Summary
이 프로토콜은 높은 시간 및 공간 분해능으로 막관통 전압 및 세포 내 Ca2+ 과도 현상의 전기 생리학적 측정을 포함하여 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥의 영향을 받는 야생형 및 녹인 동물에서 얻은 마우스 심장의 이중 염료 광학 매핑을 소개합니다.
Abstract
부정맥성 심장 질환인 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥(CPVT)은 신체 활동, 스트레스 또는 카테콜아민 챌린지 후 다형성 심실 빈맥 에피소드로 나타나며, 잠재적으로 치명적인 심실 세동으로 악화될 수 있습니다. 마우스 심장은 CPVT를 포함한 유전성 심장 부정맥 질환을 모델링하는 데 널리 사용되는 종입니다. Langendorff 관류된 쥐 심장의 막관통 전위(Vm)와 칼슘 과도성(CaT)의 동시 광학 매핑은 부정맥 발생의 기전을 밝힐 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 세포 수준 조사와 비교하여 광학 매핑 기술은 활성화, 전도 속도, 활동 전위 지속 시간 및 CaT 지속 시간 결정과 같은 일부 전기 생리학적 매개변수를 테스트할 수 있습니다. 이 논문은 이소프로테레놀 챌린지 전과 도중에 프로그래밍된 전기 페이싱과 결합된 쥐 야생형 및 이형접합 RyR2-R2474S/+ 심장에서 CaT 및 Vm의 고처리량 광학 매핑을 위한 기기 설정 및 실험 절차를 제시합니다. 이 접근법은 생체 외 마우스 심장 제제에서 CPVT 질환을 기계적으로 연구하기 위한 실현 가능하고 신뢰할 수 있는 방법을 입증했습니다.
Introduction
유전성 심장 질환 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥(CPVT)은 신체 활동, 스트레스 또는 카테콜아민 챌린지 후 다형성 심실 빈맥(PVT) 에피소드로 나타나며, 잠재적으로 치명적인 심실세동으로 악화될 수 있습니다 1,2,3,4 . 1995년 임상 증후군으로 처음 보고된 이후 최근의 증거는 7개의 유전자에 돌연변이가 있음을 시사했으며, 모두 이 상태에서 근질 망상(SR) 저장 Ca 2+ 방출에 관여했습니다: 가장 빈번하게 보고된 RYR2 인코딩 리아노딘 수용체 2(RyR2)의 Ca2+ 방출 채널5,6, FKBP12.67, CASQ2 인코딩 심장 calsequestrin8, TRDN 접합 SR 단백질 트리아딘9 및 CALM1 9, CALM2 10 및 CALM3 칼모듈린11,12를 동일하게 인코딩하는 인코딩. 이러한 유전형 패턴은 부정맥 사건을 SR 저장소 Ca2+12의 조절되지 않은 병리학적 방출에 기인합니다.
SR로부터의 자발적인 Ca 2+ 방출은 Ca 2+ 스파크 또는 Ca 2+ 파동으로 감지될 수 있으며, 이는 Na+/Ca 2+ 교환기(NCX)를 활성화합니다. 3 Na+에 대한 1 Ca의교환기 2 +는 내부 전류를 생성하여 이완기 탈분극을 가속화하고 멤브레인 전압을 활동 전위 (AP)의 임계 값으로 구동합니다. RyR2 knock-in 마우스에서, 동방 결절(SAN)에서 RyR2R4496C의 증가된 활성은 이완기 동안 I, Ca, L 및 SR Ca 2+ 고갈의 Ca2+ 의존적 감소에 의해 SAN 자동성의 예상치 못한 감소를 초래하여, CPVT 환자에서 SAN 기능 장애에 기여하는 세포 내 병태생리학적 변화를 확인한다13,14. 관련 심근세포 세포질 Ca 2+ 파의 발생은 이소프로테레놀(ISO)을 포함한 카테콜아민에 의한 RyR 감작 후 배경 세포질[Ca2+]의 증가에 따라 발생할 가능성이 더 높습니다.
온전한 심장 CPVT 모델에서 관찰된 심실 부정맥의 원인이 될 수 있는 활동 전위(AP) 활성화에 대한 반응으로 RyR2 매개 Ca 2+ 방출에 따른 Ca2+ 신호의 자세한 역학적 변화는 보고된 RyR2 유전자형12의 전체 범위에 대해 결정되어야 합니다. 이 논문은 이소프로테레놀 챌린지 전후에 프로그래밍된 전기 페이싱과 결합된 쥐 야생형(WT) 및 이형접합 RyR2-R2474S/+ 심장에서 Ca2+ 신호 및 막관통 전위(V, m)의 고처리량 매핑을 위한 기기 설정 및 실험 절차를 제시합니다. 이 프로토콜은 분리된 마우스 심장에서 CPVT 질병의 기계론적 연구를 위한 방법을 제공합니다.
