expansionsmedium kompletterat med 5% ECM. Placera organoidsuspensionen på is och fortsätt omedelbart till transplantationen.
- Ortotopisk transplantation hos möss
- I djuranläggningen, ha organoidsuspensionen och insulinnålarna på is. Aspirera organoidsuspensionen i en kall insulinnål.
- Sedera en NOD scid gamma (NSG) immunbristfällig mus med 3% isofluran för att initiera anestesi. När musen sover, placera den snabbt på sin sida med huvudtårkörteln (belägen halvvägs mellan ögat och örat) tillgänglig.
- Injicera 5 μL organoidsuspension direkt genom huden in i tårkörteln. Den maximala volymen som en tårkörtel hos möss kan innehålla är 5 μl.
- Låt musen återhämta sig och övervaka musen varje dag för att bedöma förekomsten av obehag i samband med transplantationen, särskilt i ögat.
- Bedöm engraftment
- Offra musen med O 2/CO2 inhalation efter upp till 90 dagar beroende på om kortvarig eller långvarig engraftment ska bedömas13.
- Dissekera tårkörteln enligt beskrivningen i avsnitt 1. Fixa det i 4% formalin i 24 timmar vid RT.
- Placera lacrimalkörteln i en kassett. Dehydrera tårkörteln genom att inkubera den enligt följande: 2 timmar i 70 % etanol, 2 h i 96 % etanol, 1 h i 100 % etanol (2x), 2 timmar i xylen och över natten i flytande paraffin vid 58 °C i ugnen.
- Nästa dag, orientera lacrimalkörteln som föredragen i en metallform, fyll på den med flytande paraffin och låt blocket stelna på en kall yta. Denna process utförs bäst med en inbäddningsmaskin.
- När paraffinblocket är fast, skär hela blocket i 4-5 μm sektioner med en mikrotom. Håll alla sektioner (i form av band) i en torr, dragfri miljö. Sektionerna kan förvaras på obestämd tid vid rumstemperatur.
- Prova en av 10 sektioner som spänner över hela blocket.
- Montera sektionerna på en bild enligt följande: lägg en droppe vatten på bilden, placera sektionen ovanpå, låt den vila i ~ 2 minuter så att den kan sträcka sig på en 42 ° C värmeplatta och ta bort vattnet försiktigt med papper.
- Placera glasen för att torka över natten i en ugn på 58 ° C. Bilderna kan hållas på obestämd tid vid RT förbi detta skede.
- För att skilja mänskliga celler från musceller, utför human nukleär antigenfärgning på dessa sektioner. Rehydrera sektionerna genom att utföra följande tvättar: 3 min i xylen (2x), 1 min i 100% etanol (2x), 1 min vardera i 96% etanol, 90% etanol, 80% etanol, 70% etanol, 60% etanol och 25% etanol, och slutligen 1 min i demivatten (2x).
- Inkubera glasen i 15 minuter i PO-buffert (kompletterande tabell 1). Tvätta bilderna 3x i ultrarent vatten.
- Utför en citratbaserad antigenhämtning i autoklaven:
- Placera objektglasen i en autoklavsäker glidhållare i en korg fylld med citratbuffert (kompletterande tabell 1). Placera korgen i autoklaven och kör en autoklavcykel (tryck: 10 PSI; temperatur: 121 °C; tid: 15 min).
- När autoklaven är trycksatt, hämta korgen som innehåller objektglasen och placera den i ett RT-vattenbad för att föra rutschbanorna till RT.
OBS: Antigenhämtningsstrategin beror på vilken antikropp som används. Se leverantörens datablad för att utföra den mest adekvata antigenhämtningen.
- Placera objektglasen vågrätt med sektionssidan uppåt på en inkubationsbricka. Tillsätt 500 μl blockerande buffert innehållande 1 % bovint serumalbumin (BSA) i PBS ovanpå och inkubera i 1 timme. Ta bort blockeringsbufferten.
- Bered antikroppslösningen genom att tillsätta 1 μl human nukleolär antigenantikropp till 500 μl blockerande buffert per objektsglas som skall färgas. Tillsätt antikroppslösningen till varje objektglas. Inkubera över natten i en fuktad inkubationsbricka vid 4 °C.
