Summary
פרוטוקול זה מציג מיפוי אופטי דו-צבעי של לבבות עכברים המתקבלים מחיות בר וחיות בר המושפעות מטכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית, כולל מדידות אלקטרופיזיולוגיות של מתח טרנסממברנה וטרנזיאנטים תוך-תאיים Ca2+ ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה.
Abstract
הפרעת הלב הפרו-אריתמית קטכולמינרגי טכיקרדיה חדרית פולימורפית (CPVT) מתבטאת באפיזודות טכיקרדיה חדרית פולימורפית בעקבות פעילות גופנית, מתח או אתגר קטכולאמין, אשר יכול להידרדר לפרפור חדרים שעלול להיות קטלני. לב עכבר הוא מין נפוץ למידול מחלות הפרעות קצב לב תורשתיות, כולל CPVT. מיפוי אופטי סימולטני של פוטנציאל טרנסממברנה (Vm) ומעברי סידן (CaT) מלבבות עכברים מחוררים לנגנדורף הוא בעל פוטנציאל להבהיר מנגנונים העומדים בבסיס הפרעת קצב. בהשוואה לחקירה ברמה התאית, טכניקת המיפוי האופטי יכולה לבדוק כמה פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים, כגון קביעת ההפעלה, מהירות ההולכה, משך פוטנציאל הפעולה ומשך CaT. מאמר זה מציג את מערך המכשור וההליך הניסיוני למיפוי אופטי בתפוקה גבוהה של CaT ו-V m בלבבות מסוג פרא מורין ו-RyR2-R2474S/+ הטרוזיגוטיים, בשילוב עם קצב חשמלי מתוכנת לפני ובמהלך אתגר האיזופרוטרנול. גישה זו הדגימה שיטה ישימה ואמינה ללימוד מכניסטי של מחלת CPVT בהכנת לב עכבר ex vivo.
Introduction
הפרעת לב תורשתית טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית (CPVT) מתבטאת באפיזודות טכיקרדיה חדרית פולימורפית (PVT) בעקבות פעילות גופנית, מתח או אתגר קטכולאמין, אשר יכולות להידרדר לפרפור חדרים שעלול להיות קטלני 1,2,3,4 . עדויות עדכניות בעקבות הדו"ח הראשון שלה כתסמונת קלינית בשנת 1995 היו מוטציות מעורבות בשבעה גנים, כולם מעורבים בשחרור רשתית סרקופלזמית (SR) Ca 2+ במצב זה: הדיווח הנפוץ ביותר על RYR2 המקודד קולטן ריאנודין 2 (RyR2) של Ca2+ ערוצי שחרור5,6, FKBP12.67, CASQ2 המקודד calsequestrin לב8, TRDN קידוד החלבון SR טריאדין 9, ו- CALM1 9, CALM2 10 ו- CALM3 מקודד באופן זהה קלמודולין11,12. דפוסים גנוטיפיים אלה מייחסים את האירועים הריתמיים לשחרור פתולוגי בלתי מווסת של חנות SR Ca2+12.
שחרור ספונטני של Ca 2+ מ-SR יכול להיות מזוהה כניצוצות Ca 2+ או גלי Ca 2+, אשר מפעיל את מחליף Na+/Ca 2+ (NCX). המחליף של Ca2+ אחד לשלושה Na+ מייצר זרם פנימי, אשר מאיץ את הדפולריזציה הדיאסטולית ומניע את מתח הממברנה לסף פוטנציאל הפעולה (AP). בעכברי RyR2, הפעילות המוגברת של RyR2R4496C בצומת הסינואפרוזדורי (SAN) מובילה לירידה בלתי צפויה באוטומטיות של SAN על ידי ירידה תלוית Ca 2+ של דלדול I Ca,L ו- SR Ca2+ במהלך דיאסטולה, זיהוי שינויים פתופיזיולוגיים תת-תאיים התורמים לתפקוד לקוי של SAN בחולי CPVT13,14. הופעה של גלי Ca 2+ ציטוסוליים הקשורים לקרדיומיוציטים היא סבירה יותר בעקבות עלייה בציטוסוליים ברקע [Ca2+] בעקבות רגישות RyR על ידי קטכולאמין, כולל איזופרוטרנול (ISO), אתגר.
שינויים קינטיים מפורטים באיתות Ca 2+ בעקבות שחרור Ca2+ בתיווך RyR2 בתגובה להפעלת פוטנציאל פעולה (AP) שעשויים להיות הגורם להפרעות קצב חדריות שנצפו במודלים שלמים של CPVT לב נותרו לקביעה עבור הטווח המלא של גנוטיפים מדווחים של RyR212. מאמר זה מציג את מערך המכשור ואת ההליך הניסיוני למיפוי בתפוקה גבוהה של אותות Ca2+ ופוטנציאלים טרנסממברנליים (Vm) בלבבות מסוג בר מורין (WT) ו- RyR2-R2-R2474S/+ הטרוזיגוטיים, בשילוב עם קצב חשמלי מתוכנת לפני ואחרי אתגר איזופרוטרנול. פרוטוקול זה מספק שיטה למחקר מכניסטי של מחלת CPVT בלבבות עכברים מבודדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עכברי בר זכרים בני 10 עד 14 שבועות או עכברי RyR2-R2474S/+ (רקע C57BL/6) במשקל 20-25 גרם משמשים לניסויים. כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית סאות'ווסט, סצ'ואן, סין (אישור NO:20160930) בהתאם להנחיות הלאומיות לפיהן פועל המוסד.
