Summary
Este protocolo introduz o mapeamento óptico dual-dye de corações de camundongos obtidos de animais selvagens e knock-in afetados por taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, incluindo medidas eletrofisiológicas de voltagem transmembrana e transientes intracelulares de Ca2+ com alta resolução temporal e espacial.
Abstract
O distúrbio cardíaco pró-arrítmico taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVCP) manifesta-se como episódios de taquicardia ventricular polimórfica após atividade física, estresse ou desafio com catecolaminas, que podem se deteriorar para fibrilação ventricular potencialmente fatal. O coração de camundongo é uma espécie amplamente difundida para a modelagem de doenças arrítmicas cardíacas hereditárias, incluindo o CPVT. O mapeamento óptico simultâneo de potencial transmembrana (Vm) e transientes de cálcio (CaT) de corações de camundongos perfundidos por Langendorff tem o potencial de elucidar mecanismos subjacentes à arritmogênese. Comparada com a investigação em nível celular, a técnica de mapeamento óptico pode testar alguns parâmetros eletrofisiológicos, como a determinação da ativação, velocidade de condução, duração do potencial de ação e duração do CaT. Este trabalho apresenta a configuração da instrumentação e o procedimento experimental para o mapeamento óptico de alto rendimento de CaT e Vm em corações murinos selvagens e heterozigotos RyR2-R2474S/+, combinados com estimulação elétrica programada antes e durante o desafio com isoproterenol. Esta abordagem demonstrou um método viável e confiável para estudar mecanisticamente a doença por CPVT em uma preparação ex vivo do coração de camundongos.
Introduction
O distúrbio cardíaco hereditário taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVCP) manifesta-se como episódios de taquicardia ventricular polimórfica (TVPo) após atividade física, estresse ou desafio com catecolaminas, que podem se deteriorar para fibrilação ventricular potencialmente fatal 1,2,3,4 . Evidências recentes após seu primeiro relato como síndrome clínica em 1995 implicaram mutações em sete genes, todos envolvidos na liberação de Ca 2+ no armazenamento reticular sarcoplasmático (SR) nessa condição: o RYR2 mais frequentemente relatado que codifica o receptor de rianodina 2 (RyR2) dos canais de liberação de Ca2+ 5,6, FKBP12.67, CASQ2 que codifica calsequestrina cardíaca8, TRDN codificando a proteína juncional SRtriadina 9, e CALM1 9, CALM2 10 e CALM3 codificando de forma idêntica a calmodulina 11,12. Esses padrões genotípicos atribuem os eventos arrítmicos à liberação patológica desregulada do estoque de SR Ca2+12.
A liberação espontânea de Ca 2+ do SR pode ser detectada como faíscas de Ca 2+ ou ondas de Ca 2+, que ativam o trocador Na+/Ca 2+ (NCX). O trocador de um Ca2+ por três Na+ gera uma corrente interna, que acelera a despolarização diastólica e direciona a tensão da membrana até o limiar do potencial de ação (AP). Em camundongos knock-in RyR2, o aumento da atividade do RyR2R4496C no nó sinoatrial (SAN) leva a uma diminuição inesperada da automaticidade do SAN pela diminuição dependente de Ca 2+ da depleção de ICa,L e SR Ca2+ durante a diástole, identificando alterações fisiopatológicas subcelulares que contribuem para a disfunção do SAN em pacientes com TVCP13,14. A ocorrência das ondas Ca 2+ citosólicas de cardiomiócitos relacionadas é mais provável após aumentos no citosólico de fundo [Ca2+] após a sensibilização por RyR por catecolamina, incluindo isoproterenol (ISO), desafio.
Mudanças cinéticas detalhadas na sinalização de Ca 2+ após liberação de Ca2+ mediada por RyR2 em resposta à ativação do potencial de ação (PA) que podem ser a causa das arritmias ventriculares observadas em modelos de TVCP cardíaco intacto ainda precisam ser determinadas para toda a gama de genótipos de RyR2 relatados12. Este trabalho apresenta a configuração da instrumentação e o procedimento experimental para o mapeamento de alto rendimento de sinais de Ca2+ e potenciais transmembrana (Vm) em corações murinos selvagens (WT) e heterozigotos RyR2-R2474S/+, combinados com estimulação elétrica programada antes e após o desafio com isoproterenol. Este protocolo fornece um método para o estudo mecanístico da doença por CPVT em corações isolados de camundongos.