- Nästa dag, tvätta bilderna 3x i PBS. Inkubera objektglasen med outspädd HRP-antimus-sekundär antikropp i 45 minuter. Tvätta bilderna 3x i PBS.
FÖRSIKTIGHET. Förbered DAB-bufferten i en kemisk kåpa (kompletterande tabell 1). Inkubera objektglasen med DAB-buffert i 10 minuter. Kassera allt avfall i organiska kemiska flytande avfallsbehållare. - Tvätta glasen med vatten. Inkubera objektglasen i 2 minuter i hematoxylin för att motfärga kärnorna. Tvätta rutschkanorna i rinnande kranvatten i 10 min.
- Torka ut objektglasen genom att inkubera dem i 1 min vardera i 50% etanol, 60% etanol, 70% etanol, 80% etanol och 90% etanol, 1 min i 96% etanol (2x), 1 min i 100% etanol (2x) och 1 min i xylen (2x).
- Bifoga objektglasen med monteringsmedium och ett täckglas. Efter torkning i ca 20 minuter, observera objektglasen under ett mikroskop.
Representative Results
Efter dissektion av muskrackkörteln (figur 2A) genererade den enzymatiska och mekaniska nedbrytningen små vävnadsfragment, bland vilka acini och kanalerna kunde särskiljas (figur 2B). De återstående stora vävnadsbitarna skulle destabilisera ECM, vilket skulle minska initial organoid utväxt. Muskrackkörtelorganoidhärledningen lyckades när cystiska organoider med ~ 500 μm diameter hittades efter ~ 7 dagar, det stadium där organoiderna var redo att delas (figur 2C). Även om den övergripande organoidhärledningen är framgångsrik kan vissa organoider börja växa innan de slutar så småningom. Humana lacrimal körtelorganoider växte ut som cystor inom 3-4 dagar och nådde fullvuxen storlek inom 10-14 dagar efter vävnadsisolering (figur 2D). För både möss och människor misslyckades organoidhärledning ibland, med inga eller få organoider som växte ut; Detta orsakades i allmänhet av översmältning av vävnaden. Muskas lacrimal körtelorganoider kan passeras minst 40x och de mänskliga organoiderna minst 20x. Passaging gjordes var 7-10 dagar i genomsnitt, beroende på organoid tillväxt.
Figur 2: Etablering av tårkörtelorganoider från möss och människa. a) Fotografier av de olika stadierna av tårkörteldissektion hos möss. Pilen pekar på lacrimalkörteln under dess skyddande membran. (B) Brightfield-bilder av tårkörtelceller från möss direkt efter vävnadsuppslutning, med insatser som visar en acinus och en kanal. (C) Brightfield-bilder av en framgångsrik och en misslyckad tårkörtelorganoid härledning från musen. (D) Brightfield-bilder av utväxt av mänsklig organoid under 14 dagar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tårkörtelorganoiderna innehåller en stor andel stamceller när de odlas i expansionsmediet. För att öka deras differentieringsnivå satte vi upp en mus och ett mänskligt differentieringsmedium med reducerat tillväxtfaktorinnehåll. Efter 5 dagar respektive 7 dagar i differentieringsmediet blev mus- och humana lacrimalkörtelorganoider tätare (figur 3A-B). Denna morfologiska förändring korrelerade med ökade funktionella egenskaper. Applicering av den cykliska AMP-aktivatorn forskolin eller signalsubstansen noradrenalin resulterade i organoid svullnad (dvs apikal vattensekretion) inom mindre än 3 timmar (figur 3C). När svullnaden tog längre tid än 3-4 timmar föreslog detta att organoiderna inte var tillräckligt differentierade och / eller inte uttryckte funktionella markörer, såsom receptorer för neurotransmittorer.