1. הכנה
- פתרונות מלאי
- תמיסת מלאי Blebbistatin: הוסף 1 מ"ל של 100% dimethyl sulfoxide (DMSO) בבקבוק המקורי המכיל 2.924 מ"ג של (-) אבקת blebbistatin כדי להגיע לריכוז של 10 mM.
- מחוון מתח RH237 פתרון מלאי: הוסף 1 מ"ל של 100% DMSO בבקבוק המקורי עם 1 מ"ג של אבקת RH237 כדי להשיג ריכוז של 2.01 mM.
- אינדיקטור סידן Rhod-2 AM תמיסת מניות: הוסף 1 מ"ל של 100% DMSO לתוך 1 מ"ג של אבקת Rhod-2 AM כדי להגיע לריכוז של 0.89 mM.
- תמיסת מלאי Pluronic F127: הוסף 1 מ"ל של 100% DMSO ל-200 מ"ג של Pluronic F127 כדי להגיע לריכוז של 20% w/v (0.66 מילימול).
- Aliquot את תמיסות המלאי לתוך צינורות PCR 200-μL ב 21-51 μL (21 μL של RH237, 31 μL של Rhod-2 AM, ו 51 μL של blebbistatin) לשימוש יחיד או כפול כדי למנוע הקפאה חוזרת והפשרה. לאחר מכן, עטפו את התמיסות ברדיד אלומיניום ואחסנו בטמפרטורה של -20°C, למעט תמיסת המלאי Pluronic F127 הממוקמת בחדר חשוך בטמפרטורת הסביבה.
- פתרון זילוח
- תמיסת קרבס (ב-mM): הכינו 1 ליטר של תמיסת קרבס (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO4 1.0, KCl 4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35 וגלוקוז 10).
- סנן את התמיסה עם מסנן מחט אספטית 0.22 מיקרומטר וחמצן עם 95% O 2/5% CO2.
- קח 40 מ"ל של תמיסת קרבס לתוך צינור צנטריפוגלי 50 מ"ל ואחסן אותו ב 4 ° C לבידוד לב מעקב.
- מערכת זילוח לנגנדורף ומכשיר מיפוי אופטי
- הגדר את מערכת הזלוף Langendorff.
- הפעל את אמבט המים והגדר את הטמפרטורה ל 37 °C (77 °F).
- לשטוף את מערכת זילוח Langendorff עם 1 L של מים deionized.
- יש לנקב את התמיסה ממערכת היניקה ולהתאים את קצב היציאה ל-3.5-4 מ"ל/דקה. לאחר מכן, חמצן את הפרבוסט עם גז O 2/CO2 (95% / 5%) ב 37 ° C.
הערה: לעולם אין להכניס בועה למערכת הזילוח.
- הכן את מערכת המיפוי האופטי.
- התקינו את מצלמת EMCCD (512 × 512 פיקסלים), את העדשה (הגדלה של 40x), את הדיודות פולטות האור (LED) של מפצל אורך הגל, את צג האלקטרוקרדיוגרמה (ECG) ואת אלקטרודת הגירוי (איור 1).
- התאימו את מרחק העבודה הנכון מהעדשה למיקום הלב.
- הגדר שתי נורות LED במיקום האלכסוני של האמבטיה התרמוסטטית לתאורה אחידה, וספק אורך גל של 530 ננומטר ליצירת אור עירור. השתמש במסנן ET525/50 עם ציפוי מרזב כדי להסיר נורות חוץ-פס עבור נורות ה-LED.
- כוונן את מתג הידית כדי להשיג ריבוע שווה של משטח המטרה, כך שתמונות המתח והסידן יופיעו כראוי בממשק הרכישה.
- סובב את מפתח הצמצם של העדשה לקוטר המרבי כדי למנוע דליפה של אותות מתח או סידן.
- כוונן את עדשת המצלמה בגובה מתאים, מכיוון שהיא משרתת מרחק עבודה נאה לאמבטיה התרמוסטטית, 10 ס"מ משמש בעיקר.
- הפעל את המצלמה לטמפרטורת דגימה יציבה ב -50 ° C.
- הגדר את מערכת הזלוף Langendorff.
2. נהלים
- קצירת לב עכבר, קנולציה וזילוח
- תוך צפקית להזריק לבעלי החיים תמיסת אברטין (1.2%, 0.5-0.8 מ"ל) והפרין (200 יחידות) כדי למזער סבל ורפלקס כאב ולמנוע היווצרות קרישי דם. לאחר 15 דקות, להקריב את החיות על ידי נקע צוואר הרחם.
- פתחו את החזה בעזרת מספריים, קצרו את הלב בזהירות והכניסו אותו לתמיסת קרבס הקרה (4°C, 95% O 2, 5% CO2) כדי להאט את חילוף החומרים ולהגן על הלב.
- מוציאים את הרקמה שמסביב לאבי העורקים, מקננים את אבי העורקים באמצעות מחט קנולציה בהתאמה אישית (קוטר חיצוני: 0.8 מ"מ, קוטר פנימי: 0.6 מ"מ, אורך: 27 מ"מ) ומקבעים אותו בתפר משי 4-0.