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Protocol
Camundongos selvagens machos de 10 a 14 semanas de idade ou camundongos RyR2-R2474S/+ (fundo C57BL/6) pesando 20-25 g são usados para os experimentos. Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de cuidados e uso de animais da Southwest Medical University, Sichuan, China (aprovação NO:20160930) em conformidade com as diretrizes nacionais sob as quais a instituição opera.
1. Preparo
- Soluções em estoque
- Solução-mãe de blebbistatina: Adicionar 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) a 100% no balão original contendo 2,924 mg de (-) blebistatina em pó para atingir uma concentração de 10 mM.
- Solução estoque do indicador de tensão RH237: Adicionar 1 mL de DMSO 100% no balão original com 1 mg de pó RH237 para atingir uma concentração de 2,01 mM.
- Solução estoque Rhod-2 AM indicador de cálcio: Adicionar 1 mL de DMSO 100% em 1 mg de pó Rhod-2 AM para atingir uma concentração de 0,89 mM.
- Solução estoque de Pluronic F127: Adicionar 1 mL de DMSO 100% em 200 mg de Pluronic F127 para atingir uma concentração de 20% p/v (0,66 mM).
- Aliquot as soluções-estoque em tubos de PCR de 200 μL em 21-51 μL (21 μL de RH237, 31 μL de Rhod-2 AM e 51 μL de blebbistatina) para uso simples ou duplo para evitar congelamento e descongelamento repetidos. Em seguida, envolva as soluções com papel alumínio e armazene a -20 °C, exceto para a solução-estoque Pluronic F127 colocada em uma sala escura à temperatura ambiente.
- Solução de perfusão
- Solução de Krebs (em mM): Preparar 1 L de solução de Krebs (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1,0, KCl4,7, MgCl 2 1,05, CaCl2 1,35 e glicose 10).
- Filtrar a solução com um filtro de agulha asséptico de 0,22 μm e oxigenar com 95% O 2/5% CO2.
- Tomar 40 ml de solução de Krebs num tubo centrífugo de 50 ml e armazená-lo a 4 °C para isolamento cardíaco de acompanhamento.
- O sistema de perfusão Langendorff e o dispositivo de mapeamento óptico
- Montar o sistema de perfusão Langendorff.
- Ligue o banho-maria e ajuste a temperatura para 37 °C.
- Lavar o sistema de perfusão Langendorff com 1 L de água deionizada.
- Perfundir a solução da via de admissão e ajustar a taxa de saída para 3,5-4 mL/min. Em seguida, oxigenar o perfusato com gás O 2/CO2 (95%/5%) a 37 °C.
NOTA: Uma bolha nunca é permitida no sistema de perfusão.
- Preparar o sistema de mapeamento óptico.
- Instale a câmera EMCCD (dispositivo de multiplicação de carga acoplada a elétrons) (512 × 512 pixels), lente (ampliação de 40x), diodos emissores de luz (LEDs) divisores de comprimento de onda, monitor de eletrocardiograma (ECG) e eletrodo de estimulação (Figura 1).
- Ajuste a distância de trabalho adequada da lente para a posição do coração.
- Ajuste dois LEDs na posição diagonal do banho termostático para iluminação uniforme, fornecendo um comprimento de onda de 530 nm para gerar luz de excitação. Use um filtro revestido com sputter ET525/50 para remover qualquer luz fora de banda para os LEDs.
- Ajuste o interruptor da alça para obter um quadrado igual da superfície alvo, fazendo com que as imagens de tensão e cálcio apareçam adequadamente na interface de aquisição.
- Gire a abertura da lente para o diâmetro máximo para evitar qualquer vazamento de tensão ou sinais de cálcio.
- Ajuste a lente da câmera em uma altura adequada, pois serve uma distância de trabalho fina para o banho termostático, 10 cm é usado principalmente.
- Ligue a câmara para obter uma temperatura de amostragem estável a -50 °C.
- Montar o sistema de perfusão Langendorff.
2. Procedimentos
- Colheita, canulação e perfusão do coração de camundongo
- Injetar intraperitonealmente os animais com solução de avertin (1,2%, 0,5-0,8 mL) e heparina (200 unidades) para minimizar o sofrimento e o reflexo de dor e prevenir a formação de coágulos sanguíneos. Após 15 minutos, sacrificar os animais por deslocamento cervical.
- Abra o peito com uma tesoura, colha o coração cuidadosamente e coloque-o na solução fria de Krebs (4 °C, 95% O 2, 5% CO2) para retardar o metabolismo e proteger o coração.
