Summary
يقدم هذا البروتوكول خرائط بصرية مزدوجة الصبغة لقلوب الفئران التي تم الحصول عليها من البرية المتأثرة بعدم انتظام دقات القلب البطيني متعدد الأشكال الكاتيكولاميني ، بما في ذلك القياسات الفيزيولوجية الكهربية للجهد عبر الغشاء والعابرين داخل الخلايا Ca2+ بدقة زمنية ومكانية عالية.
Abstract
يظهر اضطراب القلب المؤيد لعدم انتظام ضربات القلب الكاتيكولامينية متعدد الأشكال (CPVT) على شكل نوبات تسرع القلب البطيني متعدد الأشكال بعد النشاط البدني أو الإجهاد أو تحدي الكاتيكولامين ، والتي يمكن أن تتدهور إلى رجفان بطيني قاتل. قلب الفأر هو نوع واسع الانتشار لنمذجة أمراض عدم انتظام ضربات القلب الموروثة ، بما في ذلك CPVT. إن رسم الخرائط البصرية المتزامنة لإمكانات الغشاء (Vm) وعابرات الكالسيوم (CaT) من قلوب الفئران ذات الأداء Langendorff لديه القدرة على توضيح الآليات الكامنة وراء عدم انتظام ضربات القلب. بالمقارنة مع التحقيق على المستوى الخلوي ، يمكن لتقنية رسم الخرائط الضوئية اختبار بعض المعلمات الكهربية ، مثل تحديد التنشيط وسرعة التوصيل ومدة جهد الفعل ومدة CaT. يقدم هذا البحث إعداد الأجهزة والإجراء التجريبي لرسم الخرائط البصرية عالية الإنتاجية ل CaT و Vm في قلوب RyR2-R2474S / + من النوع البري وغير المتجانس ، جنبا إلى جنب مع السرعة الكهربائية المبرمجة قبل وأثناء تحدي الأيزوبروتيرينول. وقد أظهر هذا النهج طريقة مجدية وموثوقة لدراسة مرض CPVT ميكانيكيا في إعداد قلب الفأر خارج الجسم الحي.
Introduction
اضطراب القلب الوراثي الكاتيكولامينية يظهر تسرع القلب البطيني متعدد الأشكال (CPVT) على شكل نوبات تسرع القلب البطيني متعدد الأشكال (PVT) بعد النشاط البدني أو الإجهاد أو تحدي الكاتيكولامين ، والتي يمكن أن تتدهور إلى رجفان بطيني قاتل1،2،3،4. الأدلة الحديثة بعد تقريرها الأول كمتلازمة سريرية في عام 1995 تورطت طفرات في سبعة جينات ، وكلها متورطة في الساركوبلازم الشبكي (SR) تخزين Ca 2+ الإطلاق في هذه الحالة: مستقبلات RYR2 الأكثر شيوعا التي يتم الإبلاغ عنها لترميز RYR2 2 (RyR2) من قنوات إطلاق Ca2+ 5,6 ، FKBP12.67 ، CASQ2 ترميز كالسيكوسترين القلب8 ، TRDN ترميز بروتين SR التقاطعtriadin 9 و CALM1 9 و CALM2 10 و CALM3 بترميز الكالمودولين11,12 بشكل متطابق. تعزو هذه الأنماط الجينية أحداث عدم انتظام ضربات القلب إلى الإطلاق المرضي غير المنظم لمخزن SR Ca2 + 12.
يمكن اكتشاف إطلاق Ca 2+ التلقائي من SR على شكل شرارات Ca 2+ أو موجات Ca 2+ ، والتي تنشط مبادل Na + / Ca 2+ (NCX). يولد مبادل واحد Ca2+ لثلاثة Na + تيارا داخليا ، مما يسرع من إزالة الاستقطاب الانبساطي ويدفع جهد الغشاء إلى عتبة جهد الفعل (AP). في الفئران RyR2 ، يؤدي النشاط المتزايد ل RyR2R4496C في العقدة الجيبية الأذينية (SAN) إلى انخفاض غير متوقع في تلقائية SAN بواسطة انخفاض يعتمد على الكالسيوم2 + لاستنفاد ICa و L و SR Ca 2+ أثناء الانبساط ، وتحديد التغيرات الفيزيولوجية المرضية تحت الخلوية التي تساهم في خلل SAN في مرضى CPVT13,14. من المرجح حدوث موجات Ca 2+ الخلوية ذات الصلة بالخلايا العضلية القلبية بعد الزيادات في الخلوي الخلوي في الخلفية [Ca2+] بعد تحسس RyR بواسطة الكاتيكولامين ، بما في ذلك الأيزوبروتيرينول (ISO) ، التحدي.
لا يزال يتعين تحديد التغييرات الحركية التفصيلية في إشارات Ca 2+ بوساطة RyR2 بعد إطلاق Ca2+ بوساطة RyR2 استجابة لتنشيط جهد الفعل (AP) الذي قد يكون سبب عدم انتظام ضربات القلب البطيني المرصود في نماذج CPVT القلبية السليمة لمجموعة كاملة من الأنماط الجينية RyR2 المبلغ عنها12. تقدم هذه الورقة إعداد الأجهزة والإجراءات التجريبية لرسم خرائط عالية الإنتاجية لإشارات Ca2+ وإمكانات الغشاء (Vm) في قلوب الفئران البرية (WT) وقلوب RyR2-R2474S / + غير المتجانسة ، جنبا إلى جنب مع السرعة الكهربائية المبرمجة قبل وبعد تحدي الأيزوبروتيرينول. يوفر هذا البروتوكول طريقة للدراسة الآلية لمرض CPVT في قلوب الفئران المعزولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم استخدام ذكور الفئران البرية من العمر 10 إلى 14 أسبوعا أو الفئران RyR2-R2474S / + (خلفية C57BL / 6) التي تزن 20-25 جم في التجارب. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام في جامعة ساوث ويست الطبية ، سيتشوان ، الصين (الموافقة رقم: 20160930) وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية التي تعمل بموجبها المؤسسة.
