Summary
Pferde verfügen über eine außergewöhnliche aerobe Trainingskapazität, was die Skelettmuskulatur von Pferden zu einem wichtigen Gewebe sowohl für die Untersuchung der Trainingsphysiologie von Pferden als auch für die mitochondriale Physiologie von Säugetieren macht. Dieser Artikel beschreibt Techniken zur umfassenden Beurteilung der mitochondrialen Funktion in der Skelettmuskulatur von Pferden.
Abstract
Die Funktion der Mitochondrien - oxidative Phosphorylierung und die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies - ist sowohl für die Gesundheit als auch für die Krankheit von entscheidender Bedeutung. Daher ist die Messung der mitochondrialen Funktion von grundlegender Bedeutung für die biomedizinische Forschung. Die Skelettmuskulatur ist eine robuste Quelle für Mitochondrien, insbesondere bei Tieren mit einer sehr hohen aeroben Kapazität, wie z. B. Pferden, was sie zu idealen Objekten für die Untersuchung der mitochondrialen Physiologie macht. Dieser Artikel demonstriert die Verwendung von hochauflösender Respirometrie mit gleichzeitiger Fluorometrie mit frisch entnommenen Mitochondrien der Skelettmuskulatur, um die Fähigkeit zur Oxidation von Substraten in verschiedenen mitochondrialen Zuständen zu quantifizieren und die relativen Kapazitäten verschiedener Elemente der mitochondrialen Atmung zu bestimmen. Tetramethylrhodaminmethylester wird verwendet, um die Produktion des mitochondrialen Membranpotentials zu demonstrieren, das sich aus der Substratoxidation ergibt, einschließlich der Berechnung der relativen Effizienz der Mitochondrien durch Berechnung des relativen Membranpotentials, das pro Einheit des gleichzeitigen Sauerstoffflusses erzeugt wird. Die Umwandlung von ADP in ATP führt zu einer Änderung der Magnesiumkonzentration in der Reaktionskammer, die auf unterschiedliche Affinitäten der Adenylate zu Magnesium zurückzuführen ist. Daher kann Magnesiumgrün verwendet werden, um die Rate der ATP-Synthese zu messen, was eine weitere Berechnung der oxidativen Phosphorylierungseffizienz (Verhältnis von Phosphorylierung zu Oxidation [P/O]) ermöglicht. Schließlich ermöglicht die Verwendung von Amplex UltraRed, das in Kombination mit Wasserstoffperoxid ein fluoreszierendes Produkt (Resorufin) erzeugt, die Quantifizierung der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies während der mitochondrialen Atmung sowie die Beziehung zwischen ROS-Produktion und gleichzeitiger Atmung. Diese Techniken ermöglichen die robuste Quantifizierung der mitochondrialen Physiologie unter einer Vielzahl unterschiedlicher simulierter Bedingungen und geben so Aufschluss über den Beitrag dieser kritischen zellulären Komponente zu Gesundheit und Krankheit.
Introduction
Die Mitochondrien eukaryotischer Zellen produzieren den Großteil des ATP, das von den Zellen für Arbeit und Wartung verwendet wird1. Ein wichtiger Schritt in der mitochondrialen Produktion von ATP ist die Umwandlung von Sauerstoff in Wasser, und daher wird die Stoffwechselkapazität der Mitochondrien und der zugehörigen Zellen häufig durch die Messung des Sauerstoffverbrauchs quantifiziert2. Die mitochondriale Physiologie ist jedoch komplexer als der einfache Prozess des Sauerstoffverbrauchs, und die ausschließliche Abhängigkeit von diesem Endpunkt ermöglicht eine unvollständige Bewertung der Auswirkungen der mitochondrialen Funktion und Dysfunktion auf die Zellgesundheit. Die vollständige Charakterisierung der mitochondrialen Funktion erfordert nicht nur die Beurteilung des Sauerstoffverbrauchs, sondern auch der Produktion von ATP sowie reaktiven Sauerstoffspezies (ROS).
Zusätzliche Messungen wichtiger mitochondrialer Funktionen können gleichzeitig mit der Messung der Atmung durch den Einsatz spezifischer Fluorophore durchgeführt werden. Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM) ist ein kationischer Fluorophor, der sich in der mitochondrialen Matrix proportional zum mitochondrialen Transmembranspannungspotential anreichert, was aufgrund dieser Akkumulation zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität führt3. TMRM kann als Indikator für relative Änderungen des mitochondrialen Membranpotentials verwendet werden, oder kann verwendet werden, um präzise Änderungen der Transmembranspannung mit zusätzlichen Experimenten zu quantifizieren, um Konstanten zu bestimmen, die eine Umwandlung des Fluoreszenzsignals in mV ermöglichen. Magnesiumgrün (MgG) ist ein Fluorophor, der fluoresziert, wenn er an Mg2+ gebunden ist, und wird für Messungen der ATP-Synthese verwendet, die auf der differentiellen Affinität von ADP und ATP für das zweiwertige Magnesiumkation4 basieren. Die Forscher müssen die spezifischen Affinitäts-/Dissoziationskonstanten (Kd) sowohl für ADP als auch für ATP unter bestimmten analytischen Bedingungen bestimmen, um die Änderungen der MgG-Fluoreszenz in eine Änderung der ATP-Konzentration umzuwandeln. Amplex UltraRed (AmR) ist der Fluorophor, der zur Messung der Produktion von Wasserstoffperoxid und anderen ROS während der mitochondrialen Atmung verwendet wird5. Durch die Reaktion zwischenH2O2und AmR (das durch Meerrettichperoxidase katalysiert wird) entsteht Resorufin, das durch Fluoreszenz bei 530 nM nachweisbar ist. Jeder dieser Assays kann einzeln zu Assays der mitochondrialen Atmung in Echtzeit hinzugefügt werden, um gleichzeitige Messungen der jeweiligen Aspekte der mitochondrialen Physiologie zu ermöglichen und so eine direkte Verbindung zwischen Atmung und mitochondrialem Output herzustellen.
