Summary
このプロトコルは、高い時間的および空間的分解能の膜貫通電圧および細胞内Ca2+ トランジェントの電気生理学的測定を含む、カテコールアミン作動性多形心室頻拍の影響を受けた野生型およびノックイン動物から得られるマウス心臓の二重染料光学マッピングを導入します。
Abstract
不整脈誘発性心疾患であるカテコールアミン作動性多形性心室頻拍(CPVT)は、身体活動、ストレス、またはカテコールアミンチャレンジ後の多形性心室頻拍エピソードとして現れ、致命的な心室細動に悪化する可能性があります。マウスの心臓は、CPVTを含む遺伝性不整脈疾患のモデル化に広く用いられている種です。ランゲンドルフ灌流マウス心臓の膜貫通電位(Vm)とカルシウム過渡現象(CaT)の同時光学マッピングは、不整脈発生のメカニズムを解明する可能性を秘めています。細胞レベルの調査と比較して、光学マッピング技術は、活性化、伝導速度、活動電位持続時間、CaT持続時間の決定など、いくつかの電気生理学的パラメータをテストできます。この論文では、マウス野生型およびヘテロ接合体RyR2-R2474S/+心臓におけるCaTおよびVmのハイスループット光学マッピングのための装置セットアップと実験手順を、イソプロテレノールチャレンジの前および最中にプログラムされた電気ペーシングと組み合わせて紹介します。このアプローチは、ex vivoマウスの心臓調製物におけるCPVT疾患を機構的に研究するための実行可能で信頼性の高い方法を実証しました。
Introduction
遺伝性心疾患カテコールアミン作動性多形性心室頻拍 (CPVT) は、身体活動、ストレス、またはカテコールアミンの挑戦に続く多形性心室頻拍 (PVT) エピソードとして現れ、致命的な心室細動に悪化する可能性があります 1,2,3,4 .1995年に臨床症候群として最初に報告された最近の証拠は、この状態での筋小胞体(SR)ストアCa2+放出に関与する7つの遺伝子の変異に関与しています:最も頻繁に報告されているCa 2+放出チャネル5,6、FKBP12.67、心臓カルセクエトリン8をコードするCASQ2、TRDNのリアノジン受容体2(RyR2)をコードするRYR2接合部SRタンパク質トリアジン9をコードし、CALM1 9、CALM2 10、およびCALM3をコードするカルモジュリン11,12をコードする。 これらの遺伝子型パターンは、不整脈事象をSR貯蔵Ca2+12の無秩序な病理学的放出に起因させる。
SRからの自発的なCa2+放出は、Ca2+スパークまたはCa2+波として検出され、Na+/Ca2+交換体(NCX)を活性化します。1つのCa2+を3つのNa+に交換すると、内向きの電流が発生し、拡張期の脱分極が加速し、膜電圧が活動電位(AP)の閾値まで上昇します。RyR2ノックインマウスでは、洞房リンパ節(SAN)におけるRyR2R4496Cの活性の増加により、拡張期のCa、LおよびSR Ca2+の枯渇のCa2+依存性の減少によるSANの自動性の予期せぬ低下が起こり、CPVT患者のSAN機能障害に寄与する細胞内病態生理学的変化が特定されました13,14。関連する心筋細胞細胞質Ca2+波の発生は、イソプロテレノール(ISO)を含むカテコールアミンによるRyR感作後のバックグラウンド細胞質[Ca2+]の増加に続いてより可能性が高くなります。
無傷の心臓CPVTモデルで観察された心室性不整脈の原因である可能性のある活動電位(AP)活性化に応答したRyR2を介したCa2+放出後のCa2+シグナル伝達の詳細な動態変化は、報告されたRyR2遺伝子型の全範囲について決定されるべきです12。この論文では、マウス野生型(WT)およびヘテロ接合体RyR2-R2474S/+心臓におけるCa2+シグナルと膜貫通電位(Vm)のハイスループットマッピングのための装置セットアップと実験手順を、イソプロテレノールチャレンジの前後のプログラムされた電気的ペーシングと組み合わせて紹介します。このプロトコルは隔離されたマウス中心のCPVTの病気のメカニズムの調査に方法を提供する。
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Protocol
