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Biology

RyR2R2474S नॉक-इन चूहों से दिलों की डुअल-डाई ऑप्टिकल मैपिंग कैटेकोलामिनर्जिक पॉलीमॉर्फिक वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/65082
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 3, 1, 1,2, 1,4, 1
1Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education, Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Cardiovascular Disease, Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University, 2Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 4Department of Pharmacology, University of Oxford
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल जंगली प्रकार से प्राप्त माउस दिलों की दोहरी डाई ऑप्टिकल मैपिंग का परिचय देता है और उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ transmembrane वोल्टेज और intracellular सीए2 + यात्रियों के electrophysiological माप सहित, catecholaminergic बहुरूपी वेंट्रिकुलर tachycardia से प्रभावित जानवरों में खट्टी.

Abstract

प्रो-एरिथमिक कार्डियक डिसऑर्डर कैटेकोलामिनर्जिक पॉलीमॉर्फिक वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया (सीपीवीटी) शारीरिक गतिविधि, तनाव या कैटेकोलामाइन चुनौती के बाद पॉलीमॉर्फिक वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया एपिसोड के रूप में प्रकट होता है, जो संभावित घातक वेंट्रिकुलर फाइब्रिलेशन में बिगड़ सकता है। माउस दिल सीपीवीटी सहित विरासत में मिली हृदय अतालता संबंधी बीमारियों के मॉडलिंग के लिए एक व्यापक प्रजाति है। लैंगेंडोर्फ-छिद्रित माउस दिलों से ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता (वीएम) और कैल्शियम ट्रांजिस्टर (सीएटी) के एक साथ ऑप्टिकल मैपिंग में अतालता के अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने की क्षमता है। सेलुलर स्तर की जांच की तुलना में, ऑप्टिकल मैपिंग तकनीक कुछ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मापदंडों का परीक्षण कर सकती है, जैसे सक्रियण का निर्धारण, चालन वेग, कार्रवाई संभावित अवधि और सीएटी अवधि। यह पेपर म्यूरिन वाइल्ड-टाइप और विषमयुग्मजी RyR2-R2474S/+ दिलों में CaT और V m के उच्च-थ्रूपुट ऑप्टिकल मैपिंग के लिए इंस्ट्रूमेंटेशन सेटअप और प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रस्तुत करता है, जो आइसोप्रोटेरेनॉल चुनौती से पहले और उसके दौरान प्रोग्राम किए गए विद्युत पेसिंग के साथ संयुक्त है। इस दृष्टिकोण ने पूर्व विवो माउस दिल की तैयारी में यंत्रवत रूप से सीपीवीटी रोग का अध्ययन करने के लिए एक व्यवहार्य और विश्वसनीय विधि का प्रदर्शन किया है।

Introduction

इनहेरिटेड कार्डियक डिसऑर्डर कैटेकोलामिनर्जिक पॉलीमॉर्फिक वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया (सीपीवीटी) शारीरिक गतिविधि, तनाव या कैटेकोलामाइन चुनौती के बाद पॉलीमॉर्फिक वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया (पीवीटी) एपिसोड के रूप में प्रकट होता है, जो संभावित घातक वेंट्रिकुलर फाइब्रिलेशन 1,2,3,4 में बिगड़ सकता है . 1995 में क्लिनिकल सिंड्रोम के रूप में अपनी पहली रिपोर्ट के बाद हाल के सबूतों ने सात जीनों में उत्परिवर्तन को फंसाया, सभी इस स्थिति में सार्कोप्लाज्मिक रेटिकुलर (एसआर) स्टोर सीए 2+ रिलीज में शामिल हैं: सीए2+ रिलीज चैनल 2,6, एफकेबीपी12.67, CASQ2 एन्कोडिंग कार्डियक कैल्सेक्वेस्ट्रिन8, TRDN के सबसे अधिक बार रिपोर्ट किए गए RYR2 एन्कोडिंग रायनोडाइन रिसेप्टर2 (RyR2) जंक्शनल एसआर प्रोटीन ट्रायडिन 9, और CALM1 9, CALM2 10, और CALM3 को समान रूप से एन्कोडिंग कैलमोडुलिन11,12 एन्कोडिंग करता है। ये जीनोटाइपिक पैटर्न एसआर स्टोर सीए2 + 12 के अनियमित रोग संबंधी रिलीज के लिए अतालता घटनाओं का श्रेय देते हैं।

SR से सहज Ca 2+ रिलीज़ को Ca 2+ स्पार्क्स या Ca 2+ तरंगों के रूप में पहचाना जा सकता है, जो Na+/Ca 2+ एक्सचेंजर (NCX) को सक्रिय करता है। तीन Na+ के लिए एक Ca2+ का एक्सचेंजर एक आवक करंट उत्पन्न करता है, जो डायस्टोलिक विध्रुवण को गति देता है और झिल्ली वोल्टेज को एक्शन पोटेंशिअल (AP) की दहलीज तक ले जाता है। RyR2 नॉक-इन चूहों में, सिनोट्रियल नोड (सैन) में RyR2R4496C की बढ़ी हुई गतिविधि से डायस्टोल के दौरान Ca 2+-निर्भर I Ca, L और SR Ca2+ की कमी से सैन ऑटोमैटिसिटी में अप्रत्याशित कमी होती है, CPVT रोगियों में सैन डिसफंक्शन में योगदान देने वाले उपकोशिकीय पैथोफिजियोलॉजिकल परिवर्तनों की पहचान13,14। संबंधित कार्डियोमायोसाइट साइटोसोलिक सीए 2+ तरंगों की घटना पृष्ठभूमि साइटोसोलिक [सीए2+] में वृद्धि के बाद अधिक संभावना है, कैटेकोलामाइन द्वारा आरवाईआर संवेदीकरण के बाद, आइसोप्रोटेरेनॉल (आईएसओ), चुनौती सहित।