Pferde sind in der Lage, einen sehr hohen massespezifischen Sauerstoffverbrauch zu erzielen, was zum Teil auf den sehr hohen mitochondrialen Gehalt der Skelettmuskulatur von Pferden zurückzuführen ist, was dieses Gewebe für die Untersuchung der mitochondrialen Physiologie von großer Bedeutung macht. Mit der Entwicklung der hochauflösenden Respirometrie haben Studien mit dieser neuartigen Technologie dazu beigetragen, den Beitrag der Mitochondrien der Skelettmuskulatur von Pferden sowohl zur bemerkenswerten körperlichen Leistungsfähigkeit von Pferden als auch zur Pathophysiologie von Skelettmuskelerkrankungen zu definieren 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Untersuchungen der mitochondrialen Funktion der Skelettmuskulatur von Pferden sind besonders vorteilhaft, da die Gewinnung großer Mengen dieses Gewebes nicht terminal ist. So können Pferde nicht nur ausreichend Gewebe für die vollständige Charakterisierung der mitochondrialen Funktion bereitstellen, sondern auch als Längsschnittkontrollen für qualitativ hochwertige, mechanistische Studien zur mitochondrialen Physiologie dienen. Aus diesem Grund wurden zusätzliche Assays zur Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials, der ATP-Synthese und der Produktion von ROS entwickelt, die die Messung des Sauerstoffverbrauchs in diesem Gewebe ergänzen, um eine robustere Charakterisierung der mitochondrialen Physiologie in der Skelettmuskulatur von Pferden zu ermöglichen.
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Protocol
Diese Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Oklahoma State University genehmigt. Vier Vollblutwallache (17,5 ± 1,3 Jahre, 593 ± 45 kg) wurden in dieser Studie verwendet, um die repräsentativen Ergebnisse zu generieren.
1. Entnahme einer Skelettmuskelbiopsie
- Entnahme von Skelettmuskelbiopsien (sterile Technik) aus der Mitte des Semitendinosusmuskels (oder eines anderen Muskels von Interesse) unter Verwendung einer 12-G-Biopsienadel des University College Hospital (UCH) (siehe Materialtabelle) unter leichter Sedierung und unter örtlicher Betäubung nach einem zuvor veröffentlichten Bericht11.
- Die Biopsieproben werden sofort in Durchstechflaschen mit eiskalter Biopsie-Transportmedienlösung (2,77 mM CaK2-EGTA, 7,23 mM K 2-EGTA, 20 mM Imidazol, 20 mM Taurin, 50 mM K-MES, 0,5 mM Dithiothreitol, 6,56 mM MgCl 2, 5,77 mM ATP und 15 mM Phosphokreatin, eingestellt auf pH 7,1; siehe Materialtabelle) überführt. Transport zur Analyse ins Labor.
HINWEIS: In Doerrier et al.15 finden Sie spezifische Anweisungen zur Vorbereitung des Biopsie-Transportmediums. - Isolieren Sie Mitochondrien aus den Biopsieproben mit einem handelsüblichen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Der endgültige Lagerpuffer sollte keine Substrate wie ADP, ATP und Succinat enthalten, die Teil des Respirometrie-Assays sind.
- Das endgültige Pellet der isolierten Mitochondrien wird mit 80 μl Suspensionsmedien (225 mM Mannitol, 75 mM Saccharose und 1 mM EGTA; siehe Materialtabelle) pro 100 mg Muskel, der für die Isolierung der Mitochondrien verwendet wird, resuspendiert.
- Minimieren Sie das Intervall vom Zeitpunkt der Biopsie bis zur Isolierung der Mitochondrien und halten Sie die Proben während der gesamten Verarbeitungsschritte bei 0-4 °C, bis sie in die hochauflösenden Respirometer gegeben werden.
HINWEIS: Vorläufige Studien haben ergeben, dass Suspensionen isolierter Mitochondrien nach ca. 2 h an Funktionsfähigkeit verlieren, wenn sie bei 0-4 °C gehalten werden.
2. Einrichten des hochauflösenden Respirometers
- Hochauflösende Respirometer werden verwendet, um die mitochondriale Atmung und die damit verbundenen Prozesse zu quantifizieren. Verwenden Sie das vom Hersteller bereitgestellte Software-Steuerungsprogramm (siehe Materialtabelle), um das Respirometer zu steuern, die Sensoren zu kalibrieren und Rohdaten zu erfassen. Analysieren Sie die Proben für jede Testbedingung in zweifacher Ausfertigung.
