Summary
Denne protokol introducerer dobbeltfarvet optisk kortlægning af musehjerter opnået fra vildtype- og knock-in-dyr, der er ramt af katekolaminer polymorf ventrikulær takykardi, herunder elektrofysiologiske målinger af transmembranspænding og intracellulære Ca2+ transienter med høj tidsmæssig og rumlig opløsning.
Abstract
Den pro-arytmiske hjertesygdom catecholaminerge polymorfe ventrikulære takykardi (CPVT) manifesterer sig som polymorfe ventrikulære takykardi episoder efter fysisk aktivitet, stress eller catecholamin udfordring, som kan forværres til potentielt dødelig ventrikelflimmer. Musens hjerte er en udbredt art til modellering af arvelige hjertearytmiske sygdomme, herunder CPVT. Samtidig optisk kortlægning af transmembranpotentiale (Vm) og calciumtransienter (CaT) fra Langendorff-perfunderede musehjerter har potentiale til at belyse mekanismerne bag arytmogenese. Sammenlignet med undersøgelsen på celleniveau kan den optiske kortlægningsteknik teste nogle elektrofysiologiske parametre, såsom bestemmelse af aktivering, ledningshastighed, aktionspotentiel varighed og CaT-varighed. Dette papir præsenterer instrumenteringsopsætningen og den eksperimentelle procedure til optisk kortlægning med høj kapacitet af CaT og Vm i murine vildtype og heterozygote RyR2-R2474S / + hjerter kombineret med programmeret elektrisk pacing før og under isoproterenoludfordringen. Denne fremgangsmåde har vist en gennemførlig og pålidelig metode til mekanisk undersøgelse af CPVT-sygdom i et ex vivo-musehjertepræparat.
Introduction
Arvelig hjertesygdom katekolaminminerg polymorf ventrikulær takykardi (CPVT) manifesterer sig som polymorf ventrikulær takykardi (PVT) episoder efter fysisk aktivitet, stress eller catecholamin udfordring, som kan forværres til potentielt dødelig ventrikelflimmer 1,2,3,4 . Nylige beviser efter sin første rapport som et klinisk syndrom i 1995 implicerede mutationer i syv gener, alle involveret i sarkoplasmatisk retikulær (SR) lagerbutik Ca 2+ frigivelse i denne tilstand: den hyppigst rapporterede RYR2-kodning af ryanodinreceptor 2 (RyR2) af Ca2+ frigivelseskanaler 5,6, FKBP12.67, CASQ2-kodning af hjertekalsekvestrin8, TRDN kodning af det junctionale SR-proteintriadin 9 og CALM1 9, CALM2 10 og CALM3 identisk kodende calmodulin11,12. Disse genotypiske mønstre tilskriver de arytmiske hændelser til den uregulerede patologiske frigivelse af SR-lager Ca2+12.
Spontan Ca 2+ frigivelse fra SR kan detekteres som Ca 2+ gnister eller Ca 2+ bølger, som aktiverer Na+/Ca 2+ veksleren (NCX). Veksleren af en Ca2+ for tre Na+ genererer en indadgående strøm, som fremskynder den diastoliske depolarisering og driver membranspændingen til tærsklen for handlingspotentiale (AP). Hos RyR2-knock-in-mus fører den øgede aktivitet afRyR2 R4496C i sinoatriale knude (SAN) til et uventet fald i SAN-automaticitet ved Ca 2+-afhængigt fald i I Ca,L og SR Ca2+ udtømning under diastol, hvilket identificerer subcellulære patofysiologiske ændringer, der bidrager til SAN-dysfunktionen hos CPVT-patienter13,14. Forekomst af de relaterede kardiomyocytcytosoliske Ca2+-bølger er mere sandsynlig efter stigninger i baggrundscytosolisk [Ca2+] efter RyR-sensibilisering af catecholamin, herunder isoproterenol (ISO), udfordring.
Detaljerede kinetiske ændringer i Ca 2+ signalering efter RyR2-medieret Ca2+ frigivelse som reaktion på aktivering af handlingspotentiale (AP), der kan være årsagen til de observerede ventrikulære arytmier i intakte hjerte-CPVT-modeller, mangler at blive bestemt for hele spektret af rapporterede RyR2-genotyper12. Dette papir præsenterer instrumenteringsopsætningen og den eksperimentelle procedure til kortlægning med høj kapacitet af Ca2+ signaler og transmembranpotentialer (Vm) i murine vildtype (WT) og heterozygote RyR2-R2474S / + hjerter kombineret med programmeret elektrisk pacing før og efter isoproterenoludfordring. Denne protokol giver en metode til mekanistisk undersøgelse af CPVT-sygdom i isolerede musehjerter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mandlige 10 til 14 uger gamle vildtypemus eller RyR2-R2474S / + mus (C57BL / 6 baggrund), der vejer 20-25 g, anvendes til forsøgene. Alle procedurer er godkendt af dyrepleje- og brugsudvalget ved Southwest Medical University, Sichuan, Kina (godkendelse NO: 20160930) i overensstemmelse med de nationale retningslinjer, som institutionen opererer under.