- לנקב את הלב עם מערכת לנגנדורף במהירות קבועה של 3.5-4.0 מ"ל / דקה ולשמור על הטמפרטורה על 37 ± 1 ° C.
הערה: כל ההליכים הבאים מבוצעים במצב זה. - הכנס צינור פלסטיק קטן (קוטר 0.7 מ"מ, אורך 20 מ"מ) לחדר השמאלי כדי לשחרר את גודש התמיסה בחדר כדי למנוע עומס יתר.
- Uncoupler של עירור-התכווצות והעמסת צבע כפול
- הכנס שני מוליכים לתוך הפרבוסט באמבטיה, הפעל את העוצמה של תיבת מגבר האק"ג ובקר הגירוי החשמלי, ולאחר מכן הפעל את תוכנת האק"ג המוזכרת ועקוב אחר האק"ג ברציפות.
- בצע את השלבים הבאים בחושך כאשר הלב מגיע למצב יציב (הלב פועם בקצב ~ 400 פעימות לדקה).
- יש לערבב 50 μL של 10 mM תמיסת מלאי blebbistatin עם 50 מ"ל של תמיסת קרבס כדי להגיע לריכוז של 10 μM. יש לערבב ללא הרף את תערובת תמיסת הבלביסטטין-קרבס לתוך הלב למשך 10 דקות כדי לשחרר את ההתכווצות מהעירור ולהימנע מתוצרי התכווצות במהלך הצילום.
- השתמשו בפנס אדום כדי לבדוק אם התכווצות הלב מפסיקה לחלוטין מכיוון שההתכווצות תשפיע על איכות העמסת הצבע.
- לאחר ביטול התכווצות העירור, ערבבו 15 מיקרוליטר של תמיסת מלאי Rhod-2 AM עם 15 מיקרוליטר של תמיסת סטוק פלורונית F127 ב-50 מ"ל של תמיסת קרבס כדי להשיג את הריכוזים הסופיים של 0.267 מיקרומטר Rhod-2 AM ו-0.198 מיקרומטר פלורוני F127. לאחר מכן, לנקב את הלב ברציפות עם פתרון עבודה Rhod-2 AM במשך 15 דקות במערכת זילוח לנגנדורף.
- שמור על אספקת החמצן במהלך העמסת צבע סידן תוך תאי. מכיוון שבועות נוצרות בקלות ב- F127 פלורוני, הכנס מלכודת בועות למערכת הזילוח כדי למנוע אמבוליזציה של גזים של הכליליים.
- לדלל 10 μL של תמיסת מלאי RH237 לתוך 50 מ"ל של perfusate כדי להגיע לריכוז הסופי ב 0.402 מיקרומטר ולבצע טעינה במשך 10 דקות.
- בסוף העמסת הצבע הכפול, צלם רצף של תמונות כדי להבטיח שגם אותות המתח וגם אותות הסידן מספיקים לניתוח (אין אינטראקציה בין שני אותות).
- מיפוי אופטי והשראת הפרעות קצב
הערה: מיפוי אופטי מתחיל לאחר הפסקת התכווצות והעמסת צבע מתאימה, והלב מחורר ברציפות כמו בשלבים המתוארים לעיל ב 2.1 (4).- הפעל את שתי נורות ה- LED עבור אורות עירור וכוונן את עוצמתן בטווח מתאים (חזק מספיק לתאורה וצילום פשוט יחסית אך לא חזק מדי לחשיפת יתר).
- שים את הלב מתחת למכשיר האיתור, ודא שהוא נמצא תחת תאורה נאותה של שתי נורות LED, וכוונן את קוטר נקודת האור ל -2 ס"מ.
- הגדר את מרחק העבודה מהעדשה ללב ל- 10 ס"מ, מה שנותן קצב דגימה של כמעט 500 הרץ ורזולוציה מרחבית של 120 x 120 מיקרומטר לפיקסל.
- פתח את תוכנת דגימת האותות כדי לשלוט במצלמה באופן דיגיטלי כדי ללכוד אותות מתח וסידן בו-זמנית.
- הפעל את מגרה שדה המיופסר, והגדר את תבנית הקצב ב- Transistor Transistor Logic (TTL), משך קצב של 2 אלפיות השנייה עבור כל פעימה, ו- 0.3 V כעוצמה התחלתית.
- השתמש 30 גירויים רצופים של 10 הרץ S1 כדי לבדוק את סף המתח הדיאסטולי של הלב המונע על ידי תוכנת הקלטת האק"ג. הגדל בהדרגה את משרעת המתח עד ללכידת 1:1 (בדוק גל QRS מצג האק"ג, פוטנציאל הפעולה (AP) ואותות מעבר סידן (CaT).
- לאחר קביעת סף המתח, יש לקצב את הלב בעוצמה של פי 2 מסף המתח הדיאסטולי בעזרת זוג אלקטרודות פלטינה המחוברות לאפיקרדיאלי של קודקוד החדר השמאלי (LV) (ELVA).