एक्शन पोटेंशियल (एपी) सक्रियण के जवाब में RyR2-मध्यस्थता सीए 2+ रिलीज के बाद सीए2+ सिग्नलिंग में विस्तृत गतिज परिवर्तन जो बरकरार कार्डियक सीपीवीटी मॉडल में मनाया वेंट्रिकुलर अतालता का कारण हो सकता है, रिपोर्ट किए गए RyR2 जीनोटाइप12 की पूरी श्रृंखला के लिए निर्धारित किया जाना बाकी है। यह पेपर म्यूरिन वाइल्ड-टाइप (WT) और विषमयुग्मजी RyR2-R2474S/+ दिलों में Ca2+ सिग्नल और ट्रांसमेम्ब्रेन पोटेंशियल (V m) के उच्च-थ्रूपुट मैपिंग के लिए इंस्ट्रूमेंटेशन सेटअप और प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रस्तुत करता है, जो isoproterenol चुनौती से पहले और बाद में प्रोग्राम किए गए विद्युत पेसिंग के साथ संयुक्त है। यह प्रोटोकॉल पृथक माउस दिलों में सीपीवीटी रोग के यंत्रवत अध्ययन के लिए एक विधि प्रदान करता है।

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Protocol

प्रयोगों के लिए नर 10 से 14 सप्ताह के जंगली प्रकार के चूहों या RyR2-R2474S/+ चूहों (C57BL/6 पृष्ठभूमि) का वजन 20-25 ग्राम होता है। सभी प्रक्रियाओं को साउथवेस्ट मेडिकल यूनिवर्सिटी, सिचुआन, चीन (अनुमोदन संख्या: 20160930) की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा राष्ट्रीय दिशानिर्देशों के अनुरूप अनुमोदित किया गया है जिसके तहत संस्था संचालित होती है।

1. तैयारी

  1. स्टॉक समाधान
    1. ब्लेबिस्टैटिन स्टॉक समाधान: 10 मिमी की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 2.924 मिलीग्राम (-) ब्लेबिस्टैटिन पाउडर युक्त मूल फ्लास्क में 100% डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) का 1 एमएल जोड़ें।
    2. वोल्टेज सूचक आरएच 237 स्टॉक समाधान: 2.01 मिमी की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आरएच 237 पाउडर के 1 मिलीग्राम के साथ मूल फ्लास्क में 100% डीएमएसओ का 1 एमएल जोड़ें।
    3. कैल्शियम संकेतक रोड -2 एएम स्टॉक समाधान: 0.89 मिमी की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 1 मिलीग्राम रोड -2 एएम पाउडर में 100% डीएमएसओ का 1 एमएल जोड़ें।
    4. प्लूरोनिक F127 स्टॉक समाधान: 20% w/v (0.66 मिमी) की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 200 मिलीग्राम प्लूरोनिक F127 में 100% DMSO का 1 एमएल जोड़ें।
    5. बार-बार ठंड और विगलन से बचने के लिए सिंगल या डबल उपयोग के लिए 21-51 माइक्रोन (आरएच 237 के 21 माइक्रोन, रोड -2 एएम के 31 माइक्रोन और ब्लेबिस्टैटिन के 51 माइक्रोन) में 200-माइक्रोन पीसीआर ट्यूबों में स्टॉक समाधान को विभाज्य करें। फिर, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ समाधान लपेटें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, परिवेश के तापमान पर एक अंधेरे कमरे में रखे प्लूरोनिक एफ 127 स्टॉक समाधान को छोड़कर।
  2. छिड़काव समाधान
    1. क्रेब्स समाधान (एमएम में): क्रेब्स समाधान (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1.0, KCl4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35, और ग्लूकोज 10) के 1 एल तैयार करें।
    2. 0.22 माइक्रोन सड़न रोकनेवाला सुई फिल्टर के साथ समाधान फ़िल्टर करें और 95% ओ 2/5% सीओ2 के साथ ऑक्सीजन करें।
    3. क्रेब्स समाधान के 40 एमएल को 50 एमएल केन्द्रापसारक ट्यूब में लें और इसे फॉलो-अप हार्ट आइसोलेशन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. Langendorff छिड़काव प्रणाली और ऑप्टिकल मानचित्रण उपकरण
    1. Langendorff छिड़काव प्रणाली की स्थापना करें.
      1. पानी के स्नान को चालू करें और तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
      2. विआयनीकृत पानी के 1 एल के साथ Langendorff छिड़काव प्रणाली धो लें.
      3. सेवन पथ से समाधान छिड़कना और बहिर्वाह दर को 3.5-4 एमएल / मिनट तक समायोजित करें। फिर, ओ 2/सीओ2 (95%/5%) गैस के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इत्र को ऑक्सीजन दें।
        नोट: छिड़काव प्रणाली में एक बुलबुला की अनुमति कभी नहीं है.
    2. ऑप्टिकल मैपिंग सिस्टम तैयार करें।
      1. इलेक्ट्रॉन गुणा करने वाले चार्ज-युग्मित डिवाइस (EMCCD) कैमरा (512 × 512 पिक्सल), लेंस (40x आवर्धन), तरंग दैर्ध्य फाड़नेवाला प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी), इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम (ईसीजी) मॉनिटर, और उत्तेजना इलेक्ट्रोड(चित्रा 1)स्थापित करें।
      2. लेंस से हृदय की स्थिति तक उचित कार्य दूरी को समायोजित करें।
      3. यहां तक कि रोशनी के लिए थर्मास्टाटिक स्नान की विकर्ण स्थिति में दो एल ई डी सेट करें, उत्तेजना प्रकाश उत्पन्न करने के लिए 530 एनएम की तरंग दैर्ध्य प्रदान करें। एल ई डी के लिए किसी भी आउट-ऑफ-बैंड लाइट को हटाने के लिए ET525/50 स्पटर-लेपित फ़िल्टर का उपयोग करें।
      4. लक्ष्य सतह के बराबर वर्ग को प्राप्त करने के लिए हैंडल स्विच को समायोजित करें, जिससे वोल्टेज और कैल्शियम छवियां प्राप्त करने वाले इंटरफ़ेस पर पर्याप्त रूप से दिखाई दें।
      5. वोल्टेज या कैल्शियम संकेतों के किसी भी लीक से बचने के लिए लेंस के एपर्चर को अधिकतम व्यास में घुमाएं।
      6. कैमरा लेंस को उचित ऊंचाई पर समायोजित करें, क्योंकि यह थर्मोस्टेटिक स्नान के लिए एक अच्छी कामकाजी दूरी प्रदान करता है, 10 सेमी का उपयोग ज्यादातर किया जाता है।
      7. -50 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर नमूना तापमान के लिए कैमरा चालू करें।