1. التحضير
- حلول الأسهم
- محلول مخزون بليبيستاتين: أضف 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد 100٪ (DMSO) في الدورق الأصلي الذي يحتوي على 2.924 مجم من مسحوق بليبستاتين (-) للوصول إلى تركيز 10 مللي مول.
- محلول مخزون مؤشر الجهد RH237: أضف 1 مل من 100٪ DMSO في القارورة الأصلية مع 1 مجم من مسحوق RH237 لتحقيق تركيز 2.01 مللي مول.
- محلول مخزون مؤشر الكالسيوم Rhod-2 AM: أضف 1 مل من DMSO 100٪ إلى 1 مجم من مسحوق Rhod-2 AM للوصول إلى تركيز 0.89 مللي مول.
- محلول مخزون Pluronic F127: أضف 1 مل من DMSO بنسبة 100٪ إلى 200 مجم من Pluronic F127 للوصول إلى تركيز 20٪ وزن / فولت (0.66 مللي مول).
- قم بتقسيم محاليل المخزون إلى أنابيب PCR سعة 200 ميكرولتر في 21-51 ميكرولتر (21 ميكرولتر من RH237 ، و 31 ميكرولتر من Rhod-2 AM ، و 51 ميكرولتر من بليبيستاتين) للاستخدام الفردي أو المزدوج لتجنب التجميد والذوبان المتكرر. بعد ذلك ، لف المحاليل بورق الألمنيوم واحفظها في درجة حرارة -20 درجة مئوية ، باستثناء محلول مخزون Pluronic F127 الموجود في غرفة مظلمة في درجة حرارة الغرفة.
- حل التروية
- محلول كريبس (بالمللي مول): تحضير 1 لتر من محلول كريبس (كلوريد الصوديوم 119 ، NaHCO3 25 ، NaH 2 PO 4 1.0 ، KCl4.7 ، MgCl 2 1.05 ، CaCl2 1.35 ، والجلوكوز 10).
- قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح إبرة معقم 0.22 ميكرومتر وأكسجين بنسبة 95٪ O 2/5٪ CO2.
- خذ 40 مل من محلول كريبس في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل واحفظه في 4 درجات مئوية لمتابعة عزل القلب.
- نظام التروية Langendorff وجهاز رسم الخرائط البصرية
- قم بإعداد نظام نضح لانجيندورف.
- قم بتشغيل الحمام المائي واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.
- اغسل نظام التروية Langendorff ب 1 لتر من الماء منزوع الأيونات.
- قم بإخراج المحلول من قناة السحب واضبط معدل التدفق الخارجي إلى 3.5-4 مل / دقيقة. ثم ، قم بأكسجة البيرفوسات بغاز O 2 / CO2 (95٪ / 5٪) عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: لا يسمح أبدا بوجود فقاعة في نظام التروية.
- إعداد نظام الخرائط البصرية.
- قم بتركيب كاميرا جهاز مضاعفة الشحنة المضاعفة للإلكترون (EMCCD) (512 × 512 بكسل) ، والعدسة (تكبير 40x) ، والثنائيات الباعثة للضوء بفاصل الطول الموجي (LEDs) ، وشاشة تخطيط القلب الكهربائي (ECG) ، وقطب التحفيز (الشكل 1).
- اضبط مسافة العمل المناسبة من العدسة إلى موضع القلب.
- اضبط اثنين من مصابيح LED في الوضع القطري للحمام الثرموستاتي للإضاءة المتساوية ، مما يوفر طولا موجيا يبلغ 530 نانومتر لتوليد ضوء الإثارة. استخدم مرشحا مطليا بالرش ET525 / 50 لإزالة أي ضوء خارج النطاق لمصابيح LED.
- اضبط مفتاح المقبض لتحقيق مربع متساو للسطح المستهدف ، مما يجعل صور الجهد والكالسيوم تظهر بشكل مناسب على واجهة الاستحواذ.
- أدر فتحة العدسة إلى أقصى قطر لتجنب أي تسرب للجهد أو إشارات الكالسيوم.
- اضبط عدسة الكاميرا على ارتفاع مناسب ، حيث إنها تخدم مسافة عمل دقيقة إلى الحمام الثرموستاتي ، ويستخدم 10 سم في الغالب.
- قم بتشغيل الكاميرا للحصول على درجة حرارة ثابتة لأخذ العينات عند -50 درجة مئوية.
- قم بإعداد نظام نضح لانجيندورف.
2. الإجراءات
- حصاد قلب الفأر والقنية والتروية
- حقن داخل الصفاق بمحلول أفيرتين (1.2٪ ، 0.5-0.8 مل) والهيبارين (200 وحدة) لتقليل المعاناة والألم المنعكس ومنع تكوين جلطة دموية. بعد 15 دقيقة ، التضحية بالحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم.
- افتح الصدر بالمقص ، واحصد القلب بعناية ، وضعه في محلول كريبس البارد (4 درجات مئوية ، 95٪ O 2 ، 5٪ CO2) لإبطاء عملية التمثيل الغذائي وحماية القلب.
- قم بإزالة الأنسجة المحيطة بالشريان الأورطي ، وقم بقنية الشريان الأورطي باستخدام إبرة قنية مصنوعة خصيصا (القطر الخارجي: 0.8 مم ، القطر الداخلي: 0.6 مم ، الطول: 27 مم) وقم بإصلاحه بخياطة حرير 4-0.
