Summary
Bu protokol, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip transmembran voltajının ve hücre içi Ca2+ geçici akımlarının elektrofizyolojik ölçümleri de dahil olmak üzere, katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardiden etkilenen vahşi tip ve knock-in hayvanlardan elde edilen fare kalplerinin çift boyutlu optik haritalamasını sunar.
Abstract
Proaritmik kardiyak bozukluk katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi (CPVT), fiziksel aktivite, stres veya katekolamin zorluğunu takiben polimorfik ventriküler taşikardi atakları olarak ortaya çıkar ve potansiyel olarak ölümcül ventriküler fibrilasyona dönüşebilir. Fare kalbi, CPVT dahil kalıtsal kardiyak aritmik hastalıkları modellemek için yaygın bir türdür. Langendorff perfüze fare kalplerinden transmembran potansiyelinin (Vm) ve kalsiyum geçişlerinin (CaT) eşzamanlı optik haritalanması, aritmogenezin altında yatan mekanizmaları aydınlatma potansiyeline sahiptir. Hücresel seviye araştırması ile karşılaştırıldığında, optik haritalama tekniği, aktivasyonun belirlenmesi, iletim hızı, aksiyon potansiyeli süresi ve CaT süresi gibi bazı elektrofizyolojik parametreleri test edebilir. Bu makale, izoproterenol mücadelesi öncesinde ve sırasında programlanmış elektrik pacing ile birlikte murin vahşi tip ve heterozigot RyR2-R2474S/+ kalplerinde CaT ve V m'nin yüksek verimli optik haritalaması için enstrümantasyon kurulumunu ve deneysel prosedürü sunmaktadır. Bu yaklaşım, bir ex vivo fare kalp preparatında CPVT hastalığını mekanik olarak incelemek için uygulanabilir ve güvenilir bir yöntem göstermiştir.
Introduction
Kalıtsal kardiyak bozukluk katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi (CPVT), fiziksel aktivite, stres veya katekolamin zorluğunu takiben polimorfik ventriküler taşikardi (PVT) atakları olarak kendini gösterirve potansiyel olarak ölümcül ventriküler fibrilasyona dönüşebilir 1,2,3,4 . 1995 yılında klinik bir sendrom olarak ilk raporunu takip eden son kanıtlar, tümü bu durumda sarkoplazmik retiküler (SR) deposu Ca 2+ salınımında yer alan yedi gende mutasyonları içermiştir: en sık bildirilen RYR2 kodlayan ryR2 kodlayan Ca2+ salım kanalları5,6, FKBP12.67, kardiyak kalsekestrin8, TRDN'yi kodlayan CASQ2 kavşaksal SR proteini triadin 9 ve CALM1 9, CALM2 10 ve CALM3'ü aynı şekilde kodlayan kalmodulin11,12'yi kodlar. Bu genotipik paternler, aritmik olayları SR deposu Ca2 + 12'nin düzensiz patolojik salınımına bağlar.
SR'den spontan Ca 2+ salınımı, Na + / Ca2 + değiştiriciyi (NCX) aktive eden Ca 2+ kıvılcımları veya Ca2+ dalgaları olarak tespit edilebilir. Üç Na + için birCa2+ değiştirici, diyastolik depolarizasyonu hızlandıran ve membran voltajını aksiyon potansiyeli eşiğine (AP) yönlendiren bir içe doğru akım üretir. RyR2 knock-in farelerde, RyR2R4496C'nin sinoatriyal düğümdeki (SAN) artan aktivitesi, diyastol sırasında I Ca, L ve SR Ca2+ tükenmesinin Ca2 + 'ya bağlı azalmasıyla SAN otomatikliğinde beklenmedik bir azalmaya yol açar ve CPVT hastalarında SAN disfonksiyonuna katkıda bulunan hücre altı patofizyolojik değişiklikleri tanımlar13,14. İlgili kardiyomiyosit sitozolik Ca2+ dalgalarının ortaya çıkması, izoproterenol (ISO) dahil olmak üzere katekolamin ile RyR duyarlılığını takiben arka plan sitozolik [Ca2+] artışları takiben daha olasıdır.
Sağlam kardiyak CPVT modellerinde gözlenen ventriküler aritmilerin nedeni olabilecek aksiyon potansiyeli (AP) aktivasyonuna yanıt olarak RyR2 aracılı Ca2+ salınımını takiben Ca2+ sinyalindeki ayrıntılı kinetik değişiklikler, bildirilen RyR2 genotiplerinin tamamı için belirlenmeye devam etmektedir12. Bu makale, izoproterenol mücadelesinden önce ve sonra programlanmış elektrik pacing ile birlikte, murin vahşi tip (WT) ve heterozigot RyR2-R2474S/+ kalplerinde Ca2+ sinyallerinin ve transmembran potansiyellerinin (V m) yüksek verimli haritalanması için enstrümantasyon kurulumunu ve deneysel prosedürü sunmaktadır. Bu protokol, izole fare kalplerinde CPVT hastalığının mekanik çalışması için bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneyler için 10-14 haftalık erkek vahşi tip fareler veya 20-25 g ağırlığındaki RyR2-R2474S/+ fareler (C57BL/6 arka plan) kullanılmıştır. Tüm prosedürler, Southwest Medical University, Sichuan, Çin'in hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (onay NO:20160930) tarafından, kurumun faaliyet gösterdiği ulusal yönergelere uygun olarak onaylanmıştır.