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Protocol
실험에는 10주 내지 14주령의 수컷 야생형 마우스 또는 무게가 20-25g인 RyR2-R2474S/+ 마우스(C57BL/6 배경)가 사용되었다. 모든 절차는 기관이 운영되는 국가 지침에 따라 중국 쓰촨성 사우스웨스트 의과대학의 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호:20160930)의 승인을 받았습니다.
1. 준비
- 스톡 솔루션
- 블레비스타틴 원액: 100% 디메틸설폭사이드(DMSO) 1mL를 (-) 블레비스타틴 분말 2.924mg이 함유된 원래 플라스크에 넣어 10mM의 농도에 도달합니다.
- 전압 표시기 RH237 원액: 원래 플라스크에 100% DMSO 1mL를 RH237 분말 1mg과 함께 첨가하여 2.01mM의 농도를 달성합니다.
- 칼슘 지시약 Rhod-2 AM 원액: 100% DMSO 1mL를 Rhod-2 AM 분말 1mg에 첨가하여 0.89mM 농도에 도달합니다.
- Pluronic F127 원액: 100% DMSO 1mL를 Pluronic F127 200mg에 첨가하여 20% w/v(0.66mM)의 농도에 도달합니다.
- 반복적인 동결 및 해동을 방지하기 위해 단일 또는 이중 사용을 위해 21-51 μL(RH237 21μL, Rhod-2 AM 31μL, blebbistatin 51μL)의 200μL PCR 튜브에 원액을 분주합니다. 그런 다음 용액을 알루미늄 호일로 싸서 상온의 어두운 방에 배치한 Pluronic F20 원액을 제외하고 -127°C에서 보관합니다.
- 관류 용액
- 크렙스 용액(mM): 크렙스 용액 1L(NaCl 119, NaHCO3 25, NaH2PO41.0, KCl 4.7, MgCl2 1.05, CaCl2 1.35 및 포도당 10)를 준비합니다.
- 0.22 μm 무균 바늘 필터로 용액을 여과하고 95 % O2 / 5 %CO2로 산소를 공급하십시오.
- 40mL의 Krebs 용액을 50mL 원심 튜브에 넣고 후속 심장 격리를 위해 4°C에서 보관합니다.
- Langendorff 관류 시스템 및 광학 매핑 장치
- Langendorff 관류 시스템을 설정합니다.
- 수조를 켜고 온도를 37°C로 설정합니다.
- Langendorff 관류 시스템을 탈이온수 1L로 세척합니다.
- 흡입관에서 용액을 관류하고 유출 속도를 3.5-4mL/분으로 조정합니다. 그런 다음 37°C에서 O 2/CO2(95%/5%) 가스로 관류액에 산소를 공급합니다.
알림: 관류 시스템에는 기포가 허용되지 않습니다.
- 광학 매핑 시스템을 준비합니다.
- 전자 곱셈 전하 결합 장치(EMCCD) 카메라(512픽셀 × 512픽셀), 렌즈(40배 확대), 파장 분할기 LED(발광 다이오드), 심전도(ECG) 모니터 및 자극 전극을 설치합니다(그림 1).
- 렌즈에서 심장 위치까지 적절한 작동 거리를 조정하십시오.
- 균일한 조명을 위해 자동 온도 조절 수조의 대각선 위치에 두 개의 LED를 배치하여 여기광을 생성하기 위한 530nm의 파장을 제공합니다. ET525/50 스퍼터 코팅 필터를 사용하여 LED의 대역 외 조명을 제거합니다.
- 핸들 스위치를 조정하여 대상 표면의 동일한 정사각형을 달성하여 전압 및 칼슘 이미지가 획득 인터페이스에 적절하게 나타나도록 합니다.
- 전압 또는 칼슘 신호의 누출을 방지하기 위해 렌즈의 조리개를 최대 직경으로 돌립니다.
- 카메라 렌즈는 자동 온도 조절 수조에 미세한 작동 거리를 제공하므로 적절한 높이로 조정하며 대부분 10cm가 사용됩니다.
- -50°C에서 안정적인 샘플링 온도를 위해 카메라를 켭니다.
- Langendorff 관류 시스템을 설정합니다.
2. 절차
- 쥐 심장 채취, 캐뉼레이션 및 관류
- 동물에게 아베르틴 용액(1.2%, 0.5-0.8mL)과 헤파린(200단위)을 복강내 주사하여 고통과 통증 반사를 최소화하고 혈전 형성을 예방합니다. 15분 후 자궁경부 탈구로 동물을 희생시킵니다.
- 가위로 가슴을 열고 심장을 조심스럽게 채취하여 차가운 크렙스 용액(4°C, 95% O2, 5%CO2)에 넣어 신진대사를 늦추고 심장을 보호합니다.
- 대동맥 주변 조직을 제거하고 맞춤형 캐뉼레이션 바늘(외경: 0.8mm, 내경: 0.6mm, 길이: 27mm)을 사용하여 대동맥을 캐뉼레이션하고 4-0 실크 봉합사로 고정합니다.