HINWEIS: In allen Fällen basieren die empfohlenen Titrationen und endgültigen Reagenzkonzentrationen, die in diesem Protokoll beschrieben sind, auf einer 2-ml-Respirometriekammer. - Bestimmen Sie den Hintergrund-O2-Fluss und den Nullpunkt desO2-Sensors alle 2-4 Wochen durch die serielle Titration von Dithionit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Behalten Sie diese Kalibrierkonstanten für nachfolgende Assays bei, bis die Kalibrierung wiederholt wird.
HINWEIS: Im Gegensatz zu bisher publizierten Verfahren mit permeabilisierten Muskelfasern11,12,13,16, bei denen eine Hyperoxie (250-500 μM) notwendig ist, um eine Diffusionsbegrenzung von O2 zu den Mitochondrien zu vermeiden, können isolierte Mitochondrien mit einem Bereich von 50-200 μM O2 bewertet werden. Dies kann einfach dadurch erreicht werden, dass sich das Atmungsmedium vor der Zugabe der mitochondrialen Suspension (d. h. nach täglicher Einzelpunktkalibrierung) mit der Raumluft ausgleicht. In ähnlicher Weise kann eine Reoxygenierung der Beatmungskammer durch einfaches Öffnen der Kammer erreicht werden, bis sich genügend Umgebungssauerstoff in den Respirometriemedien gelöst hat, um die Sauerstoffkonzentration auf das gewünschte Niveau zu erhöhen. - Füllen Sie die Respirometerkammern mit magnesiumfreien Medien (0,5 mM EGTA, 60 mM K-Lactobionat, 20 mM Taurin, 10 mMKH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM Saccharose und 1 g/L Rinderserumalbumin [BSA], im Wesentlichen fettsäurefrei, eingestellt auf pH 7,1; siehe Materialtabelle).
HINWEIS: In Komlodi et al.17 finden Sie spezifische Anweisungen zur Vorbereitung des Beatmungsmediums.- Stellen Sie die Inkubationstemperatur des Instruments auf 38 °C ein, um die Basaltemperatur der Skelettmuskulatur des Pferdes darzustellen, und stellen Sie das Mischen des Beatmungsmediums auf 800 U/min ein, indem Sie einen Magnetrührer verwenden, der sich im Boden der Respirometerkammer dreht.
- Schalten Sie die Kammerbeleuchtung aus, um Interferenzen mit Leuchtstoffsensoren zu vermeiden.
- Versorgen Sie die Sauerstoffelektrode mit einer Polarisationsspannung von 800 mV und verstärken Sie das resultierende Signal mit einer Verstärkungseinstellung von 1.
- Notieren Sie die Sauerstoffkonzentration alle 2 s, berechnen Sie den Sauerstofffluss als negative Steigung der Sauerstoffmessung über die vorangegangenen 40 s (20 Datenpunkte) und geben Sie sie als pmol x s-1 x ml Inkubationslösung an.
- Kalibrieren Sie den Lambdasonden, indem Sie das Medium mit der Raumluft ausgleichen lassen. Berechnen Sie den Referenzsauerstoffpartialdruck, basierend auf dem mit dem hochauflösenden Respirometer gemessenen Luftdruck und der Standardsauerstoffkonzentration in der Atmosphäre.
3. Messung des mitochondrialen Membranpotentials mittels TMRM
- Verwenden Sie "grüne" Fluoreszenzsensoren (530 nm dominante Wellenlänge), um das Fluoreszenzsignal aus der Beatmungskammer zu quantifizieren. Versorgen Sie die Sensoren mit 400-500 mV; Das resultierende Signal wird mit einer Verstärkung von 1:1.000 verstärkt.
HINWEIS: Spezifische Einstellungen müssen für einzelne Geräte optimiert werden, um das erwartete Signal innerhalb des linearen Bereichs des Sensors zu erfassen. - TMRM (4 μL 1 mM Lösung für eine Endkonzentration von 2 μM; siehe Materialtabelle) vor der Zugabe von Mitochondrien zugeben.
- Kalibrieren Sie das Fluoreszenzsignal mit einer einfachen Zwei-Punkt-Kalibrierung des Fluoreszenzsignals (Spannung) im Vergleich zur Menge des hinzugefügten Fluorophors (mM), bevor die Mitochondrien hinzugefügt werden.
Anmerkungen: Verwenden Sie die Kalibrierungsfunktion für Fluoreszenzsignale in der Maschinensteuerungssoftware, um dieses Signal zu kalibrieren. Es kann 30 Minuten oder länger dauern, bis sich das Rohsignal der Fluoreszenzsonde stabilisiert hat, um den zweiten Punkt der Kalibrierung aufzuzeichnen. - Führen Sie die endgültige Kalibrierung des TMRM-Signals nach Abschluss des Respirometrie-Titrationsprotokolls durch, indem Sie mehrere Titrationen des Entkopplungsmittels (Carbonylcyanid-m-Chlorphenylhydrazon; 2 μl pro Titration) durchführen, bis keine weiteren Anstiege des TMRM-Fluoreszenzsignals beobachtet werden, was auf einen vollständigen Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials hinweist (Abbildung 1).