1. Hazırlık
- Stok çözümleri
- Blebbistatin stok çözeltisi: 10 mM'lik bir konsantrasyona ulaşmak için 2.924 mg (-) blebbistatin tozu içeren orijinal şişeye 1 mL %100 dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin.
- Voltaj göstergesi RH237 stok çözeltisi: 2,01 mM'lik bir konsantrasyon elde etmek için orijinal şişeye 1 mg RH237 tozu ile 1 mL %100 DMSO ekleyin.
- Kalsiyum indikatörü Rhod-2 stok çözeltisi: 0.89 mM'lik bir konsantrasyona ulaşmak için 1 mg Rhod-2 tozuna 1 mL %100 DMSO ekleyin.
- Pluronic F127 stok çözeltisi: %20 w/v (0.66 mM) konsantrasyona ulaşmak için 200 mg Pluronic F127'ye 1 mL %100 DMSO ekleyin.
- Tekrarlanan donma ve çözülmeyi önlemek için stok çözeltilerini 21-51 μL'de (21 μL RH237, 31 μL Rhod-2 ve 51 μL blebbistatin) 200 μL'lik PCR tüplerine ayırın. Daha sonra solüsyonları alüminyum folyo ile sarın ve ortam sıcaklığında karanlık bir odaya konulan Pluronic F127 stok solüsyonu hariç -20 °C'de saklayın.
- Perfüzyon çözeltisi
- Krebs çözeltisi (mM cinsinden): 1 L Krebs çözeltisi hazırlayın (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1.0, KCl4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35 ve glikoz 10).
- Çözeltiyi 0.22 μm aseptik iğneli filtre ile filtreleyin ve %95 O2/5CO2 ile oksijenlendirin.
- 40 mL Krebs çözeltisini 50 mL'lik bir santrifüj tüpe alın ve takip eden kalp izolasyonu için 4 ° C'de saklayın.
- Langendorff perfüzyon sistemi ve optik haritalama cihazı
- Langendorff perfüzyon sistemini kurun.
- Su banyosunu açın ve sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın.
- Langendorff perfüzyon sistemini 1 L deiyonize su ile yıkayın.
- Çözeltiyi giriş kanalından perfüze edin ve çıkış hızını 3.5-4 mL/dk'ya ayarlayın. Daha sonra perfüzatı 37 °C'de O2 / CO2 (% 95 /% 5) gazı ile oksijenlendirin.
NOT: Perfüzyon sisteminde kabarcık oluşmasına asla izin verilmez.
- Optik haritalama sistemini hazırlayın.
- Elektron çarpan şarj bağlantılı cihaz (EMCCD) kamerayı (512 × 512 piksel), lensi (40x büyütme), dalga boyu ayırıcı ışık yayan diyotları (LED'ler), elektrokardiyogram (EKG) monitörünü ve stimülasyon elektrodunu kurun (Şekil 1).
- Lens ile kalp pozisyonu arasındaki uygun çalışma mesafesini ayarlayın.
- Uyarma ışığı üretmek için 530 nm'lik bir dalga boyu sağlayan, eşit aydınlatma için termostatik banyonun diyagonal konumuna iki LED yerleştirin. LED'ler için bant dışı ışığı ortadan kaldırmak için bir ET525/50 püskürtme kaplı filtre kullanın.
- Hedef yüzeyin eşit bir karesini elde etmek için tutamak anahtarını ayarlayın, voltaj ve kalsiyum görüntülerinin alıcı arayüzde yeterince görünmesini sağlayın.
- Voltaj veya kalsiyum sinyallerinin sızmasını önlemek için lensin açıklığını maksimum çapa çevirin.
- Kamera merceğini, termostatik banyoya ince bir çalışma mesafesi sağladığı için uygun bir yüksekliğe ayarlayın, çoğunlukla 10 cm kullanılır.
- -50 °C'de sabit örnekleme sıcaklığı için kamerayı açın.
- Langendorff perfüzyon sistemini kurun.
2. Prosedürler
- Fare kalbi hasadı, kanülasyon ve perfüzyon
- Acı ve ağrı refleksini en aza indirmek ve kan pıhtısı oluşumunu önlemek için hayvanlara intraperitoneal olarak avertin solüsyonu (%1.2, 0.5-0.8 mL) ve heparin (200 ünite) enjekte edilir. 15 dakika sonra hayvanları servikal çıkık ile kurban edin.
- Göğsü makasla açın, kalbi dikkatlice toplayın ve metabolizmayı yavaşlatmak ve kalbi korumak için soğuk Krebs çözeltisine (4 °C,% 95 O 2,% 5 CO2) yerleştirin.
- Aortun çevre dokusunu çıkarın, özel yapım bir kanül iğnesi (dış çap: 0,8 mm, iç çap: 0,6 mm, uzunluk: 27 mm) kullanarak aortu kanül edin ve 4-0 ipek sütür ile sabitleyin.
- Kalbi Langendorff sistemi ile 3,5-4,0 mL/dk sabit hızda perfüze edin ve sıcaklığı 37 ± 1 °C'de tutun.