1. Forberedelse
- Lager løsninger
- Blebbistatin-stamopløsning: Der tilsættes 1 ml 100% dimethylsulfoxid (DMSO) i den originale kolbe indeholdende 2,924 mg (-) blebbistatinpulver for at nå en koncentration på 10 mM.
- Spændingsindikator RH237 stamopløsning: Tilsæt 1 ml 100% DMSO i den originale kolbe med 1 mg RH237 pulver for at opnå en koncentration på 2,01 mM.
- Calciumindikator Rhod-2 AM stamopløsning: Tilsæt 1 ml 100% DMSO i 1 mg Rhod-2 AM pulver for at nå en koncentration på 0,89 mM.
- Pluronic F127 stamopløsning: Tilsæt 1 ml 100% DMSO i 200 mg Pluronic F127 for at nå en koncentration på 20% w/v (0,66 mM).
- Stamopløsningerne omdannes til 200 μL PCR-reagensglas i 21-51 μL (21 μL RH237, 31 μL Rhod-2 AM og 51 μL blebbistatin) til engangs- eller dobbeltanvendelse for at undgå gentagen frysning og optøning. Derefter pakkes opløsningerne ind med aluminiumsfolie og opbevares ved -20 °C, bortset fra Pluronic F127-stamopløsningen, der er anbragt i et mørkt rum ved omgivelsestemperatur.
- Perfusionsopløsning
- Krebs-opløsning (i mM): Forbered 1 liter Krebs-opløsning (NaCl 119, NaHCO3 25,NaH2PO4 1,0, KCl4,7, MgCl 2 1,05, CaCl2 1,35 og glucose 10).
- Opløsningen filtreres med et 0,22 μm aseptisk nålefilter og iltes med 95%O2/5% CO2.
- Tag 40 ml Krebs-opløsning i et 50 ml centrifugalrør og opbevar det ved 4 °C til opfølgende hjerteisolering.
- Langendorff-perfusionssystemet og optisk kortlægningsenhed
- Opsæt Langendorff-perfusionssystemet.
- Tænd for vandbadet og indstil temperaturen til 37 °C.
- Langendorff-perfusionssystemet vaskes med 1 liter deioniseret vand.
- Perfus opløsningen fra indtagskanalen og juster udstrømningshastigheden til 3,5-4 ml / min. Derefter iltes perfusatet medO2/CO2 (95 % / 5%) gas ved 37 ° C.
BEMÆRK: En boble er aldrig tilladt i perfusionssystemet.
- Forbered det optiske kortlægningssystem.
- Installer EMCCD-kameraet (elektronmultiplikatorisk ladningskoblet enhed) (512 × 512 pixel), objektivet (40x forstørrelse), bølgelængdesplitterlysdioder (LED'er), elektrokardiogrammonitor (EKG) og stimuleringselektrode (figur 1).
- Juster den korrekte arbejdsafstand fra linsen til hjertepositionen.
- Indstil to lysdioder i diagonal position af det termostatiske bad for jævn belysning, hvilket giver en bølgelængde på 530 nm til generering af excitationslys. Brug et ET525/50 sputterbelagt filter til at fjerne alt lys, der er uden for båndet, til LED'erne.
- Juster håndtagskontakten for at opnå et lige kvadrat af måloverfladen, hvilket får spændings- og calciumbillederne til at se tilstrækkeligt ud på modtagergrænsefladen.
- Drej objektivets blænde til den maksimale diameter for at undgå lækage af spændings- eller calciumsignaler.
- Juster kameralinsen i en passende højde, da den tjener en fin arbejdsafstand til det termostatiske bad, bruges 10 cm mest.
- Tænd kameraet for stabil prøvetagningstemperatur ved -50 °C.
- Opsæt Langendorff-perfusionssystemet.
2. Procedurer
- Høst, kanylering og perfusion af mus
- Intraperitonealt injicere dyrene med avertinopløsning (1,2%, 0,5-0,8 ml) og heparin (200 enheder) for at minimere lidelse og smerterefleks og forhindre dannelse af blodpropper. Efter 15 minutter ofres dyrene ved cervikal forskydning.
- Åbn brystet med en saks, høst hjertet omhyggeligt, og læg det i den kolde Krebs-opløsning (4 °C, 95%O2, 5% CO2) for at bremse stofskiftet og beskytte hjertet.