2. प्रक्रियाएं

  1. माउस दिल की फसल, cannulation, और छिड़काव
    1. इंट्रापेरिटोनली जानवरों को एवर्टिन समाधान (1.2%, 0.5-0.8 एमएल) और हेपरिन (200 इकाइयों) के साथ इंजेक्ट करें ताकि पीड़ा और दर्द पलटा को कम किया जा सके और रक्त के थक्के के गठन को रोका जा सके। 15 मिनट के बाद, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा जानवरों की बलि दें।
    2. कैंची के साथ छाती खोलें, दिल को ध्यान से काटें, और चयापचय को धीमा करने और हृदय की रक्षा करने के लिए इसे ठंडे क्रेब्स समाधान (4 डिग्री सेल्सियस, 95% ओ 2, 5% सीओ2) में रखें।
    3. महाधमनी के आसपास के ऊतक निकालें, एक कस्टम-निर्मित कैनुलेटिंग सुई (बाहरी व्यास: 0.8 मिमी, भीतरी व्यास: 0.6 मिमी, लंबाई: 27 मिमी) का उपयोग करके महाधमनी को कैनुलेट करें और इसे 4-0 रेशम सीवन के साथ ठीक करें।
    4. 3.5-4.0 एमएल / मिनट की निरंतर गति से लैंगेंडोर्फ प्रणाली के साथ दिल को छिड़कें और तापमान 37 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: बाद की सभी प्रक्रियाएं इस स्थिति में की जाती हैं।
    5. ओवरप्रेलोड से बचने के लिए कक्ष में समाधान की भीड़ को छोड़ने के लिए बाएं वेंट्रिकल में एक छोटी प्लास्टिक ट्यूब (0.7 मिमी व्यास, 20 मिमी लंबाई) डालें।
  2. उत्तेजना-संकुचन और दोहरी-डाई लोडिंग का अनकपलर
    1. स्नान में इत्र में दो लीड डालें, ईसीजी एम्पलीफायर बॉक्स और इलेक्ट्रिक उत्तेजना नियंत्रक की शक्तियों को चालू करें, और फिर संदर्भित ईसीजी सॉफ्टवेयर शुरू करें और ईसीजी की लगातार निगरानी करें।
    2. अंधेरे में बाद के चरणों प्रदर्शन जब दिल एक स्थिर राज्य स्थिति तक पहुँच जाता है (दिल ~ 400 बीपीएम पर लयबद्ध धड़क रहा है).
    3. 10 माइक्रोन की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए क्रेब्स समाधान के 50 एमएल के साथ 10 एमएम ब्लेबिस्टैटिन स्टॉक समाधान के 50 माइक्रोन मिलाएं। उत्तेजना से संकुचन को कम करने और फिल्मांकन के दौरान संकुचन कलाकृतियों से बचने के लिए 10 मिनट के लिए दिल में ब्लेबिस्टैटिन-क्रेब्स समाधान मिश्रण को लगातार छिड़कें।
    4. यह जांचने के लिए लाल टॉर्च का उपयोग करें कि क्या हृदय संकुचन पूरी तरह से बंद हो जाता है क्योंकि संकुचन डाई लोडिंग गुणवत्ता को प्रभावित करेगा।
    5. उत्तेजना-संकुचन को अलग करने के बाद, 0.267 माइक्रोन रोड -2 एएम और 0.198 माइक्रोन प्लुरोनिक एफ 127 की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए क्रेब्स समाधान के 50 एमएल में प्लूरोनिक एफ 127 स्टॉक समाधान के 15 माइक्रोन के साथ रोड -2 एएम स्टॉक समाधान के 15 माइक्रोन मिलाएं। फिर, Langendorff छिड़काव प्रणाली में 15 मिनट के लिए Rhod-2 AM काम समाधान के साथ लगातार दिल छिड़कना.
    6. इंट्रासेल्युलर कैल्शियम डाई लोडिंग के दौरान ऑक्सीजन की आपूर्ति रखें। चूंकि बुलबुले आसानी से Pluronic F127 में बनते हैं, इसलिए कोरोनरी के गैस एम्बोलिज़ेशन से बचने के लिए छिड़काव प्रणाली में एक बुलबुला जाल डालें।
    7. 0.402 माइक्रोन पर अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने और 10 मिनट के लिए लोडिंग करने के लिए परफ्यूसेट के 50 एमएल में आरएच 237 स्टॉक समाधान के 10 माइक्रोन को पतला करें।
    8. दोहरे डाई लोडिंग के अंत में, दोनों वोल्टेज और कैल्शियम संकेतों विश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं सुनिश्चित करने के लिए तस्वीरों का एक क्रम ले लो (दो संकेतों के बीच कोई बातचीत नहीं).
  3. ऑप्टिकल मैपिंग और अतालता प्रेरण
    नोट: ऑप्टिकल मैपिंग संकुचन समाप्ति और एक उपयुक्त डाई-लोडिंग के बाद शुरू होती है, और दिल लगातार 2.1 (4) पर ऊपर वर्णित चरणों के रूप में perfused है.
    1. उत्तेजना रोशनी के लिए दो एल ई डी चालू करें और एक उचित सीमा पर उनकी तीव्रता को समायोजित करें (रोशनी के लिए पर्याप्त मजबूत और अपेक्षाकृत सरल फिल्मांकन लेकिन ओवरएक्सपोजर के लिए बहुत मजबूत नहीं)।
    2. दिल को डिटेक्शन डिवाइस के नीचे रखें, सुनिश्चित करें कि यह दो एल ई डी की पर्याप्त रोशनी में है, और लाइट स्पॉट व्यास को 2 सेमी तक समायोजित करें।
    3. लेंस से दिल तक काम करने की दूरी को 10 सेमी तक सेट करें, जिससे लगभग 500 हर्ट्ज की नमूना दर और 120 x 120 माइक्रोन प्रति पिक्सेल का स्थानिक रिज़ॉल्यूशन दिया जा सके।
    4. वोल्टेज और कैल्शियम संकेतों को एक साथ कैप्चर करने के लिए कैमरे को डिजिटल रूप से नियंत्रित करने के लिए सिग्नल सैंपलिंग सॉफ़्टवेयर खोलें।
    5. मायोपेसर क्षेत्र उत्तेजक शुरू करें, और ट्रांजिस्टर ट्रांजिस्टर लॉजिक (टीटीएल) पर पेसिंग पैटर्न सेट करें, प्रत्येक पल्स के लिए 2 एमएस पेसिंग अवधि, और प्रारंभिक तीव्रता के रूप में 0.3 वी।