- Remova o tecido circundante da aorta, canule a aorta usando uma agulha canulante personalizada (diâmetro externo: 0,8 mm, diâmetro interno: 0,6 mm, comprimento: 27 mm) e fixe-a com uma sutura de seda 4-0.
- Perfundir o coração com o sistema Langendorff a uma velocidade constante de 3,5-4,0 mL/min e manter a temperatura em 37 ± 1 °C.
NOTA: Todos os procedimentos subsequentes são realizados nesta condição. - Insira um pequeno tubo de plástico (0,7 mm de diâmetro, 20 mm de comprimento) no ventrículo esquerdo para liberar a congestão da solução na câmara para evitar sobrecarga.
- Desacoplador de excitação-contração e carregamento de corante duplo
- Coloque dois eletrodos no perfusato no banho, ligue as potências da caixa do amplificador de ECG e do controlador de estimulação elétrica e, em seguida, inicie o software de ECG referenciado e monitore o ECG continuamente.
- Execute os passos subsequentes no escuro quando o coração atingir uma condição de estado estável (o coração está batendo ritmicamente a ~400 bpm).
- Misturar 50 μL de solução-mãe de blebistatina 10 mM com 50 ml de solução de Krebs para atingir uma concentração de 10 μM. Perfundir constantemente a mistura de solução de blebbistatina-Krebs no coração por 10 minutos para desacoplar a contração da excitação e evitar artefatos de contração durante a filmagem.
- Use uma lanterna vermelha para verificar se a contração do coração para totalmente, porque a contração influenciará a qualidade do carregamento do corante.
- Após o desacoplamento excitação-contração, misturar 15 μL de solução-mãe Rhod-2 AM com 15 μL de solução-estoque Pluronic F127 em 50 mL de solução Krebs para atingir as concentrações finais de 0,267 μM Rhod-2 AM e 0,198 μM Pluronic F127. Em seguida, perfundir o coração continuamente com a solução de trabalho Rhod-2 AM por 15 minutos no sistema de perfusão Langendorff.
- Manter o suprimento de oxigênio durante a carga intracelular de corante de cálcio. Como as bolhas são facilmente formadas no Pluronic F127, insira uma armadilha de bolhas no sistema de perfusão para evitar embolização gasosa das coronárias.
- Diluir 10 μL da solução-mãe RH237 em 50 mL do perfusato para atingir a concentração final de 0,402 μM e realizar o carregamento por 10 minutos.
- No final do carregamento de corante duplo, tire uma sequência de fotos para garantir que os sinais de tensão e cálcio sejam adequados para análise (sem interação entre dois sinais).
- Mapeamento óptico e indução de arritmias
NOTA: O mapeamento óptico inicia-se após a cessação da contração e uma carga de corante apropriada, e o coração é perfundido consecutivamente como nas etapas descritas acima em 2.1 (4).- Ligue os dois LEDs para luzes de excitação e ajuste sua intensidade em uma faixa adequada (forte o suficiente para iluminação e filmagem relativamente simples, mas não muito robusta para superexposição).
- Coloque o coração sob o dispositivo de detecção, certifique-se de que está sob iluminação adequada de dois LEDs e ajuste o diâmetro do ponto de luz para 2 cm.
- Ajuste a distância de trabalho da lente ao coração para 10 cm, dando uma taxa de amostragem de quase 500 Hz e uma resolução espacial de 120 x 120 μm por pixel.
- Abra o software de amostragem de sinal para controlar a câmera digitalmente para capturar sinais de tensão e cálcio simultaneamente.
- Inicie o estimulador de campo myopacer e defina o padrão de estimulação no Transistor Transistor Logic (TTL), duração de estimulação de 2 ms para cada pulso e 0,3 V como intensidade inicial.
- Utilizar 30 estímulos consecutivos de 10 Hz S1 para testar o limiar de voltagem diastólica do coração acionado pelo software de registro de ECG. Aumente gradualmente a amplitude de tensão até que a captura 1:1 seja realizada (verifique a onda QRS do monitor de ECG, os sinais de potencial de ação (AP) e transientes de cálcio (CaT).
- Após a determinação do limiar de voltagem, o coração acelera a uma intensidade de 2x o limiar de voltagem diastólica com um par de eletrodos de platina fixados ao epicárdio do ápice do ventrículo esquerdo (AVE).