実験には、体重20〜25gの10〜14週齢の雄の野生型マウスまたはRyR2-R2474S/+マウス(C57BL/6バックグラウンド)を使用します。すべての手順は、中国四川省の西南医科大学の動物管理および使用委員会(承認番号:20160930)によって承認されており、機関が運営する国のガイドラインに準拠しています。
1. 事前準備
- ストックソリューション
- ブレビスタチン原液:2.924 mgの(-)ブレビスタチン粉末を含む元のフラスコに100%ジメチルスルホキシド(DMSO)1 mLを加え、濃度を10 mMにします。
- 電圧指示器RH237原液:1 mLの100%DMSOを1 mgのRH237粉末とともに元のフラスコに加え、濃度を2.01 mMにします。
- カルシウムインジケーター Rhod-2 AM 原液:1 mL の 100% DMSO を 1 mg の Rhod-2 AM 粉末に添加し、濃度を 0.89 mM にします。
- Pluronic F127 原液:100% DMSO 1 mL を 200 mg の Pluronic F127 に添加し、濃度が 20% w/v(0.66 mM)になるようにします。
- ストック溶液を200 μLのPCRチューブに21〜51 μL(RH237 21 μL、Rhod-2 AM31 μL、ブレビスタチン51 μL)で分注し、凍結融解を繰り返さないように単回または2回使用します。次に、溶液をアルミホイルで包み、-20°Cで保存します(Pluronic F127原液は室温の暗室に置いた場合を除く)。
- 灌流液
- クレブス溶液(単位:mM):1 Lのクレブス溶液(NaCl 119、NaHCO3 25、NaH 2 PO 4 1.0、KCl4.7、MgCl 2 1.05、CaCl2 1.35、およびグルコース10)を調製します。
- 0.22 μmの無菌ニードルフィルターで溶液をろ過し、95% O 2/5% CO2で酸素化します。
- 40 mLのクレブス溶液を50 mLの遠心チューブに入れ、フォローアップの心臓分離のために4°Cで保存します。
- ランゲンドルフ灌流システムおよび光学マッピング装置
- ランゲンドルフ灌流システムをセットアップします。
- ウォーターバスをオンにし、温度を37°Cに設定します。
- ランゲンドルフ灌流システムを1Lの脱イオン水で洗浄します。
- 吸気管から溶液を灌流し、流出速度を3.5〜4 mL / minに調整します。次に、灌流液をO 2 / CO2(95%/ 5%)ガスで37°Cで酸素化します。
注:灌流システムでは気泡は決して許可されません。
- 光学マッピングシステムを準備します。
- 電子増倍電荷結合素子(EMCCD)カメラ(512 × 512ピクセル)、レンズ(倍率40倍)、波長分配器発光ダイオード(LED)、心電図(ECG)モニタ、および刺激電極を取り付けます(図1)。
- レンズから心臓の位置までの適切な作動距離を調整します。
- 恒温槽の対角線上に2つのLEDを設置して均一に照らし、励起光を発生させる波長を530nmにします。ET525/50スパッタコーティングフィルタを使用して、LEDの帯域外光を除去します。
- ハンドルスイッチを調整してターゲット表面の正方形を均等にし、電圧とカルシウムの画像がアクイジションインターフェースに適切に表示されるようにします。
- レンズの口径を最大径まで回して、電圧やカルシウム信号の漏れを防ぎます。
- カメラのレンズは、恒温槽までの作動距離が長いため、適切な高さに調整し、主に10cmが使用されます。
- カメラの電源を入れると、サンプリング温度が-50°Cで安定します。
- ランゲンドルフ灌流システムをセットアップします。
2. 手続き
- マウスの心臓採取、カニューレ挿入、灌流
- 動物にアベルチン溶液(1.2%、0.5〜0.8 mL)とヘパリン(200単位)を腹腔内に注射して、苦痛と痛みの反射を最小限に抑え、血栓の形成を防ぎます。.15分後、子宮頸部脱臼で動物を犠牲にします。
- はさみで胸を開き、心臓を慎重に採取し、冷たいクレブス溶液(4°C、95%O 2、5%CO2)に入れて代謝を遅くし、心臓を保護します。
- 大動脈の周囲組織を切除し、特注のカニューレ針(外径:0.8mm、内径:0.6mm、長さ:27mm)で大動脈をカニューレ挿入し、4-0のシルク縫合糸で固定します。
- 3.5〜4.0 mL / minの一定速度でLangendorffシステムで心臓を灌流し、温度を37〜1°Cに保ち±。