    6. ईसीजी रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर द्वारा संचालित दिल के डायस्टोलिक वोल्टेज थ्रेशोल्ड का परीक्षण करने के लिए लगातार 30 लगातार 10 हर्ट्ज एस 1 उत्तेजनाओं का उपयोग करें। धीरे-धीरे वोल्टेज आयाम बढ़ाएं जब तक कि 1: 1 कैप्चर का एहसास न हो (ईसीजी मॉनिटर, एक्शन पोटेंशियल (एपी), और कैल्शियम ट्रांजिस्टर (सीएटी) सिग्नल से क्यूआरएस लहर की जांच करें)।
    7. वोल्टेज थ्रेशोल्ड का निर्धारण करने के बाद, बाएं वेंट्रिकल (एलवी) एपेक्स (ईएलवीए) के एपिकार्डियल से जुड़े प्लैटिनम इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी के साथ डायस्टोलिक वोल्टेज थ्रेशोल्ड को 2x की तीव्रता पर दिल को गति दें।
    8. कैल्शियम या कार्रवाई संभावित विकल्प और बहाली गुणों को मापने के लिए S1S1 प्रोटोकॉल को लागू करें। 100 एमएस की एक बुनियादी चक्र लंबाई पर लगातार दिल पेस, 50 एमएस तक पहुंचने तक हर निम्नलिखित अनुक्रम चक्र की लंबाई के 10 एमएस को कम करना। प्रत्येक एपिसोड में 2 एमएस पल्स चौड़ाई के साथ लगातार 30 उत्तेजनाएं शामिल हैं। उसी समय, उत्तेजना से पहले ऑप्टिकल मैपिंग शुरू करें (नमूना समय ~ 10 साइनस लय और पेसिंग अवधि शामिल है)।
    9. S1S2 उत्तेजना प्रोटोकॉल का उपयोग करके वेंट्रिकुलर प्रभावी दुर्दम्य अवधि (ERP) को मापने के लिए, S2 के साथ 100 ms की S1S1 पेसिंग चक्र लंबाई के साथ शुरू करें, जो 2 ms चरण कमी के साथ 60 ms पर युग्मित हो, जब तक कि S2 एक्टोपिक QRS कॉम्प्लेक्स पर कब्जा करने में विफल न हो जाए।
    10. अतालता प्रेरण के लिए, सतत 50 हर्ट्ज फट पेसिंग (एक 2 एमएस पल्स चौड़ाई के साथ 50 निरंतर विद्युत उत्तेजना) का संचालन, और आराम के एक 2 एस अंतराल के बाद एक ही पेसिंग प्रकरण प्रदर्शन.
    11. निरंतर उच्च आवृत्ति पेसिंग अवधि के दौरान ईसीजी रिकॉर्डिंग को ध्यान से देखें ताकि एक साथ ऑप्टिकल मैपिंग रिकॉर्डिंग तुरंत शुरू हो सके जब एक दिलचस्प अतालता ईसीजी लहर उत्पन्न होती है (चूंकि अधिकांश कार्डियक अतालता विद्युत पेसिंग द्वारा प्रेरित होती है, ऑप्टिकल सिग्नल का नमूना 2-3 एस फट से पहले महत्वपूर्ण हृदय संबंधी घटनाओं को खोने के मामले में)।
    12. EMCCD कैमरा का उपयोग कर छवि (नमूना दर: 500 हर्ट्ज, पिक्सेल आकार: 64 x 64).
  4. डेटा विश्लेषण
    1. छवि लोड हो रहा है और सिग्नल प्रोसेसिंग
      1. प्रेस फ़ोल्डर का चयन करें और छवियों को लोड करने के लिए सेटअप और प्रोटोकॉल पहले वर्णित15,16 के अनुसार अर्द्ध स्वचालित रूप से बड़े पैमाने पर वीडियो डेटा विश्लेषण के लिए छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में छवियों को लोड करने के लिए.
      2. सही नमूनाकरण पैरामीटर (जैसे पिक्सेल आकार और फ़्रेमरेट) दर्ज करें।
      3. मैन्युअल इनपुट द्वारा छवि सीमा सेट करें और रुचि के क्षेत्र (ROI) का चयन करें।
      4. एक 3 x 3 पिक्सेल गाऊसी स्थानिक फ़िल्टर, एक Savitzky-goly फ़िल्टर, और एक शीर्ष-टोपी आधारभूत सुधार लागू करें।
      5. बेसलाइन को हटाने और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मापदंडों की गणना करने के लिए प्रोसेस इमेज दबाएं, जैसे APD80 और CaTD50।
    2. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल पैरामीटर विश्लेषण
      1. APD80 की गणना के लिए 80% पुनरावर्तन (APD80) पर शिखर और टर्मिनल बिंदु पर APD का दीक्षा समय निर्धारित करें। इसी तरह, सीएटीडी प्रारंभ समय को शिखर के रूप में परिभाषित किया गया है, और टर्मिनल बिंदु को 80% छूट के रूप में परिभाषित किया गया है।
      2. चालन वेग (सीवी) का मापन पिक्सेल आकार और दो पिक्सेल या अधिक के बीच कार्रवाई संभावित चालन समय पर निर्भर करता है। सभी चुने हुए पिक्सल से औसत वेग की गणना करें - यह चयनित क्षेत्र का औसत चालन वेग है। चालन दिशा के स्पष्ट दृश्य के लिए एक साथ संबंधित समकालिक मानचित्र उत्पन्न करें।
        नोट: O'Shea एट अल .15 विस्तार से सीवी माप की सूचना दी.
      3. अल्टरनेंस और अतालता विश्लेषण के लिए, कैल्शियम अल्टरनेन्स को वैकल्पिक रूप से दिखाई देने वाले निरंतर बड़े और छोटे शिखर आयाम के रूप में परिभाषित किया जाता है। आवृत्ति-निर्भर अल्टरनेंस (1-A2/A1) की गंभीरता का आकलन करने के लिए शिखर आयाम अनुपात का उपयोग करें। वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया (वीटी) जैसे जटिल अतालता का विश्लेषण करने के लिए चरण मानचित्र लागू करें। रोटार शिफ्ट के रूप में एक विशिष्ट क्षेत्र में स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले रोटार की तलाश करें।