- قم بتهوية القلب بنظام Langendorff بسرعة ثابتة تبلغ 3.5-4.0 مل / دقيقة وحافظ على درجة الحرارة عند 37 ± 1 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الإجراءات اللاحقة في هذه الحالة. - أدخل أنبوبا بلاستيكيا صغيرا (قطره 0.7 مم وطوله 20 مم) في البطين الأيسر لتحرير احتقان المحلول في الحجرة لتجنب التحميل الزائد.
- فك قارنة الإثارة والانكماش وتحميل الصبغة المزدوجة
- ضع سلكين في perfusate في الحمام ، وقم بتشغيل قوى صندوق مكبر الصوت ECG ووحدة التحكم في التحفيز الكهربائي ، ثم ابدأ تشغيل برنامج ECG المشار إليه ومراقبة ECG باستمرار.
- قم بتنفيذ الخطوات اللاحقة في الظلام عندما يصل القلب إلى حالة مستقرة (ينبض القلب بشكل إيقاعي عند ~ 400 نبضة في الدقيقة).
- امزج 50 ميكرولتر من محلول مخزون بليبيستاتين 10 مللي متر مع 50 مل من محلول كريبس للوصول إلى تركيز 10 ميكرومتر. قم باستمرار برش خليط محلول بليبستاتين-كريبس في القلب لمدة 10 دقائق لفصل الانقباض عن الإثارة وتجنب القطع الأثرية للانكماش أثناء التصوير.
- استخدم مصباحا يدويا أحمر للتحقق مما إذا كان انقباض القلب يتوقف تماما لأن الانكماش سيؤثر على جودة تحميل الصبغة.
- بعد فصل الإثارة والانكماش ، امزج 15 ميكرولتر من محلول مخزون Rhod-2 AM مع 15 ميكرولتر من محلول مخزون Pluronic F127 في 50 مل من محلول كريبس لتحقيق التركيزات النهائية 0.267 ميكرومتر Rhod-2 AM و 0.198 ميكرومتر Pluronic F127. بعد ذلك ، قم بتهوية القلب باستمرار باستخدام محلول العمل Rhod-2 AM لمدة 15 دقيقة في نظام التروية Langendorff.
- حافظ على إمداد الأكسجين أثناء تحميل صبغة الكالسيوم داخل الخلايا. نظرا لأن الفقاعات تتشكل بسهولة في Pluronic F127 ، أدخل مصيدة فقاعات في نظام التروية لتجنب انصمام الغاز في الشريان التاجي.
- قم بتخفيف 10 ميكرولتر من محلول مخزون RH237 إلى 50 مل من البيروسات للوصول إلى التركيز النهائي عند 0.402 ميكرومتر وإجراء التحميل لمدة 10 دقائق.
- في نهاية تحميل الصبغة المزدوجة ، التقط سلسلة من الصور للتأكد من أن إشارات الجهد والكالسيوم كافية للتحليل (لا يوجد تفاعل بين إشارتين).
- رسم الخرائط البصرية وتحريض عدم انتظام ضربات القلب
ملاحظة: يبدأ رسم الخرائط البصرية بعد توقف الانقباض وتحميل الصبغة المناسب ، ويتم تثقيب القلب على التوالي كما في الخطوات الموضحة أعلاه في 2.1 (4).- قم بتشغيل اثنين من مصابيح LED لأضواء الإثارة واضبط شدتها في نطاق مناسب (قوي بما يكفي للإضاءة وتصوير مباشر نسبيا ولكن ليس قويا جدا للتعرض المفرط).
- ضع القلب أسفل جهاز الكشف ، وتأكد من أنه تحت إضاءة كافية لاثنين من مصابيح LED ، واضبط قطر بقعة الضوء على 2 سم.
- اضبط مسافة العمل من العدسة إلى القلب على 10 سم ، مما يعطي معدل أخذ عينات يبلغ حوالي 500 هرتز ودقة مكانية تبلغ 120 × 120 ميكرومتر لكل بكسل.
- افتح برنامج أخذ عينات الإشارة للتحكم في الكاميرا رقميا لالتقاط إشارات الجهد والكالسيوم في وقت واحد.
- ابدأ تشغيل محفز مجال myopacer ، واضبط نمط السرعة في Transistor Transistor Logic (TTL) ، ومدة سرعة 2 مللي ثانية لكل نبضة ، و 0.3 فولت كشدة أولية.
- استخدم 30 محفزا متتاليا 10 هرتز S1 لاختبار عتبة الجهد الانبساطي للقلب مدفوعة ببرنامج تسجيل ECG. قم بزيادة سعة الجهد تدريجيا حتى يتم تحقيق التقاط 1: 1 (تحقق من موجة QRS من شاشة ECG ، وإمكانات العمل (AP) ، وإشارات الكالسيوم العابرة (CaT)).
- بعد تحديد عتبة الجهد ، قم بوتيرة القلب بكثافة 2x عتبة الجهد الانبساطي مع زوج من الأقطاب البلاتينية المتصلة بقمة البطين الأيسر (LV) (ELVA).
- تنفيذ بروتوكول S1S1 لقياس الكالسيوم أو مولدات جهد العمل وخصائص الاسترداد. قم بإيقاع القلب على التوالي بطول دورة أساسي يبلغ 100 مللي ثانية ، مع تقليل 10 مللي ثانية من طول الدورة كل تسلسل تال حتى يتم الوصول إلى 50 مللي ثانية. تتضمن كل حلقة 30 محفزا متتاليا بعرض نبضة 2 مللي ثانية. في الوقت نفسه ، ابدأ رسم الخرائط الضوئية قبل التحفيز (يشمل وقت أخذ العينات ~ 10 إيقاعات الجيوب الأنفية ومدة السرعة).