- Langendorff 시스템으로 심장에 3.5-4.0mL/분의 일정한 속도로 관류하고 온도를 37 ± 1 °C로 유지합니다.
참고: 모든 후속 절차는 이 조건에서 수행됩니다. - 작은 플라스틱 튜브(직경 0.7mm, 길이 20mm)를 좌심실에 삽입하여 챔버의 용액 혼잡을 해제하여 과부하를 방지합니다.
- excitation-contraction 및 dual-dye loading의 Uncoupler
- 두 개의 리드를 수조의 관류수에 넣고 ECG 증폭기 상자와 전기 자극 컨트롤러의 전원을 켠 다음 참조된 ECG 소프트웨어를 시작하고 ECG를 지속적으로 모니터링합니다.
- 심장이 안정된 상태에 도달하면 어둠 속에서 후속 단계를 수행합니다(심장이 ~400bpm에서 리드미컬하게 뛰고 있음).
- 50μL의 10mM 블레비스타틴 원액과 50mL의 크렙스 용액을 혼합하여 10μM의 농도에 도달합니다. 블레비스타틴-크렙스 용액 혼합물을 10분 동안 심장에 지속적으로 관류하여 흥분으로 인한 수축을 분리하고 촬영 중 수축 아티팩트를 방지합니다.
- 수축이 염료 로딩 품질에 영향을 미치기 때문에 빨간색 손전등을 사용하여 심장 수축이 완전히 멈췄는지 확인하십시오.
- 여기-수축을 분리한 후 50mL의 Krebs 용액에 15μL의 Rhod-2 AM 원액과 15μL의 Pluronic F127 원액을 혼합하여 0.267μM Rhod-2 AM 및 0.198μM Pluronic F127의 최종 농도를 얻습니다. 그런 다음 Langendorff 관류 시스템에서 Rhod-2 AM 작동 용액으로 15분 동안 심장을 지속적으로 관류합니다.
- 세포 내 칼슘 염료 로딩 중에 산소 공급을 유지하십시오. Pluronic F127에서는 기포가 쉽게 형성되기 때문에 관류 시스템에 기포 트랩을 삽입하여 관상 동맥의 가스 색전술을 방지합니다.
- RH237 원액 10μL를 관류액 50mL에 희석하여 0.402μM의 최종 농도에 도달하고 10분 동안 로딩을 수행합니다.
- 이중 염료 로딩이 끝나면 일련의 사진을 찍어 전압 및 칼슘 신호가 모두 분석에 적합한지 확인합니다(두 신호 간의 상호 작용 없음).
- 광학 매핑 및 부정맥 유도
참고: 광학 매핑은 수축 중단 및 적절한 염료 로딩 후에 시작되며 심장은 위의 2.1(4)에서 설명한 단계에서와 같이 연속적으로 관류됩니다.- 여기 조명을 위해 두 개의 LED를 켜고 적절한 범위(조명과 비교적 간단한 촬영에 충분히 강하지만 과다 노출에 너무 강하지 않음)에서 강도를 조정합니다.
- 심장을 감지 장치 아래에 놓고 두 개의 LED가 적절하게 비추는지 확인한 다음 광점 직경을 2cm로 조정합니다.
- 렌즈에서 심장까지의 working distance를 10cm로 설정하여 거의 500Hz의 샘플링 속도와 픽셀당 120 x 120μm의 공간 해상도를 제공합니다.
- 신호 샘플링 소프트웨어를 열어 카메라를 디지털 방식으로 제어하여 전압과 칼슘 신호를 동시에 캡처합니다.
- myopacer 필드 자극기를 시작하고 TTL(Transistor Transistor Logic)에서 페이싱 패턴, 각 펄스에 대한 2ms 페이싱 지속 시간, 초기 강도로 0.3V를 설정합니다.
- 30개의 연속 10Hz S1 자극을 사용하여 ECG 기록 소프트웨어로 구동되는 심장의 이완기 전압 임계값을 테스트합니다. 점차적으로 증가tage amp1:1 캡처가 실현될 때까지 위폭을 조정합니다(ECG 모니터의 QRS 파동, 활동 전위(AP) 및 칼슘 과도 상태(CaT) 신호 확인).
- 전압 임계값을 결정한 후 좌심실(LV) 정점(ELVA)의 심외막에 부착된 한 쌍의 백금 전극을 사용하여 이완기 전압 임계값의 2배 강도로 심장 속도를 조절합니다.
- S1S1 프로토콜을 구현하여 칼슘 또는 활동 전위 대체 물질 및 회복 특성을 측정합니다. 100ms의 기본 주기 길이로 심장을 연속적으로 페이스를 조절하고 50ms에 도달할 때까지 다음 시퀀스마다 주기 길이의 10ms를 줄입니다. 각 에피소드에는 2ms 펄스 폭의 30개의 연속 자극이 포함됩니다. 동시에 자극 전에 광학 매핑을 시작합니다(샘플링 시간에는 ~10개의 부비동 리듬 및 페이싱 기간이 포함됨).