メモ: 以降のすべての手順は、この状態で実行されます。 - 小さなプラスチックチューブ(直径0.7 mm、長さ20 mm)を左心室に挿入して、チャンバー内の溶液のうっ血を解放し、過負荷を回避します。
- 励起収縮と二重色素の担持の非結合器
- 浴槽の灌流液に2本のリード線を入れ、心電図アンプボックスと電気刺激コントローラーの電源をオンにしてから、参照された心電図ソフトウェアを起動し、心電図を継続的に監視します。
- 心臓が安定した状態に達したら(心臓が~400 bpmでリズミカルに鼓動している)、暗闇の中で次の手順を実行します。
- 50 μL の 10 mM ブレビススタチン原液と 50 mL のクレブス溶液を混合して、濃度を 10 μM にします。 ブレビスタチンとクレブス溶液の混合物を心臓に 10 分間常時灌流して、収縮と興奮を切り離し、撮影中の収縮アーチファクトを回避します。
- 赤い懐中電灯を使用して、収縮が染料の負荷品質に影響を与えるため、心臓の収縮が完全に停止するかどうかを確認します。
- 励起-収縮を切り離した後、15 μL の Rhod-2 AM 原液と 15 μL の Pluronic F127 原液を 50 mL のクレブス溶液中で混合し、最終濃度が 0.267 μM の Rhod-2 AM と 0.198 μM の Pluronic F127 になるようにします。次に、ランゲンドルフ灌流システムで Rhod-2 AM ワーキング溶液で 15 分間心臓を連続的に灌流します。
- 細胞内カルシウム色素のローディング中は酸素供給を維持してください。Pluronic F127では気泡が形成されやすいため、冠動脈のガス塞栓を避けるために、灌流システムに気泡トラップを挿入します。
- RH237原液10 μLを50 mLの灌流液に希釈し、最終濃度の0.402 μMに到達し、10分間ローディングします。
- デュアル色素のローディングが終了したら、一連の写真を撮影して、電圧信号とカルシウム信号の両方が分析に適していることを確認します(2つの信号間に相互作用がない)。
- 光学マッピングと不整脈誘導
注:光学マッピングは、収縮の停止と適切な色素のローディング後に開始され、心臓は上記の2.1(4)で説明した手順のように連続的に灌流されます。- 励起光用の2つのLEDを点灯させ、適切な範囲で強度を調整します(照明と比較的簡単な撮影には十分な強度ですが、露出オーバーには堅牢すぎません)。
- 心臓を検出装置の下に置き、2つのLEDが適切に照らされていることを確認し、光点の直径を2cmに調整します。
- レンズから心臓までの作動距離を10cmに設定することで、サンプリングレートは約500Hz、空間分解能は1ピクセルあたり120 x 120 μmになります。
- 信号サンプリングソフトウェアを開き、カメラをデジタルで制御して、電圧信号とカルシウム信号を同時にキャプチャします。
- ミオペーサー電界刺激装置を起動し、ペーシングパターンをトランジスタトランジスタロジック(TTL)、各パルスのペーシング期間2ms、初期強度として0.3Vに設定します。
- 30 回の連続した 10 Hz S1 刺激を使用して、ECG 記録ソフトウェアによって駆動される心臓の拡張期電圧しきい値をテストします。1:1の捕捉が実現されるまで、電圧振幅を徐々に増やします(ECGモニターからのQRS波、活動電位(AP)、およびカルシウム過渡現象(CaT)信号を確認します)。
- 電圧閾値を決定した後、左心室 (LV) 頂点 (ELVA) の心外膜に取り付けられた一対の白金電極を使用して、拡張期電圧閾値の 2 倍の強度で心臓のペースを調整します。
- S1S1プロトコルを実装して、カルシウムまたは活動電位の代替および反発特性を測定します。基本サイクル長100msで連続して心臓のペースを調整し、50msに達するまで、次のシーケンスごとにサイクル長を10ms減らします。各エピソードには、2msのパルス幅を持つ30の連続した刺激が含まれています。同時に、刺激の前に光学マッピングを開始します(サンプリング時間には、~10の洞リズムとペーシング時間が含まれます)。
- S1S2 刺激プロトコルを使用して心室有効耐火期間 (ERP) を測定するには、S1S1 ペーシング サイクル長を 100 ms とし、S2 を 60 ms で結合し、S2 が異所性 QRS 複合体を捕捉できなくなるまで 2 ms ずつ減らします。