NOT: Sonraki tüm prosedürler bu durumda gerçekleştirilir. - Aşırı ön yüklemeyi önlemek için haznedeki çözelti tıkanıklığını gidermek için sol ventriküle küçük bir plastik tüp (0,7 mm çapında, 20 mm uzunluğunda) yerleştirin.
- Uyarma-büzülme ve çift boya yükleme bağlayıcısı
- Banyodaki perfüzata iki uç koyun, EKG amplifikatör kutusunun ve elektrik stimülasyon kontrolörünün güçlerini açın ve ardından referans verilen EKG yazılımını başlatın ve EKG'yi sürekli izleyin.
- Kalp kararlı bir duruma ulaştığında (kalp ~ 400 bpm'de ritmik olarak atıyor) karanlıkta sonraki adımları gerçekleştirin.
- 10 μM'lik bir konsantrasyona ulaşmak için 50 μL 10 mM blebbistatin stok çözeltisini 50 mL Krebs çözeltisi ile karıştırın. Blebbistatin-Krebs solüsyon karışımını, eksitasyondan kasılmayı ayırmak ve çekim sırasında kasılma artefaktlarını önlemek için 10 dakika boyunca kalbe sürekli olarak perfüze edin.
- Kalp kasılmasının tamamen durup durmadığını kontrol etmek için kırmızı bir el feneri kullanın, çünkü kasılma boya yükleme kalitesini etkileyecektir.
- Uyarma-büzülmeyi ayırdıktan sonra, 0.267 μM Rhod-2 ve 0.198 μM Pluronic F127'nin nihai konsantrasyonlarını elde etmek için 15 μL Rhod-2 stok çözeltisini 15 μL Pluronic F127 stok çözeltisi ile 50 mL Krebs çözeltisinde karıştırın. Ardından, Langendorff perfüzyon sisteminde 15 dakika boyunca Rhod-2 çalışma solüsyonu ile kalbi sürekli olarak perfüze edin.
- Hücre içi kalsiyum boya yüklemesi sırasında oksijen kaynağını koruyun. Pluronic F127'de kabarcıklar kolayca oluştuğundan, koronerlerin gaz embolizasyonunu önlemek için perfüzyon sistemine bir kabarcık tutucu yerleştirin.
- 0.402 μM'de nihai konsantrasyona ulaşmak için 10 μL RH237 stok çözeltisini 50 mL perfüzat içine seyreltin ve 10 dakika boyunca yükleme yapın.
- Çift boya yüklemesinin sonunda, hem voltaj hem de kalsiyum sinyallerinin analiz için yeterli olduğundan emin olmak için bir dizi fotoğraf çekin (iki sinyal arasında etkileşim yok).
- Optik haritalama ve aritmi indüksiyonu
NOT: Optik haritalama, kasılma kesildikten ve uygun bir boya yüklemesinden sonra başlar ve kalp, yukarıda 2.1 (4)'te açıklanan adımlarda olduğu gibi ardışık olarak perfüze edilir.- Uyarma ışıkları için iki LED'i açın ve yoğunluklarını uygun bir aralıkta ayarlayın (aydınlatma ve nispeten basit çekim için yeterince güçlü, ancak aşırı pozlama için çok sağlam değil).
- Kalbi algılama cihazının altına koyun, iki LED'in yeterli aydınlatması altında olduğundan emin olun ve ışık noktası çapını 2 cm'ye ayarlayın.
- Lensten kalbe olan çalışma mesafesini 10 cm'ye ayarlayarak yaklaşık 500 Hz'lik bir örnekleme hızı ve piksel başına 120 x 120 μm uzamsal çözünürlük elde edin.
- Voltaj ve kalsiyum sinyallerini aynı anda yakalamak için kamerayı dijital olarak kontrol etmek için sinyal örnekleme yazılımını açın.
- Miyopaker alan stimülatörünü başlatın ve Transistör Transistör Mantığında (TTL), her darbe için 2 ms pacing süresinde ve başlangıç yoğunluğu olarak 0.3 V'ta pacing modelini ayarlayın.
- EKG kayıt yazılımı tarafından yönlendirilen kalbin diyastolik voltaj eşiğini test etmek için 30 ardışık 10 Hz S1 uyaranı kullanın. 1:1 yakalama gerçekleşene kadar voltaj genliğini kademeli olarak artırın (EKG monitöründen QRS dalgasını, aksiyon potansiyelini (AP) ve kalsiyum geçişleri (CaT) sinyallerini kontrol edin).
- Voltaj eşiğini belirledikten sonra, sol ventrikül (LV) apeksin (ELVA) epikardiyaline bağlı bir çift platin elektrot ile kalbi diyastolik voltaj eşiğinin 2 katı yoğunlukta hızlandırın.
- Kalsiyum veya aksiyon potansiyeli alternanslarını ve restitüsyon özelliklerini ölçmek için S1S1 protokolünü uygulayın. Kalbi 100 ms'lik temel döngü uzunluğunda art arda hızlandırın, 50 ms'ye ulaşılana kadar her sekansta döngü uzunluğunu 10 ms azaltın. Her bölüm, 2 ms darbe genişliğine sahip 30 ardışık uyaran içerir. Aynı zamanda, stimülasyondan önce optik haritalamaya başlayın (örnekleme süresi ~ 10 sinüs ritmi ve pacing süresini içerir).