- لقياس فترة الانكسار الفعال البطيني (ERP) باستخدام بروتوكول التحفيز S1S2 ، ابدأ بطول دورة سرعة S1S1 يبلغ 100 مللي ثانية مع S2 مقترنا ب 60 مللي ثانية مع انخفاض خطوة 2 مللي ثانية حتى يفشل S2 في التقاط مجمع QRS خارج الرحم.
- لتحريض عدم انتظام ضربات القلب ، قم بإجراء سرعة اندفاع دائمة تبلغ 50 هرتز (50 تحفيزا كهربائيا مستمرا بعرض نبضة 2 مللي ثانية) ، وقم بإجراء نفس حلقة السرعة بعد فترة راحة مدتها 2 ثانية.
- راقب تسجيلات تخطيط القلب بعناية خلال فترة السرعة المستمرة عالية التردد بحيث يمكن أن تبدأ تسجيلات الخرائط الضوئية المتزامنة على الفور عندما تتولد موجة تخطيط كهربية القلب المثيرة للاهتمام (نظرا لأن معظم حالات عدم انتظام ضربات القلب ناتجة عن السرعة الكهربائية ، يتم أخذ عينات من الإشارات الضوئية قبل 2-3 ثوان من سرعة الانفجار في حالة فقدان الأحداث القلبية الهامة).
- الصورة باستخدام كاميرا EMCCD (معدل أخذ العينات: 500 هرتز، حجم البكسل: 64 × 64).
- تحليل البيانات
- تحميل الصور ومعالجة الإشارات
- اضغط على تحديد مجلد وتحميل الصور لتحميل الصور في برنامج الحصول على الصور لتحليل بيانات الفيديو الضخمة شبه التلقائية وفقا للإعداد والبروتوكول الموضح سابقا15,16.
- أدخل معلمات أخذ العينات الصحيحة (مثل حجم البكسل ومعدل الإطارات).
- اضبط حد الصورة عن طريق الإدخال اليدوي وحدد منطقة الاهتمام (ROI).
- قم بتنفيذ مرشح مكاني غاوسي 3 × 3 بكسل ، ومرشح Savitzky-Goaly ، وتصحيح خط الأساس للقبعة العلوية.
- اضغط على صور العملية لإزالة خط الأساس وحساب المعلمات الكهربية، مثل APD80 وCaTD50.
- تحليل المعلمات الكهربية
- اضبط وقت بدء APD عند الذروة والنقطة النهائية عند إعادة استقطاب 80٪ (APD80) لحساب APD80. وبالمثل ، يتم تعريف وقت بدء CaTD على أنه الذروة ، ويتم تعريف النقطة الطرفية على أنها استرخاء بنسبة 80٪.
- يعتمد قياس سرعة التوصيل (CV) على حجم البكسل ووقت توصيل جهد الفعل بين بكسلين أو أكثر. احسب متوسط السرعة من جميع وحدات البكسل المختارة - وهذا هو متوسط سرعة التوصيل للمنطقة المحددة. قم بإنشاء خرائط متزامنة مقابلة في وقت واحد للحصول على رؤية واضحة لاتجاه التوصيل.
ملاحظة: أبلغ O'Shea et al.15 عن قياس السيرة الذاتية بالتفصيل. - بالنسبة للمولدات وتحليل عدم انتظام ضربات القلب ، يتم تعريف بدائل الكالسيوم على أنها سعة ذروة كبيرة وصغيرة مستمرة تظهر بدلا من ذلك. استخدم نسبة سعة الذروة لتقييم شدة المولدات المعتمدة على التردد (1-A2 / A1). تطبيق خرائط المرحلة لتحليل عدم انتظام ضربات القلب المعقدة مثل عدم انتظام دقات القلب البطيني (VT). ابحث عن الدوارات التي تظهر بوضوح في منطقة معينة مع تحول الدوارات.
- تحميل الصور ومعالجة الإشارات
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كان رسم الخرائط البصرية نهجا شائعا في دراسة عدم انتظام ضربات القلب المعقدة في العقد الماضي. يتكون إعداد الخرائط الضوئية من كاميرا EMCCD ، مما يوفر معدل أخذ عينات يصل إلى 1000 هرتز ودقة مكانية تبلغ 74 × 74 ميكرومتر لكل بكسل. إنه يتيح نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية إلى حد ما أثناء أخذ عينات الإشارة (الشكل 1). بمجرد أن يصل القلب الذي يعمل بطبقة Langendorff إلى حالة مستقرة وينتهي تحميل الصبغة ، يتم وضع القلب في غرفة الحرارة المتجانسة تحت إضاءة اثنين من مصابيح LED 530 نانومتر ، والتي تستخدم لإثارة مؤشر الجهد RH237 ومؤشر Ca2+ Rhod-2 AM. ينقسم ضوء الانبعاث إلى طولين موجيين 600 نانومتر (ل Ca2+) و 670 نانومتر (ل Vm) ، والتي يتم اكتشافها في وقت واحد باستخدام كاميرا EMCCD. بعد تروية الأفيرتين والهيبارين لمدة 15 دقيقة ، استخدم الأدوات الجراحية (الشكل 2 أ) لفتح الصدر واستخراج القلب بسرعة ، ثم نقله إلى محلول كريبس البارد (4 درجات مئوية ، 95٪ O 2 ، 5٪ CO2) (الشكل 2B). نظف الأنسجة المحيطة بعناية ، وأصلح الشريان الأورطي بخياطة 4-0 ، ويتم إدخال أنبوب بلاستيكي 0.7 مم في البطين الأيسر (الشكل 2C) لتحرير احتقان البيرفوسات في غرفة البطين الأيسر. ضع أسلاك تخطيط القلب في البيروزيت (الشكل 2 د) وتأكد من أن القلب ينبض بشكل إيقاعي وفقا لمراقبة تخطيط القلب التي يقودها برنامج تسجيل تخطيط القلب. بعد ذلك ، قم بإجراء تحميل الصبغة المزدوجة في الظلام (الشكل 2E).