Figur 3: Differentiering av tårkörtelorganoider hos mus och människa och funktionell svullnadsanalys i humana organoider. (A) Brightfield-bilder av tårkörtelorganoider från möss odlade i expansionsmedium i 7 dagar och i differentieringsmedium i 5 dagar efter 2 dagar i expansionsmedium. (B) Brightfield-bilder av humana tårkörtelorganoider odlade i expansionsmedium i 11 dagar och i differentieringsmedium i 9 dagar efter 2 dagar i expansionsmedium. (C) Brightfield-bilder av differentierade humana tårkörtelorganoider exponerade för färskt differentieringsmedium (kontroll), till 1 μM forskolin och till 100 μM noradrenalin under loppet av 3 timmar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
För att slå ut Pax6 i tårkörtelorganoider hos möss genererades en plasmid innehållande det valda Pax6-riktade gRNA genom PCR och ligering (figur 4A). Denna gRNA-innehållande plasmid elektroporerades tillsammans med Piggy-Bac-plasmiderna (hygromycinresistenstransposoninnehållande och transposasinnehållande plasmider) och C> T-basredigeraren Cas9 i tårkörtelorganoider hos möss dissocierade i enskilda celler. Efter 3 dagar, när organoiderna hade återhämtat sig, exponerades de för hygromycin för att välja kloner som hade införlivat hygromycinresistenskassetten. I framgångsrika elektroporationer växte organoider resistenta mot hygromycin ut (figur 4B). De växande organoidklonerna som var större än ~ 300 μm plockades, helst innan de började spontant differentiera (figur 4C). DNA extraherades från en del av organoiden medan resten hölls i odling. PCR-amplifieringen av Pax6-lokus riktad mot gRNA gav ett 367 bp-band för var och en av de valda klonerna (figur 4D). Efter sekvensering av den förstärkta platsen behölls kloner som var homozygously C > T redigerade (n = 1). Å andra sidan kasserades kloner som inte redigerades (n = 4), redigerades heterozygt eller felaktigt redigerades (n = 1) (figur 4E). Sammantaget, med användning av detta gRNA riktat mot Pax6, erhölls en homozygot knock-out mus lacrimal körtelklon av sex sekvenserade. Vissa kloner växte ut bra, men vissa organoidkloner förlorades efter plockning eller började differentiera (figur 4F). Av de 10 organoidkloner som valdes växte 7 ut bra.
Figur 4: Basredigeringsmedierad knock-out av Pax6 i tårkörtelorganoider hos möss. (A) Sanger-sekvenseringsspår av pFYF1320 efter korrekt integration av gRNA som riktar sig mot Pax6-lokusen. (B) Brightfield-bilder av tårkörtelorganoider hos möss 5 dagar efter exponering för hygromycin efter elektroporering. Organoiderna odlades i musexpansionsmedium. Till vänster är ett exempel på en misslyckad elektroporering, utan klon resistent mot hygromycin som växer ut. Till höger är ett exempel på en framgångsrik elektroporering, med flera hygromycinresistenta organoidkloner överlevande. (C) Brightfield-bilder av kloner som bör plockas och kloner som inte bör plockas. (D) Agarosgel som visar amplifieringen av Pax6-lokus riktad mot gRNA. I grönt markeras bandet med den förväntade storleken 367 bp. (E) Sangersekvenseringsspår av tre organoidkloner som var resistenta mot hygromycin. Den översta klonen är oredigerad. Den mellersta klonen är en homozygot C- > T-utgåva och därmed en homozygot knock-out. Den nedre klonen presenterar två heterozygota punktmutationer och är antingen en heterozygot knock-out eller en blandad klon och har felaktigt redigerats. (F) Brightfield-bilder av de plockade organoidklonerna med olika nivåer av utväxt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Slutligen, för att utföra human lacrimal körtel organoid ortotopisk transplantation hos möss, användes organoider som delades 3 dagar i förväg (< 100 μm i diameter). Organoidgravering bekräftades 1 månad efter injektion av organoiderna i tårkörteln hos möss genom färgning för en humanspecifik markör, det humana nukleolära antigenet (figur 5). Frånvaron av punkterad färgning från alla delar av musens lacrimal körtel innebar brist på mänsklig organoid engraftment.