- S1S2 uyaran protokolünü kullanarak ventriküler etkili refrakter periyodunu (ERP) ölçmek için, S2 ektopik QRS kompleksini yakalayamayana kadar 2 ms'lik bir adım azaltma ile 60 ms'de birleştirilmiş bir S2 ile 100 ms'lik bir S1S1 pacing döngüsü uzunluğu ile başlayın.
- Aritmi indüksiyonu için, sürekli 50 Hz patlama pacing (50 ms darbe genişliğine sahip 2 sürekli elektrik stimülasyonu) gerçekleştirin ve 2 sn dinlenme aralığından sonra aynı pacing bölümünü gerçekleştirin.
- İlginç bir aritmik EKG dalgası oluştuğunda eşzamanlı optik haritalama kayıtlarının hemen başlayabilmesi için sürekli yüksek frekanslı pacing süresi boyunca EKG kayıtlarını dikkatlice gözlemleyin (çoğu kardiyak aritmi elektriksel pacing ile indüklendiğinden, optik sinyaller önemli kardiyak olayların kaybedilmesi durumunda patlama pacinginden 2-3 saniye önce örneklenir).
- EMCCD kamera kullanılarak görüntü (örnekleme hızı: 500 Hz, piksel boyutu: 64 x 64).
- Veri analizi
- Görüntü yükleme ve sinyal işleme
- Daha önce açıklanan kurulum ve protokole göre yarı otomatik olarak büyük video veri analizi için görüntüleri görüntü alma yazılımına yüklemek için Klasör Seç ve Görüntüleri Yükle'ye basın15,16.
- Doğru örnekleme parametrelerini ( Piksel Boyutu ve Kare Hızı gibi) girin.
- Manuel girişle görüntü eşiğini ayarlayın ve ilgilendiğiniz bölgeyi (ROI) seçin.
- 3 x 3 piksel Gauss uzamsal filtresi, Savitzky-Goaly filtresi ve silindir şapka taban çizgisi düzeltmesi uygulayın.
- Taban çizgisini kaldırmak ve APD80 ve CaTD50 gibi elektrofizyolojik parametreleri hesaplamak için İşlem Görüntüleri'ne basın.
- Elektrofizyolojik parametrelerin analizi
- APD80'in hesaplanması için APD'nin başlama zamanını tepe noktasında ve bitiş noktasını %80 repolarizasyonda (APD80) ayarlayın. Benzer şekilde, CaTD başlangıç zamanı tepe noktası olarak tanımlanır ve son nokta %80 gevşeme olarak tanımlanır.
- İletim hızının (CV) ölçümü, piksel boyutuna ve iki veya daha fazla piksel arasındaki aksiyon potansiyeli iletim süresine bağlıdır. Seçilen tüm piksellerden ortalama hızı hesaplayın - bu, seçilen bölgenin ortalama iletim hızıdır. İletim yönünün net bir görünümü için aynı anda ilgili eşzamanlı haritalar oluşturun.
NOT: O'Shea ve ark.15 CV ölçümünü ayrıntılı olarak bildirmiştir. - Alternanlar ve aritmi analizi için, kalsiyum alternans, alternatif olarak ortaya çıkan sürekli büyük ve küçük bir pik genliği olarak tanımlanır. Frekansa bağlı alternansların (1-A2/A1) şiddetini değerlendirmek için tepe genlik oranını kullanın. Ventriküler taşikardi (VT) gibi karmaşık aritmileri analiz etmek için faz haritaları uygulayın. Rotorlar yer değiştirirken rotorların belirli bir bölgede belirgin bir şekilde görünüp görünmediğine bakın.
- Görüntü yükleme ve sinyal işleme
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optik haritalama, son on yılda karmaşık kardiyak aritmilerin incelenmesinde popüler bir yaklaşım olmuştur. Optik haritalama kurulumu, 1.000 Hz'e kadar örnekleme hızı ve her piksel için 74 x 74 μm uzamsal çözünürlük sağlayan bir EMCCD kameradan oluşur. Sinyal örneklemesi sırasında oldukça yüksek bir sinyal-gürültü oranı sağlar (Şekil 1). Langendorff perfüze edilmiş kalp stabil bir duruma ulaştığında ve boya yüklemesi bittiğinde, kalp, RH237 ve Ca2+ göstergesi Rhod-2'nin uyarılması için kullanılan iki adet 530 nm LED'in aydınlatması altında homootermik odaya yerleştirilir. Emisyon ışığı, EMCCD kamera kullanılarak aynı anda algılanan 600 nm (Ca2+ için) ve 670 nm (Vm için) olmak üzere iki dalga boyuna bölünür. 15 dakika boyunca avertin ve heparin perfüzyonundan sonra, göğsü açmak ve kalbi hızlı bir şekilde çıkarmak için cerrahi aletleri (Şekil 2A) kullanın, ardından soğuk Krebs solüsyonuna (4 °C,% 95 O 2,% 5 CO2) aktarın (Şekil 2B). Çevre dokuları dikkatlice temizleyin, aortu 4-0 dikişle sabitleyin ve sol ventrikül odasındaki perfüzatın tıkanıklığını gidermek için sol ventriküle 0.7 mm'lik plastik bir tüp yerleştirilir (Şekil 2C). EKG uçlarını perfüzata yerleştirin (Şekil 2D) ve EKG kayıt yazılımı tarafından yönlendirilen EKG izlemeye göre kalbin ritmik olarak attığından emin olun. Ardından, karanlıkta çift boya yüklemesi yapın (Şekil 2E).