- Fjern det omgivende væv i aorta, cannulate aorta ved hjælp af en specialfremstillet kanyleringsnål (ydre diameter: 0,8 mm, indvendig diameter: 0,6 mm, længde: 27 mm) og fastgør den med en 4-0 silkesutur.
- Perfus hjertet med Langendorff-systemet ved en konstant hastighed på 3,5-4,0 ml/min, og hold temperaturen på 37 ± 1 °C.
BEMÆRK: Alle efterfølgende procedurer udføres i denne tilstand. - Indsæt et lille plastrør (0,7 mm diameter, 20 mm længde) i venstre ventrikel for at frigøre overbelastning af opløsningen i kammeret for at undgå overbelastning.
- Afkobling af excitationskontraktion og dobbeltfarvebelastning
- Sæt to ledninger i perfusatet i badet, tænd for strømmen til EKG-forstærkerboksen og den elektriske stimuleringscontroller, og start derefter den refererede EKG-software og overvåg EKG kontinuerligt.
- Udfør de efterfølgende trin i mørket, når hjertet når en stabil tilstand (hjertet slår rytmisk ved ~ 400 bpm).
- 50 μL 10 mM blebbistatinopløsning blandes med 50 ml Krebs-opløsning for at nå en koncentration på 10 μM. Rengør konstant blebbistatin-Krebs-opløsningsblandingen i hjertet i 10 minutter for at afkoble sammentrækning fra excitation og undgå sammentrækningsartefakter under optagelsen.
- Brug en rød lommelygte til at kontrollere, om hjertekontraktionen stopper helt, fordi sammentrækning vil påvirke farvestofbelastningskvaliteten.
- Efter afkobling af excitationskontraktion blandes 15 μL Rhod-2 AM stamopløsning med 15 μL Pluronic F127 stamopløsning i 50 ml Krebs-opløsning for at opnå de endelige koncentrationer på 0,267 μM Rhod-2 AM og 0,198 μM Pluronic F127. Derefter perfuseres hjertet kontinuerligt med Rhod-2 AM arbejdsløsning i 15 minutter i Langendorff perfusionssystemet.
- Hold iltforsyningen under intracellulær calciumfarvestofbelastning. Da bobler let dannes i Pluronic F127, skal du indsætte en boblefælde i perfusionssystemet for at undgå gasembolisering af koronarerne.
- 10 μL RH237 stamopløsning fortyndes i 50 ml perfusat for at nå den endelige koncentration ved 0,402 μM, og belastningen udføres i 10 minutter.
- Ved afslutningen af dobbeltfarveindlæsning skal du tage en sekvens af fotos for at sikre, at både spændings- og calciumsignaler er tilstrækkelige til analyse (ingen interaktion mellem to signaler).
- Optisk kortlægning og arytmi induktion
BEMÆRK: Optisk kortlægning starter efter ophør af sammentrækning og en passende farvebelastning, og hjertet perfuseres fortløbende som i trinene beskrevet ovenfor i 2.1 (4).- Tænd de to lysdioder for excitationslys, og juster deres intensitet i et passende område (stærkt nok til belysning og relativt ligetil filmoptagelse, men ikke for robust til overeksponering).
- Placer hjertet under detekteringsenheden, sørg for, at den er under tilstrækkelig belysning af to lysdioder, og juster lyspunktdiameteren til 2 cm.
- Indstil arbejdsafstanden fra objektivet til hjertet til 10 cm, hvilket giver en samplinghastighed på næsten 500 Hz og en rumlig opløsning på 120 x 120 μm pr. pixel.
- Åbn signalsamplingssoftwaren for at styre kameraet digitalt for at fange spændings- og calciumsignaler samtidigt.
- Start myopacerfeltstimulatoren, og indstil pacingmønsteret ved Transistor Transistor Logic (TTL), 2 ms pacing varighed for hver puls og 0,3 V som en indledende intensitet.
- Brug 30 på hinanden følgende 10 Hz S1-stimuli til at teste hjertets diastoliske spændingstærskel drevet af EKG-optagelsessoftwaren. Forøg gradvist spændingsamplituden, indtil 1: 1-optagelse realiseres (kontroller QRS-bølge fra EKG-skærmen, handlingspotentiale (AP) og calciumtransienter (CaT) signaler).
- Efter bestemmelse af spændingstærsklen, tempo hjertet med en intensitet på 2x den diastoliske spændingstærskel med et par platinelektroder fastgjort til epikardialen i venstre ventrikel (LV) apex (ELVA).