Figur 5: Transplantation av humana tårkörtelorganoider i tårkörteln hos möss. Färgning av transplanterade muskrackkörtlar för den humana nukleolära markören för att övervaka engraftment 1 månad efter transplantation. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande tabell 1: Mediernas och buffertarnas sammansättning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Discussion
Detta protokoll beskriver etablering och användning av tårkörtelorganoider för funktionella analyser, mutationsmodellering och transplantation. Vid etablering av mus- och humana lacrimalkörtelorganoider är vävnadsdissociation avgörande. Om vävnaden inte smälts tillräckligt kommer organoidutbytet att vara lågt. Om vävnaden översmälts kommer cellerna att dö och inte växa ut som organoider. Varje vävnad bör smälta med ett specifikt enzym under en viss tid för att säkerställa optimal organoid utväxt14,17,18. Lacrimalkörteln är en ganska mjuk vävnad för vilken en kollagenasuppslutning på 5-10 min i kombination med pipetterbaserad mekanisk dissociation är tillräcklig för att isolera små bitar av vävnad. Om enskilda celler behöver erhållas för tillämpningar såsom encells-RNA-sekvensering kan dissociationen utföras längre tills encellsstadiet uppnås, men dissociationen bör stoppas så snart enskilda celler erhålls för att begränsa eventuell minskning av livsdugligheten. Eftersom vävnadsdissociation är så avgörande är över-digestion den mest troliga orsaken till misslyckandet av lacrimal körtel organoid etablering.
Lämpligt underhåll av lacrimal körtelorganoider är viktigt för deras användning. Långsiktigt underhåll är ett kännetecken för vuxna tårkörtelorganoider som härrör från stamceller, jämfört med inducerade pluripotenta stamcellsderiverade organoider 7,17. För att uppnå långsiktigt underhåll bör regelbunden organoiddelning och medieförändringar utföras. Utan detta börjar organoider differentiera och utveckla minskad stamcellspotential, vilket hindrar deras långsiktiga underhåll7. Vid detta steg igen kan övermatsmältning döda stamcellerna och försämra organoidunderhållet. För regelbundet underhåll krävs inte organoiddissociation i enskilda celler. Men för att generera klonala knock-out organoidlinjer är det viktigt att börja med enstaka celler. Om inte, kommer organoiderna att bestå av en mosaik av celler med olika genetisk bakgrund, vilket gör det omöjligt att analysera effekten av en enda, definierad mutation. Här beskriver vi användningen av en C- > T-basredigerare för att generera stoppkodoner. Denna genomredigerare förlitar sig på närvaron av arginin-, glutamin- eller tryptofankodon inom 12-18 baser från en NGG PAM. När dessa villkor inte är uppfyllda vid utformningen av ett gRNA kan konventionella Cas9- eller C >T-basredigerare med alternativa PAMs användas 7,18. Konventionell Cas9 introducerar dock dubbelsträngade brott som resulterar i indels vid reparation11. Eftersom båda allelerna kan ha olika indels, kräver klongenotypning ytterligare försiktighet. Dekonvolution av de införda modifieringarna bör utföras för att säkerställa att båda allelerna innehåller indels utanför ramen och därmed att organoidklonerna slås ut för den riktade genen19. Fördelen med C> T-basredigerare ligger i det faktum att de kan användas för att modellera punktmutationer som inte nödvändigtvis resulterar i stoppkodoner. De kan till exempel användas för att modellera specifika Pax6-mutationer som finns hos patienter med aniridi för att studera deras inverkan på tårkörtelns fysiologi20.
Lacrimalkörteln utsöndrar den vattenhaltiga delen av tårfilmen1. Tårsekretion kan rekapituleras i humana organoider efter differentiering medierad av tillväxtfaktoruttag och NOTCH-hämning. Under dessa förhållanden genomgår organoider terminal differentiering och kan inte bibehållas ytterligare. Ändå kan differentierade lacrimal körtelorganoider styra utvecklingen av rivinducerande läkemedel i samband med torra ögonsjukdomar, potentiellt i skärmar med hög genomströmning. Den rivningsanalys som presenteras i detta protokoll är den som för närvarande ger den största förändringen i organoidstorlek på kort tid, vilket gör det lättare att kvantifiera i samband med en läkemedelsskärm 7,9,17.