Blebbistatin (10 μM) ile kontraksiyon artefaktları en aza indirildikten ve yeterli boya yüklemesi tamamlandıktan sonra, izoproterenol (1 μM ISO) zorluğundan sonra frekansa bağlı elektrofizyolojik parametre restitüsyon özelliklerini ve kalsiyum alternanslarını değerlendirmek için S1S1 pacing protokolünden önce yaklaşık 10 sinüs atımı için filme başlandı (Şekil 3A). Şekil 3B , VT'nin temsili bir EKG dalga cephesini ve bir CPVT faresinde 50 Hz'lik bir patlama hızı dizisi tarafından indüklenen karşılık gelen aksiyon potansiyeli (AP) ve CaT izlerini sergiler. Optik sinyal görüntüleme yazılımı, büyük video verilerinin yarı otomatik analizini tamamlamak için kullanılır.
Şekil 4A,B, sırasıyla APD80 ve CaTD80'in tipik izlerini ve ısı haritalarını göstermektedir. ISO, WT ve CPVT farelerinde APD80'i kısaltır, ancak ISO zorluğundan önce ve sonra WT ve CPVT fareleri arasında bir fark bulunmamıştır (Şekil 4C, **P < 0.01. n = 5/6). Şekil 4D , CPVT farelerinde CaTD80'in ISO zorluğundan sonra WT'den daha uzun olduğunu, ISO tedavisinden önce ise anlamlı olmadığını göstermektedir (**P < 0.01. n =6.).
İletim ölçümü için Şekil 5A, CV'nin nicelleştirilmesi için tek bir vektör algoritması sunar. Voltaj sinyallerine göre, WT ve CPVT kalpleri, başlangıçta ve ISO müdahalesinden sonra epikard boyunca aynı iletim yeteneğine sahiptir (Şekil 5B). Şekil 5C, D, ISO zorluğundan önce ve sonra WT ve CPVT kalplerinde voltaj ve kalsiyumun temsili aktivasyon haritalarını göstermektedir.
Kalsiyum alternans, aritmi için kritik bir parametredir. Kalsiyum genlik alternansları, Şekil 6A'da gösterildiği gibi formülasyona göre hesaplanır. WT kalplerindeki kalsiyum sinyalleri, 14.29 ve 16.67 Hz'de ardışık S1S1 pacing sırasında başlangıçta sabit kalırken (Şekil 6B), CPVT kalpleri frekansa bağlı alternanslar gösterir (Şekil 6C). ISO zorluğundan sonra, CPVT kalpleri, S1S1 pacing sırasında kalsiyum sinyalinde frekansa bağlı alternanslar sergilerken, WT kalpleri etkilenmez (Şekil 6D, E). Sürekli S1S1 pacing'den sonra, ölümcül aritmileri indüklemek için bir burst pacing protokolü gerçekleştirilir. WT ve CPVT kalpleri, başlangıçta 50 Hz patlama hızı sırasında normal iletim sergiler (Şekil 7A). ISO ile perfüzyondan sonra, CPVT kalpleri 50 Hz patlama hızından sonra yüksek frekanslı rotorlar gösterirken, WT kalpleri normal iletimi korur (Şekil 7B).
Resim 1: Optik haritalama aparatı. Sistem, yüksek uzamsal-zamansal çözünürlüğe (1.000 Hz'e kadar örnekleme hızı, minimum örnekleme pikseli 74 x 74 μm) sahip özel olarak tasarlanmış bir EMCCD kamera içerir. Örnekleme ve çıkış elektrik stimülasyon protokolü için bir elektrik stimülasyon kontrolörü kullanılır. Floresan problarının uyarma ışığı için iki yeşil LED kullanılır. Uzun geçişli bir dikroik ayna (610 nm) ve karşılık gelen yayıcılar, voltajı ve kalsiyum floresan emisyon ışıklarını ayırır. Gerilime duyarlı boya olan RH237, 670 nm'lik bir tepe dalga boyunda bir emisyon ışığına sahipken, kalsiyuma duyarlı boya olan Rhod-2, 600 nm'lik bir tepe dalga boyunda bir emisyon ışığına sahiptir. Kamera sensörünün yüksek örnekleme hızı ve hassasiyeti nedeniyle her iki floresan sinyalindeki küçük değişiklikler kamera tarafından aynı anda yakalanabilir. Kısaltmalar: EMCCD = elektron çarpan yük bağlantılı cihaz; LED = ışık yayan diyot; EKG = elektrokardiyogram. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hazırlama ve çift boya yüklemesi . (A) Cerrahi aletler. (B) Fare kalbinin hasadı. (C) Aortun net bir şekilde görülebilmesi için gereksiz dokuyu dikkatlice kesin ve aorttan sol ventriküle 0,7 mm'lik plastik bir tüp yerleştirin. (D) Kalp hızlı bir şekilde Langendorff perfüzyon sistemine alınır. (E) Karanlıkta çift boya yükleme ve uyarma-büzülme durdurma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: S1S1 protokolü ve aritmi indüksiyon protokolü. (A) ISO zorluğundan sonra S1S1 pacing protokolünü kullanan temsili EKG dalga