بعد تقليل القطع الأثرية للانكماش بواسطة بليبستاتين (10 ميكرومتر) والانتهاء من تحميل الصبغة المناسب ، بدأ التصوير لحوالي 10 نبضات جيبية قبل بروتوكول سرعة S1S1 لتقييم خصائص استعادة المعلمات الكهربية المعتمدة على التردد وبدائل الكالسيوم بعد تحدي الأيزوبروتيرينول (1 ميكرومتر ISO) (الشكل 3 أ). يعرض الشكل 3B واجهة موجة ECG تمثيلية ل VT وإمكانات الفعل المقابلة (AP) وآثار CaT الناتجة عن تسلسل سرعة الاندفاع 50 هرتز في ماوس CPVT. يستخدم برنامج تصوير الإشارات الضوئية لإكمال تحليل شبه تلقائي لبيانات الفيديو الضخمة.
يوضح الشكل 4A و B آثارا نموذجية وخرائط حرارية ل APD80 و CaTD80 ، على التوالي. تقصر ISO APD80 في الفئران WT و CPVT ، ولكن لم يتم العثور على فرق بين الفئران WT و CPVT قبل وبعد تحدي ISO (الشكل 4C ، ** P < 0.01. n = 5/6). يشير الشكل 4D إلى أن CaTD80 في فئران CPVT أطول من WT بعد تحدي ISO ، بينما لم تكن هناك أهمية قبل معالجة ISO (** P < 0.01. n = 6.).
لقياس التوصيل ، يقدم الشكل 5 أ خوارزمية متجه واحد لقياس السيرة الذاتية. وفقا لإشارات الجهد ، تمتلك قلوب WT و CPVT نفس قدرة التوصيل عبر النخاب عند خط الأساس وبعد تدخل ISO (الشكل 5B). يوضح الشكل 5C ، D خرائط التنشيط التمثيلية للجهد والكالسيوم في قلوب WT و CPVT قبل وبعد تحدي ISO.
بدائل الكالسيوم هي معلمة حاسمة لعدم انتظام ضربات القلب. يتم حساب مولدات سعة الكالسيوم وفقا للصيغة كما هو موضح في الشكل 6A. تظل إشارات الكالسيوم في قلوب WT مستقرة عند خط الأساس خلال سرعة S1S1 المتتالية عند 14.29 و 16.67 هرتز (الشكل 6B) ، بينما تظهر قلوب CPVT بدائل تعتمد على التردد (الشكل 6C). بعد تحدي ISO ، تظهر قلوب CPVT مولدات تعتمد على التردد في إشارة الكالسيوم أثناء سرعة S1S1 ، بينما لا تتأثر قلوب WT (الشكل 6D ، E). بعد سرعة S1S1 المستمرة ، يتم تنفيذ بروتوكول سرعة الاندفاع للحث على عدم انتظام ضربات القلب المميت. تظهر قلوب WT و CPVT توصيلا طبيعيا أثناء سرعة انفجار 50 هرتز عند خط الأساس (الشكل 7 أ). بعد التروية باستخدام ISO ، تظهر قلوب CPVT دوارات عالية التردد بعد سرعة انفجار 50 هرتز ، بينما تحافظ قلوب WT على التوصيل الطبيعي (الشكل 7B).
الشكل 1: جهاز رسم الخرائط البصرية. يشتمل النظام على كاميرا EMCCD مصممة خصيصا بدقة مكانية وزمانية عالية (معدل أخذ العينات يصل إلى 1000 هرتز ، والحد الأدنى لبكسل أخذ العينات 74 × 74 ميكرومتر). يتم استخدام وحدة تحكم التحفيز الكهربائي لأخذ العينات وإخراج بروتوكول التحفيز الكهربائي. يتم استخدام اثنين من مصابيح LED الخضراء لضوء الإثارة لتحقيقات التألق. تقوم مرآة ثنائية اللون طويلة التمرير (610 نانومتر) وبواعث مقابلة بتقسيم مصابيح انبعاث الجهد ومضان الكالسيوم. RH237 ، الصبغة الحساسة للجهد ، لها ضوء انبعاث عند ذروة الطول الموجي 670 نانومتر ، في حين أن Rhod-2 AM ، الصبغة الحساسة للكالسيوم ، تمتلك ضوء انبعاث عند ذروة الطول الموجي 600 نانومتر. يمكن التقاط تغييرات طفيفة في كل من إشارات التألق بواسطة الكاميرا في وقت واحد بسبب ارتفاع معدل أخذ العينات وحساسية مستشعر الكاميرا. الاختصارات: EMCCD = جهاز اقتران شحنة مضاعفة الإلكترون ؛ LED = الصمام الثنائي الباعث للضوء ؛ ECG = مخطط كهربية القلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التحضير وتحميل الصبغة المزدوجة. أ: الأدوات الجراحية. ب: حصاد قلب الفأر. ج: قطع الأنسجة غير الضرورية بعناية للحصول على رؤية واضحة للشريان الأورطي وإدخال أنبوب بلاستيكي 0.7 مم من الشريان الأورطي إلى البطين الأيسر. د: يرفع القلب بسرعة إلى نظام التروية لانغندورف. (ه) تحميل الصبغة المزدوجة ووقف الإثارة والانكماش في الظلام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: بروتوكول S1S1 وبروتوكول تحريض عدم انتظام ضربات القلب. (أ) واجهة موجة ECG التمثيلية وآثار إشارة AP والكالسيوم المقابلة باستخدام بروتوكول سرعة S1S1 بعد تحدي ISO. (B) تحريض VT بواسطة تسلسل سرعة الاندفاع 50 هرتز بعد تروية ISO في ماوس