Stamcellsterapi är mycket lovande för tårkörtelregenerering vid torra ögonsjukdomar21. Vuxna stamcellshärledda tårkörtelorganoider kan vara ett källmaterial för sådana tillämpningar. Protokollet som presenteras här resulterar i mänsklig lacrimal körtelorganoid engraftment, mestadels som cystor. Låg organoidgravering kan uppstå på grund av att organoider injiceras på fel plats. Träning av injektionsproceduren med ett färgämne möjliggör spårning av injektionsstället och förbättrar i slutändan injektionsnoggrannheten. Alternativt kan musepidermis skäras för att ha direkt tillgång till tårkörteln, vilket görs hos råttor före22. Den här metoden tar längre tid men kan vara mer exakt. Å andra sidan, med det nuvarande protokollet, integrerades organoiderna inte funktionellt i musens lacrimalkörtel. Liknande resultat har observerats för iPSC-härledd tårkörtelgravering22. Transplantationsmetoden kan förbättras ytterligare genom att skada tårkörteln i förväg, med hjälp av en musmodell med torra ögon, och/eller injicera organoiderna som enstaka celler eller små klumpar. Ändå kan vuxna stamcellshärledda tårkörtelorganoider och den relaterade verktygslådan ligga till grund för framtida tillämpningar inom tårkörtelforskning och regenerativ medicin.
Disclosures
Hans Clevers är chef för Pharma Research and Early Development vid Roche, Basel, och innehar flera patent relaterade till organoidteknologi.
Acknowledgments
Vi tackar Yorick Post för den inledande utvecklingen av protokollet. Detta arbete stöddes delvis av en utmärkelse från Cancer Research UK Grand Challenge (C6307/A29058) och Mark Foundation for Cancer Research till SPECIFICANCER-teamet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 °C |
| 5x green GoTaq Flexi buffer | Promega | M891A | Store at -20 °C |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Store at -20 °C, stock at 30 mM, 10000x |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | store at 4 °C |
| Agar plates containing Ampicillin | Hubrecht Institute | ||
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclave VAPOUR-Line lite | VWR chemicals | ||
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | Store at -20 °C, 50x |
| BD Micro-Fine insulin needle 1 mL | BD Bioscience | 324825 | |
| Benchtop microscope DMI1 | Leica | ||
| Bovine serum albumine (BSA) | MP biomedicals | 160069 | Store at 4 °C |
| BTXpress | BTX | MDS450805 | |
| C57BL/6 mice | Hubrecht Institute | ||
| Cassettes | Klinipath | 410-02S | |
| CellBanker 1 | amsbio | 11910 | Cryopreservation medium, adhere to instructions |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Citric acid monohydrate | J.T. Baker | 0088 | CAS: 5949-29-1 |
| Collagenase I | Sigma Aldrich | C9407 | Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 °C |
| Conical tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
| Conical tubes 50 mL | Corning | CLS430828-500EA | |
| Coverslips 24 mm x 50 mm | Menzel-Gläzer | BB024050S1 | |
| Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix | R&D Systems, Bio-Techne | 3533-001-02 | Store at -20 °C, keep at 4 °C for up to 1 month |
| DAPT | Sigma Aldrich | D5942 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |
| Disodium hydrogen phosphate anhydrous | VWR chemicals | 28026.292 | CAS: 7558-79-4 |
| Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | CAS:10028-24-7 |
| Dispase | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | Aliquots at 50 U/mL, store at -20 °C until use, 400x |
| Disposable Scalpel Sterile N° 10 | Swann Morton | 3033838 | |
| DM4000 microscope | Leica | ||
| dNTPs 25 mM | Promega | U1420 | Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 °C |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
| Easy strainers 70 µm | Greiner | 542170 | |
| Electroporation cuvette | Nepagene | EC002S | |
| EnVision+/HRP mouse | Agilent | K400111-2 | |
| Ethanol 100% | BOOM | 84045206;5000 | CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions |
| Ethanol 70% | BOOM | 84010059.5000 | CAUTION |
| Ethanol 96% | BOOM | 84050065.5000 | CAUTION |
| EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | Live-imaging brightfield microscrope | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Store at -20 °C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x |
| Fiji | NIH, Fiji developers | ||
| Formaldehyde solution 4% | Sigma-Aldrich | 1.00496 | CAS: 50-00-0, CAUTION |
| Forskolin | Tocris | 1099 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100x |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7805 | Store at -20 °C |
| Haematoxylin | VWR chemicals | 10047105 | Store at room temperature |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | Store at 4 °C, 100x |
| Histocore H and C, Tissue embedding machine | Leica | ||
| Hot plate | Meidax | ||
| Human nucleolar antigen antibody | Abcam | ab-190710 | |
| Hydrochloric acid 5 N | ThermoFisher Scientific | 10605882 | CAS: 7647-01-0, CAUTION |
| Hydrogen peroxyde 30% | Chem-lab | CL00.2308.1000 | CAS: 7722-84-1, CAUTION |