cephesi ve karşılık gelen AP ve kalsiyum sinyal izleri. (B) Bir CPVT farede ISO perfüzyonundan sonra 50 Hz'lik bir patlama hızı dizisi ile VT indüksiyonu. Kısaltmalar: EKG = elektrokardiyogram; AP = aksiyon potansiyeli; ISO = izoproterenol; VT = ventriküler taşikardi; CPVT = katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: ISO sorgulamasından önce ve sonra 10 Hz'de APD80 ve CaTD80 analizi. (A) ISO tedavisinden önce ve sonra WT ve CPVT kalplerinin temsili AP izleri ve APD80 ısı haritaları. (B) ISO mücadelesinden önce ve sonra WT ve CPVT kalplerinin tipik CaT izleri ve CaTD80 ısı haritaları. (C) ISO, WT ve CPVT farelerde APD80'i kısaltır, ancak ISO zorluğundan önce ve sonra WT ve CPVT fareler arasında bir fark bulunmaz. (D) CPVT farelerinde CaTD80, ISO mücadelesinden sonra WT'den daha uzundur, ancak ISO tedavisinden önce anlamlı bir şey yoktu. (* P < 0.05, **P < 0.01. n =5/6.) Kısaltmalar: AP = aksiyon potansiyeli; APD80 = %80 repolarizasyonda zirve; ISO = izoproterenol; CPVT = katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi; WT = vahşi tip. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 10 Hz'de iletim hızı analizi. (A) İletim hızının tek vektör algoritması. (B) WT ve CPVT farelerinde AP'nin CV'sinde fark yoktur. (C) Temsili ısı haritaları, CPVT farelerin, voltaj sinyallerine göre ISO zorluğundan önce ve sonra WT farelerle aynı iletim yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir. (D) ISO zorluğundan önce ve sonra aksiyon potansiyeli kaynaklı CaT80 izokronları için iki grupta önemli bir fark bulunmadı. Kısaltmalar: AP = aksiyon potansiyeli; ISO = izoproterenol; CPVT = katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi; WT = vahşi tip; AT = aktivasyon süresi; CV = iletim hızı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Kalsiyum genliği alternans analizi. (A) Kalsiyum genliği alternanslarını hesaplama algoritması. (B) WT kalplerindeki kalsiyum sinyalleri, 14.29 ve 16.67 Hz'de ardışık S1S1 pacing sırasında başlangıçta sabit kalırken, (C) CPVT kalpleri frekansa bağlı alternanslar gösterir. (D) WT kalpleri ISO zorluğundan etkilenmezken, (E) ISO zorluğundan sonra, CPVT kalpleri S1S1 pacing sırasında kalsiyum sinyalinde frekansa bağlı alternanslar sergiler. Kısaltmalar: ISO = izoproterenol; CPVT = katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi; WT = vahşi tip. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Faz haritaları kullanılarak taşiaritmi analizi . (A) WT ve CPVT kalpleri, başlangıçta 50 Hz patlama hızı sırasında normal iletim sergiler. (B) ISO ile perfüzyondan sonra, CPVT kalpleri 50 Hz patlama hızından sonra yüksek frekanslı rotorlar gösterirken, WT kalpleri normal iletimi korur. Kısaltmalar: ISO = izoproterenol; CPVT = katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi; WT = vahşi tip. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deneyimlerimize dayanarak, bir fare kalbinin başarılı bir çift boyutlu optik haritalamasının anahtarları, iyi hazırlanmış bir çözüm ve kalp, boya yüklemesi, en iyi sinyal-gürültü oranının elde edilmesi ve hareket artefaktının azaltılmasını içerir.
Çözeltinin hazırlanması
Başarılı bir kalp deneyi için Krebs çözümü şarttır. MgCl 2 ve CaCl2 stok çözeltileri (1 mol/L) su emilimleri göz önünde bulundurularak önceden hazırlanır ve diğer tüm bileşenler saf suda çözüldükten sonra Krebs çözeltisine eklenir çünkü Mg 2+ ve Ca 2+ CO3 2+ ile kolayca çökelebilir. Krebs çözeltisi, oksijenasyonu sağlamak için en az 30 dakika boyunca %95 O 2/5% CO2 ile köpürtülür. Fare kalbi pH'a özellikle duyarlı olduğundan, oksijenasyondan sonra çözelti pH'ı 7.4 civarında olmalıdır. Çözeltide küçük parçacıklar olsa bile, bu parçacıklar kılcal damarları tıkayabileceğinden ve perfüzyon etkisini etkileyebileceğinden deneysel sonuçlar etkilenebilir. Bu nedenle, çözelti kullanımdan önce 0,22 μm'lik bir aseptik iğne filtre kullanılarak filtrelenir.