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Representative Results

ऑप्टिकल मैपिंग पिछले एक दशक में जटिल कार्डियक अतालता का अध्ययन करने में एक लोकप्रिय दृष्टिकोण रहा है। ऑप्टिकल मैपिंग सेटअप में एक EMCCD कैमरा होता है, जो प्रत्येक पिक्सेल के लिए 1,000 हर्ट्ज तक की नमूना दर और 74 x 74 माइक्रोन का स्थानिक रिज़ॉल्यूशन देता है। यह सिग्नल नमूनाकरण (चित्रा 1) के दौरान एक उच्च सिग्नल-शोर अनुपात को सक्षम बनाता है। एक बार लैंगेंडॉर्फ-छिद्रित हृदय एक स्थिर अवस्था में पहुंच जाता है और डाई लोडिंग खत्म हो जाता है, तो दिल को दो 530 एनएम एल ई डी की रोशनी के तहत होमोइथर्मिक कक्ष में रखा जाता है, जिसका उपयोग वोल्टेज संकेतक आरएच 237 और सीए 2 + संकेतक रोड -2 एएम की उत्तेजना के लिए किया जाता है। उत्सर्जन प्रकाश को 600 एनएम (सीए2+ के लिए) और 670 एनएम (वी एम के लिए) के दो तरंग दैर्ध्य में विभाजित किया जाता है, जो ईएमसीसीडी कैमरे का उपयोग करके एक साथ पता लगाया जाताहै। 15 मिनट के लिए avertin और हेपरिन के छिड़काव के बाद, शल्य चिकित्सा उपकरणों (चित्रा 2A) का उपयोग करने के लिए छाती को खोलने और जल्दी से दिल निकालने, तो ठंड Krebs समाधान (4 डिग्री सेल्सियस, 95% हे 2, 5% सीओ2) (चित्रा 2B) के लिए हस्तांतरण. आसपास के ऊतकों को ध्यान से साफ करें, महाधमनी को 4-0 सिवनी के साथ ठीक करें, और बाएं वेंट्रिकुलर कक्ष में परफ्यूसेट की भीड़ को छोड़ने के लिए बाएं वेंट्रिकल(चित्रा 2सी)में 0.7 मिमी प्लास्टिक ट्यूब डाली जाती है। ईसीजी इत्र (चित्रा 2 डी) में ले जाता है रखो और सुनिश्चित करें कि दिल ईसीजी रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर द्वारा संचालित ईसीजी निगरानी के अनुसार लयबद्ध धड़कता है. फिर, अंधेरे में दोहरी डाई लोडिंग करें (चित्र 2E)।

संकुचन कलाकृतियों blebbistatin (10 माइक्रोन) द्वारा कम से कम किया गया है और एक पर्याप्त डाई लोड हो रहा है पूरा हो गया है के बाद, आवृत्ति-निर्भर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल पैरामीटर बहाली गुणों और isoproterenol (1 माइक्रोन आईएसओ) चुनौती (चित्रा 3A) के बाद कैल्शियम alternans का मूल्यांकन करने के लिए S1S1 पेसिंग प्रोटोकॉल से पहले लगभग 10 साइनस धड़कता के लिए फिल्मांकन शुरू कर दिया. चित्रा 3 बी वीटी के एक प्रतिनिधि ईसीजी वेवफ्रंट और इसी एक्शन पोटेंशियल (एपी) और सीएटी निशान को सीपीवीटी माउस में 50 हर्ट्ज फट पेसिंग अनुक्रम द्वारा प्रेरित करता है। ऑप्टिकल सिग्नल इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग बड़े पैमाने पर वीडियो डेटा के अर्ध-स्वचालित विश्लेषण को पूरा करने के लिए किया जाता है।

चित्रा 4 ए, बी क्रमशः APD80 और CaTD80 के विशिष्ट निशान और गर्मी के नक्शे दिखाते हैं। आईएसओ डब्ल्यूटी और सीपीवीटी चूहों में एपीडी 80 को छोटा करता है, लेकिन आईएसओ चुनौती से पहले और बाद में डब्ल्यूटी और सीपीवीटी चूहों के बीच कोई अंतर नहीं पाया गया (चित्र 4 सी, ** पी < 0.01. एन = 5/6)। चित्रा 4 डी इंगित करता है कि सीपीवीटी चूहों में सीएडी 80 आईएसओ चुनौती के बाद डब्ल्यूटी की तुलना में लंबे समय तक हैं, जबकि आईएसओ उपचार से पहले कोई महत्व नहीं था (** पी < 0.01. एन = 6।

चालन माप के लिए, चित्रा 5 ए सीवी की मात्रा का ठहराव के लिए एक एकल वेक्टर एल्गोरिथ्म प्रस्तुत करता है। वोल्टेज संकेतों के अनुसार, डब्ल्यूटी और सीपीवीटी दिलों में बेसलाइन पर और आईएसओ हस्तक्षेप (चित्रा 5बी) के बाद एपिकार्डियम में समान चालन क्षमता होती है। चित्रा 5 सी, डी आईएसओ चुनौती से पहले और बाद में डब्ल्यूटी और सीपीवीटी दिल में वोल्टेज और कैल्शियम के प्रतिनिधि सक्रियण नक्शे दिखाते हैं।