- Implemente o protocolo S1S1 para medir o cálcio ou potenciais de ação e propriedades de restituição. Cadenciar o coração consecutivamente em um comprimento de ciclo básico de 100 ms, diminuindo 10 ms do comprimento do ciclo a cada sequência seguinte até atingir 50 ms. Cada episódio inclui 30 estímulos consecutivos com largura de pulso de 2 ms. Ao mesmo tempo, inicie o mapeamento óptico antes da estimulação (o tempo de amostragem inclui ~10 ritmos sinusais e duração do ritmo).
- Para medir o período refratário efetivo ventricular (PRE) usando o protocolo de estímulo S1S2, inicie com um ciclo de estimulação S1S1 de 100 ms com um S2 acoplado a 60 ms com um decremento de passo de 2 ms até que S2 não consiga capturar o complexo QRS ectópico.
- Para indução da arritmia, realizar estimulação burst perpétua de 50 Hz (50 estímulos elétricos contínuos com largura de pulso de 2 ms) e realizar o mesmo episódio de estimulação após um intervalo de 2 s de repouso.
- Observe cuidadosamente os registros de ECG durante o período de estimulação contínua de alta frequência para que os registros simultâneos do mapeamento óptico possam ser iniciados prontamente quando uma onda arrítmica interessante do ECG for gerada (como a maioria das arritmias cardíacas é induzida por estimulação elétrica, os sinais ópticos são amostrados 2-3 s antes da estimulação de explosão em caso de perda de eventos cardíacos importantes).
- Imagem usando a câmera EMCCD (taxa de amostragem: 500 Hz, tamanho do pixel: 64 x 64).
- Análise de dados
- Carregamento de imagens e processamento de sinais
- Pressione Select Folder e Load Images para carregar as imagens no software de aquisição de imagens para análise semiautomática massiva de dados de vídeo de acordo com a configuração e protocolo descritos anteriormente15,16.
- Insira os parâmetros de amostragem corretos (como Tamanho do Pixel e Taxa de Quadros).
- Defina o limite da imagem por entrada manual e selecione a região de interesse (ROI).
- Implemente um filtro espacial gaussiano de 3 x 3 pixels, um filtro Savitzky-Goaly e uma correção de linha de base de cartola.
- Pressione Process Images para remover a linha de base e calcular os parâmetros eletrofisiológicos, como APD80 e CaTD50.
- Análise de parâmetros eletrofisiológicos
- Definir o tempo de início da DPA no pico e o ponto terminal em 80% de repolarização (DPA80) para o cálculo da DPA80. Da mesma forma, o tempo de início do CaTD é definido como o pico, e o ponto terminal é definido como o relaxamento de 80%.
- A medida da velocidade de condução (CV) depende do tamanho do pixel e do tempo de condução do potencial de ação entre dois pixels ou mais. Calcule a velocidade média de todos os pixels escolhidos - esta é a velocidade média de condução da região selecionada. Gere mapas isocronais correspondentes simultaneamente para uma visão clara da direção de condução.
NOTA: O'Shea et al.15 relataram detalhadamente a medida CV. - Para a análise de alternans e arritmias, os alternans de cálcio são definidos como um pico contínuo de grande e pequeno pico de amplitude aparecendo alternativamente. Utilizar a razão da amplitude de pico para avaliar a severidade de alternanos dependentes de frequência (1-A2/A1). Aplicar mapas de fase para analisar arritmias complexas, como taquicardia ventricular (TV). Procure os rotores que aparecem distintamente em uma região específica à medida que os rotores mudam.
- Carregamento de imagens e processamento de sinais
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Representative Results
O mapeamento óptico tem sido uma abordagem popular no estudo de arritmias cardíacas complexas na última década. A configuração de mapeamento óptico consiste em uma câmera EMCCD, fornecendo uma taxa de amostragem de até 1.000 Hz e uma resolução espacial de 74 x 74 μm para cada pixel. Ele permite uma relação sinal-ruído bastante alta durante a amostragem do sinal (Figura 1). Uma vez que o coração perfundido por Langendorff atinge um estado estável e a carga do corante termina, o coração é colocado na câmara homoetérmica sob a iluminação de dois LEDs de 530 nm, que são usados para excitação do indicador de tensão RH237 e indicador de Ca2+ Rhod-2 AM. A luz de emissão é dividida em dois comprimentos de onda de 600 nm (para Ca2+) e 670 nm (para Vm), que são detectados simultaneamente usando a câmera EMCCD. Após a perfusão de avertin e heparina por 15 minutos, utilizar os instrumentos cirúrgicos (Figura 2A) para abrir o tórax e extrair rapidamente o coração, transferindo-o para a solução de Krebs gelada (4 °C, 95% O 2, 5% CO2) (Figura 2B). Limpar cuidadosamente os tecidos circundantes, fixar a aorta com uma sutura 4-0 e um tubo plástico de 0,7 mm é inserido no ventrículo esquerdo (Figura 2C) para liberar a congestão do perfusato na câmara ventricular esquerda. Coloque os eletrodos do ECG no perfusato (Figura 2D) e certifique-se de que o coração bate ritmicamente de acordo com a monitorização do ECG conduzida pelo software de gravação do ECG. Em seguida, execute o carregamento de corante duplo no escuro (Figura 2E).