- S1S2 자극 프로토콜을 사용하여 심실 유효 불응 기간(ERP)을 측정하려면 S1S1 페이싱 주기 길이 100ms로 시작하여 S2가 이소성 QRS 복합체를 포착하지 못할 때까지 2ms 단계 감소로 60ms에서 S2가 결합됩니다.
- 부정맥 유도의 경우 영구 50Hz 버스트 페이싱(2ms 펄스 폭으로 50회 연속 전기 자극)을 수행하고 2초 간격의 휴식 후 동일한 페이싱 에피소드를 수행합니다.
- 흥미로운 부정맥 ECG 파동이 생성될 때 동시 광학 매핑 기록이 즉시 시작될 수 있도록 연속 고주파 페이싱 기간 동안 ECG 기록을 주의 깊게 관찰하십시오(대부분의 심장 부정맥은 전기 페이싱에 의해 유도되기 때문에 광학 신호는 samp중요한 심장 사건을 잃는 경우 버스트 페이싱 2-3초 전에).
- EMCCD 카메라를 사용한 이미지(샘플링 속도: 500Hz, 픽셀 크기: 64 x 64).
- 데이터 분석
- 이미지 로딩 및 신호 처리
- 폴더 선택 및 이미지 로드를 눌러 앞서 설명한 설정 및 프로토콜에 따라 반자동 대용량 비디오 데이터 분석을 위해 이미지 수집 소프트웨어에 이미지를 로드합니다15,16.
- 올바른 샘플링 매개변수(예: Pixel Size 및 Framerate)를 입력합니다.
- 수동 입력으로 이미지 임계값을 설정하고 관심 영역(ROI)을 선택합니다.
- 3 x 3 픽셀 가우스 공간 필터, 사비츠키-골리 필터, top-hat 기준선 보정을 구현합니다.
- 영상 처리를 눌러 기준선을 제거하고 APD80 및 CaTD50과 같은 전기생리학적 파라미터를 계산합니다.
- 전기생리학적 파라미터 분석
- APD80 계산을 위해 피크에서 APD의 시작 시간을 설정하고 80% 재분극(APD80)에서 단자점을 설정합니다. 마찬가지로 CaTD 시작 시간은 피크로 정의되고 터미널 포인트는 80% 완화로 정의됩니다.
- 전도 속도(CV)의 측정은 픽셀 크기와 두 픽셀 이상의 활동 전위 전도 시간에 따라 달라집니다. 선택한 모든 픽셀의 평균 속도를 계산합니다 - 이것은 선택한 영역의 평균 전도 속도입니다. 전도 방향을 명확하게 볼 수 있도록 해당 등시간 맵을 동시에 생성합니다.
참고: O'Shea et al.15 는 CV 측정을 자세히 보고했습니다. - alternans 및 부정맥 분석의 경우, calcium alternans는 번갈아 나타나는 연속적인 크고 작은 피크 진폭으로 정의됩니다. 피크 진폭 비율을 사용하여 주파수 종속 교류(1-A2/A1)의 심각도를 평가합니다. 심실 빈맥(VT)과 같은 복잡한 부정맥을 분석하기 위해 위상 맵을 적용합니다. 로터가 이동할 때 특정 영역에 뚜렷하게 나타나는 로터를 찾습니다.
- 이미지 로딩 및 신호 처리
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Representative Results
광학 매핑은 지난 10년 동안 복잡한 심장 부정맥을 연구하는 데 널리 사용되는 접근 방식이었습니다. 광학 매핑 설정은 EMCCD 카메라로 구성되며 각 픽셀에 대해 최대 1,000Hz의 샘플링 속도와 74 x 74μm의 공간 분해능을 제공합니다. 이를 통해 신호 샘플링 중에 다소 높은 신호 잡음비를 구현할 수 있습니다(그림 1). 랑겐도르프 관류된 심장이 안정된 상태에 도달하고 염료 로딩이 완료되면 심장은 전압 표시기 RH237 및 Ca2+ 표시기 Rhod-2 AM의 여기(excitation)에 사용되는 두 개의 530nm LED 조명 아래 동종 발열 챔버에 배치됩니다. 방출광은 600nm(Ca2+의 경우)와 670nm(V의 경우)의 두 가지 파장으로 나뉘며 EMCCD 카메라를 사용하여 동시에 감지됩니다. 15분 동안 아베르틴과 헤파린을 관류한 후 수술 기구(그림 2A)를 사용하여 흉부를 열고 심장을 빠르게 추출한 다음 차가운 크렙스 용액(4°C, 95% O2, 5%CO2)으로 옮깁니다(그림 2B). 주변 조직을 꼼꼼히 청소하고 대동맥을 4-0 봉합사로 고정한 후 0.7mm 플라스틱 튜브를 좌심실에 삽입하여(그림 2C) 좌심실의 관류액 울혈을 풀어줍니다. ECG 리드를 관류수(그림 2D)에 넣고 ECG 기록 소프트웨어로 구동되는 ECG 모니터링에 따라 심장이 리드미컬하게 박동하는지 확인합니다. 그런 다음 어두운 곳에서 이중 염료 로딩을 수행합니다(그림 2E).