Anmerkungen: Dieser Fluoreszenzsignalwert wird als gleich 0 mV Transmembranpotential betrachtet und als Referenzpunkt für die relativen Membranpotentialwerte verwendet, die während des Respirometrie-Titrationsprotokolls aufgezeichnet wurden.
4. Messung der ATP-Produktion mit Magnesiumgrün (MgG)
- Verwenden Sie "blaue" Fluoreszenzsensoren (465 nm dominante Wellenlänge), um das Fluoreszenzsignal aus der Beatmungskammer zu quantifizieren. Versorgen Sie diese Sensoren für einzelne Instrumente, um das erwartete Signal innerhalb des linearen Bereichs des Sensors zu erfassen.
- Führen Sie den chemischen Aufbau und die Kalibrierung des MgG-Fluoreszenzsignals nach der Zugabe der Mitochondrien, aber vor der Zugabe von Substraten durch. Geben Sie 8 μl 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in die Respirometriekammer, um Kationen (insbesondere Ca 2+) zu chelatisieren, die mit Mg2+ um die Bindung an MgG konkurrieren würden, und fügen Sie dann 4 μl 1 mM MgG (1,1 μM) in die Beatmungskammer hinzu.
- Kalibrieren Sie das rohe Fluoreszenzsignal mit sequenziellen 10 x 2 μL-Titrationen von 100 mMMgCl2 und lassen Sie zwischen den Titrationen 1 Minute zur Stabilisierung des Fluoreszenzsignals (Abbildung 2).
HINWEIS: Dieser Prozess, der nach Abschluss des Assays offline abgeschlossen wird und Vorlagen verwendet, die vom Hersteller des Geräts und der zugehörigen Software zur Verfügung gestellt werden, erzeugt eine Kurve zweiter Ordnung von Magnesiumkonzentration zu Fluoreszenzsignal (erwartetes r2 > 0,98), die mit einer bekannten Menge ADP, die der Respirometriekammer zugesetzt wird, und den zuvor ermittelten Kd-Werten verwendet wird, um die entsprechende Konzentration von ATP11 zu bestimmen. - Bestimmen Sie die Rate der ATP-Synthese, d. h. die Steigung der ATP-Konzentration im Laufe der Zeit im gesamten Protokoll (Abbildung 3).
5. Messung der mitochondrialen Produktion von ROS mit Amplex UltraRed (AmR)
- Verwenden Sie "grüne" Fluoreszenzsensoren (530 nm dominante Wellenlänge), um das Fluoreszenzsignal aus der Beatmungskammer zu quantifizieren. Versorgen Sie die Sensoren mit 300-400 mV; Das resultierende Signal wird mit einer Verstärkung von 1:1.000 verstärkt. Optimieren Sie spezifische Einstellungen für einzelne Instrumente, um das erwartete Signal innerhalb des linearen Bereichs des Sensors zu erfassen.
HINWEIS: Wenn Sie Beatmungsmedien ohne MgCl 2 verwenden, sollte dies vor der Zugabe von Reagenzien für den AmR-Assay hinzugefügt werden (20-60 μl 100 mM MgCl 2, um 1-3 μM MgCl2 zu erzeugen). - Führen Sie den chemischen Aufbau und die Erstkalibrierung des AmR-Assays durch, bevor Sie die Mitochondrien hinzufügen. Fügen Sie 30 μMol DTPA (6 μl einer 5-mM-Lösung) hinzu, um Kationen zu chelatisieren, die die Reaktion stören könnten, und fügen Sie dann Superoxiddismutase hinzu (2 μl einer 5.000 U/ml-Stammlösung zur Umwandlung von Superoxid-Anionen inH2O2für einen umfassenderen Nachweis der reaktiven Sauerstofferzeugung), Meerrettichperoxidase (5 μl einer 500 U/ml-Stammlösung), und Amplex UltraRed (2 μl einer 10-mM-Stammlösung) (siehe Materialtabelle) zur Herstellung von 5 U/ml, 1 U/ml bzw. 10 μM in der Respirometriekammer.
- Lassen Sie das Fluoreszenzsignal stabilisieren und fügen Sie dann zweimal im Abstand von etwa 5 Minuten 0,2 μMol Wasserstoffperoxid (5 μl einer täglich frisch hergestellten 40-μM-Lösung) hinzu.
HINWEIS: Das Fluoreszenzsignal vor und nach den beiden Titrationen von H2O2 liefert eine lineare Dreipunkt-Kalibrierungskurve des Systems (erwartete r2 > 0,95), deren Steigung die Gesamtreaktionsfähigkeit des Systems bei der Meldung der Beziehung zwischen dem Fluoreszenzsignal und der Erzeugung (oder Zugabe) vonH2O2widerspiegelt. Verwenden Sie die Fluoreszenzsignalkalibrierungsfunktion in der Maschinensteuerungssoftware, um dieses Signal zu kalibrieren. - Führen Sie während des gesamten Assays zusätzliche Zwei-Punkt-Kalibrierungen durch (5 μl einer täglich frisch hergestellten 40-μM-Lösung), um die Reaktionsfähigkeit des Assays anpassen zu können, wenn sich die Chemie der Respirometrie während des Assays ändert, wobei der spezifische Zeitpunkt dieser Kalibrierungspunkte im Ermessen des Prüfers liegt (Abbildung 4).