- יישם את פרוטוקול S1S1 כדי למדוד סידן או פעולה פוטנציאלית alternans ותכונות השבה. קצב את הלב ברציפות באורך מחזור בסיסי של 100 מילישניות, והקטנת 10 מילישניות מאורך המחזור בכל רצף עוקב עד שמגיעים ל- 50 מילישניות. כל פרק כולל 30 גירויים רצופים ברוחב פולס של 2 אלפיות השנייה. במקביל, התחל מיפוי אופטי לפני הגירוי (זמן הדגימה כולל ~ 10 מקצבי סינוס ומשך קצב).
- כדי למדוד את התקופה העקשנית האפקטיבית החדרית (ERP) באמצעות פרוטוקול גירוי S1S2, התחל עם אורך מחזור קצב S1S1 של 100 אלפיות השנייה עם S2 מצומד ב 60 ms עם ירידה של 2 ms צעד עד S2 נכשל ללכוד קומפלקס QRS חוץ רחמי.
- עבור השראת הפרעות קצב, בצע קצב פרץ תמידי של 50 הרץ (50 גירויים חשמליים רציפים עם רוחב פולס של 2 אלפיות השנייה), ובצע את אותו פרק קצב לאחר מרווח של 2 שניות של מנוחה.
- התבונן היטב ברישומי אק"ג במהלך תקופת הקצב הרציפה בתדר גבוה, כך שהקלטות המיפוי האופטי בו זמנית יוכלו להתחיל מיד כאשר גל א.ק.ג. מעניין יוצר (מכיוון שרוב הפרעות קצב הלב נגרמות על ידי קצב חשמלי, האותות האופטיים נדגמים 2-3 שניות לפני קצב פרץ במקרה של אובדן אירועים לבביים חשובים).
- תמונה באמצעות מצלמת EMCCD (קצב דגימה: 500 הרץ, גודל פיקסל: 64 x 64).
- ניתוח נתונים
- טעינת תמונות ועיבוד אותות
- לחץ על Select Folder and Load Images כדי לטעון את התמונות לתוכנת רכישת התמונות לניתוח נתוני וידאו מסיבי באופן אוטומטי למחצה בהתאם להגדרה ולפרוטוקול שתוארו קודם לכן15,16.
- הזינו את פרמטרי הדגימה הנכונים (כגון 'גודל פיקסל ' ו'קצב מסגרות').
- הגדר את סף התמונה באמצעות הזנה ידנית ובחר את אזור העניין (ROI).
- הטמע מסנן מרחבי גאוסיאני, מסנן Savitzky-Goaly ותיקון קו בסיס עליון.
- לחץ על תמונות פרוצס כדי להסיר את קו הבסיס ולחשב את הפרמטרים האלקטרופיזיולוגיים, כגון APD80 ו- CaTD50.
- ניתוח פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים
- הגדר את זמן האתחול של APD בשיא ואת נקודת הקצה ברפולריזציה של 80% (APD80) לצורך חישוב APD80. באופן דומה, זמן תחילת CaTD מוגדר כשיאו, ונקודת הטרמינל מוגדרת כ-80% הרפיה.
- מדידת מהירות ההולכה (CV) תלויה בגודל הפיקסלים ובזמן ההולכה הפוטנציאלי של הפעולה בין שני פיקסלים או יותר. חשב את המהירות הממוצעת מכל הפיקסלים שנבחרו - זוהי מהירות ההולכה הממוצעת של האזור שנבחר. צור מפות איזוכרוניות מתאימות בו זמנית לקבלת תצוגה ברורה של כיוון ההולכה.
הערה: O'Shea et al.15 דיווחו בפירוט על מדידת קורות החיים. - עבור ניתוח אלטרננים והפרעות קצב, אלטרננים של סידן מוגדרים כמשרעת שיא רציפה גדולה וקטנה המופיעה לחילופין. השתמש ביחס משרעת השיא כדי להעריך את חומרת האלטרננים תלויי התדר (1-A2/A1). החל מפות פאזה כדי לנתח הפרעות קצב מורכבות כמו טכיקרדיה חדרית (VT). חפש את הרוטורים המופיעים באופן מובהק באזור מסוים כאשר הרוטורים זזים.
- טעינת תמונות ועיבוד אותות
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיפוי אופטי הוא גישה פופולרית בחקר הפרעות קצב לב מורכבות בעשור האחרון. מערך המיפוי האופטי מורכב ממצלמת EMCCD, המעניקה קצב דגימה של עד 1,000 הרץ ורזולוציה מרחבית של 74 x 74 מיקרומטר לכל פיקסל. הוא מאפשר יחס אות-רעש גבוה למדי במהלך דגימת אות (איור 1). ברגע שהלב המחורר בלנגנדורף מגיע למצב יציב וטעינת הצבע מסתיימת, הלב ממוקם בחדר ההומואותרמי תחת הארה של שתי נוריות LED של 530 ננומטר, המשמשות לעירור מחוון המתח RH237 ומחוון Ca2+ Rhod-2 AM. אור הפליטה מחולק לשני אורכי גל של 600 ננומטר (עבור Ca2+) ו-670 ננומטר (עבור Vm), אשר מזוהים בו זמנית באמצעות מצלמת EMCCD. לאחר זילוח של אברטין והפרין במשך 15 דקות, השתמשו בכלי הניתוח (איור 2A) כדי לפתוח את בית החזה ולחלץ במהירות את הלב, ואז העבירו אותו לתמיסת קרבס הקרה (4°C, 95% O 2, 5% CO2) (איור 2B). נקו את הרקמות שמסביב בזהירות, תקנו את אבי העורקים בתפר 4-0, וצינור פלסטיק בקוטר 0.7 מ"מ מוכנס לחדר השמאלי (איור 2C) כדי לשחרר את הגודש של הפרפוזט בחדר החדר השמאלי. הכניסו את מוליכי האק"ג לתוך הפרבוסט (איור 2D) וודאו שהלב פועם בקצב בהתאם לניטור אק"ג המונע על-ידי תוכנת רישום האק"ג. לאחר מכן, בצעו העמסת צבע כפול בחושך (איור 2E).