- 不整脈誘発の場合、50 Hzのバーストペーシング(パルス幅2msで50回の連続電気刺激)を永続的に行い、2秒の安静後に同じペーシングエピソードを実行します。
- 興味深い不整脈性心電図波が発生したときに同時光マッピング記録をすぐに開始できるように、連続的な高周波ペーシング期間中に心電図記録を注意深く観察します(ほとんどの不整脈は電気ペーシングによって誘発されるため、光信号はサンプリングされます重要な心臓イベントが失われた場合、バーストペーシングの2〜3秒前に)。
- EMCCDカメラ(サンプリングレート:500Hz、画素サイズ:64×64)による画像。
- データ解析
- 画像読み込みと信号処理
- [フォルダの選択]と[画像の読み込み]を押して、画像を画像取得ソフトウェアにロードし、前述のセットアップとプロトコルに従って半自動的に大量のビデオデータ分析を行います15,16。
- 正しいサンプリングパラメータ( ピクセルサイズ や フレームレートなど)を入力します。
- 手動入力でイメージのしきい値を設定し、関心領域 (ROI) を選択します。
- 3 x 3 ピクセルのガウス空間フィルター、Savitzky-Goaly フィルター、およびトップハット ベースライン補正を実装します。
- [画像の処理]を押してベースラインを削除し、APD80やCaTD50などの電気生理学的パラメータを計算します。
- 電気生理学的パラメータ解析
- APD80を計算するために、ピークでのAPDの開始時間と80%再分極(APD80)での終点を設定します。同様に、CaTDの開始時間はピークとして定義され、終点は80%の緩和として定義されます。
- 伝導速度(CV)の測定は、画素サイズと2つ以上の画素間の活動電位伝導時間に依存します。選択したすべてのピクセルから平均速度を計算します-これは選択した領域の平均伝導速度です。対応する等時性マップを同時に生成して、伝導方向を明確に表示します。
注:O'Sheaら15 はCV測定を詳細に報告しています。 - オルタナンおよび不整脈の解析では、カルシウムオルタナンは、交互に現れる連続した大小のピーク振幅として定義されます。ピーク振幅比を使用して、周波数依存のオルタナン(1-A2 / A1)の重症度を評価します。心室頻拍(VT)などの複雑な不整脈を分析するためにフェーズマップを適用します。ローターが移動するにつれて、特定の領域にはっきりと現れるローターを探します。
- 画像読み込みと信号処理
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Representative Results
光学マッピングは、過去10年間、複雑な不整脈を研究する上で一般的なアプローチでした。光学マッピングのセットアップはEMCCDカメラで構成されており、各ピクセルで最大1,000Hzのサンプリングレートと74 x 74 μmの空間分解能を提供します。これにより、信号サンプリング時にかなり高い信号対雑音比が可能になります(図1)。ランゲンドルフ灌流された心臓が安定した状態に達し、色素のローディングが終了すると、心臓は2つの530 nm LEDの照明下でホモエザミックチャンバーに入れられ、電圧指示器RH237とCa2+指示薬Rhod-2 AMの励起に使用されます。発光光は600nm(Ca2+の場合)と670nm(Vmの場合)の2つの波長に分割され、EMCCDカメラで同時に検出されます。アベルチンとヘパリンを15分間灌流した後、手術器具(図2A)を使用して胸部を開き、心臓をすばやく抽出してから、冷たいクレブス溶液(4°C、95%O 2、5%CO2)に移します(図2B)。周囲の組織を注意深く洗浄し、大動脈を4-0縫合糸で固定し、0.7mmのプラスチックチューブを左心室に挿入して(図2C)、左心室の灌流液のうっ血を解放します。心電図リード線を灌流液に入れ(図2D)、心電図記録ソフトウェアによって駆動される心電図モニタリングに従って心臓がリズミカルに鼓動することを確認します。次に、暗所で二重色素ローディングを行います(図2E)。