- Implementer S1S1-protokollen til måling af calcium eller virkningspotentielle alternaner og restitutionsegenskaber. Tempo hjertet fortløbende ved en grundlæggende cykluslængde på 100 ms, faldende 10 ms af cykluslængden hver efterfølgende sekvens, indtil 50 ms er nået. Hver episode indeholder 30 på hinanden følgende stimuli med en pulsbredde på 2 ms. Start samtidig optisk kortlægning før stimulering (prøvetagningstid inkluderer ~ 10 sinusrytmer og tempovarighed).
- For at måle den ventrikulære effektive ildfaste periode (ERP) ved hjælp af S1S2-stimulusprotokollen skal du begynde med en S1S1-pacingcykluslængde på 100 ms med en S2 koblet ved 60 ms med en 2 ms trinreduktion, indtil S2 ikke fanger ektopisk QRS-kompleks.
- Til arytmi induktion, udfør evig 50 Hz burst pacing (50 kontinuerlige elektriske stimuleringer med en 2 ms pulsbredde), og udfør den samme pacing episode efter et 2 s interval af hvile.
- Overhold EKG-optagelser omhyggeligt i den kontinuerlige højfrekvente pacingperiode, så de samtidige optiske kortlægningsoptagelser kan starte straks, når en interessant arytmisk EKG-bølge genererer (da de fleste hjertearytmier induceres af elektrisk pacing, samples de optiske signaler 2-3 s før burstpacing i tilfælde af tab af vigtige hjertehændelser).
- Billede med EMCCD-kamera (samplinghastighed: 500 Hz, pixelstørrelse: 64 x 64).
- Analyse af data
- Billedindlæsning og signalbehandling
- Tryk på Vælg mappe, og indlæs billeder for at indlæse billederne i billedoptagelsessoftwaren til halvautomatisk massiv videodataanalyse i henhold til den tidligere beskrevne opsætning og protokol15,16.
- Indtast de korrekte samplingparametre (f.eks. pixelstørrelse og billedhastighed).
- Indstil billedtærsklen ved manuel indtastning, og vælg interesseområdet (ROI).
- Implementer et 3 x 3 pixel Gaussisk rumligt filter, et Savitzky-Goaly-filter og en baselinekorrektion med tophat.
- Tryk på Behandl billeder for at fjerne basislinjen og beregne de elektrofysiologiske parametre, såsom APD80 og CaTD50.
- Analyse af elektrofysiologiske parametre
- Indstil initieringstiden for APD ved toppen og terminalpunktet ved 80% repolarisering (APD80) til beregning af APD80. På samme måde defineres CaTD-starttid som toppen, og terminalpunktet defineres som 80% afslapning.
- Måling af ledningshastighed (CV) afhænger af pixelstørrelsen og aktionspotentialledningstiden mellem to pixels eller mere. Beregn gennemsnitshastigheden fra alle de valgte pixels - dette er den gennemsnitlige ledningshastighed for det valgte område. Generer tilsvarende isochronale kort samtidigt for et klart overblik over ledningsretningen.
BEMÆRK: O'Shea et al.15 rapporterede CV-målingen i detaljer. - Til alternener og arytmianalyse defineres calciumalternaner som en kontinuerlig stor og lille topamplitude, der vises alternativt. Brug topamplitudeforholdet til at vurdere sværhedsgraden af frekvensafhængige alternaner (1-A2/A1). Anvend fasekort til at analysere komplekse arytmier som ventrikulær takykardi (VT). Se efter rotorerne, der vises tydeligt i et bestemt område, når rotorerne skifter.
- Billedindlæsning og signalbehandling
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optisk kortlægning har været en populær tilgang til at studere komplekse hjertearytmier i det sidste årti. Den optiske kortlægningsopsætning består af et EMCCD-kamera, der giver en samplinghastighed på op til 1.000 Hz og en rumlig opløsning på 74 x 74 μm for hver pixel. Det muliggør et ret højt signalstøjforhold under signalprøveudtagning (figur 1). Når Langendorff-perfunderet hjerte når en stabil tilstand, og farvestofbelastningen er afsluttet, placeres hjertet i det homotermiske kammer under belysning af to 530 nm LED'er, der bruges til excitation af spændingsindikatoren RH237 og Ca2+ indikatoren Rhod-2 AM. Emissionslyset opdeles i to bølgelængder på 600 nm (for Ca2+) og 670 nm (for Vm), som detekteres samtidigt ved hjælp af EMCCD-kameraet. Efter perfusion af avertin og heparin i 15 minutter skal du bruge de kirurgiske instrumenter (figur 2A) til at åbne brystet og hurtigt trække hjertet ud og derefter overføre det til den kolde Krebs-opløsning (4 ° C, 95% O 2, 5% CO2) (figur 2B). Rens de omgivende væv omhyggeligt, fastgør aorta med en 4-0 sutur, og et 0,7 mm plastrør indsættes i venstre ventrikel (figur 2C) for at frigøre overbelastningen af perfusatet i venstre ventrikelkammer. Sæt EKG-ledningerne ind i perfusatet (figur 2D), og sørg for, at hjertet slår rytmisk i henhold til EKG-overvågning drevet af EKG-optagelsessoftwaren. Udfør derefter dobbeltfarveindlæsning i mørke (figur 2E).