Kalp hazırlığı
Kalpler alınmadan önce, koroner arter sisteminde pıhtı oluşumunu önlemek için fareler önce heparinize edilir ve kardiyak tıkanıklığın neden olduğu zayıf boya perfüzyonunun sonraki görüntülemeyi etkilemesi önlenir. Kalbin iskemik süresi ne kadar kısa olursa, kalbin durumu o kadar iyi olur. Bu nedenle, Langendorff sistemindeki aort yoluyla kanülasyona kadar kalplerin toplanmasından kanülasyona kadar iskemik süre 2-3 dakika içinde kontrol edilir. Ek olarak, perfüzyon basıncının iyi korunması da önemlidir. Bu nedenle, sol ventrikül çıkışı bağlandıktan sonra ventrikül kasılması sırasında sol ventrikül basıncının çok yüksek olmasını önlemek için sol ventrikül boşluğuna ince bir silikon (plastik) tüp yerleştirilir, bu da zayıf miyokard perfüzyonu ve anoksik doku asitlenmesine neden olabilir.
Boya yükleme
Bu deneyler, Langendorff sisteminde kalbi perfüze ederek boya yüklemesini gerçekleştirir. Kalp ritmini izlemek çok önemlidir, çünkü anormal ritim cerrahi operasyonlardan veya iskemi-reperfüzyon hasarından kaynaklandığında kötü boya yüklemesi meydana gelecektir. Kalp, sonraki adımları gerçekleştirecek kadar sağlıklı olmalıdır. Ca2+'ya duyarlı bir boya olan Rhod-2, formunda hücrelere kolayca yüklenen Rhod2'nin bir asetil metil ester türevidir. Molekülün floresan yoğunluğunda 100 kat artış,Ca2+ şelasyon17'den kaynaklanır. Pluronic F127, Rhod-2'nin tamponda polimerleşmesini önlemek ve hücrelere girmesine yardımcı olmak için Rhod-2 yükleme çözeltisine dahil edilmiştir. Pluronic F127, Rhod-2'nin stabilitesini azaltabilir, bu nedenle yalnızca çalışma solüsyonunu hazırlarken eklenmesi önerilir, ancak uzun süreli depolama için depolama solüsyonuna eklenmemesi önerilir. Gerilime duyarlı boya RH237, Ca2+ indikatörü Rhod-2 ile kullanım için uygun spektral özellikleri nedeniyle bu çalışmada kullanılmıştır.
En iyi sinyal-gürültü oranını elde etme
Yüksek sinyal-gürültü oranlarına sahip görüntüler elde etmek görüntülemenin hedefidir, ancak gürültü her zaman sorun çıkaran gölgeli bir hayalet gibidir. Zayıf sinyaller nedeniyle, optik haritalama gibi bazı yüksek hızlı mikroskobik görüntüleme uygulamalarında daha düşük gürültü özellikle önemlidir. Sinyal-gürültü oranı (SNR), gürültü genliğinin dinlenme potansiyeli18'de değerlendirildiği kök ortalama kare genlik oranının kök ortalama kare gürültüye oranı olarak hesaplanır. Işık kaynağı, optik filtreler, odaklama optikleri ve fotodetektörler gibi bazı faktörler, en iyi SNR'yi elde etmek için gereklidir. Çalışmada, numunenin arka plan bölgesi, genellikle küçük bir düzeyde dalgalanan gürültü açısından incelenmiştir. Her piksel tarafından algılanan optik sinyal, yüzey alanından yayılan ışığın ortalamasıdır. AP ve kalsiyum aktiviteleri aritmi sırasında salınır ve her iki sinyalin de genliği nispeten düşüktür. Küçük parazitler bile optik sinyallerin bozulmasına neden olabilir ve veri analizinde hatalara neden olabilir. Bu nedenle, VT gibi aritmiler sırasında lokal heterojenlik elektriksel fonksiyondan kaynaklandığında optik sinyallerin yorumlanması dikkatli olmalıdır.
Hareket artefaktını azaltın
Elektrot kaydı ile karşılaştırıldığında, optik sinyaller genellikle hareket artefaktı nedeniyle Langendorff perfüze kalplerinin kasılma aktivitesinden etkilenir. Doğru optik sinyalleri yakalamak için, çoğunlukla uyarma-kasılmanın farmakolojik inhibitörleri kullanılır. Görüntüleme sırasında hareket artefaktını en aza indirmek için, kalbin atmasını durdurmak için blebbistatin kullanılır. Kas dışı miyozin II'nin ATPaz aktivitesinin seçici bir inhibitörüdür ve kalbin uyarma-kasılma sürecini etkili bir şekilde ayırır 19,20,21. Bazı çalışmalarbileşik 22'yi kullanarak bazı yan etkileri ima etse de, kalbe olası hasarı en aza indirmek için 10 μM'de en düşük çalışma konsantrasyonunu kullanıyoruz.