収縮アーチファクトがブレビスタチン(10 μM)によって最小限に抑えられ、適切な色素のローディングが完了した後、S1S1ペーシングプロトコルの前に約10サイナスビートの撮影を開始し、イソプロテレノール(1 μM ISO)チャレンジ後の周波数依存の電気生理学的パラメータの反発特性とカルシウムオルタナンを評価しました(図3A)。 図3B は、VTの代表的なECG波面と、CPVTマウスの50Hzバーストペーシングシーケンスによって誘導される対応する活動電位(AP)およびCaTトレースを示しています。光信号イメージングソフトウェアを使用して、大量のビデオデータの半自動分析を完了します。
図4A、Bは、APD80とCaTD80の標準的なトレースとヒートマップをそれぞれ示しています。ISOはWTマウスとCPVTマウスでAPD80を短縮するが、ISOチャレンジ前後でWTマウスとCPVTマウスの間に差は認められなかった(図4C、**P < 0.01.n = 5/6)。図4Dは、CPVTマウスのCaTD80がISO処理後はWTよりも長いが、ISO処理前は有意性がなかったことを示している(**P < 0.01.n =6)。
導通測定の場合、図5AはCVを定量化するためのシングルベクトルアルゴリズムを示しています。電圧信号によると、WT心臓とCPVT心臓は、ベースライン時とISO介入後に心外膜全体で同じ伝導能力を持っています(図5B)。図5C、Dは、ISOチャレンジ前後のWTおよびCPVT心臓の電圧とカルシウムの代表的な活性化マップを示しています。
カルシウムアルテルナンは不整脈の重要なパラメータです。カルシウム振幅オルタナンは、図6Aに示すような定式に従って計算される。WT心臓のカルシウムシグナルは、14.29Hzと16.67Hzで連続したS1S1ペーシングの間、ベースラインで安定していますが(図6B)、CPVT心臓は周波数依存的なオルタナンを示します(図6C)。ISOチャレンジ後、CPVT心臓はS1S1ペーシング中にカルシウムシグナルに周波数依存的なオルタナンを示しますが、WT心臓は影響を受けません(図6D、E)。連続的なS1S1ペーシングの後、致命的な不整脈を誘発するためにバーストペーシングプロトコルが実行されます。WTおよびCPVT心臓は、ベースラインでの50Hzバーストペーシング中に正常な伝導を示します(図7A)。ISOによる灌流後、CPVTハートは50Hzバーストペーシング後に高周波ローターを示しますが、WTハートは正常な伝導を維持します(図7B)。
図1:光学マッピング装置。 このシステムには、高い時空間分解能(最大1,000Hzのサンプリングレート、最小サンプリングピクセル74 x 74 μm)を備えたカスタム設計のEMCCDカメラが含まれています。電気刺激コントローラは、サンプリングと出力電気刺激プロトコルに使用されます。蛍光プローブの励起光には2つの緑色LEDが使用されています。ロングパスダイクロイックミラー(610 nm)と対応するエミッターが、電圧とカルシウム蛍光の発光を分割します。感電性色素であるRH237はピーク波長670 nmの発光光を持ち、カルシウム感受性色素であるRhod-2 AMはピーク波長600 nmの発光光を持っています。カメラセンサーの高いサンプリングレートと感度により、両方の蛍光シグナルのわずかな変化をカメラで同時に捉えることができます。略語:EMCCD = 電子増倍電荷結合素子;LED =発光ダイオード;ECG = 心電図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:調製と二重色素のローディング。 (A)手術器具。(B)マウスの心臓の収穫。(C)大動脈がはっきりと見えるように不要な組織を慎重に切り取り、大動脈から左心室に0.7mmのプラスチックチューブを挿入します。(D)心臓はランゲンドルフ灌流システムに迅速に移動されます。(E)暗所での二重色素の負荷と励起収縮の停止。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:S1S1プロトコルと不整脈誘導プロトコル 。 (A)ISOチャレンジ後のS1S1ペーシングプロトコルを使用した代表的なECG波面と対応するAPおよびカルシウム信号トレース。(B)CPVTマウスにおけるISOの灌流後の50HzバーストペーシングシーケンスによるVT誘導。略語:ECG =心電図;AP = 活動電位;ISO =イソプロテレノール;VT = 心室頻拍;CPVT = カテコールアミン作動性多形性心室頻拍。