कैल्शियम अल्टरनेन्स अतालता के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। कैल्शियम आयाम अल्टरनेंस की गणना चित्रा 6 ए में दिखाए गए फॉर्मूलेशन के अनुसार की जाती है। डब्ल्यूटी दिलों में कैल्शियम संकेत 14.29 और 16.67 हर्ट्ज(चित्रा 6बी)पर लगातार एस 1 एस 1 पेसिंग के दौरान बेसलाइन पर स्थिर रहते हैं, जबकि सीपीवीटी दिल आवृत्ति-निर्भर अल्टरनेंस(चित्रा 6सी)दिखाते हैं। आईएसओ चुनौती के बाद, सीपीवीटी दिल एस 1 एस 1 पेसिंग के दौरान कैल्शियम सिग्नल में आवृत्ति-निर्भर अल्टरनेंस प्रदर्शित करते हैं, जबकि डब्ल्यूटी दिल प्रभावित नहीं होते हैं (चित्रा 6 डी, ई)। निरंतर S1S1 पेसिंग के बाद, घातक अतालता को प्रेरित करने के लिए एक फट पेसिंग प्रोटोकॉल किया जाता है। डब्ल्यूटी और सीपीवीटी दिल बेसलाइन (चित्रा 7 ए) पर 50 हर्ट्ज फट पेसिंग के दौरान सामान्य चालन प्रदर्शित करते हैं। आईएसओ के साथ छिड़काव के बाद, सीपीवीटी दिल 50 हर्ट्ज फट पेसिंग के बाद उच्च आवृत्ति रोटार दिखाते हैं, जबकि डब्ल्यूटी दिल सामान्य चालन(चित्रा 7बी)बनाए रखते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: ऑप्टिकल मैपिंग उपकरण। प्रणाली में एक उच्च स्थानिक-अस्थायी संकल्प (1,000 हर्ट्ज तक नमूना दर, न्यूनतम नमूना पिक्सेल 74 x 74 माइक्रोन) के साथ एक कस्टम-डिज़ाइन किया गया ईएमसीसीडी कैमरा शामिल है। एक विद्युत उत्तेजना नियंत्रक का उपयोग नमूनाकरण और आउटपुट विद्युत उत्तेजना प्रोटोकॉल के लिए किया जाता है। प्रतिदीप्ति जांच की उत्तेजना प्रकाश के लिए दो हरे एल ई डी का उपयोग किया जाता है। एक लंबे समय से पास डाइक्रोइक दर्पण (610 एनएम) और इसी उत्सर्जक वोल्टेज और कैल्शियम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन रोशनी को विभाजित करते हैं। RH237, वोल्टेज-संवेदनशील डाई, में 670 एनएम की चरम तरंग दैर्ध्य पर उत्सर्जन प्रकाश होता है, जबकि रोड-2 एएम, कैल्शियम-संवेदनशील डाई, 600 एनएम की चरम तरंग दैर्ध्य पर उत्सर्जन प्रकाश रखता है। कैमरा सेंसर की उच्च नमूना दर और संवेदनशीलता के कारण दोनों प्रतिदीप्ति संकेतों में मामूली बदलाव कैमरे द्वारा एक साथ कैप्चर किए जा सकते हैं। संक्षिप्ताक्षर: EMCCD = इलेक्ट्रॉन-गुणा चार्ज-युग्मित डिवाइस; एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड; ईसीजी = इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: तैयारी और दोहरी डाई लोड हो रहा है। (ए) शल्य चिकित्सा उपकरणों. (बी) माउस दिल की फसल। (सी) महाधमनी के स्पष्ट दृश्य के लिए अनावश्यक ऊतक को सावधानी से काटें और महाधमनी से बाएं वेंट्रिकल में 0.7 मिमी प्लास्टिक ट्यूब डालें। (डी) दिल Langendorff छिड़काव प्रणाली के लिए जल्दी से हटा दिया जाता है. (ई) अंधेरे में दोहरी डाई लोडिंग और उत्तेजना-संकुचन समाप्ति। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एस 1 एस 1 प्रोटोकॉल और अतालता प्रेरण प्रोटोकॉल। (ए) आईएसओ चुनौती के बाद प्रतिनिधि ईसीजी वेवफ्रंट और एस 1 एस 1 पेसिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके संबंधित एपी और कैल्शियम सिग्नल ट्रेस। (बी) सीपीवीटी माउस में आईएसओ के छिड़काव के बाद 50 हर्ट्ज फट पेसिंग अनुक्रम द्वारा वीटी प्रेरण। संक्षिप्ताक्षर: ईसीजी = इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम; AP = ऐक्शन पोटेंशियल; आईएसओ = आइसोप्रोटेरेनॉल; वीटी = वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया; CPVT = catecholaminergic polymorphic वेंट्रिकुलर टैचीकार्डिया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: आईएसओ चुनौती से पहले और बाद में 10 हर्ट्ज पर APD80 और CaTD80 विश्लेषण। (ए) आईएसओ उपचार से पहले और बाद में डब्ल्यूटी और सीपीवीटी दिलों के प्रतिनिधि एपी निशान और एपीडी 80 गर्मी मानचित्र। (बी) आईएसओ चुनौती से पहले और बाद में डब्ल्यूटी और सीपीवीटी दिलों के विशिष्ट सीएटी निशान और सीएडी 80 गर्मी मानचित्र। (सी) आईएसओ डब्ल्यूटी और सीपीवीटी चूहों में एपीडी 80 को छोटा करता है, लेकिन आईएसओ चुनौती से पहले और बाद में डब्ल्यूटी और सीपीवीटी चूहों के बीच कोई अंतर नहीं पाया जाता है। (डी) सीपीवीटी चूहों में सीएडी 80 आईएसओ चुनौती के बाद डब्ल्यूटी की तुलना में लंबे समय तक हैं, जबकि आईएसओ उपचार से पहले कोई महत्व नहीं था। (* पी < 0.05, ** पी < 0.01. एन = 5/6। संक्षिप्ताक्षर: एपी = एक्शन पोटेंशियल; APD80 = 80% पुनरावृत्ति पर शिखर; आईएसओ = आइसोप्रोटेरेनॉल; CPVT = catecholaminergic बहुरूपी वेंट्रिकुलर क्षिप्रहृदयता; WT = जंगली प्रकार। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: 10 हर्ट्ज पर चालन वेग विश्लेषण। (ए) चालन वेग का एकल वेक्टर एल्गोरिथ्म। (बी) डब्ल्यूटी और सीपीवीटी चूहों में एपी के सीवी में कोई अंतर नहीं है। (सी) प्रतिनिधि गर्मी के नक्शे से पता चलता है कि सीपीवीटी चूहों में वोल्टेज संकेतों के अनुसार आईएसओ चुनौती से पहले और बाद में डब्ल्यूटी चूहों के समान चालन क्षमता है। (D) ISO चुनौती से पहले और बाद में ऐक्शन पोटेंशिअल प्रेरित CaT80 आइसोक्रोन के लिए दो समूहों में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया जाता है। संक्षिप्ताक्षर: एपी = एक्शन पोटेंशियल; आईएसओ = आइसोप्रोटेरेनॉल; CPVT = catecholaminergic बहुरूपी वेंट्रिकुलर क्षिप्रहृदयता; WT = जंगली प्रकार; AT = सक्रियण समय; CV = चालन वेग। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: कैल्शियम आयाम अल्टरनेंस विश्लेषण। (ए) कैल्शियम आयाम अल्टरनेंस की गणना का एल्गोरिथ्म। (बी) डब्ल्यूटी दिलों में कैल्शियम सिग्नल 14.29 और 16.67 हर्ट्ज पर लगातार एस 1 एस 1 पेसिंग के दौरान बेसलाइन पर स्थिर रहते हैं, जबकि (सी) सीपीवीटी दिल आवृत्ति-निर्भर विकल्प दिखाते हैं। (डी) डब्ल्यूटी दिल आईएसओ चुनौती से प्रभावित नहीं होते हैं, जबकि (ई) आईएसओ चुनौती के बाद, सीपीवीटी दिल एस 1 एस 1 पेसिंग के दौरान कैल्शियम सिग्नल में आवृत्ति-निर्भर अल्टरनेन प्रदर्शित करते हैं। संक्षिप्ताक्षर: आईएसओ = आइसोप्रोटेरेनॉल; CPVT = catecholaminergic बहुरूपी वेंट्रिकुलर क्षिप्रहृदयता; WT = जंगली प्रकार। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: चरण नक्शे का उपयोग कर Tachyarrhythmia विश्लेषण. (ए) डब्ल्यूटी और सीपीवीटी दिल बेसलाइन पर 50 हर्ट्ज फट पेसिंग के दौरान सामान्य चालन प्रदर्शित करते हैं। (बी) आईएसओ के साथ छिड़काव के बाद, सीपीवीटी दिल 50 हर्ट्ज फट पेसिंग के बाद उच्च आवृत्ति रोटार दिखाते हैं, जबकि डब्ल्यूटी दिल सामान्य चालन बनाए रखते हैं। संक्षिप्ताक्षर: आईएसओ = आइसोप्रोटेरेनॉल; CPVT = catecholaminergic बहुरूपी वेंट्रिकुलर क्षिप्रहृदयता; WT = जंगली प्रकार। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हमारे अनुभव के आधार पर, एक माउस दिल की एक सफल दोहरी डाई ऑप्टिकल मानचित्रण के लिए कुंजी एक अच्छी तरह से तैयार समाधान और दिल, डाई लोड हो रहा है, सबसे अच्छा संकेत करने के लिए शोर अनुपात प्राप्त करने, और गति विरूपण साक्ष्य को कम करने में शामिल हैं.