Efter at sammentrækningsartefakter er blevet minimeret af blebbistatin (10 μM), og en passende farvestofbelastning er afsluttet, startede optagelserne i ca. 10 sinusslag før S1S1-pacingprotokollen for at evaluere frekvensafhængige elektrofysiologiske parameterrestitutionsegenskaber og calciumalternaner efter isoproterenol (1 μM ISO) udfordring (figur 3A). Figur 3B viser en repræsentativ EKG-bølgefront af VT og tilsvarende aktionspotentiale (AP) og CaT-spor induceret af en 50 Hz burstpacingsekvens i en CPVT-mus. Optisk signalbilledbehandlingssoftware bruges til at gennemføre en halvautomatisk analyse af massive videodata.
Figur 4A,B viser typiske spor og varmekort over henholdsvis APD80 og CaTD80. ISO forkorter APD80 i WT- og CPVT-mus, men der blev ikke fundet nogen forskel mellem WT- og CPVT-mus før og efter ISO-udfordringen (figur 4C, **P < 0,01. n = 5/6). Figur 4D indikerer, at CaTD80 i CPVT-mus er længere end i WT efter ISO-udfordringen, mens der ikke var nogen betydning før ISO-behandling (**P < 0,01. n = 6.).
Til ledningsmåling viser figur 5A en enkelt vektoralgoritme til kvantificering af CV. Ifølge spændingssignalerne har WT- og CPVT-hjerterne den samme ledningsevne over epikardiet ved baseline og efter ISO-intervention (figur 5B). Figur 5C,D viser de repræsentative aktiveringskort over spænding og calcium i WT- og CPVT-hjerter før og efter ISO-udfordringen.
Calciumalternener er en kritisk parameter for arytmi. Calciumamplitude alternans beregnes i henhold til formuleringen som vist i figur 6A. Calciumsignaler i WT-hjerter forbliver stabile ved baseline under fortløbende S1S1-pacing ved 14,29 og 16,67 Hz (figur 6B), mens CPVT-hjerter viser frekvensafhængige alternaner (figur 6C). Efter ISO-udfordringen udviser CPVT-hjerter frekvensafhængige alternener i calciumsignal under S1S1-pacing, mens WT-hjerter ikke påvirkes (figur 6D, E). Efter kontinuerlig S1S1-pacing udføres en burstpacing-protokol for at inducere dødelige arytmier. WT- og CPVT-hjerter udviser normal ledning under 50 Hz burst-pacing ved baseline (figur 7A). Efter perfusion med ISO viser CPVT-hjerter højfrekvente rotorer efter 50 Hz bursthastighed, mens WT-hjerter opretholder normal ledning (figur 7B).
Figur 1: Optisk kortlægningsapparat. Systemet inkluderer et specialdesignet EMCCD-kamera med en høj rumlig-tidsmæssig opløsning (samplinghastighed op til 1.000 Hz, minimal samplingpixel 74 x 74 μm). En elektrisk stimuleringsregulator bruges til prøveudtagning og output elektrisk stimuleringsprotokol. To grønne lysdioder bruges til excitationslyset af fluorescensprober. Et dikroisk spejl med lang passage (610 nm) og tilsvarende emittere splitter spændings- og calciumfluorescensemissionslysene. RH237, det spændingsfølsomme farvestof, har et emissionslys ved en maksimal bølgelængde på 670 nm, mens Rhod-2 AM, det calciumfølsomme farvestof, har et emissionslys ved en maksimal bølgelængde på 600 nm. Mindre ændringer i begge fluorescenssignaler kunne opfanges af kameraet samtidigt på grund af kamerasensorens høje samplinghastighed og følsomhed. Forkortelser: EMCCD = elektronmultiplicerende ladningskoblet enhed; LED = lysemitterende diode; EKG = elektrokardiogram. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Forberedelse og dobbeltfarvning . (A) De kirurgiske instrumenter. (B) Høst af musehjertet. (C) Afskær det unødvendige væv omhyggeligt for at få et klart udsyn over aorta, og indsæt et 0,7 mm plastrør fra aorta i venstre ventrikel. (D) Hjertet fjernes hurtigt til Langendorff-perfusionssystemet. (E) Dual-dye loading og excitation-contraction ophør i mørke. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: S1S1-protokol og arytmi-induktionsprotokol . (A) Repræsentativ EKG-bølgefront og tilsvarende AP- og calciumsignalspor ved hjælp af S1S1-pacingprotokol efter ISO-udfordring. B) VT-induktion ved en 50 Hz burstpacingsekvens efter perfusion af ISO i en CPVT-mus. Forkortelser: EKG = elektrokardiogram; AP = aktionspotentiale; ISO = isoproterenol; VT = ventrikulær takykardi; CPVT = katekolaminerg polymorf ventrikulær takykardi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: APD80- og CaTD80-analyse ved 10 Hz før og efter ISO-udfordring. (A) Repræsentative AP-spor og APD80-varmekort over WT- og CPVT-hjerter før og efter ISO-behandling. (B) Typiske CaT-spor og CaTD80-varmekort over WT- og CPVT-hjerter før og efter ISO-udfordringen. (C) ISO forkorter APD80 i WT- og CPVT-mus, men der findes ingen forskel mellem WT- og CPVT-mus før og efter ISO-udfordringen. (D) CaTD80 i CPVT-mus er længere end i WT efter ISO-udfordring, mens der ikke var nogen betydning før ISO-behandling. (* P < 0,05, **P < 0,01. n = 5/6.) Forkortelser: AP = aktionspotentiale; APD80 = peak ved 80% repolarisering; ISO = isoproterenol; CPVT = catecholaminerg polymorf ventrikulær takykardi; WT = vildtype. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Ledningshastighedsanalyse ved 10 Hz. (A) Den enkelte vektoralgoritme for ledningshastighed. (B) Ingen forskel i AP's CV hos WT- og CPVT-mus. (C) Repræsentative varmekort viser, at CPVT-mus har samme ledningsevne som WT-mus før og efter ISO-udfordringen i henhold til spændingssignaler. (D) Der findes ingen signifikant forskel i de to grupper for CaT80-isokroner før og efter ISO-udfordringen. Forkortelser: AP = aktionspotentiale; ISO = isoproterenol; CPVT = catecholaminerg polymorf ventrikulær takykardi; WT = vildtype; AT = aktiveringstid; CV = ledningshastighed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Analyse af calciumamplitude alternener. (A) Algoritmen til beregning af calciumamplitude alternere. (B) Calciumsignaler i WT-hjerter forbliver stabile ved baseline under på hinanden følgende S1S1-pacing ved 14,29 og 16,67 Hz, mens (C) CPVT-hjerter viser frekvensafhængige alternener. (D) WT-hjerter påvirkes ikke af ISO-udfordringen, mens (E) efter ISO-udfordringen udviser CPVT-hjerter frekvensafhængige alternener i calciumsignal under S1S1-pacing. Forkortelser: ISO = isoproterenol; CPVT = catecholaminerg polymorf ventrikulær takykardi; WT = vildtype. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Takyarytmianalyse ved hjælp af fasekort . (A) WT- og CPVT-hjerter udviser normal ledning under 50 Hz bursthastighed ved baseline. (B) Efter perfusion med ISO viser CPVT-hjerter højfrekvente rotorer efter 50 Hz bursthastighed, mens WT-hjerter opretholder normal ledning. Forkortelser: ISO = isoproterenol; CPVT = catecholaminerg polymorf ventrikulær takykardi; WT = vildtype. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Baseret på vores erfaring inkluderer nøglerne til en vellykket dobbeltfarvet optisk kortlægning af et musehjerte en velforberedt løsning og hjerte, farvestofbelastning, opnåelse af det bedste signal-støj-forhold og reduktion af bevægelsesartefakten.
Fremstilling af opløsning
Krebs-løsningen er afgørende for et vellykket hjerteeksperiment. MgCl2- ogCaCl2-stamopløsninger (1 mol/l) fremstilles på forhånd under hensyntagen til deres vandabsorption og tilsættes Krebs-opløsningen, efter at alle andre komponenter er opløst i rent vand, fordi Mg 2+ og Ca 2+ let kan udfældes med CO3 2+. Krebs-opløsningen bobles med 95%O2/5% CO2 i mindst 30 minutter for at sikre iltning. Fordi musens hjerte er særligt følsomt over for pH, bør opløsningens pH være omkring 7,4 efter iltning. Selvom små partikler er i opløsningen, kan de eksperimentelle resultater blive påvirket, fordi disse partikler kan blokere kapillærerne og påvirke perfusionseffekten. Derfor filtreres opløsningen ved hjælp af et 0,22 μm aseptisk nålefilter før brug.