CPVT. الاختصارات: ECG = مخطط كهربية القلب. AP = جهد الفعل ؛ ISO = الأيزوبروتيرينول ؛ VT = عدم انتظام دقات القلب البطيني. CPVT = عدم انتظام دقات القلب البطيني متعدد الأشكال الكاتيكولامينية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل APD80 و CaTD80 عند 10 هرتز قبل وبعد تحدي ISO. (أ) آثار AP التمثيلية وخرائط الحرارة APD80 لقلوب WT و CPVT قبل وبعد معالجة ISO. (ب) آثار CaT النموذجية والخرائط الحرارية CaTD80 لقلوب WT و CPVT قبل وبعد تحدي ISO. (C) تقصر ISO APD80 في الفئران WT و CPVT ، ولكن لم يتم العثور على فرق بين الفئران WT و CPVT قبل وبعد تحدي ISO. (د) CaTD80 في الفئران CPVT أطول من WT بعد تحدي ISO ، في حين لم تكن هناك أهمية قبل معاملة ISO. (* P < 0.05 ، ** P < 0.01. n = 5/6.) الاختصارات: AP = جهد الفعل ؛ APD80 = الذروة عند إعادة استقطاب 80٪ ؛ ISO = الأيزوبروتيرينول ؛ CPVT = عدم انتظام دقات القلب البطيني متعدد الأشكال الكاتيكولامينية. WT = النوع البري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل سرعة التوصيل عند 10 هرتز. أ: خوارزمية المتجه الأحادي لسرعة التوصيل. (ب) لا يوجد فرق في السيرة الذاتية ل AP في الفئران WT و CPVT. (ج) توضح الخرائط الحرارية التمثيلية أن فئران CPVT لها نفس قدرة التوصيل مثل فئران WT قبل وبعد تحدي ISO وفقا لإشارات الجهد. (د) لم يتم العثور على فرق كبير في المجموعتين لمزاكلات CaT80 المستحثة بجهد الفعل قبل وبعد تحدي ISO. الاختصارات: AP = جهد الفعل ؛ ISO = الأيزوبروتيرينول ؛ CPVT = عدم انتظام دقات القلب البطيني متعدد الأشكال الكاتيكولامينية. WT = النوع البري ؛ AT = وقت التنشيط ؛ CV = سرعة التوصيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تحليل بدائل سعة الكالسيوم. أ: خوارزمية حساب مولدات سعة الكالسيوم. (ب) تظل إشارات الكالسيوم في قلوب WT مستقرة عند خط الأساس خلال سرعة S1S1 المتتالية عند 14.29 و 16.67 هرتز ، بينما (C) تظهر قلوب CPVT بدائل تعتمد على التردد. (د) لا تتأثر قلوب WT بتحدي ISO ، بينما (E) بعد تحدي ISO ، تظهر قلوب CPVT مولدات تعتمد على التردد في إشارة الكالسيوم أثناء سرعة S1S1. الاختصارات: ISO = الأيزوبروتيرينول. CPVT = عدم انتظام دقات القلب البطيني متعدد الأشكال الكاتيكولامينية. WT = النوع البري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تحليل عدم انتظام ضربات القلب باستخدام خرائط الطور . (أ) تظهر قلوب WT و CPVT توصيلا طبيعيا أثناء سرعة الاندفاع 50 هرتز عند خط الأساس. (B) بعد التروية باستخدام ISO ، تظهر قلوب CPVT دوارات عالية التردد بعد سرعة انفجار 50 هرتز ، بينما تحافظ قلوب WT على التوصيل الطبيعي. الاختصارات: ISO = الأيزوبروتيرينول. CPVT = عدم انتظام دقات القلب البطيني متعدد الأشكال الكاتيكولامينية. WT = النوع البري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بناء على تجربتنا ، تتضمن مفاتيح رسم الخرائط البصرية ثنائية الصبغة الناجحة لقلب الفأر حلا وقلبا مجهزين جيدا ، وتحميل الصبغة ، وتحقيق أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء ، وتقليل قطعة أثرية للحركة.
تحضير الحل
حل كريبس ضروري لتجربة القلب الناجحة. يتم تحضير محاليل مخزون MgCl 2 و CaCl2 (1 مول / لتر) مسبقا مع مراعاة امتصاصها للماء وإضافتها إلى محلول كريبس بعد إذابة جميع المكونات الأخرى في الماء النقي لأن Mg 2+ و Ca 2+ يمكن أن يترسب بسهولة مع CO3 2+. يتم فقاعات محلول كريبس بنسبة 95٪ O 2/5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة على الأقل لضمان الأكسجين. نظرا لأن قلب الفأر حساس بشكل خاص لدرجة الحموضة ، يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني للمحلول حوالي 7.4 بعد الأكسجين. حتى لو كانت الجسيمات الصغيرة في المحلول ، فقد تتأثر النتائج التجريبية لأن هذه الجسيمات قد تسد الشعيرات الدموية وتؤثر على تأثير التروية. ومن ثم ، يتم ترشيح المحلول باستخدام مرشح إبرة معقم 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام.