לאחר שממצאי ההתכווצות צומצמו על-ידי בלביסטטין (10 מיקרומטר) והושלם עומס צבע הולם, הצילומים החלו במשך כ-10 פעימות סינוס לפני פרוטוקול הקצב של S1S1 כדי להעריך תכונות השבת פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים תלויי תדר ואלטרנני סידן לאחר אתגר איזופרוטרנול (1 מיקרומטר ISO) (איור 3A). איור 3B מציג חזית גל אק"ג מייצגת של VT ופוטנציאל פעולה מקביל (AP) ועקבות CaT המושרים על-ידי רצף קצב פרץ של 50 הרץ בעכבר CPVT. תוכנת הדמיית אותות אופטיים משמשת להשלמת ניתוח חצי אוטומטי של נתוני וידאו מסיביים.
איור 4A,B מציג עקבות טיפוסיים ומפות חום של APD80 ו-CaTD80, בהתאמה. ISO מקצר APD80 בעכברי WT ו-CPVT, אך לא נמצא הבדל בין עכברי WT ו-CPVT לפני ואחרי אתגר ISO (איור 4C, **P < 0.01. n = 5/6). איור 4D מצביע על כך ש-CaTD80 בעכברי CPVT ארוך יותר מאשר ב-WT לאחר אתגר ISO, בעוד שלא הייתה משמעות לפני טיפול ISO (**P < 0.01. n =6).
למדידת הולכה, איור 5A מציג אלגוריתם וקטורי יחיד לכימות CV. על פי אותות המתח, ללבבות WT ו-CPVT יש את אותה יכולת הולכה על פני האפיקרדיום בתחילת המחקר ולאחר התערבות ISO (איור 5B). איור 5C,D מציג את מפות ההפעלה המייצגות של מתח וסידן בלבבות WT ו-CPVT לפני ואחרי אתגר ISO.
סידן alternans הוא פרמטר קריטי עבור הפרעות קצב. אלטרננים של משרעת סידן מחושבים לפי הנוסחה כפי שמוצג באיור 6A. אותות הסידן בלבבות WT נשארים יציבים בקו הבסיס במהלך קצב S1S1 רצוף של 14.29 ו-16.67 הרץ (איור 6B), בעוד שלבבות CPVT מראים אלטרננים תלויי תדר (איור 6C). לאחר אתגר ISO, לבבות CPVT מציגים אלטרננים תלויי תדר באות הסידן במהלך קצב S1S1, בעוד שלבבות WT אינם מושפעים (איור 6D,E). לאחר קצב S1S1 רציף, מבוצע פרוטוקול קצב פרץ כדי לגרום להפרעות קצב קטלניות. לבבות WT ו-CPVT מפגינים הולכה נורמלית במהלך קצב פרץ של 50 הרץ בנקודת ההתחלה (איור 7A). לאחר זילוח עם ISO, לבבות CPVT מראים רוטורים בתדר גבוה לאחר קצב פרץ של 50 הרץ, בעוד שלבבות WT שומרים על הולכה רגילה (איור 7B).
איור 1: מנגנון מיפוי אופטי. המערכת כוללת מצלמת EMCCD מותאמת אישית ברזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה (קצב דגימה של עד 1,000 הרץ, פיקסל דגימה מינימלי 74X74 מיקרומטר). בקר גירוי חשמלי משמש לדגימה ופרוטוקול גירוי חשמלי פלט. שתי נורות LED ירוקות משמשות לאור העירור של בדיקות פלואורסצנטיות. מראה דיכרואית בעלת מעבר ארוך (610 ננומטר) ופולטים מתאימים מפצלים את נורות פליטת המתח והסידן הפלואורסצנטי. ל-RH237, הצבע הרגיש למתח, יש אור פליטה באורך גל שיא של 670 ננומטר, ואילו ל-Rhod-2 AM, הצבע הרגיש לסידן, יש אור פליטה באורך גל שיא של 600 ננומטר. שינויים קלים בשני אותות הפלואורסצנטיות יכולים להיקלט על ידי המצלמה בו זמנית בגלל קצב הדגימה הגבוה והרגישות של חיישן המצלמה. קיצורים: EMCCD = התקן מצמיד מטען מכפיל אלקטרונים; LED = דיודה פולטת אור; א.ק.ג. = אלקטרוקרדיוגרמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכנה והעמסה של צבע כפול . (A) כלי הניתוח. (B) קציר לב העכבר. (C) חתכו את הרקמה המיותרת בזהירות כדי לראות בבירור את אבי העורקים והכניסו צינור פלסטיק בקוטר 0.7 מ"מ מאבי העורקים לחדר השמאלי. (D) הלב מוסר במהירות למערכת הזלוף לנגנדורף. (E) העמסת צבע כפול והפסקת עירור-כיווץ בחושך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פרוטוקול S1S1 ופרוטוקול השראת הפרעות קצב. (A) חזית גל מייצג של אק"ג ועקבות AP ואותות סידן תואמים באמצעות פרוטוקול קצב S1S1 לאחר אתגר ISO. (B) אינדוקציה VT על ידי רצף קצב פרץ של 50 הרץ לאחר זילוח של ISO בעכבר CPVT. קיצורים: א.ק.