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:ISOチャレンジ前後の10 HzでのAPD80およびCaTD80分析 。 (A)ISO処理前後のWTおよびCPVT心臓の代表的なAPトレースとAPD80ヒートマップ。(B)ISOチャレンジ前後のWTおよびCPVTハートの典型的なCaTトレースとCaTD80ヒートマップ。(C)ISOはWTマウスとCPVTマウスでAPD80を短縮するが、WTマウスとCPVTマウスの間にはISOチャレンジの前後で差は見られなかった。(D)CPVTマウスのCaTD80は、ISO試験前は有意性がなかったが、ISO試験後のWTよりも長い。(* P < 0.05, **P < 0.01. n =5/6.)略語:AP =活動電位;APD80 = 80%の再分極でピーク。ISO =イソプロテレノール;CPVT = カテコールアミン作動性多形性心室頻拍;WT = 野生型。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:10Hzでの伝導速度解析。 (A) 伝導速度の単一ベクトルアルゴリズム。(B)WTマウスとCPVTマウスのAPのCVに差はなかった。(C)代表的なヒートマップは、CPVTマウスが電圧信号に応じてISOチャレンジ前後のWTマウスと同等の伝導能を有することを示している。(D)活動電位誘導CaT80等時線については、ISOチャレンジ前後の2群で有意差は認められなかった。略語:AP =活動電位;ISO =イソプロテレノール;CPVT = カテコールアミン作動性多形性心室頻拍;WT = 野生型;AT = アクティベーション時間。CV = 伝導速度。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:カルシウム振幅のオルタナン分析。 (A)カルシウム振幅オルタナンを計算するアルゴリズム。(B)WT心臓のカルシウムシグナルは、14.29Hzと16.67Hzで連続したS1S1ペーシングの間、ベースラインで安定しているが、(C)CPVT心臓は周波数依存的なオルタナンを示す。(D)WT心臓はISOチャレンジの影響を受けませんが、(E)ISOチャレンジ後、CPVT心臓はS1S1ペーシング中にカルシウムシグナルに周波数依存的なオルタナンを示します。略語:ISO =イソプロテレノール;CPVT = カテコールアミン作動性多形性心室頻拍;WT = 野生型。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:位相マップを用いた頻脈性不整脈解析 。 (A)WTおよびCPVT心臓は、ベースラインでの50Hzバーストペーシング中に正常な伝導を示します。(B)ISOで灌流した後、CPVTハートは50Hzバーストペーシング後に高周波ローターを示しますが、WTハートは正常な伝導を維持します。略語:ISO =イソプロテレノール;CPVT = カテコールアミン作動性多形性心室頻拍;WT = 野生型。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
私たちの経験から、マウスの心臓の二重色素光学マッピングを成功させるための鍵は、十分に準備された溶液と心臓、色素のローディング、最高のS/N比の達成、およびモーションアーチファクトの低減です。
溶液の調製
クレブス溶液は、心臓実験を成功させるために不可欠です。MgCl 2 と CaCl2 の原液 (1 mol/L) は、Mg 2+ と Ca2+ が CO32+ で沈殿しやすいため、吸水性を考慮して事前に調製し、他のすべての成分を純水に溶かした後にクレブス溶液に添加します。クレブス溶液を95%O2/5%CO2で少なくとも30分間バブリングし、酸素化を確保します。マウスの心臓は特にpHに敏感であるため、酸素化後の溶液のpHは約7.4である必要があります。溶液中に微小な粒子があっても、これらの粒子が毛細血管を塞ぎ、灌流効果に影響を与える可能性があるため、実験結果に影響を与える可能性があります。したがって、溶液は使用前に0.22μmの無菌ニードルフィルターを使用してろ過されます。
心臓の準備