समाधान की तैयारी
क्रेब्स समाधान एक सफल हृदय प्रयोग के लिए आवश्यक है। MgCl 2 और CaCl2 स्टॉक समाधान (1 mol/L) उनके जल अवशोषण पर विचार करते हुए अग्रिम रूप से तैयार किए जाते हैं और अन्य सभी घटकों को शुद्ध पानी में भंग करने के बाद क्रेब्स समाधान में जोड़ा जाता है क्योंकि Mg 2+ और Ca 2+ आसानी से CO3 2+ के साथ अवक्षेपित हो सकते हैं। ऑक्सीजन सुनिश्चित करने के लिए क्रेब्स समाधान को कम से कम 95 मिनट के लिए 2/5% सीओ 2/30% सीओ 30 के साथ बुदबुदाया जाता है। क्योंकि माउस दिल पीएच के लिए विशेष रूप से संवेदनशील है, समाधान पीएच ऑक्सीजन के बाद 7.4 के आसपास होना चाहिए. यहां तक कि अगर छोटे कण समाधान में हैं, तो प्रयोगात्मक परिणाम प्रभावित हो सकते हैं क्योंकि ये कण केशिकाओं को अवरुद्ध कर सकते हैं और छिड़काव प्रभाव को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, समाधान का उपयोग करने से पहले एक 0.22 माइक्रोन सड़न रोकनेवाला सुई फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर किया जाता है.

दिल की तैयारी
इससे पहले कि दिल काटा जाता है, चूहों को कोरोनरी धमनी प्रणाली में थक्का गठन से बचने के लिए पहले हेपरिनाइज़ किया जाता है, बाद में इमेजिंग को प्रभावित करने से हृदय की भीड़ के कारण खराब डाई छिड़काव को रोकता है। दिल का इस्केमिक समय जितना कम होगा, दिल की स्थिति उतनी ही बेहतर होगी। इसलिए, इस्केमिक समय को लैंगेंडोर्फ प्रणाली पर महाधमनी के माध्यम से कैनुलेशन के लिए काटे जा रहे दिलों से 2-3 मिनट के भीतर नियंत्रित किया जाता है। इसके अलावा, अच्छी तरह से बनाए रखा छिड़काव दबाव भी आवश्यक है। इसलिए, बाएं वेंट्रिकुलर आउटलेट के लिगेट होने के बाद वेंट्रिकुलर संकुचन के दौरान बाएं वेंट्रिकुलर दबाव से बचने के लिए बाएं वेंट्रिकुलर गुहा में एक पतली सिलिकॉन (प्लास्टिक) ट्यूब डाली जाती है, जिसके परिणामस्वरूप खराब मायोकार्डियल परफ्यूजन और एनोक्सिक ऊतक अम्लीकरण हो सकता है।

डाई लोड हो रहा है
ये प्रयोग Langendorff प्रणाली में दिल perfusing द्वारा डाई लोड हो रहा है प्रदर्शन. हृदय ताल की निगरानी करना महत्वपूर्ण है क्योंकि खराब डाई लोडिंग तब होगी जब असामान्य लय सर्जिकल ऑपरेशन या इस्किमिया-रिपरफ्यूजन क्षति के कारण होती है। बाद के चरणों को करने के लिए हृदय पर्याप्त स्वस्थ होना चाहिए। रोड -2 एएम, एक सीए 2 +-संवेदनशील डाई, रोड2 का एक एसिटाइल मिथाइल एस्टर व्युत्पन्न है, जिसे आसानी से अपने एएम रूप में कोशिकाओं में लोड किया जाता है। अणु की प्रतिदीप्ति तीव्रता में 100 गुना वृद्धि सीए2+ केलेशन17 से परिणाम है। Pluronic F127 को Rhod-2 AM लोडिंग सॉल्यूशन में शामिल किया गया है ताकि Rhod-2 AM को बफर में पोलीमराइज़ करने से रोका जा सके और इसे कोशिकाओं में प्रवेश करने में मदद मिल सके। प्लूरोनिक F127 Rhod-2 AM की स्थिरता को कम कर सकता है, इसलिए इसे केवल कार्यशील समाधान तैयार करते समय जोड़ने की अनुशंसा की जाती है, लेकिन दीर्घकालिक भंडारण के लिए भंडारण समाधान में नहीं। वोल्टेज-संवेदनशील डाई आरएच 237 का उपयोग सीए 2 + संकेतक रोड -2 एएम के साथ उपयोग के लिए इसके अनुकूल वर्णक्रमीय गुणों के कारण इस अध्ययन में किया जाता है।