ג. = אלקטרוקרדיוגרמה; AP = פוטנציאל פעולה; ISO = isoproterenol; VT = טכיקרדיה חדרית; CPVT = טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח APD80 ו-CaTD80 ב-10 הרץ לפני ואחרי אתגר ISO. (A) עקבות AP מייצגים ומפות חום APD80 של לבבות WT ו-CPVT לפני ואחרי טיפול ISO. (B) עקבות CaT טיפוסיים ומפות חום CaTD80 של לבבות WT ו-CPVT לפני ואחרי אתגר ISO. (C) ISO מקצר APD80 בעכברי WT ו-CPVT, אך לא נמצא הבדל בין עכברי WT ו-CPVT לפני ואחרי אתגר ISO. (D) CaTD80 בעכברי CPVT ארוכים יותר מאשר ב-WT לאחר אתגר ISO, בעוד שלא הייתה משמעות לפני טיפול ISO. (* P < 0.05, **P < 0.01. n = 5/6.) קיצורים: AP = פוטנציאל פעולה; APD80 = שיא של 80% רה-פולריזציה; ISO = isoproterenol; CPVT = טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית; WT = סוג פראי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח מהירות הולכה ב-10 הרץ. (A) האלגוריתם הווקטורי היחיד של מהירות ההולכה. (B) אין הבדל בקורות החיים של AP בעכברי WT ו-CPVT. (C) מפות חום מייצגות מראות שלעכברי CPVT יש יכולת הולכה זהה לזו של עכברי WT לפני ואחרי אתגר ISO בהתאם לאותות מתח. (D) לא נמצא הבדל משמעותי בין שתי הקבוצות עבור איזוכרונים CaT80 הנגרמים על ידי פוטנציאל פעולה לפני ואחרי אתגר ISO. קיצורים: AP = פוטנציאל פעולה; ISO = isoproterenol; CPVT = טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית; WT = סוג פראי; AT = זמן הפעלה; CV = מהירות הולכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניתוח אלטרננים של משרעת סידן. (A) האלגוריתם של חישוב אלטרנים של משרעת סידן. (B) אותות הסידן בלבבות WT נשארים יציבים בקו הבסיס במהלך קצב S1S1 רצוף של 14.29 ו-16.67 הרץ, בעוד שלבבות CPVT (C) מראים אלטרננים תלויי תדר. (D) לבבות WT אינם מושפעים מאתגר ISO, בעוד (E) לאחר אתגר ISO, לבבות CPVT מציגים אלטרננים תלויי תדר באות הסידן במהלך קצב S1S1. קיצורים: ISO = isoproterenol; CPVT = טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית; WT = סוג פראי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ניתוח טכיאריתמיה באמצעות מפות פאזה . (A) לבבות WT ו-CPVT מפגינים הולכה תקינה במהלך קצב פרץ של 50 הרץ בנקודת ההתחלה. (B) לאחר זילוח עם ISO, לבבות CPVT מראים רוטורים בתדר גבוה לאחר קצב פרץ של 50 הרץ, בעוד שלבבות WT שומרים על הולכה רגילה. קיצורים: ISO = isoproterenol; CPVT = טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית; WT = סוג פראי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהתבסס על הניסיון שלנו, המפתחות למיפוי אופטי מוצלח של לב עכבר בצבע כפול כוללים פתרון מוכן היטב ולב, טעינת צבע, השגת יחס אות לרעש הטוב ביותר והפחתת חפץ התנועה.
הכנת פתרון
פתרון קרבס חיוני לניסוי לב מוצלח. תמיסות מלאי MgCl 2 ו- CaCl2 (1 mol/L) מוכנות מראש בהתחשב בספיגת המים שלהן ומתווספות לתמיסת קרבס לאחר שכל שאר הרכיבים מומסים במים טהורים מכיוון ש- Mg 2+ ו- Ca 2+ יכולים לזרז בקלות עם CO3 2+. תמיסת קרבס מבעבעת עם 95% O 2/5% CO2 למשך 30 דקות לפחות כדי להבטיח חמצון. מכיוון שלב העכבר רגיש במיוחד ל- pH, pH התמיסה צריך להיות סביב 7.4 לאחר חמצון. גם אם חלקיקים זעירים נמצאים בתמיסה, תוצאות הניסוי עשויות להיות מושפעות מכיוון שחלקיקים אלה עשויים לחסום את הנימים ולהשפיע על אפקט הזילוח. לפיכך, הפתרון מסונן באמצעות מסנן מחט אספטית 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
הכנת הלב
לפני קצירת הלבבות, העכברים עוברים תחילה הפריניזציה כדי למנוע היווצרות קריש דם במערכת העורקים הכליליים, ומונעים זילוח צבע לקוי הנגרם על ידי גודש לב להשפיע על ההדמיה הבאה. ככל שהזמן האיסכמי של הלב קצר יותר, כך מצב הלב טוב יותר. לכן, הזמן האיסכמי נשלט תוך 2-3 דקות מרגע קצירת הלבבות לקנולציה דרך אבי העורקים במערכת לנגנדורף. בנוסף, לחץ זילוח מתוחזק היטב הוא גם חיוני. לפיכך, צינור סיליקון (פלסטיק) דק מוכנס לחלל החדר השמאלי כדי למנוע לחץ גבוה מדי בחדר השמאלי במהלך התכווצות החדר לאחר קשירת מוצא החדר השמאלי, מה שעלול לגרום לזילוח לקוי של שריר הלב ולהחמצת רקמות אנוקסיות.