Após os artefatos de contração terem sido minimizados pela blebistatina (10 μM) e uma carga de corante adequada ter sido concluída, a filmagem foi iniciada por cerca de 10 batimentos sinusais antes do protocolo de estimulação S1S1 para avaliar as propriedades de restituição de parâmetros eletrofisiológicos dependentes da frequência e alternans de cálcio após o desafio com isoproterenol (1 μM ISO) (Figura 3A). A Figura 3B exibe uma frente de onda representativa do ECG do VT e os traços correspondentes de potencial de ação (PA) e CaT induzidos por uma sequência de estimulação burst de 50 Hz em um camundongo CPVT. O software de imagem de sinal óptico é usado para completar uma análise semiautomática de dados massivos de vídeo.
A Figura 4A,B mostra traços típicos e mapas de calor de APD80 e CaTD80, respectivamente. ISO encurta APD80 em camundongos WT e CPVT, mas nenhuma diferença foi encontrada entre WT e CPVT antes e após o desafio ISO (Figura 4C, **P < 0,01. n = 5/6). A Figura 4D indica que o CaTD80 em camundongos CPVT é mais longo do que em WT após o desafio ISO, enquanto não houve significância antes do tratamento ISO (**P < 0,01. n =6.).
Para a medida de condução, a Figura 5A apresenta um algoritmo vetorial único para a quantificação do CV. De acordo com os sinais de voltagem, os corações WT e CPVT possuem a mesma capacidade de condução através do epicárdio no início e após a intervenção ISO (Figura 5B). A Figura 5C,D mostra os mapas representativos de ativação de voltagem e cálcio nos corações WT e CPVT antes e após o desafio ISO.
O cálcio alternante é um parâmetro crítico para arritmia. A amplitude de cálcio alternans é calculada de acordo com a formulação como mostrado na Figura 6A. Os sinais de cálcio nos corações WT permanecem estáveis no início do estudo durante a estimulação consecutiva de S1S1 em 14,29 e 16,67 Hz (Figura 6B), enquanto os corações com TVCP apresentam alternâncias dependentes da frequência (Figura 6C). Após o desafio ISO, os corações com TVCP exibem alternâncias dependentes de frequência no sinal de cálcio durante a estimulação S1S1, enquanto os corações WT não são influenciados (Figura 6D,E). Após estimulação contínua de S1S1, um protocolo de estimulação burst é realizado para induzir arritmias letais. Os corações WT e CPVT apresentam condução normal durante a estimulação burst de 50 Hz no início do estudo (Figura 7A). Após a perfusão com ISO, os corações com TVCP apresentam rotores de alta frequência após estimulação burst de 50 Hz, enquanto os corações WT mantêm condução normal (Figura 7B).