블레비스타틴(10μM)에 의해 수축 아티팩트가 최소화되고 적절한 염료 로딩이 완료된 후, 이소프로테레놀(1μM ISO) 챌린지 후 주파수 의존적 전기생리학적 파라미터 복원 특성 및 칼슘 알터난을 평가하기 위해 S1S1 페이싱 프로토콜 전에 약 10개의 부비동 박동에 대한 촬영이 시작되었습니다(그림 3A). 그림 3B 는 VT의 대표적인 ECG 파면과 CPVT 마우스의 50Hz 버스트 페이싱 시퀀스에 의해 유도된 해당 활동 전위(AP) 및 CaT 트레이스를 보여줍니다. 광학 신호 이미징 소프트웨어는 대용량 비디오 데이터의 반자동 분석을 완료하는 데 사용됩니다.
그림 4A,B는 각각 APD80 및 CaTD80의 일반적인 트레이스와 히트 맵을 보여줍니다. ISO는 WT 및 CPVT 마우스에서 APD80을 단축시키지만, ISO 챌린지 전후에 WT와 CPVT 마우스 간에 차이가 발견되지 않았습니다(그림 4C, **P < 0.01. n = 5/6). 그림 4D는 CPVT 마우스의 CaTD80이 ISO 챌린지 후 WT보다 더 길다는 것을 나타내며, ISO 처리 전에는 유의성이 없었습니다(**P < 0.01. n =6.).
전도 측정의 경우, 그림 5A는 CV의 정량화를 위한 단일 벡터 알고리즘을 제시합니다. 전압 신호에 따라 WT 및 CPVT 심장은 기준선과 ISO 개입 후 심외막 전체에 걸쳐 동일한 전도 능력을 가지고 있습니다(그림 5B). 그림 5C,D는 ISO 챌린지 전후의 WT 및 CPVT 심장에서 전압 및 칼슘의 대표적인 활성화 맵을 보여줍니다.
칼슘 알터난은 부정맥의 중요한 매개 변수입니다. 칼슘 진폭 알터난은 도 6A에서 도시된 것과 같이 정립에 따라 계산된다. WT 심장의 칼슘 신호는 14.29Hz 및 16.67Hz에서 연속적인 S1S1 페이싱 동안 기준선에서 안정적으로 유지되는 반면(그림 6B), CPVT 심장은 주파수 의존적 교류를 보여줍니다(그림 6C). ISO 챌린지 후, CPVT 심장은 S1S1 페이싱 동안 칼슘 신호에서 주파수 의존적 교류를 나타내는 반면, WT 심장은 영향을 받지 않습니다(그림 6D,E). 지속적인 S1S1 페이싱 후 치명적인 부정맥을 유도하기 위해 버스트 페이싱 프로토콜이 수행됩니다. WT 및 CPVT 심장은 기준선에서 50Hz 버스트 페이싱 동안 정상적인 전도를 나타냅니다(그림 7A). ISO로 관류한 후 CPVT 심장은 50Hz 버스트 페이싱 후 고주파 로터를 나타내는 반면 WT 심장은 정상 전도를 유지합니다(그림 7B).
그림 1: 광학 매핑 장치. 이 시스템에는 높은 공간 시간 해상도(최대 1,000Hz의 샘플링 속도, 최소 샘플링 픽셀 74 x 74μm)를 갖춘 맞춤형 EMCCD 카메라가 포함되어 있습니다. 전기 자극 컨트롤러는 샘플링 및 출력 전기 자극 프로토콜에 사용됩니다. 두 개의 녹색 LED는 형광 프로브의 여기광에 사용됩니다. long-pass dichroic mirror(610nm)와 해당 emitter는 전압 및 칼슘 형광 방출광을 분할합니다. 전압에 민감한 염료인 RH237은 670nm의 피크 파장에서 발광을 하는 반면, 칼슘에 민감한 염료인 Rhod-2 AM은 600nm의 피크 파장에서 발광을 가지고 있습니다. 두 형광 신호의 미세한 변화는 카메라 센서의 높은 샘플링 속도와 감도 덕분에 카메라에서 동시에 캡처할 수 있습니다. 약어: EMCCD = 전자 곱셈 전하 결합 장치; LED = 발광 다이오드; ECG = 심전도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 준비 및 이중 염료 로딩. (A) 수술 기구. (B) 쥐 심장의 수확. (C) 대동맥이 잘 보이도록 불필요한 조직을 조심스럽게 잘라내고 대동맥에서 좌심실로 0.7mm 플라스틱 튜브를 삽입합니다. (D) 심장은 Langendorff 관류 시스템으로 빠르게 제거됩니다. (E) 어둠 속에서 이중 염료 로딩 및 여기-수축 중단. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: S1S1 프로토콜 및 부정맥 유도 프로토콜. (A) ISO 챌린지 후 S1S1 페이싱 프로토콜을 사용하는 대표적인 ECG 파면과 해당 AP 및 칼슘 신호 트레이스. (B) CPVT 마우스에서 ISO 관류 후 50Hz 버스트 페이싱 시퀀스에 의한 VT 유도. 