טעינת צבע
ניסויים אלה מבצעים העמסת צבע על ידי ניקוב הלב במערכת לנגנדורף. חיוני לעקוב אחר קצב הלב מכיוון שהעמסת צבע לקויה תתרחש כאשר הקצב החריג נגרם על ידי פעולות כירורגיות או נזק לאיסכמיה-רפרפוזיה. הלב חייב להיות בריא מספיק כדי לבצע את השלבים הבאים. Rhod-2 AM, צבע רגיש ל-Ca2+, הוא נגזרת של אצטיל מתיל אסטר של Rhod 2, אשר נטען בקלות לתאים בצורתו AM. עלייה של פי 100 בעוצמת הפלואורסצנטיות של המולקולה נובעת מקלציה Ca2+ 17. פלורוני F127 משולב בתמיסת ההעמסה Rhod-2 AM כדי למנוע מ-Rhod-2 AM להתפלמר במאגר ולסייע לו להיכנס לתאים. F127 פלורוני יכול להפחית את היציבות של Rhod-2 AM, ולכן מומלץ להוסיף אותו רק בעת הכנת פתרון העבודה אך לא בפתרון האחסון לאחסון לטווח ארוך. הצבע הרגיש למתח RH237 משמש במחקר זה בשל תכונותיו הספקטרליות החיוביות לשימוש עם מחוון Ca2+ Rhod-2 AM.
השגת יחס אות לרעש הטוב ביותר
השגת תמונות עם יחסי אות לרעש גבוהים היא המטרה של ההדמיה, אבל רעש הוא כמו רוח רפאים אפלה שתמיד גורמת לצרות. בשל אותות חלשים, רעש נמוך חשוב במיוחד בכמה יישומי הדמיה מיקרוסקופית במהירות גבוהה, כגון מיפוי אופטי. יחס אות לרעש (SNR) מחושב כיחס המשרעת הריבועית הממוצעת של השורש לרעש הריבועי הממוצע של השורש, כאשר משרעת הרעש מוערכת בפוטנציאל מנוחה18. גורמים מסוימים, כגון מקור אור, מסננים אופטיים, אופטיקה ממוקדת וגלאי אור, חיוניים להשגת ה- SNR הטוב ביותר. במחקר, אזור הרקע של המדגם נבדק עבור רעש, אשר לעתים קרובות משתנה ברמה זעירה. האות האופטי המזוהה על ידי כל פיקסל הוא ממוצע האור הנפלט משטח הפנים שלו. פעילויות AP וסידן מתנודדות במהלך הפרעות קצב, ומשרעת שני האותות נמוכה יחסית. אפילו הפרעות קלות עלולות להוביל לעיוות של אותות אופטיים ולגרום לטעויות בניתוח הנתונים. לכן, הפרשנות של אותות אופטיים צריכה להיות זהירה כאשר ההטרוגניות המקומית נגרמת על ידי תפקוד חשמלי במהלך הפרעות קצב כמו VT.
הפחת את חפץ התנועה
בהשוואה לרישום אלקטרודות, אותות אופטיים מושפעים לעתים קרובות מפעילות ההתכווצות של הלבבות המחוררים של לנגנדורף בגלל חפץ תנועה. כדי ללכוד אותות אופטיים מדויקים, מעכבים פרמקולוגיים של עירור-התכווצות משמשים בעיקר. כדי למזער את התנועה במהלך ההדמיה, blebbistatin מאומץ כדי לעצור את הלב מלפעום. זהו מעכב סלקטיבי של פעילות ATPase של מיוזין שאינו שריר II ולמעשה מנטרל את תהליך העירור-כיווץ של הלב 19,20,21. למרות שמחקרים מסוימים מרמזים על כמה תופעות לוואי באמצעות התרכובת22, אנו משתמשים בריכוז העבודה הנמוך ביותר של 10 מיקרומטר כדי למזער את הנזק האפשרי ללב.