Figura 1: Equipamento de mapeamento óptico. O sistema inclui uma câmera EMCCD personalizada com alta resolução espaço-temporal (taxa de amostragem de até 1.000 Hz, pixel de amostragem mínimo de 74 x 74 μm). Um controlador de estimulação elétrica é usado para amostragem e protocolo de estimulação elétrica de saída. Dois LEDs verdes são usados para a luz de excitação de sondas de fluorescência. Um espelho dicroico de passagem longa (610 nm) e emissores correspondentes dividem as luzes de emissão de tensão e fluorescência de cálcio. RH237, o corante sensível à tensão, tem uma luz de emissão em um comprimento de onda de pico de 670 nm, enquanto Rhod-2 AM, o corante sensível ao cálcio, possui uma luz de emissão em um comprimento de onda de pico de 600 nm. Pequenas alterações em ambos os sinais de fluorescência podem ser capturadas pela câmera simultaneamente por causa da alta taxa de amostragem e sensibilidade do sensor da câmera. Abreviaturas: EMCCD = electron-multiplicating charge-coupled device; LED = diodo emissor de luz; ECG = eletrocardiograma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparo e carregamento de corante duplo . (A) Os instrumentos cirúrgicos. (B) Colheita do coração de rato. (C) Cortar cuidadosamente o tecido desnecessário para uma visão clara da aorta e inserir um tubo plástico de 0,7 mm da aorta no ventrículo esquerdo. (D) O coração é removido rapidamente para o sistema de perfusão Langendorff. (E) Dupla carga de corante e cessação de excitação-contração no escuro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Protocolo de S1S1 e protocolo de indução de arritmias. (A) Frente de onda representativa do ECG e traçados correspondentes do sinal AP e cálcio usando o protocolo de estimulação S1S1 após desafio ISO. (B) Indução de TV por meio de burst pacing de 50 Hz após perfusão de ISO em camundongo CPVT. Abreviações: ECG = eletrocardiograma; PA = potencial de ação; ISO = isoproterenol; TV = taquicardia ventricular; TVCP = taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise APD80 e CaTD80 a 10 Hz antes e após a provocação ISO. (A) Traços representativos de AP e mapas de calor APD80 de corações WT e CPVT antes e após o tratamento ISO. (B) Traços típicos de CaT e mapas de calor de CaTD80 de corações WT e CPVT antes e após o desafio ISO. (C) A ISO encurta a APD80 em camundongos WT e CPVT, mas nenhuma diferença é encontrada entre camundongos WT e CPVT antes e depois do desafio ISO. (D) CaTD80 em camundongos CPVT são mais longos do que em WT após desafio ISO, enquanto não houve significância antes do tratamento ISO. (* P < 0,05, **P < 0,01. n =5/6.) Abreviações: AP = potencial de ação; APD80 = pico com 80% de repolarização; ISO = isoproterenol; TVCP = taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica; WT = tipo selvagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise da velocidade de condução em 10 Hz. (A) O algoritmo vetorial único de velocidade de condução. (B) Não houve diferença no CV da PA em camundongos WT e CPVT. (C) Mapas de calor representativos demonstram que camundongos CPVT têm a mesma capacidade de condução que camundongos WT antes e depois do desafio ISO de acordo com sinais de tensão. (D) Não há diferença significativa nos dois grupos para as isócronas CaT80 induzidas pelo potencial de ação antes e após o desafio ISO. Abreviações: AP = potencial de ação; ISO = isoproterenol; TVCP = taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica; WT = tipo selvagem; AT = tempo de ativação; CV = velocidade de condução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Análise da amplitude de cálcio alternans. (A) O algoritmo de cálculo de alternâncias de amplitude de cálcio. (B) Os sinais de cálcio nos corações WT permanecem estáveis no início do estudo durante a estimulação consecutiva S1S1 em 14,29 e 16,67 Hz, enquanto (C) os corações CPVT mostram alternans dependentes da frequência. (D) Os corações WT não são influenciados pelo desafio ISO, enquanto (E) após o desafio ISO, os corações CPVT exibem alternans dependentes de frequência no sinal de cálcio durante a estimulação S1S1. Abreviações: ISO = isoproterenol; TVCP = taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica; WT = tipo selvagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Análise da taquiarritmia por meio de mapas de fases . (A) Os corações WT e CPVT exibem condução normal durante a estimulação burst de 50 Hz no início do estudo. (B) Após a perfusão com ISO, os corações CPVT apresentam rotores de alta frequência após estimulação burst de 50 Hz, enquanto os corações WT mantêm condução normal. Abreviações: ISO = isoproterenol; TVCP = taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica; WT = tipo selvagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Com base em nossa experiência, as chaves para um mapeamento óptico de corante duplo bem-sucedido de um coração de mouse incluem uma solução e coração bem preparados, carregamento de corante, alcançar a melhor relação sinal-ruído e reduzir o artefato de movimento.
Preparação da solução
A solução de Krebs é essencial para um experimento cardíaco bem-sucedido. As soluções-mãe de MgCl 2 e CaCl2 (1 mol/L) são preparadas com antecedência considerando sua absorção de água e adicionadas à solução de Krebs depois que todos os outros componentes são dissolvidos em água pura, pois Mg 2+ e Ca 2+ podem facilmente precipitar com CO3 2+. A solução de Krebs é borbulhada com 95% O 2/5% CO2 por pelo menos 30 minutos para garantir a oxigenação. Como o coração de camundongo é particularmente sensível ao pH, o pH da solução deve estar em torno de 7,4 após a oxigenação. Mesmo que partículas minúsculas estejam na solução, os resultados experimentais podem ser afetados, pois essas partículas podem bloquear os capilares e afetar o efeito de perfusão. Assim, a solução é filtrada usando um filtro de agulha asséptico de 0,22 μm antes do uso.