Hjerte forberedelse
Før hjerter høstes, hepariniseres musene først for at undgå dannelse af blodpropper i koronararteriesystemet, hvilket forhindrer dårlig farvestofperfusion forårsaget af hjertestop i at påvirke den efterfølgende billeddannelse. Jo kortere hjertets iskæmiske tid, jo bedre er hjertets tilstand. Derfor styres den iskæmiske tid inden for 2-3 minutter fra hjerter høstes til kanylering via aorta på Langendorff-systemet. Derudover er velholdt perfusionstryk også vigtigt. Derfor indsættes et tyndt silikone (plast) rør i venstre ventrikulære hulrum for at undgå, at venstre ventrikulære tryk bliver for højt under ventrikulær sammentrækning, efter at venstre ventrikeludløb er ligeret, hvilket kan resultere i dårlig myokardieperfusion og forsuring af anoxisk væv.
Indlæsning af farvestof
Disse eksperimenter udfører farvestofbelastning ved at perfusere hjertet i Langendorff-systemet. Det er afgørende at overvåge hjerterytmen, fordi dårlig farvestofbelastning vil forekomme, når den unormale rytme skyldes kirurgiske operationer eller iskæmi-reperfusionsskader. Hjertet skal være sundt nok til at udføre de efterfølgende trin. Rhod-2 AM, et Ca2+-følsomt farvestof, er et acetylmethylesterderivat af Rhod 2, som let indlæses i celler i sin AM-form. En 100 gange stigning i molekylets fluorescensintensitet skyldes Ca2+ chelation17. Pluronic F127 er inkorporeret i Rhod-2 AM-belastningsopløsningen for at forhindre Rhod-2 AM i at polymerisere i bufferen og hjælpe den med at komme ind i cellerne. Pluronic F127 kan reducere stabiliteten af Rhod-2 AM, så det anbefales kun at tilføje det, når du forbereder arbejdsløsningen, men ikke i opbevaringsopløsningen til langtidsopbevaring. Det spændingsfølsomme farvestof RH237 anvendes i denne undersøgelse på grund af dets gunstige spektrale egenskaber til brug med Ca2+ indikator Rhod-2 AM.
Opnåelse af det bedste signal-støj-forhold
At få billeder med høje signal-støj-forhold er målet for billeddannelse, men støj er som et skyggefuldt spøgelse, der altid forårsager problemer. På grund af svage signaler er lavere støj særlig vigtig i nogle mikroskopiske højhastighedsbilleddannelsesapplikationer, såsom optisk kortlægning. Signal-støj-forholdet (SNR) beregnes som det kvadratiske middelamplitudeforhold til den kvadratiske middelstøj, hvor støjamplituden vurderes ved hvilepotentiale18. Nogle faktorer, såsom lyskilde, optiske filtre, fokuseringsoptik og fotodetektorer, er afgørende for at opnå den bedste SNR. I undersøgelsen undersøges prøvens baggrundsområde for støj, som ofte svinger på et lille niveau. Det optiske signal, der registreres af hver pixel, er gennemsnittet af udsendt lys fra dets overfladeareal. AP- og calciumaktiviteter svinger under arytmi, og begge signalers amplitude er relativt lav. Selv mindre interferens kan føre til forvrængning af optiske signaler og resultere i fejl i dataanalyse. Derfor bør fortolkningen af optiske signaler være forsigtig, når den lokale heterogenitet skyldes elektrisk funktion under arytmier som VT.
Reducer bevægelsesartefakten
Sammenlignet med elektrodeoptagelse påvirkes optiske signaler ofte af sammentrækningsaktiviteten af Langendorff-perfunderede hjerter på grund af bevægelsesartefakt. For at fange nøjagtige optiske signaler anvendes farmakologiske hæmmere af excitationskontraktion mest. For at minimere bevægelsesartefakten under billeddannelse vedtages blebbistatin for at forhindre hjertet i at slå. Det er en selektiv hæmmer af ATPase-aktiviteten af ikke-muskelmyosin II og afkobler effektivt excitationskontraktionsprocessen i hjertet 19,20,21. Selvom nogle undersøgelser indebærer nogle bivirkninger ved hjælp af forbindelsen22, bruger vi den laveste arbejdskoncentration ved 10 μM for at minimere den mulige skade på hjertet.