心臓を採取する前に、まずマウスをヘパリン処理して冠動脈系での血栓形成を防ぎ、心臓のうっ血による色素の灌流不良がその後の画像検査に影響を与えるのを防ぎます。心臓の虚血時間が短いほど、心臓の状態は良好です。したがって、虚血時間は、心臓が採取されてからランゲンドルフ系の大動脈を介してカニューレ挿入されるまで、2〜3分以内に制御されます。さらに、十分に維持された灌流圧力も不可欠です。したがって、細いシリコン(プラスチック)チューブが左心室腔に挿入され、左心室出口が結紮された後の心室収縮中に左心室圧が高すぎるのを防ぎ、心筋灌流不良および無酸素組織の酸性化を引き起こす可能性があります。
染料のローディング
これらの実験は、ランゲンドルフ系で心臓を灌流することによって色素のローディングを行います。外科手術や虚血再灌流損傷によって異常なリズムが引き起こされると、色素の負荷が不十分になるため、心拍リズムを監視することが重要です。心臓は、その後のステップを実行するのに十分な健康状態でなければなりません。Ca2+感受性色素であるRhod-2 AMは、Rhod 2のアセチルメチルエステル誘導体であり、AM形態で細胞に容易にロードされます。分子の蛍光強度が100倍に増加するのは、Ca2+ キレート化17による。Pluronic F127 は、Rhod-2 AM ローディング溶液に組み込まれており、Rhod-2 AM がバッファー内で重合するのを防ぎ、細胞への侵入を助けます。Pluronic F127はRhod-2 AMの安定性を低下させる可能性があるため、作業溶液を調製するときにのみ添加し、長期保存用の保存溶液には添加しないことをお勧めします。電位感受性色素RH237は、Ca2+ 指示薬Rhod-2 AMでの使用に有利なスペクトル特性のため、この試験で使用されています。
最高のS/N比を実現
S/N比の高い画像を得ることがイメージングの対象ですが、ノイズは常にトラブルを引き起こす影の幽霊のようなものです。信号が弱いため、光学マッピングなどの高速顕微鏡イメージングアプリケーションでは、低ノイズが特に重要です。信号対雑音比(SNR)は、二乗平均平方根ノイズに対する二乗平均平方根振幅比として計算され、ノイズ振幅は静止電位18で評価されます。光源、光学フィルター、集光光学系、光検出器などのいくつかの要因は、最高のSNRを実現するために不可欠です。この研究では、サンプルのバックグラウンド領域にノイズがないか調べますが、ノイズはしばしば小さなレベルで変動します。各ピクセルによって検出される光信号は、その表面積から放出された光の平均です。不整脈の間、APとカルシウムの活動は振動し、両方の信号の振幅は比較的小さいです。わずかな干渉でも光信号の歪みにつながり、データ解析のミスにつながる可能性があります。したがって、VTのような不整脈中の電気的機能によって局所的な不均一性が引き起こされる場合は、光信号の解釈に注意する必要があります。
モーションアーチファクトの低減
電極記録と比較して、光信号は、運動アーチファクトのために、ランゲンドルフ灌流心臓の収縮活性に影響されることがよくあります。正確な光信号を捕捉するために、励起収縮の薬理学的阻害剤が主に使用されます。イメージング中のモーションアーチファクトを最小限に抑えるために、心臓の鼓動を止めるためにブレビスタチンが採用されています。これは、非筋肉ミオシンIIのATPase活性の選択的阻害剤であり、心臓の興奮-収縮プロセスを効果的に切り離します19,20,21。いくつかの研究は、化合物22を使用したいくつかの副作用を示唆していますが、心臓への損傷の可能性を最小限に抑えるために、10μMの最低使用濃度を利用しています。
心臓光学マッピングデータセットの解析のためのElectroMapソフトウェア
ElectroMapは、心臓光学マッピングデータセットの解析のためのハイスループットなオープンソースソフトウェアです。APおよびCaT形態、CV、拡張期間隔、支配周波数、ピークまでの時間、および緩和定数(τ)15,23を含む主要な心臓電気生理学的パラメータの分析を提供します。このソフトウェアでは、ガウス フィルター、Savitzky-Goaly フィルター、トップハット ベースライン補正など、複数のフィルター オプションを使用できます。ガウスフィルタは、各チャンネルと隣接チャンネルの加重平均平滑化を計算することによる2次元平滑化です。これは、スパイクグリッチノイズに一般的に使用されます。Savitzky-Goalyフィルタは、最小二乗法により、隣接するデータセットの下位多項式および連続サブセットを適合させるため、さまざまな滑らかなフィルタリングのニーズを満たし、ノイズに由来する非周期的および非線形のデータセットの処理にも効果的です。トップハットベースライン補正は、トレースのピークに応じて光信号を同じ高さに調整し、活動電位持続時間(APD)やカルシウム過渡持続時間(CaTD)などのパラメータをより正確に計算できます。ベースラインドリフトは、電圧および蛍光カルシウム信号をサンプリングするときに発生することがあります。また、カルシウムの交互と振幅を計算するときにも役立ちます。両方の心室を電気生理学的検査のために選択しました。