Preparo do coração
Antes de os corações serem colhidos, os camundongos são primeiro heparinizados para evitar a formação de coágulos no sistema arterial coronariano, evitando que a má perfusão do corante causada pela congestão cardíaca afete a imagem subsequente. Quanto menor o tempo de isquemia do coração, melhor a condição do coração. Portanto, o tempo de isquemia é controlado dentro de 2-3 minutos desde a retirada dos corações até a canulação via aorta no sistema de Langendorff. Além disso, uma pressão de perfusão bem mantida também é essencial. Assim, um fino tubo de silicone (plástico) é inserido na cavidade ventricular esquerda para evitar que a pressão ventricular esquerda fique muito alta durante a contração ventricular após a ligadura da via de saída do ventrículo esquerdo, o que poderia resultar em má perfusão miocárdica e acidificação do tecido anóxico.
Carregamento de corante
Esses experimentos realizam a carga de corante perfundindo o coração no sistema Langendorff. É crucial monitorar o ritmo cardíaco, pois a má carga de corante ocorrerá quando o ritmo anormal for causado por operações cirúrgicas ou dano de isquemia-reperfusão. O coração deve estar saudável o suficiente para realizar os passos subsequentes. Rhod-2 AM, um corante sensível ao Ca2+, é um derivado do éster metílico acetil do Rhod 2, que é facilmente carregado nas células em sua forma AM. Um aumento de 100 vezes na intensidade de fluorescência da molécula resulta da quelação de Ca2+ 17. O Pluronic F127 é incorporado à solução de carregamento Rhod-2 AM para evitar que o Rhod-2 AM se polimerize no tampão e o ajude a entrar nas células. O Pluronic F127 pode reduzir a estabilidade do Rhod-2 AM, por isso só é recomendado adicioná-lo ao preparar a solução de trabalho, mas não na solução de armazenamento para armazenamento de longo prazo. O corante sensível à voltagem RH237 é usado neste estudo devido às suas propriedades espectrais favoráveis para uso com o indicador de Ca2+ Rhod-2 AM.
Alcançando a melhor relação sinal-ruído
Obter imagens com altas relações sinal-ruído é o alvo das imagens, mas o ruído é como um fantasma sombrio que sempre causa problemas. Devido a sinais fracos, o ruído mais baixo é particularmente importante em algumas aplicações de imagem microscópica de alta velocidade, como mapeamento óptico. A relação sinal-ruído (S/R) é calculada como a razão entre a raiz quadrática da amplitude média e a raiz quadrada média do ruído, onde a amplitude do ruído é avaliada no potencial derepouso18. Alguns fatores, como fonte de luz, filtros ópticos, óptica de focalização e fotodetectores, são essenciais para alcançar a melhor SNR. No estudo, a região de fundo da amostra é examinada em busca de ruído, que muitas vezes flutua em um nível minúsculo. O sinal óptico detectado por cada pixel é a média da luz emitida a partir de sua área de superfície. As atividades de PA e cálcio oscilam durante a arritmia, e a amplitude de ambos os sinais é relativamente baixa. Mesmo pequenas interferências podem levar à distorção dos sinais ópticos e resultar em erros na análise dos dados. Portanto, a interpretação de sinais ópticos deve ser cuidadosa quando a heterogeneidade local é causada pela função elétrica durante arritmias como a TV.
Reduzir o artefato de movimento
Em comparação com o registro de eletrodos, os sinais ópticos são frequentemente influenciados pela atividade de contração dos corações perfundidos de Langendorff por causa do artefato de movimento. Para capturar sinais ópticos precisos, inibidores farmacológicos de excitação-contração são usados principalmente. Para minimizar o artefato de movimento durante a imagem, a blebistatina é adotada para impedir que o coração bata. É um inibidor seletivo da atividade da ATPase da miosina II não muscular e efetivamente desacopla o processo excitação-contração do coração 19,20,21. Embora alguns estudos impliquem alguns efeitos colaterais com o uso do composto22, utilizamos a menor concentração de trabalho em 10 μM para minimizar os possíveis danos ao coração.