| Hygromycin B-gold | InvivoGen | ant-hg | Stock at 100 mg/µL, 1000x |
| Hygromycin resistance cassette-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
| IsoFlo 100% | Mecan | 5960501 | |
| LB medium | Hubrecht Institute | ||
| MgCl2 25 mM | Promega | A351H | Store at -20 °C |
| Microtome RM2235 | Leica | ||
| Midiprep DNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | K210005 | |
| Miniprep DNA isolation kit | ThermoFisher scientific | K210003 | |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Store at -20 °C, stock at 500 mM, 400x |
| NEPA21 electroporator | Nepagene | ||
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Store at -20 °C, stock at 1M, 100x |
| NOD Scid Gamma (NSG) mice | Hubrecht Institute colony | ||
| Noggin conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
| Noradrenaline | Sigma Aldrich | A7257 | Store at -20 °C, stock at 100 mM |
| Oven | Memmert | Set at 58 °C | |
| P20, P200 and P1000 pipettes | Gilson | ||
| Paraffin | VWR chemicals | 10048502 | |
| Pasteur pipettes, glass plugged | ThermoFisher Scientific | 1150-6973 | |
| Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG | IDT | ||
| Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC | IDT | ||
| pCMV_ABEmax_P2A_GFP | Addgene | 112101 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Store at -20 °C |
| Pertex | Klinipath | AM-08010 | |
| pFYF1320 | Addgene | 47511 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1000X, store at -20 °C |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
| Petri dish, 10 cm | Greiner | 633102 | |
| Q5 buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | Store aliquots at -20 °C |
| R-spondin 3 conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
| sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG | IDT | ||
| Slides | StarFrost | MBB-0302-55A | Adhesive, ground |
| Sodium azide | Merck | 8.22335.1000 | CAS: 26628-22-8, CAUTION |
| Sodium cytrate dihydrate | J.T. Baker | 0280 | CAS: 6132-04-3 |
| Standard Forward Primer: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC |
IDT | ||
| Subcloning efficiency competent cells DH5alpha | Invitrogen | 18265-017 | |
| Suspension cell culture plates (24-well) | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
| Suspension cell culture plates (12-well) | Greiner Bio-One | 665102 | 12-well |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
| TAE buffer | ThermoFisher Scientific | B49 | Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water |
| Transposase-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
| TrypLE Express Enzyme | Invitrogen | 12605-028 | store at 4 °C |
| U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT | IDT | ||
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550 | |
| Water bath | Tulabo | ||
| Xylene | Klinipath | 4055-9005 | CAS: 1330-20-7, CAUTION |
| Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |
References
- Garg, A., Zhang, X. Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine. Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).
- Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. Resistance to infection of the external eye: The role of tears. Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).
- Messmer, E. M. The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease. Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).
- Massie, I., et al. Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).
- Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PloS One. 7 (1), 29458 (2012).
- Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).
- Bannier-Hélaouët, M., et al. Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).
- Hayashi, R., et al. Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells. Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).
- Jeong, S. Y., et al. Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 247 (2021).
- Hofer, M., Lutolf, M. P.
- Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing. Frontiers in Genetics. 12, 728520 (2021).
- Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Driehuis, E., et al. Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy. Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids. Journal of Visualized Experiments. (180), e62438 (2022).
- Lõhmussaar, K., et al. Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer. Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).
- Bloh, K., et al. Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data. The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).
- Latta, L., et al. Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions. The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).
- Veernala, I., et al. Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy. The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).
- Hayashi, R., et al. Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells. Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).