二重色素マッピングの長所と短所、および干渉を制限する方法
近年、不整脈などの疾患のメカニズムを理解する上で重要な、心臓全体の細胞の脱分極や再分極、細胞間伝導の不均一性、膜時計とカルシウム時計の結合を明らかにすることが不可欠であることがわかってきました24,25。光学マッピングは、トランスジェニックマウスの心臓の心室活性化および再分極特性を決定するための高い時空間分解能を有する26,27,28,29。また、例えば、電圧およびカルシウム感受性色素を装填した同じ心臓24,30または組織31,32の膜電位および細胞内カルシウムの測定など、マルチパラメータイメージングを検出することもできる。二重色素イメージングは、膜(M)時計とCa2+(C)時計の関係、または自発的なカルシウム放出と脱分極後の遅延(DAD)など、活動電位とカルシウムの関係を研究するのに有益です。正常な心臓興奮では、2つの時計の周期的なイベントを揃える必要があります。このアライメントの乱れは、不整脈25につながる。カルシウムの自然放出とDADの関係は、心不全における活動の引き金となるメカニズムである33。ただし、染料の組み合わせは慎重に選択する必要があります。RH-237/Rhod-2またはdi-4-ANEPPS/Indo-1の組み合わせは同時記録が可能ですが、Fluo-3/4/di-4-ANEPPSは2つの色素30,34,35の発光スペクトルの重複によるエラーにつながります。この実験では、RH237とRhod-2 AMを選択して心臓に負荷をかけ、良好な画像品質を獲得しました。
さらに、このプロトコルで使用されるカメラには2つのターゲット面があり、1つのサンプリングインターフェースで分割信号をキャプチャし、1台のカメラで2つの異なる発光波長を検出できます。このような様々な光電子分光法(PES)プロトコルを組み合わせた光APとCaTの同時マッピングにより、ストレス条件下での異常な[Ca2+]iと電気的不安定性と、これらの異常に対する活性化後の増強の影響との相互関係を決定することができます。SR Ca2 +サイクリングの空間的に不均一な性質と、これが電気的オルタナンの出現、重症度、および一致にどのように影響するか 空間的に不調和なオルタナンやその結果としてのVTなどの不整脈誘発性行動は、さまざまなグループの無傷の心臓で研究されます。SR Ca 2+ オルタナン、RyR2 耐火性、および SR Ca2+ および APD オルタナンにおけるそれらの役割が調査されます。
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Disclosures
著者の誰一人として、宣言すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
本研究は、中国国家自然科学基金会(81700308からXOに、31871181からML、82270334からXTに)、四川省科学技術支援プログラム(CN)(2021YJ0206からXO、23ZYZYTS0433、2022YFS0607からXT、2022NSFSC1602からTC)、広西師範大学薬用資源化学分子工学国家重点実験室(CMEMR2017-B08からXO)、 MRC(G10031871181からML02647、G1002082、ML)、BHF(PG/14/80/31106、PG/16/67/32340、PG/12/21/29473、PG/11/59/29004 ML)、BHF CRE at Oxford(ML)助成金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
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