6. Messung der mitochondrialen Atmung
- In jede 2-ml-Inkubationskammer werden 15 μl isolierte Mitochondriensuspension (Schritt 1.4) gegeben, so dass die Ergebnisse der mitochondrialen Ausbeute von 18,75 mg Muskelmasse entsprechen. Verschließen Sie die Inkubationskammer. Verschieben Sie die Probe zwischen den einzelnen Titrationen, um eine gleichmäßige Suspension der Probe aufrechtzuerhalten.
- Messen Sie den Restsauerstoffverbrauch (ROX) vor der Zugabe von Substraten. Subtrahieren Sie diesen Wert (typischerweise weniger als 0,2 pmolO2 x s-1 x mL-1) von den Sauerstoffverbrauchswerten jedes Schritts im Substrat-/Entkuppler-/Inhibitor-Titrationsprotokoll 11 nach Abschluss des Protokolls.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass sich die Signale sowohl des Sauerstoffsensors als auch des Fluoreszenzsensors mindestens 1 Minute lang stabilisieren (gemessen an der stabilen berechneten Steigung der primären Sensorsignale), da der Gesamtatmungszustand durch die Titrationen verändert wird, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Dies gilt für alle Titrationsschritte. - Verwenden Sie einen Allzweck-SUIT, der die anfängliche Charakterisierung der mitochondrialen Funktion der Skelettmuskulatur des Pferdes ermöglicht. Beginnen Sie mit sequenziellen Titrationen von Pyruvat (5 μl von 2 M wässriger Lösung), Glutamat (10 μl von 2 M wässriger Lösung) und Malat (10 μl von 0,4 M wässriger Lösung) in jede Kammer, um Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) herzustellen und die nicht-phosphorylierende (Leck-) Atmung zu stimulieren, unterstützt durch NADH, das durch Komplex I (LN) oxidiert wird (Abbildung 1, Abbildung 3 und Abbildung 4).
- Fügen Sie ADP (20 μl 500 mM wässrige Lösung; siehe Materialtabelle) hinzu, um die phosphorylierende Atmung durch Komplex I (PN) zu stimulieren.
- Fügen Sie Succinat (20 μl 1 M wässrige Lösung; siehe Materialtabelle) hinzu, um durch die Kombination von Komplex I und Komplex II (PN+S) eine phosphorylierende Atmung zu erzeugen.
Anmerkungen: Bei der Kombination der Atmung durch Komplex I und Komplex II kann der Sauerstoffverbrauch hoch genug sein, um den größten Teil des im Inkubationsmedium gelösten Sauerstoffs zu verbrauchen. Wenn die O2-Konzentration unter 50 μM sinkt, reoxygenieren Sie das Inkubationsmedium, indem Sie die Inkubationskammer entsiegeln, bis die gemessene O2-Konzentration über 150 μM angestiegen ist. Wiederholen Sie diesen Schritt nach Bedarf, um genügend O 2 für die mitochondriale Atmung aufrechtzuerhalten. - Fügen Sie Rotenon (2 μl 0,1 mM Ethanollösung; siehe Materialtabelle) hinzu, um den Komplex I zu blockieren. Der resultierende Sauerstofffluss repräsentiert die Fähigkeit von Komplex II, den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch durch die Oxidation von Succinat allein (PS) zu unterstützen.
ACHTUNG: Rotenon ist eine giftige Substanz. Verwenden Sie die Standard-Laborsicherheit und vermeiden Sie das Verschlucken oder Einatmen. - Berechnen Sie den Mittelwert für eine gegebene Versuchsbedingung über einzelne Respirometriekammern, die Aliquots einer einzelnen Biopsie enthalten.
HINWEIS: Abgeleitete Berechnungen, wie z. B. Flusskontrollverhältnisse (FCRs), sind wertvoll bei der Identifizierung relativer Änderungen in verschiedenen Pfaden und umfassen FCR-Leck (L N/P N), FCR N (P N/P N+S) und FCR S (P S/PN+S). Die berechnete oxidative Phosphorylierungseffizienz (1-LN/PN+S) liefert eine Schätzung der Gesamtauswirkungen der Leckatmung, bereinigt um die Gesamtrespirationskapazität.