إعداد القلب
قبل حصاد القلوب ، يتم أولا هيبارين الفئران لتجنب تكوين جلطة في نظام الشريان التاجي ، مما يمنع ضعف نضح الصبغة الناجم عن احتقان القلب من التأثير على التصوير اللاحق. كلما كان وقت نقص تروية القلب أقصر ، كانت حالة القلب أفضل. لذلك ، يتم التحكم في الوقت الإقفاري في غضون 2-3 دقائق من حصاد القلوب إلى القنية عبر الشريان الأورطي على نظام Langendorff. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ضغط التروية الذي يتم الحفاظ عليه جيدا ضروري أيضا. وبالتالي ، يتم إدخال أنبوب رفيع من السيليكون (البلاستيك) في تجويف البطين الأيسر لتجنب ارتفاع ضغط البطين الأيسر أثناء تقلص البطين بعد ربط مخرج البطين الأيسر ، مما قد يؤدي إلى ضعف نضح عضلة القلب وتحمض الأنسجة غير الأكسجينية.
تحميل الصبغة
تقوم هذه التجارب بتحميل الصبغة عن طريق تعطير القلب في نظام Langendorff. من الأهمية بمكان مراقبة إيقاع القلب لأن تحميل الصبغة السيئ سيحدث عندما يكون الإيقاع غير الطبيعي ناتجا عن العمليات الجراحية أو تلف نقص التروية. يجب أن يكون القلب بصحة جيدة بما يكفي لأداء الخطوات اللاحقة. Rhod-2 AM ، صبغة حساسة ل Ca2+ ، هي مشتقة من أسيتيل ميثيل إستر من Rhod 2 ، والتي يتم تحميلها بسهولة في الخلايا في شكلها AM. تنتج زيادة بمقدار 100 ضعف في شدة مضان الجزيء عن استخلاب Ca2+ 17. تم دمج Pluronic F127 في محلول التحميل Rhod-2 AM لمنع Rhod-2 AM من البلمرة في المخزن المؤقت ومساعدته على دخول الخلايا. يمكن أن يقلل Pluronic F127 من استقرار Rhod-2 AM ، لذلك يوصى بإضافته فقط عند إعداد حل العمل ولكن ليس في حل التخزين للتخزين طويل الأجل. تم استخدام الصبغة الحساسة للجهد RH237 في هذه الدراسة نظرا لخصائصها الطيفية المواتية للاستخدام مع مؤشر Ca2+ Rhod-2 AM.
تحقيق أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء
يعد الحصول على صور ذات نسب إشارة إلى ضوضاء عالية هو هدف التصوير ، لكن الضوضاء تشبه شبحا غامضا يسبب المتاعب دائما. نظرا للإشارات الضعيفة ، فإن الضوضاء المنخفضة مهمة بشكل خاص في بعض تطبيقات التصوير المجهري عالي السرعة ، مثل رسم الخرائط البصرية. يتم حساب نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) على أنها نسبة السعة التربيعية لمتوسط الجذر إلى جذر متوسط الضوضاء التربيعية ، حيث يتم تقييم سعة الضوضاء عند جهد الراحة18. بعض العوامل ، مثل مصدر الضوء ، والمرشحات البصرية ، وبصريات التركيز ، وأجهزة الكشف الضوئي ، ضرورية لتحقيق أفضل نسبة إلى الضوضاء (SNR). في الدراسة ، يتم فحص منطقة خلفية العينة بحثا عن الضوضاء ، والتي غالبا ما تتقلب عند مستوى صغير. الإشارة الضوئية المكتشفة بواسطة كل بكسل هي متوسط الضوء المنبعث من مساحة سطحه. تتذبذب أنشطة AP والكالسيوم أثناء عدم انتظام ضربات القلب ، وسعة كلتا الإشارتين منخفضة نسبيا. حتى التداخل الطفيف قد يؤدي إلى تشويه الإشارات الضوئية ويؤدي إلى أخطاء في تحليل البيانات. لذلك ، يجب أن يكون تفسير الإشارات الضوئية دقيقا عندما يكون عدم التجانس المحلي ناتجا عن الوظيفة الكهربائية أثناء عدم انتظام ضربات القلب مثل VT.
تقليل قطعة أثرية الحركة
بالمقارنة مع تسجيل القطب الكهربائي ، غالبا ما تتأثر الإشارات الضوئية بنشاط الانكماش لقلوب Langendorff بسبب قطعة أثرية للحركة. لالتقاط إشارات بصرية دقيقة ، يتم استخدام مثبطات الإثارة والانكماش في الغالب. لتقليل قطعة أثرية الحركة أثناء التصوير ، تم اعتماد بليبيستاتين لمنع القلب من النبض. وهو مثبط انتقائي لنشاط ATPase للميوسين II غير العضلي ويفصل بشكل فعال عملية الإثارة والانقباض للقلب19،20،21. على الرغم من أن بعض الدراسات تشير إلى بعض الآثار الجانبية باستخدام المركب22 ، إلا أننا نستخدم أقل تركيز عمل عند 10 ميكرومتر لتقليل الضرر المحتمل للقلب.