Software ElectroMap para análise de conjuntos de dados de mapeamento óptico cardíaco
O ElectroMap é um software de código aberto de alto rendimento para a análise de conjuntos de dados de mapeamento óptico cardíaco. Ele fornece uma análise dos principais parâmetros eletrofisiológicos cardíacos, incluindo morfologia da PA e CaT, VC, intervalo diastólico, frequência dominante, tempo-a-pico e constante de relaxamento (τ) 15,23. O software permite várias opções de filtragem, incluindo o filtro Gaussiano, o filtro Savitzky-Goaly e a correção de linha de base Top-hat. O filtro gaussiano é uma suavização bidimensional através do cálculo da suavização média ponderada de cada canal e canais adjacentes. É comumente usado para ruído de falha de pico. O filtro Savitzky-Goaly se ajusta a um subconjunto polinomial inferior e contínuo de conjuntos de dados adjacentes por meio do método dos mínimos quadrados, que atende à necessidade de várias filtragens suaves e também é eficaz para processar conjuntos de dados não periódicos e não lineares derivados de ruído. A correção de linha de base de cartola pode ajustar os sinais ópticos para a mesma altura de acordo com os picos dos traços, calculando parâmetros como duração do potencial de ação (DPA) e duração transitória do cálcio (CaTD) com muito mais precisão. A deriva da linha de base ocorre ocasionalmente quando a amostragem de sinais de voltagem e fluorescência de cálcio. Também é útil no cálculo de alternâncias e amplitude de cálcio. Ambos os ventrículos foram selecionados para investigação eletrofisiológica.
Vantagens e desvantagens do mapeamento de corante duplo e métodos para limitar a interferência
Nos últimos anos, tem-se percebido que é vital esclarecer a despolarização ou repolarização celular e a heterogeneidade da condução intercelular em todo o coração, bem como o acoplamento do relógio de membrana e do relógio de cálcio, o que é fundamental para a compreensão do mecanismo de doenças como a arritmia24,25. O mapeamento óptico tem alta resolução espaço-temporal para determinar as propriedades de ativação e repolarização ventricular do coração de camundongos transgênicos26,27,28,29. Também pode detectar imagens multiparâmetros, por exemplo, medição do potencial de membrana e cálcio intracelular do mesmo coração24,30 ou tecido31,32 carregado com voltagem e corante sensível ao cálcio. A imagem com corante duplo é benéfica para estudar a relação entre o potencial de ação e o cálcio, como a relação entre o relógio da membrana (M) e o relógio de Ca2+ (C) ou liberação espontânea de cálcio e retardada após a despolarização (DAD). A excitação cardíaca normal requer então que os eventos cíclicos nos dois relógios estejam alinhados. A ruptura desse alinhamento leva àarritmia25. A relação entre liberação espontânea de cálcio e DAD é o mecanismo desencadeante de atividades na insuficiência cardíaca 33. No entanto, a combinação de corantes deve ser cuidadosamente selecionada. A combinação de RH-237/Rhod-2 ou di-4-ANEPPS/Indo-1 permite o registro simultâneo, enquanto o Fluo-3/4/di-4-ANEPPS levará a erros devido à sobreposição dos espectros de emissão de dois corantes30,34,35. Este experimento selecionou RH237 e Rhod-2 AM para carregar o coração e adquiriu boa qualidade de imagem.
Além disso, a câmera usada neste protocolo tem duas superfícies alvo, o que permite capturar os sinais divididos em uma interface de amostragem e permite que uma única câmera detecte dois comprimentos de onda de emissão diferentes. Este mapeamento simultâneo de AP óptico e CaT combinando vários protocolos de espectroscopia fotoeletrônica (PES) permitirá determinar a inter-relação entre [Ca2+]i anormal e instabilidade elétrica sob condições de estresse e o efeito da potencialização pós-ativação sobre essas anomalias. A natureza espacialmente heterogênea da ciclagem de Ca2+ da RS e como isso afeta a emergência, gravidade e concordância de alternans elétricos e comportamento arritmogênico, como alternans espacialmente discordantes e consequentes TVs, será estudada no coração intacto em diferentes grupos. SR Ca 2+ alternans, refratariedade RyR2 e seu papel em SR Ca2+ e APD alternans serão explorados.
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Disclosures
Nenhum dos autores tem qualquer conflito de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este estudo é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81700308 para XO e 31871181 para ML, e 82270334 para XT), Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (CN) (2021YJ0206 a XO, 23ZYZYTS0433 e 2022YFS0607 a XT, e 2022NSFSC1602 a TC) e Laboratório Chave Estadual para Química e Engenharia Molecular de Recursos Medicinais (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 a XO), Bolsas MRC (G10031871181 a ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE em Oxford (ML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
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