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Representative Results
Der vorgeschlagene Referenzzustand ist der eines gesunden, sesshaften Vollbluts (keine erhöhte Fitness durch Zwangsbewegung) und einer frischen Muskelprobe, die aus dem Zentrum eines Haltungsmuskels entnommen wurde, einen hohen Anteil an mitochondrienreichen Typ-I-Skelettmuskelfasern enthält und unter Bedingungen inkubiert wurde, die dem Ruhestoffwechsel nahe kommen (d. h. 38 °C und pH 7,0). Unter diesen Bedingungen kann der Untersucher mit L-N-Werten von 2,71 ± 0,90,P-N-Werten von 62,40 ± 26,22, P-N+S-Werten von 93,67 ± 34,76 und P-S-Werten von 46,93 ± 14,58 pmolO2 x s-1 x mL-1 rechnen (Abbildung 3 und Abbildung 4). Die Atmungswerte von Mitochondrien, die mit TMRM inkubiert wurden, sind aufgrund einer hemmenden Wirkung dieses Fluorophors niedriger (Abbildung 1). FCR-Leck, FCRN und FCRS betragen 0,05 ± 0,01, 0,66 ± 0,07 bzw. 0,51 ± 0,07. Die berechnete oxidative Phosphorylierungseffizienz beträgt 0,97 ± 0,01. Die absoluten Werte für diese Atemzustände variieren aufgrund der Oxidationskapazität des einzelnen Subjekts und des Gewebes, aber das relative Muster dieser Werte stimmt mit den veröffentlichten Ergebnissen von permeabilisierten Skelettmuskelfasern von Pferden überein (d. h. Zunahme der Atmung durch die Zugabe spezifischer Substrate, wobei die Kombination der Atmung durch Komplex I und Komplex II aufgrund der Sättigung des Elektronentransfersystems geringer ist als jede dieser Elektronenquellen einzeln [ETS] Downstream-Kapazität). Die berechnete Effizienz isolierter Mitochondrien der Skelettmuskulatur des Pferdes stimmt mit den entsprechenden Werten überein, die für permeabilisierte Skelettmuskelfasern des Pferdes berichtet wurden11.
Es wird erwartet, dass die ATP-Syntheserate 438,59 ± 397,10 pM x s-1 für die PN-Atmung, 383,18 ± 397,19 für die PN+S-Atmung und 172,07 ± 125,60 für die P S-Atmung beträgt, pro mg Quellgewebe, das zur Isolierung der Mitochondrien verwendet wird. Die Abnahme der ATP-Synthese durch die Zugabe von Succinat ist wahrscheinlich auf die Konkurrenz am Chinonübergang des ETS durch die beiden Elektronenzuführungen zurückzuführen, wobei die Zuführung von Komplex II (der nicht direkt zum mitochondrialen Membranpotential beiträgt) den Elektronenfluss durch Komplex I reduziert (der durch das Pumpen von Protonen durch die innere Mitochondrienmembran direkt zum mitochondrialen Membranpotential beiträgt).
Es wird erwartet, dass die Produktionsrate von H 2 O20,079 ± 0,095 nmol.s-1 für die L-N-Atmung, 0,021 ± 0,043 für die PN-Atmung, 0,026 ± 0,056 für die P N+S-Atmung und 0,237 ± 0,248 für dieP S-Atmung pro mg Quellgewebe beträgt, das zur Isolierung der Mitochondrien verwendet wird (Abbildung 4). Die relative Rate der ROS-Produktion stimmt mit der vorhergesagten Größe des mitochondrialen Membranpotentials und dem Zusammenhang zwischen hohem Membranpotential und ROS-Produktion überein. Die Ausnahme von dieser Beziehung ist die sehr hohe ROS-Produktion, wenn die Atmung allein durch Komplex II erfolgt, aufgrund des Rückflusses von Elektronen vom Chinonübergang zu Komplex I, wenn dieser durch Rotenon blockiert wird.
Abbildung 1: Repräsentative hochauflösende Respirometriespur der mitochondrialen Atmung und des relativen Membranpotentials der Skelettmuskulatur des Pferdes. Das obere Fenster zeigt die Sauerstoffkonzentration der Kammer (linke Y-Achse) und den Sauerstofffluss (rechte Y-Achse) über die Zeit (X-Achse); Das untere Fenster zeigt die TMRM-Fluoreszenz der Kammer (linke Y-Achse) und die Änderungsrate des Fluoreszenzsignals (rechte Y-Achse) über die Zeit (X-Achse). Vertikale Markierungen deuten auf die Zugabe spezifischer Substrate in die Kammer hin (mt: Mitochondriensuspension; P: Pyruvat; G: Glutamat; M: Malat; D: ADP; S: Succinat; R: Rotenon; CCCP: Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative hochauflösende Respirometriespur der Kalibrierung des Kammerfluoreszenzsignals für Magnesiumgrün und der Bestimmung von Kd für Magnesium und Adenylate. Kammer-MgG-Fluoreszenz (linke Y-Achse) und Änderungsrate des Fluoreszenzsignals (rechte Y-Achse) über die Zeit (X-Achse). Die anfänglichen vertikalen Markierungen deuten auf die Zugabe spezifischer Substrate in die Kammer hin (MgG: Magnesiumgrün; mt: Mitochondriensuspension; P: Pyruvat; G: Glutamat; M: Malat; S: Succinat; EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure). Es folgt die serielle Titration von MgCl2 mit einer automatisierten Titrationspumpe (TIP), die das Fluoreszenzsignal erhöht, und dann die serielle Titration eines Adenylats (in diesem Fall ATP), das das Fluoreszenzsignal verringert. Die Titration von MgCl2 wird auch zu Beginn jedes Assays zur Kalibrierung des MgG-Signals verwendet, wird jedoch vor der Zugabe von Mitochondrien und Respirometriesubstraten wie P, G, M und S durchgeführt . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative hochauflösende Respirometriespur der mitochondrialen Atmung und ATP-Synthese der Skelettmuskulatur des Pferdes. Das obere Fenster zeigt die Sauerstoffkonzentration der Kammer (linke Y-Achse) und den Sauerstofffluss (rechte Y-Achse) über die Zeit (X-Achse); Das untere Fenster zeigt die MgG-Fluoreszenz der Kammer (linke Y-Achse) und die Änderungsrate des Fluoreszenzsignals (rechte Y-Achse) über die Zeit (X-Achse). Vertikale Markierungen deuten auf die Zugabe spezifischer Substrate in die Kammer hin (mt: Mitochondriensuspension; P: Pyruvat; G: Glutamat; M: Malat; D: ADP; S: Succinat; R: Rotenon). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative hochauflösende Respirometriespur der mitochondrialen Atmung der Skelettmuskulatur des Pferdes und der Produktion vonH2O2. Das obere Fenster zeigt die Sauerstoffkonzentration der Kammer (linke Y-Achse) und den Sauerstofffluss (rechte Y-Achse) über die Zeit (X-Achse); Das untere Fenster zeigt die Fluoreszenz des Kammerresorufins (linke Y-Achse) und die Änderungsrate des Fluoreszenzsignals (rechte Y-Achse) über die Zeit (X-Achse). Vertikale Markierungen deuten auf die Zugabe spezifischer Substrate in die Kammer hin (mt: Mitochondriensuspension; P: Pyruvat; G: Glutamat; M: Malat; D: ADP; S: Succinat; R: Rotenon). Ebenfalls enthalten sind drei Intra-Assay-Zweipunktkalibrierungen des Fluoreszenzsignals mitH2O2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Hinzufügung von Fluoreszenzsignalen zum Standardausgang des hochauflösenden Respirometers liefert wertvolle Informationen über die mitochondriale Physiologie, aber eine sorgfältige Kalibrierung des Fluoreszenzsignals ist entscheidend für die Qualität der Daten. Die ursprünglichen Protokolle für die Verwendung von MgG deuten darauf hin, dass die Kalibrierkurven, die bei der Berechnung der Magnesium-Adenylat-Dissoziationskonstanten erzeugt wurden, auf nachfolgende Assays angewendet werden könnten4; Das Fluoreszenzsignal des MgG ist jedoch für diesen Ansatz möglicherweise nicht ausreichend von Assay zu Assay reproduzierbar. Daher wird jeder Assay mit einer automatisierten MgCl 2-Titration und der daraus resultierenden Kalibrierkurve zur Berechnung der ATP-Synthese für diesen einzelnen Assay kalibriert. Darüber hinaus müssen die Kd (Dissoziationskonstanten) für Magnesium und sowohl ADP als auch ATP für die spezifischen Bedingungen des Assays berechnet werden, einschließlich des spezifischen Gewebes, der Inkubationsbedingungen und der Substrate, die eine phosphorylierende Atmung erzeugen, um sicherzustellen, dass die Ableitung der ATP-Syntheserate genau ist. Die Variabilität des AmR-Assays ist allgemein anerkannt15,17, und es ist üblich, während des Protokolls nach Ermessen des Prüfers mehrere diskrete Rekalibrierungspunkte in das Protokoll einzufügen. Historische Daten unter Verwendung der Skelettmuskulatur von Pferden deuten darauf hin, dass die typische Reaktionsfähigkeit des Assays am ersten Kalibrierungspunkt (vor der Zugabe der Probe) etwa 0,646 V/mM H2O2 beträgt und über die Spanne des Assays um 8 % bis 15 % abnehmen kann. Daher ist eine häufige Rekalibrierung des AmR-Assays erforderlich, um relativ kleine Änderungen in der ROS-Produktion zu detektieren, und der Zeitpunkt der Punktkalibrierungen innerhalb des Protokolls sollte für jedes Titrationsprotokoll festgelegt werden.
Die Prüfärzte müssen während der gesamten Assay-Durchführung ein sorgfältiges Urteilsvermögen anwenden, um zu entscheiden, wann sie zum nächsten Titrationsschritt übergehen sollen. Im Idealfall sollten die relevanten Signale, die in Echtzeit erzeugt werden (O2-Fluss , Fluoreszenz der TMRM und die Änderungsrate des MgG- und Resorufin-Fluoreszenzsignals), stabil sein, was auf einen stationären Zustand innerhalb der Kammer hinweist, aber es ist eine Entscheidung des Prüfers, was eine akzeptable Stabilität ausmacht. Zum jetzigen Zeitpunkt gibt es keinen allgemein anerkannten Standard für diese Entscheidung. Die Forscher müssen sich jedoch der Risiken bewusst sein, die sich daraus ergeben, dass sie nicht lange genug auf die Etablierung eines stabilen Zustands warten (was zu Daten führt, die den beabsichtigten Atemzustand nicht perfekt charakterisieren) und so lange warten, dass die Substrate erschöpft sind und der Assay nicht mehr zuverlässig ist. Nach der Erfahrung des Autors ist das Versäumnis, innerhalb von 30 Minuten nach einer Substrattitration ein stabiles Signal zu erhalten, ein Beweis für eine Probe (oder Maschine), die sich nicht biologisch verhält, und der Assay muss verworfen werden.