약어: ECG = 심전도; AP = 활동 전위; ISO = 이소프로테레놀; VT = 심실 빈맥; CPVT = 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: ISO 챌린지 전후의 10Hz에서 APD80 및 CaTD80 분석. (A) ISO 처리 전후의 WT 및 CPVT 심장의 대표적인 AP 트레이스 및 APD80 히트 맵. (B) ISO 챌린지 전후의 WT 및 CPVT 심장의 일반적인 CaT 추적 및 CaTD80 히트 맵. (C) ISO는 WT 및 CPVT 마우스에서 APD80을 단축시키지만, ISO 챌린지 전후에 WT와 CPVT 마우스 간에 차이가 발견되지 않습니다. (D) CPVT 마우스의 CaTD80은 ISO 챌린지 후 WT보다 더 긴 반면, ISO 처리 전에는 유의성이 없었습니다. (* P < 0.05, **P < 0.01. n =5/6.) 약어: AP = 활동 전위; APD80 = 80% 재분극에서 피크; ISO = 이소프로테레놀; CPVT = 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥; WT = 와일드 타입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 10Hz에서의 전도 속도 분석. (A) 전도 속도의 단일 벡터 알고리즘. (B) WT 및 CPVT 마우스에서 AP의 CV에는 차이가 없습니다. (C) 대표적인 히트 맵은 CPVT 마우스가 전압 신호에 따라 ISO 챌린지 전후에 WT 마우스와 동일한 전도 능력을 갖는다는 것을 보여줍니다. (D) ISO 챌린지 전후에 활동 전위 유도 CaT80 등시성에 대해 두 그룹에서 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다. 약어: AP = 활동 전위; ISO = 이소프로테레놀; CPVT = 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥; WT = 와일드 타입; AT = 활성화 시간; CV = 전도 속도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 칼슘 진폭 교류 분석. (A) 칼슘 진폭 교류를 계산하는 알고리즘. (B) WT 심장의 칼슘 신호는 14.29Hz 및 16.67Hz에서 연속적인 S1S1 페이싱 동안 기준선에서 안정적으로 유지되는 반면, (C) CPVT 심장은 주파수 의존적 교류를 보여줍니다. (D) WT 심장은 ISO 챌린지의 영향을 받지 않는 반면, (E) ISO 챌린지 후 CPVT 심장은 S1S1 페이싱 동안 칼슘 신호에서 주파수 의존적 교류를 나타냅니다. 약어: ISO = 이소프로테레놀; CPVT = 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥; WT = 와일드 타입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 위상 맵을 사용한 빈맥 분석 . (A) WT 및 CPVT 심장은 기준선에서 50Hz 버스트 페이싱 동안 정상적인 전도를 나타냅니다. (B) ISO로 관류 후 CPVT 심장은 50Hz 버스트 페이싱 후 고주파 로터를 나타내는 반면 WT 심장은 정상 전도를 유지합니다. 약어: ISO = 이소프로테레놀; CPVT = 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥; WT = 와일드 타입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리의 경험에 비추어 볼 때, 쥐 심장의 성공적인 이중 염료 광학 매핑의 핵심은 잘 준비된 솔루션과 심장, 염료 로딩, 최상의 신호 대 잡음비 달성 및 모션 아티팩트 감소입니다.
용액의 준비
크렙스 용액은 성공적인 심장 실험에 필수적입니다. MgCl 2및 CaCl 2 원액 (1 mol / L)은 수분 흡수를 고려하여 미리 준비되고 다른 모든 성분이 순수한 물에 용해 된 후 Krebs 용액에 첨가됩니다. Krebs 용액은 산소화를 보장하기 위해 최소 30분 동안 95% O 2/5% CO2로 기포됩니다. 쥐의 심장은 pH에 특히 민감하기 때문에 산소화 후 용액 pH는 약 7.4여야 합니다. 용액에 작은 입자가 있더라도 이러한 입자가 모세혈관을 차단하고 관류 효과에 영향을 줄 수 있기 때문에 실험 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 용액은 사용하기 전에 0.22μm 무균 바늘 필터를 사용하여 여과됩니다.