ElectroMap-software til analyse af datasæt til optisk kortlægning af hjerter
ElectroMap er en open source-software med høj kapacitet til analyse af hjerteoptiske kortlægningsdatasæt. Det giver en analyse af de vigtigste hjerteelektrofysiologiske parametre, herunder AP- og CaT-morfologi, CV, diastolisk interval, dominerende frekvens, tid til top og afslapningskonstant (τ) 15,23. Softwaren tillader flere filtreringsmuligheder, herunder Gaussisk filter, Savitzky-Goaly-filter og Top-hat baseline-korrektion. Gaussisk filter er en todimensionel udjævning ved at beregne den vægtede gennemsnitlige udjævning af hver kanal og tilstødende kanaler. Det bruges almindeligvis til spike glitch støj. Savitzky-Goaly-filter passer til et lavere polynomium og en kontinuerlig delmængde af tilstødende datasæt gennem den mindst kvadratiske metode, som opfylder behovet for forskellige glatte filtreringer og også er effektiv til behandling af ikke-periodiske og ikke-lineære datasæt afledt af støj. Top-hat baseline korrektion kan justere de optiske signaler til samme højde i henhold til sporets toppe og beregne parametre som aktionspotentiel varighed (APD) og calcium transient varighed (CaTD) meget mere præcist. Baseline drift forekommer lejlighedsvis ved prøveudtagning af spændings- og calciumfluorescenssignaler. Det er også nyttigt ved beregning af calciumalternaner og amplitude. Begge ventrikler blev udvalgt til elektrofysiologisk undersøgelse.
Fordele og ulemper ved dual-dye kortlægning og metoder til at begrænse interferens
I de senere år er det blevet indset, at det er vigtigt at afklare celledepolarisering eller repolarisering og intercellulær ledningsheterogenitet i hele hjertet samt kobling af membranuret og calciumuret, hvilket er afgørende for at forstå mekanismen for sygdomme som arytmi24,25. Optisk kortlægning har en høj spatiotemporal opløsning til bestemmelse af ventrikulær aktivering og repolariseringsegenskaber i hjertet af transgene mus26,27,28,29. Det kan også detektere multiparameterbilleddannelse, for eksempel måling af membranpotentiale og intracellulært calcium af det samme hjerte24,30 eller væv31,32 fyldt med spænding og calciumfølsomt farvestof. Dual-dye imaging er gavnligt for at studere forholdet mellem handlingspotentiale og calcium, såsom forholdet mellem membran (M) ur og Ca2 + (C) -ur eller spontan calciumfrigivelse og forsinket efter depolarisering (DAD). Normal hjerteexcitation kræver derefter, at de cykliske begivenheder i de to ure justeres. Forstyrrelse i denne tilpasning fører til arytmi25. Forholdet mellem spontan calciumfrigivelse og DAD er mekanismen til at udløse aktiviteter ved hjertesvigt 33. Kombinationen af farvestoffer bør dog vælges omhyggeligt. Kombinationen af RH-237 / Rhod-2 eller di-4-ANEPPS / Indo-1 tillader samtidig optagelse, mens Fluo-3/4 / di-4-ANEPPS vil føre til fejl på grund af overlappende emissionsspektre af to farvestoffer30,34,35. Dette eksperiment valgte RH237 og Rhod-2 AM til at indlæse hjertet og opnåede god billedkvalitet.
Derudover har kameraet, der bruges i denne protokol, to målflader, som gør det muligt at fange de delte signaler på en prøveudtagningsgrænseflade og gør det muligt for et enkelt kamera at registrere to forskellige emissionsbølgelængder. En sådan samtidig kortlægning af optisk AP og CaT, der kombinerer forskellige fotoelektronspektroskopiprotokoller (PES), vil give os mulighed for at bestemme sammenhængen mellem unormal [Ca2+]i og elektrisk ustabilitet under stressforhold og effekten af postaktiveringsforstærkning på disse anomalier. Den rumligt heterogene karakter af SR Ca2+ cykling, og hvordan dette påvirker fremkomsten, sværhedsgraden og konkordansen af elektriske alternener og arytmogen adfærd, såsom rumligt uoverensstemmende alternere og deraf følgende VT'er, vil blive undersøgt i det intakte hjerte i forskellige grupper. SR Ca 2+ alternere, RyR2 ildfasthed og deres rolle i SR Ca2+ og APD alternans vil blive undersøgt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har nogen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Denne undersøgelse støttes af National Natural Science Foundation of China (81700308 til XO og 31871181 til ML og 82270334 til XT), Sichuan Province Science and Technology Support Program (CN) (2021YJ0206 til XO, 23ZYZYTS0433 og 2022YFS0607 til XT og 2022NSFSC1602 til TC) og State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 til XO), MRC (G10031871181 til ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE i Oxford (ML) tilskud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
References
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
- Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
- Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
- Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
- Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
- Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al.
- Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
- Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
- Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
- Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
- Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
- O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
- Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
- Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
- Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
- Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
- Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
- Mal Baudot,, et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
- Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
- Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
- Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
- Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
- He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
- Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).