Die Ergebnisse, die diesen Ansatz zur Quantifizierung der mitochondrialen Physiologie verwenden, zeigen eine beträchtliche Variabilität zwischen den Probanden, mit einem typischen Variationskoeffizienten (CV) von 30%-40%. Im Gegensatz dazu führt die Analyse permeabilisierter Skelettmuskelfasern von Pferden zu einem CV von 19%-20%11, was darauf hindeutet, dass der Prozess der Isolierung von Mitochondrien zusätzlich zu der ausgeprägten Variabilität zwischen den Subjekten eine erhebliche Variabilität für die nachfolgende Analyse mit sich bringt. Obwohl der Effekt des letzteren gemildert werden kann, indem Probanden nach Möglichkeit als ihre eigenen Kontrollen verwendet werden, kann ersteres nur durch sorgfältige Beachtung der Isolationstechnik minimiert werden. Wenn das Versuchsdesign keine experimentellen Replikate aus einer einzelnen Biopsie zulässt, kann der Prüfer die Respirometriedaten relativ zu einem Korrekturfaktor ausdrücken, der Unterschiede im mitochondrialen Gehalt in verschiedenen Proben widerspiegelt. Die häufigsten Korrekturfaktoren sind der Proteingehalt der Probe und die Citratsynthaseaktivität der Probe. Wie jedoch in einer kürzlich veröffentlichten Konsenserklärung von Wissenschaftlern, die auf diesem Gebiet tätig sind, dargelegt wird, gibt es keine einheitliche Methode zur Durchführung dieser Anpassung, auf die sich alle einig sind18. Die Korrektur des Proteingehalts und/oder der Citratsynthaseaktivität sind die beiden gebräuchlichsten Ansätze, die für das Skelettmuskelgewebe von Pferden verwendet werden12,13, aber beide haben ihre Mängel. Es kann für verschiedene Versuchspläne notwendig sein, Daten sowohl durch interne (d.h. Flusskontrollverhältnisse) als auch durch externe (Protein, Enzymaktivität, andere mitochondriale Marker) auszudrücken, um die mitochondriale Funktion zu interpretieren.
Das beschriebene Protokoll baut auf der Verwendung von permeabilisierten Muskelfasern auf, mit einigen wichtigen Unterschieden. Permeabilisierte Faserassays erfordern kleinere Biopsien, da die hochauflösende Respirometrie von permeabilisierten Fasern der Skelettmuskulatur von Pferden in der Regel mit nur ~2 mg Probenmasse in jeder Kammer durchgeführt wird 6,7,8,9,10,11. Im Gegensatz dazu hat das hier beschriebene Protokoll das Äquivalent von fast 10x so viel Fasermasse in jeder Kammer. Dieser Unterschied verdeutlicht die Ineffizienz der mitochondrialen Isolierung aus frischem Gewebe. Ein möglicher Grund für diese Ineffizienz ist die Schwierigkeit, die Mitochondrien der Skelettmuskulatur wiederherzustellen, die sich innerhalb des kontraktilen Proteinnetzwerks befinden. Das kommerzielle Kit für die mitochondriale Isolierung, das in diesem Protokoll verwendet wird, umfasst die Behandlung mit einer Protease und die Verwendung ionischer Medien, um den Abbau der kontraktilen Fasern zu unterstützen, aber es ist wahrscheinlich, dass ein erheblicher Teil der intermyofibrillären Mitochondrien nicht wiederhergestellt wird. Diese Funktion des Protokolls ist nicht nur für die Bestimmung der benötigten Menge an Biopsiematerial relevant, sondern auch im Hinblick auf die Interpretation der Ergebnisse. Isolierte Mitochondrien sind aufgrund der Diffusionsbegrenzung im Vergleich zu permeabilisierten Fasern weniger anfällig für Sauerstoffabhängigkeit15; Daher ist bei isolierten Mitochondrien keine Hyperoxie erforderlich, und das Beatmungsmedium kann durch einfaches Öffnen der Kammer zur Raumluft ausreichend mit Sauerstoff angereichert (und während des Assays wieder mit Sauerstoff angereichert) werden. Dieser Aspekt der Sauerstoffzufuhr ist besonders nützlich bei der Messung der Produktion vonH2O2und anderen ROS, da die ROS-Produktion während der hyperoxischen Inkubation auf unphysiologische Weise erhöht wird19. Schließlich liefert die Verwendung isolierter Mitochondrien ein stabileres und reproduzierbareres Fluoreszenzsignal, da die unspezifische Proteinbindung von Fluorophoren im Vergleich zur Verwendung von Fluorophoren mit permeabilisierten Muskelfasern verringert ist. Jede Probenvorbereitung hat Vor- und Nachteile, und die Beherrschung sowohl mit permeabilisierten Fasern als auch mit isolierten Mitochondrien bietet dem Prüfarzt einen robusten Satz von Assays zur Beantwortung einer Vielzahl von Fragen im Zusammenhang mit der mitochondrialen Physiologie.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Manuskript.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich für die großzügige Unterstützung des John and Debbie Oxley Stiftungslehrstuhls für Pferdesportmedizin und der Grayson Jockey Club Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | Software to operate O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Imidazole | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnesium Green | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9647 | |
| Mitochondrial isolation kit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently. | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| Potassium lactobionate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Rotenone | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| Titration pump | Oroboros Inc | ||
| Titration syringes | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH biopsy needle | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | Available in a range of sizes |
References
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