심장 준비
심장을 채취하기 전에 쥐는 먼저 관상 동맥 시스템에 혈전이 형성되는 것을 방지하기 위해 헤파린화되어 심장 울혈로 인한 염료 관류 불량이 후속 이미징에 영향을 미치지 않도록 합니다. 심장의 허혈 시간이 짧을수록 심장 상태가 좋아집니다. 따라서 허혈성 시간은 심장이 적출되는 시점부터 랑겐도르프 시스템의 대동맥을 통한 캐뉼레이션까지 2-3분 이내에 조절됩니다. 또한 잘 유지된 관류 압력도 필수적입니다. 따라서 좌심실 출구를 결찰한 후 심실 수축 중에 좌심실 압력이 너무 높아져 심근 관류가 불량하고 무산소 조직 산성화가 발생할 수 없도록 얇은 실리콘(플라스틱) 튜브를 좌심실강에 삽입합니다.
염료 로딩
이 실험은 Langendorff 시스템에서 심장을 관류하여 염료 로딩을 수행합니다. 심장 리듬을 모니터링하는 것이 중요한데, 이는 비정상적인 리듬이 외과 수술이나 허혈 재관류 손상으로 인해 발생할 때 불량한 염료 로딩이 발생하기 때문입니다. 심장은 후속 단계를 수행할 수 있을 만큼 건강해야 합니다. Ca 2 + 감응성 염료 인 Rhod-2 AM은 Rhod2 의 아세틸 메틸 에스테르 유도체로 AM 형태로 세포에 쉽게 로드됩니다. 분자의 형광 강도가 100배 증가하면 Ca2+ 킬레이트화(17)가 발생합니다. Pluronic F127은 Rhod-2 AM 로딩 용액에 통합되어 Rhod-2 AM이 완충액에서 중합되는 것을 방지하고 세포에 들어가는 것을 돕습니다. Pluronic F127은 Rhod-2 AM의 안정성을 저하시킬 수 있으므로 작업 용액을 준비할 때만 추가하는 것이 좋지만 장기 보관용 저장 용액에는 추가하지 않는 것이 좋습니다. 전압에 민감한 염료 RH237은 Ca2+ 지시약 Rhod-2 AM과 함께 사용하기에 유리한 스펙트럼 특성으로 인해 이 연구에서 사용됩니다.
최고의 신호 대 잡음비 달성
신호 대 노이즈 비율이 높은 이미지를 얻는 것이 이미징의 목표이지만 노이즈는 항상 문제를 일으키는 그림자 유령과 같습니다. 신호가 약하기 때문에 낮은 노이즈는 광학 매핑과 같은 일부 고속 현미경 이미징 응용 분야에서 특히 중요합니다. 신호 대 잡음비(SNR)는 평균 제곱근 잡음에 대한 평균 제곱근 진폭 비율로 계산되며, 여기서 잡음 진폭은 휴지 전위(18)에서 평가됩니다. 광원, 광학 필터, 집속 광학 장치 및 광검출기와 같은 일부 요소는 최상의 SNR을 달성하는 데 필수적입니다. 이 연구에서는 샘플의 배경 영역에 노이즈가 있는지 검사하며, 노이즈는 종종 미세한 수준에서 변동합니다. 각 픽셀에서 감지된 광 신호는 표면적에서 방출되는 빛의 평균입니다. 부정맥 중에는 AP와 칼슘 활동이 진동하며, 두 신호의 진폭은 상대적으로 낮습니다. 사소한 간섭이라도 광 신호의 왜곡으로 이어져 데이터 분석에 실수가 발생할 수 있습니다. 따라서 VT와 같은 부정맥 중 전기적 기능에 의해 국부적 이질성이 발생하는 경우 광 신호의 해석에 주의해야 합니다.
모션 아티팩트 줄이기
전극 기록과 비교할 때 광학 신호는 종종 운동 인공물 때문에 Langendorff 관류 심장의 수축 활동에 의해 영향을 받습니다. 정확한 광학 신호를 포착하기 위해 여기-수축의 약리학적 억제제가 주로 사용됩니다. 이미징 중 모션 아티팩트를 최소화하기 위해 심장 박동을 멈추기 위해 블레비스타틴을 채택합니다. 그것은 비 근육 myosin II의 ATPase 활성의 선택적 억제제이며 심장 19,20,21의 흥분-수축 과정을 효과적으로 분리합니다. 일부 연구에서는 화합물22를 사용할 때 몇 가지 부작용이 있음을 암시하지만, 당사는 심장에 발생할 수 있는 손상을 최소화하기 위해 10μM의 가장 낮은 작동 농도를 사용합니다.