Kardiyak optik haritalama veri kümelerinin analizi için ElectroMap yazılımı
ElectroMap, kardiyak optik haritalama veri kümelerinin analizi için yüksek verimli açık kaynaklı bir yazılımdır. AP ve CaT morfolojisi, CV, diyastolik aralık, baskın frekans, pik zamanı ve gevşeme sabiti (τ) 15,23 dahil olmak üzere ana kardiyak elektrofizyoloji parametrelerinin bir analizini sağlar. Yazılım, Gauss filtresi, Savitzky-Goaly filtresi ve Top-hat taban çizgisi düzeltmesi dahil olmak üzere birden fazla filtreleme seçeneğine izin verir. Gauss filtresi, her kanalın ve bitişik kanalların ağırlıklı ortalama düzgünleştirmesini hesaplayarak iki boyutlu bir yumuşatmadır. Genellikle ani aksaklık gürültüsü için kullanılır. Savitzky-Goaly filtresi, çeşitli pürüzsüz filtreleme ihtiyacını karşılayan ve aynı zamanda gürültüden türetilen periyodik olmayan ve doğrusal olmayan veri kümelerini işlemek için etkili olan en küçük kareler yöntemiyle bitişik veri kümelerinin daha düşük bir polinom ve sürekli alt kümesine uyar. Silindir şapka taban çizgisi düzeltmesi, optik sinyalleri izlerin tepe noktalarına göre aynı yüksekliğe ayarlayabilir, aksiyon potansiyeli süresi (APD) ve kalsiyum geçici süresi (CaTD) gibi parametreleri çok daha doğru bir şekilde hesaplayabilir. Voltaj ve kalsiyum floresan sinyallerini örneklerken bazen taban çizgisi kayması meydana gelir. Kalsiyum alternanslarını ve genliğini hesaplarken de yararlıdır. Elektrofizyolojik inceleme için her iki ventrikül seçildi.
Çift boya eşlemenin avantajları ve dezavantajları ve paraziti sınırlama yöntemleri
Son yıllarda, aritmi gibi hastalıkların mekanizmasını anlamak için kritik olan membran saati ve kalsiyum saatinin bağlanmasının yanı sıra tüm kalpte hücre depolarizasyonu veya repolarizasyonu ve hücreler arası iletim heterojenliğinin açıklığa kavuşturulmasının hayati önem taşıdığı fark edilmiştir24,25. Optik haritalama, transgenik farelerinkalbinin ventriküler aktivasyon ve repolarizasyon özelliklerini belirlemek için yüksek bir uzay-zamansal çözünürlüğe sahiptir 26,27,28,29. Ayrıca, voltaj ve kalsiyuma duyarlı boya ile yüklü aynı kalbin24,30 veya doku31,32'nin membran potansiyelinin ve hücre içi kalsiyumunun ölçümü gibi çok parametreli görüntülemeyi de tespit edebilir. Çift boya görüntüleme, membran (M) saati ile Ca2+ (C) saati veya spontan kalsiyum salınımı ve depolarizasyondan sonra gecikmiş (DAD) arasındaki ilişki gibi aksiyon potansiyeli ve kalsiyum arasındaki ilişkiyi incelemek için faydalıdır. Normal kardiyak uyarılma daha sonra iki saatteki döngüsel olayların hizalanmasını gerektirir. Bu uyumdaki bozulma aritmiyeyol açar 25. Spontan kalsiyum salınımı ile DAD arasındaki ilişki, kalp yetersizliğinde aktiviteleri tetikleme mekanizmasıdır 33. Bununla birlikte, boyaların kombinasyonu dikkatlice seçilmelidir. RH-237 / Rhod-2 veya di-4-ANEPPS / Indo-1 kombinasyonu eşzamanlı kayda izin verirken, Fluo-3/4 / di-4-ANEPPS, iki boyanın30,34,35 örtüşen emisyon spektrumları nedeniyle hatalara yol açacaktır. Bu deney, kalbi yüklemek için RH237 ve Rhod-2'yi seçti ve iyi görüntüleme kalitesi elde etti.
Ek olarak, bu protokolde kullanılan kamera, bölünmüş sinyalleri tek bir örnekleme arayüzünde yakalamasını sağlayan ve tek bir kameranın iki farklı emisyon dalga boyunu algılamasını sağlayan iki hedef yüzeye sahiptir. Çeşitli fotoelektron spektroskopisi (PES) protokollerini birleştiren optik AP ve CaT'nin bu şekilde eşzamanlı haritalanması, stres koşulları altında anormal [Ca2+]i ile elektriksel kararsızlık arasındaki karşılıklı ilişkiyi ve aktivasyon sonrası potansiyasyonun bu anomaliler üzerindeki etkisini belirlememize izin verecektir. SR Ca2+ döngüsünün mekansal olarak heterojen doğası ve bunun, uzamsal olarak uyumsuz alternans ve bunun sonucunda ortaya çıkan VT'ler gibi elektriksel alternansların ve aritmojenik davranışların ortaya çıkışını, şiddetini ve uyumunu nasıl etkilediği, farklı gruplarda sağlam kalpte incelenecektir. SR Ca 2+ alternansları, RyR2 refrakterliği ve bunların SR Ca2+ ve APD alternanslarındaki rolleri araştırılacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hiçbirinin beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81700308'dan XO'ya ve 31871181'dan ML'ye ve 82270334'dan XT'ye), Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Destek Programı (CN) (2021YJ0206'dan XO'ya, 23ZYZYTS0433 ve 2022YFS0607'den XT'ye ve 2022NSFSC1602'den TC'ye) ve Tıbbi Kaynakların Kimyası ve Moleküler Mühendisliği için Devlet Anahtar Laboratuvarı (Guangxi Normal Üniversitesi) (CMEMR2017-B08'den XO'ya), MRC (ML02647, G1002082, ML için G10031871181), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE at Oxford (ML) hibeleri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
References
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
- Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
- Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
- Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
- Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
- Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al.
- Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
- Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
- Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
- Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
- Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
- O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
- Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
- Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
- Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
- Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
- Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
- Mal Baudot,, et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
- Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
- Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
- Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
- Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
- He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
- Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).