תוכנת ElectroMap לניתוח מערכי נתונים של מיפוי אופטי לבבי
ElectroMap היא תוכנת קוד פתוח בעלת תפוקה גבוהה לניתוח מערכי נתונים של מיפוי אופטי לב. הוא מספק ניתוח של פרמטרים עיקריים של אלקטרופיזיולוגיה לבבית, כולל מורפולוגיה AP ו- CaT, CV, מרווח דיאסטולי, תדירות דומיננטית, זמן לשיא וקבוע הרפיה (τ) 15,23. התוכנה מאפשרת אפשרויות סינון מרובות, כולל מסנן גאוס, מסנן Savitzky-Goaly ותיקון קו בסיס Top-hat. מסנן גאוס הוא החלקה דו-ממדית על ידי חישוב ההחלקה הממוצעת המשוקללת של כל ערוץ וערוצים סמוכים. הוא משמש בדרך כלל לרעש תקלות ספייק. מסנן סביצקי-גולי מתאים לתת-קבוצה פולינומית נמוכה יותר ולתת-קבוצה רציפה של מערכי נתונים סמוכים בשיטה הכי פחות ריבועית, העונה על הצורך בסינון חלק שונים ויעילה גם לעיבוד מערכי נתונים לא מחזוריים ולא ליניאריים הנגזרים מרעש. תיקון קו בסיס עליון יכול להתאים את האותות האופטיים לאותו גובה בהתאם לשיאי העקבות, ולחשב פרמטרים כגון משך פוטנציאל פעולה (APD) ומשך מעבר סידן (CaTD) בצורה מדויקת הרבה יותר. סטייה מקו הבסיס מתרחשת מדי פעם בעת דגימת מתח ואותות פלואורסצנטיים של סידן. זה גם שימושי בעת חישוב סידן alternans ומשרעת. שני החדרים נבחרו לחקירה אלקטרופיזיולוגית.
יתרונות וחסרונות של מיפוי צבע כפול ושיטות להגבלת הפרעות
בשנים האחרונות הובן כי חיוני להבהיר דה-פולריזציה או רפולריזציה של תאים והטרוגניות הולכה בין-תאית בלב כולו, כמו גם צימוד של שעון הממברנה ושעון הסידן, שהוא קריטי להבנת המנגנון של מחלות כגון הפרעות קצב24,25. למיפוי אופטי יש רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה כדי לקבוע את תכונות ההפעלה והרפולריזציה של הלב של עכברים טרנסגניים 26,27,28,29. הוא יכול גם לזהות הדמיה מרובת פרמטרים, למשל, מדידת פוטנציאל הממברנה וסידן תוך תאי של אותו לב24,30 או רקמה31,32 עמוסה במתח וצבע רגיש לסידן. הדמיה של צבע כפול מועילה לחקר הקשר בין פוטנציאל פעולה לסידן, כגון הקשר בין שעון הממברנה (M) לבין שעון Ca2+ (C) או שחרור סידן ספונטני ועיכוב לאחר דפולריזציה (DAD). עירור לב רגיל דורש את האירועים המחזוריים בשני השעונים להיות מיושרים. הפרעה ביישור זה מובילה להפרעות קצב25. הקשר בין שחרור סידן ספונטני לבין DAD הוא המנגנון של הפעלת פעילויות באי ספיקת לב 33. עם זאת, שילוב של צבעים צריך להיות נבחר בקפידה. השילוב של RH-237/Rhod-2 או di-4-ANEPPS/Indo-1 מאפשר הקלטה סימולטנית, בעוד Fluo-3/4/di-4-ANEPPS יוביל לשגיאות עקב ספקטרום פליטה חופף של שני צבעים30,34,35. ניסוי זה בחר RH237 ו- Rhod-2 AM כדי לטעון את הלב ורכש איכות הדמיה טובה.
בנוסף, למצלמה המשמשת בפרוטוקול זה יש שני משטחי מטרה, המאפשרים לה ללכוד את האותות המפוצלים בממשק דגימה אחד ומאפשרים למצלמה אחת לזהות שני אורכי גל פליטה שונים. מיפוי סימולטני כזה של AP אופטי ו-CaT המשלב פרוטוקולים שונים של ספקטרוסקופיית פוטואלקטרונים (PES) יאפשר לנו לקבוע את יחסי הגומלין בין [Ca2+] חריג לבין חוסר יציבות חשמלית בתנאי לחץ ואת ההשפעה של הגברה לאחר ההפעלה על אנומליות אלה. האופי ההטרוגני מבחינה מרחבית של מחזור SR Ca2+ וכיצד זה משפיע על הופעתם, חומרתם וקונקורדנציה של אלטרננים חשמליים והתנהגות אריתמוגנית, כגון אלטרננים צורמים מרחבית ו- VTs כתוצאה מכך, ייחקרו בלב השלם בקבוצות שונות. SR Ca2 + alternans, Refractoriness RyR2 ותפקידם ב- SR Ca2+ ו- APD alternans ייחקרו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לאף אחד מהכותבים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81700308 ל- XO ו- 31871181 ל- ML, ו- 82270334 ל- XT), תוכנית התמיכה במדע וטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (CN) (2021YJ0206 ל- XO, 23ZYZYTS0433 ו- 2022YFS0607 ל- XT, ו- 2022NSFSC1602 ל- TC) ומעבדת מפתח המדינה לכימיה והנדסה מולקולרית של משאבים רפואיים (אוניברסיטת גואנגשי הרגילה) (CMEMR2017-B08 ל- XO), MRC (G10031871181 עד ML02647, G1002082, מ"ל), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE באוקספורד (ML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
References
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
- Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
- Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
- Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
- Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
- Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al.
- Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
- Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
- Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
- Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
- Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
- O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
- Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
- Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
- Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
- Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
- Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
- Mal Baudot,, et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
- Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
- Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
- Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
- Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
- He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
- Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).