심장 광학 매핑 데이터 세트 분석을 위한 ElectroMap 소프트웨어
ElectroMap은 심장 광학 매핑 데이터 세트 분석을 위한 고처리량 오픈 소스 소프트웨어입니다. AP 및 CaT 형태, CV, 이완기 간격, 우세 주파수, 피크 시간 및 이완 상수(τ) 15,23을 포함한 주요 심장 전기 생리학 매개변수에 대한 분석을 제공합니다. 이 소프트웨어는 가우스 필터, 사비츠키-골리 필터, 탑햇 기준선 보정을 포함한 여러 필터링 옵션을 허용합니다. 가우스 필터는 각 채널과 인접 채널의 가중 평균 평활화를 계산하여 2차원 평활화입니다. 일반적으로 스파이크 글리치 노이즈에 사용됩니다. 사비츠키-골리(Savitzky-Goaly) 필터는 최소 제곱법을 통해 인접 데이터셋의 하부 다항식 및 연속 서브셋을 피팅하며, 이는 다양한 평활 필터링의 필요성을 충족하고 노이즈에서 파생된 비주기적 및 비선형 데이터셋을 처리하는 데에도 효과적입니다. 탑햇 베이스라인 보정은 트레이스의 피크에 따라 광 신호를 동일한 높이로 조정하여 활동 전위 지속 시간(APD) 및 칼슘 과도 지속 시간(CaTD)과 같은 파라미터를 훨씬 더 정확하게 계산할 수 있습니다. 기준선 드리프트는 전압 및 칼슘 형광 신호를 샘플링할 때 가끔 발생합니다. 칼슘 교류와 진폭을 계산할 때도 유용합니다. 전기생리학적 조사를 위해 양쪽 심실을 선택하였다.
이중 염료 매핑의 장점과 단점 및 간섭을 제한하는 방법
최근 몇 년 동안 부정맥과 같은 질병의 메커니즘을 이해하는 데 중요한 멤브레인 시계와 칼슘 시계의 결합뿐만 아니라 심장 전체의 세포 탈분극 또는 재분극 및 세포 간 전도 이질성을 명확히 하는 것이 중요하다는 것이 깨달혔습니다24,25. 광학 매핑은 형질전환 마우스(26,27,28,29)의 심장의 심실 활성화 및 재분극 특성을 결정하기 위해 높은 시공간 분해능을 갖는다. 또한, 멀티-파라미터 이미징, 예를 들어, 전압 및 칼슘-민감성 염료가 로딩된 동일한 심장(24,30) 또는 조직(31,32)의 막 전위 및 세포내 칼슘의 측정을 검출할 수 있다. 이중 염료 이미징은 막(M) 시계와 Ca2+ (C) 시계 사이의 관계 또는 자발적인 칼슘 방출 및 탈분극 후 지연(DAD)과 같은 활동 전위와 칼슘 간의 관계를 연구하는 데 유용합니다. 정상적인 심장 흥분은 두 시계의 주기적 이벤트를 정렬해야 합니다. 이 정렬의 붕괴는 부정맥을 유발한다25. 자발적 칼슘 방출과 DAD의 관계는 심부전에서 활동을 유발하는 기전이다 33. 그러나 염료의 조합은 신중하게 선택해야합니다. RH-237/Rhod-2 또는 di-4-ANEPPS/Indo-1의 조합은 동시 기록이 가능한 반면, Fluo-3/4/di-4-ANEPPS는 두 염료30,34,35의 중복 방출 스펙트럼으로 인해 오류를 발생시킵니다. 이 실험은 RH237 및 Rhod-2 AM을 선택하여 심장에 부하를 가하고 우수한 이미징 품질을 얻었습니다.
또한 이 프로토콜에 사용되는 카메라에는 두 개의 타겟 표면이 있어 하나의 샘플링 인터페이스에서 분할 신호를 캡처할 수 있으며 단일 카메라로 두 개의 서로 다른 방출 파장을 감지할 수 있습니다. 다양한 광전자 분광법(PES) 프로토콜을 결합한 광학 AP와 CaT의 동시 매핑을 통해 스트레스 조건에서 비정상 [Ca2+]i와 전기적 불안정성 사이의 상호 관계와 이러한 이상에 대한 활성화 후 강화의 효과를 결정할 수 있습니다. SR Ca2+ 사이클링의 공간적으로 이질적인 특성과 이것이 공간적으로 불일치하는 교류 및 그에 따른 VT와 같은 부정맥 거동과 전기 교류의 출현, 심각도 및 일치에 미치는 영향은 다른 그룹의 온전한 심장에서 연구될 것입니다. SR Ca 2+ 알터난, RyR2 내화도 및 SR Ca2+ 및 APD 알터난에서의 역할을 탐구합니다.
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Disclosures
저자 중 누구도 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81700308에서 XO로, 31871181에서 ML로, 82270334에서 XT로), 쓰촨성 과학 기술 지원 프로그램 (CN) (2021YJ0206 - XO, 23ZYZYTS0433 및 2022YFS0607 - XT, 2022NSFSC1602 - TC) 및 의약 자원의 화학 및 분자 공학을 위한 국가 핵심 연구소 (광시 사범 대학) (CMEMR2017-B08 - XO)의 지원을 받습니다. MRC(G10031871181 to ML02647, G1002082, ML), BHF(PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE at Oxford(ML) 보조금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
References
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
- Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
- Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
- Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
- Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
- Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al.
- Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
- Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
- Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
- Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
- Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
- O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
- Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
- Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
- Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
- Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
- Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
- Mal Baudot,, et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
- Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
- Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
- Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
- Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
- He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
- Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).