برنامج ElectroMap لتحليل مجموعات بيانات رسم الخرائط البصرية للقلب
ElectroMap هو برنامج مفتوح المصدر عالي الإنتاجية لتحليل مجموعات بيانات رسم الخرائط البصرية للقلب. يوفر تحليلا لمعلمات الفيزيولوجيا الكهربية للقلب الرئيسية ، بما في ذلك مورفولوجيا AP و CaT ، والسيرة الذاتية ، والفاصل الانبساطي ، والتردد السائد ، والوقت حتى الذروة ، وثابت الاسترخاء (τ) 15,23. يسمح البرنامج بخيارات تصفية متعددة ، بما في ذلك مرشح Gaussian ومرشح Savitzky-Goaly وتصحيح خط الأساس للقبعة العلوية. مرشح Gaussian هو تجانس ثنائي الأبعاد عن طريق حساب متوسط التنعيم المرجح لكل قناة والقنوات المجاورة. يستخدم عادة لضوضاء خلل السنبلة. يناسب مرشح Savitzky-Goaly مجموعة فرعية منخفضة متعددة الحدود ومستمرة من مجموعات البيانات المجاورة من خلال طريقة المربع الأصغر ، والتي تلبي الحاجة إلى تصفية سلسة مختلفة وهي فعالة أيضا لمعالجة مجموعات البيانات غير الدورية وغير الخطية المشتقة من الضوضاء. يمكن لتصحيح خط الأساس العلوي ضبط الإشارات الضوئية على نفس الارتفاع وفقا لقمم الآثار ، وحساب المعلمات مثل مدة جهد الفعل (APD) ومدة الكالسيوم العابرة (CaTD) بشكل أكثر دقة. يحدث انحراف خط الأساس أحيانا عند أخذ عينات من الجهد وإشارات مضان الكالسيوم. ومن المفيد أيضا عند حساب بدائل الكالسيوم والسعة. تم اختيار كلا البطينين للفحص الفيزيولوجي الكهربي.
مزايا وعيوب رسم الخرائط ذات الصبغة المزدوجة وطرق الحد من التداخل
في السنوات الأخيرة ، تم إدراك أنه من الضروري توضيح إزالة استقطاب الخلايا أو إعادة الاستقطاب وعدم تجانس التوصيل بين الخلايا في القلب كله ، وكذلك اقتران ساعة الغشاء وساعة الكالسيوم ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم آلية الأمراض مثل عدم انتظام ضربات القلب24,25. يتميز رسم الخرائط البصرية بدقة زمانية مكانية عالية لتحديد خصائص تنشيط البطين وإعادة الاستقطاب لقلب الفئران المعدلة وراثيا26،27،28،29. يمكنه أيضا اكتشاف التصوير متعدد المعلمات ، على سبيل المثال ، قياس إمكانات الغشاء والكالسيوم داخل الخلايا لنفس القلب24,30 أو الأنسجة31,32 المحملة بصبغة حساسة للجهد والكالسيوم. يعد التصوير ثنائي الصبغة مفيدا لدراسة العلاقة بين جهد الفعل والكالسيوم ، مثل العلاقة بين ساعة الغشاء (M) وساعة Ca2+ (C) أو إطلاق الكالسيوم التلقائي والتأخر بعد إزالة الاستقطاب (DAD). ثم يتطلب الإثارة القلبية الطبيعية محاذاة الأحداث الدورية في الساعتين. اضطراب في هذه المحاذاة يؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب25. العلاقة بين إطلاق الكالسيوم التلقائي و DAD هي آلية تحفيز الأنشطة في قصور القلب 33. ومع ذلك ، ينبغي اختيار مزيج من الأصباغ بعناية. يسمح الجمع بين RH-237 / Rhod-2 أو di-4-ANEPPS / Indo-1 بالتسجيل المتزامن ، بينما سيؤدي Fluo-3 / 4 / di-4-ANEPPS إلى أخطاء بسبب تداخل أطياف الانبعاث لصبغتين30،34،35. اختارت هذه التجربة RH237 و Rhod-2 AM لتحميل القلب واكتسبت جودة تصوير جيدة.
بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي الكاميرا المستخدمة في هذا البروتوكول على سطحين مستهدفين ، مما يمكنها من التقاط إشارات الانقسام على واجهة واحدة لأخذ العينات وتسمح لكاميرا واحدة باكتشاف طولين موجيين مختلفين للانبعاثات. سيسمح لنا هذا التعيين المتزامن ل AP و CaT البصري الذي يجمع بين بروتوكولات التحليل الطيفي الضوئي الإلكتروني (PES) المختلفة بتحديد العلاقة المتبادلة بين [Ca2+] i غير الطبيعي وعدم الاستقرار الكهربائي في ظل ظروف الإجهاد وتأثير التقوية بعد التنشيط على هذه الحالات الشاذة. ستتم دراسة الطبيعة غير المتجانسة مكانيا لركوب الدراجات SR Ca2+ وكيف يؤثر ذلك على ظهور وشدة وتوافق المولدات الكهربائية والسلوك المسبب لاضطراب النظم ، مثل البدائل المتنافرة مكانيا وما يترتب على ذلك من VTs ، في القلب السليم في مجموعات مختلفة. سيتم استكشاف بدائل SR Ca 2+ و RyR2 ودورها في بدائل SR Ca2+ و APD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أي من المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgments
يتم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81700308 إلى XO و 31871181 إلى ML ، و 82270334 إلى XT) ، وبرنامج دعم العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (CN) (2021YJ0206 إلى XO ، 23ZYZYTS0433 ، و 2022YFS0607 إلى XT ، و 2022NSFSC1602 إلى TC) ومختبر الدولة الرئيسي للكيمياء والهندسة الجزيئية للموارد الطبية (جامعة Guangxi Normal) (CMEMR2017-B08 إلى XO) ، MRC (G10031871181 إلى ML02647 ، G1002082 ، ML) ، BHF (PG / 14/80/31106 ، PG / 16/67/32340 ، PG / 12/21/29473 ، PG / 11/59/29004 ML) ، BHF CRE في منح أكسفورد (ML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
References
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
- Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
- Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
- Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
- Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
- Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al.
- Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
- Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
- Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
- Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
- Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
- O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
- Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
- Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
- Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
- Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
- Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
- Mal Baudot,, et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
- Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
- Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
- Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
- Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
- He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
- Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).