सर्वोत्तम सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करना
उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात वाली छवियां प्राप्त करना इमेजिंग का लक्ष्य है, लेकिन शोर एक छायादार भूत की तरह है जो हमेशा परेशानी का कारण बनता है। कमजोर संकेतों के कारण, कुछ उच्च गति वाले सूक्ष्म इमेजिंग अनुप्रयोगों में कम शोर विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जैसे ऑप्टिकल मैपिंग। सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) की गणना रूट माध्य वर्ग आयाम अनुपात के रूप में रूट मीन स्क्वायर शोर के रूप में की जाती है, जहां शोर आयाम का मूल्यांकन आराम क्षमता18 पर किया जाता है। कुछ कारक, जैसे प्रकाश स्रोत, ऑप्टिकल फिल्टर, फ़ोकसिंग ऑप्टिक्स और फोटोडेटेक्टर, सर्वश्रेष्ठ एसएनआर प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। अध्ययन में, शोर के लिए नमूने के पृष्ठभूमि क्षेत्र की जांच की जाती है, जो अक्सर एक छोटे स्तर पर उतार-चढ़ाव करता है। प्रत्येक पिक्सेल द्वारा पता लगाया गया ऑप्टिकल सिग्नल उसके सतह क्षेत्र से उत्सर्जित प्रकाश का औसत है। एपी और कैल्शियम गतिविधियां अतालता के दौरान दोलन करती हैं, और दोनों संकेतों का आयाम अपेक्षाकृत कम है। यहां तक कि मामूली हस्तक्षेप से ऑप्टिकल संकेतों का विरूपण हो सकता है और परिणामस्वरूप डेटा विश्लेषण में गलतियां हो सकती हैं। इसलिए, ऑप्टिकल संकेतों की व्याख्या सावधान रहनी चाहिए जब स्थानीय विषमता वीटी जैसे अतालता के दौरान विद्युत कार्य के कारण होती है।

गति विरूपण साक्ष्य को कम करें
इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के साथ तुलना में, ऑप्टिकल संकेतों अक्सर गति विरूपण साक्ष्य की वजह से Langendorff perfused दिल की संकुचन गतिविधि से प्रभावित कर रहे हैं. सटीक ऑप्टिकल संकेतों को पकड़ने के लिए, उत्तेजना-संकुचन के औषधीय अवरोधकों का उपयोग ज्यादातर किया जाता है। इमेजिंग के दौरान गति विरूपण साक्ष्य को कम करने के लिए, दिल को धड़कने से रोकने के लिए ब्लेबिस्टैटिन को अपनाया जाता है। यह गैर-मांसपेशी मायोसिन II की ATPase गतिविधि का एक चयनात्मक अवरोधक है और हृदय 19,20,21 की उत्तेजना-संकुचन प्रक्रिया को प्रभावी ढंग से अनकपल करता है। हालांकि कुछ अध्ययनों में यौगिक22 का उपयोग करके कुछ दुष्प्रभाव होते हैं, हम हृदय को संभावित नुकसान को कम करने के लिए 10 माइक्रोन पर सबसे कम काम करने वाली एकाग्रता का उपयोग करते हैं।

कार्डियक ऑप्टिकल मैपिंग डेटासेट के विश्लेषण के लिए इलेक्ट्रोमैप सॉफ्टवेयर
इलेक्ट्रोमैप कार्डियक ऑप्टिकल मैपिंग डेटासेट के विश्लेषण के लिए एक उच्च-थ्रूपुट ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर है। यह एपी और सीएटी आकृति विज्ञान, सीवी, डायस्टोलिक अंतराल, प्रमुख आवृत्ति, समय-से-शिखर, और विश्राम स्थिरांक (τ) 15,23 सहित मुख्य कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी मापदंडों का विश्लेषण प्रदान करता है। सॉफ्टवेयर कई फ़िल्टरिंग विकल्पों की अनुमति देता है, जिसमें गॉसियन फ़िल्टर, साविट्ज़की-गोली फ़िल्टर और टॉप-हैट बेसलाइन सुधार शामिल हैं। गाऊसी फिल्टर प्रत्येक चैनल और आसन्न चैनलों के भारित औसत चौरसाई की गणना करके एक द्वि-आयामी चौरसाई है। यह आमतौर पर स्पाइक ग्लिच शोर के लिए उपयोग किया जाता है। Savitzky-Goaly फ़िल्टर कम से कम वर्ग विधि के माध्यम से आसन्न डेटासेट के निचले बहुपद और निरंतर सबसेट में फिट बैठता है, जो विभिन्न चिकनी फ़िल्टरिंग की आवश्यकता को पूरा करता है और शोर से प्राप्त गैर-आवधिक और गैर-रैखिक डेटासेट को संसाधित करने के लिए भी प्रभावी है। टॉप-हैट बेसलाइन सुधार ऑप्टिकल संकेतों को निशान की चोटियों के अनुसार समान ऊंचाई तक समायोजित कर सकता है, एक्शन पोटेंशियल पीरियड (APD) और कैल्शियम क्षणिक अवधि (CaTD) जैसे मापदंडों की गणना अधिक सटीक रूप से कर सकता है। बेसलाइन बहाव कभी-कभी तब होता है जब नमूना वोल्टेज और कैल्शियम प्रतिदीप्ति संकेत देता है। कैल्शियम विकल्प और आयाम की गणना करते समय यह भी उपयोगी है। दोनों निलय को इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल जांच के लिए चुना गया था।

दोहरी-डाई मैपिंग के फायदे और नुकसान और हस्तक्षेप को सीमित करने के तरीके
हाल के वर्षों में, यह महसूस किया गया है कि यह सेल विध्रुवण या repolarization और पूरे दिल में अंतरकोशिकीय चालन विषमता, साथ ही झिल्ली घड़ी और कैल्शियम घड़ी, जो अतालता24,25 जैसे रोगों के तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है के युग्मन को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि महसूस किया गया है. ऑप्टिकल मैपिंग में ट्रांसजेनिक चूहों के दिल के वेंट्रिकुलर सक्रियण और पुनरावृत्ति गुणों को निर्धारित करने के लिए एक उच्च स्थानिक संकल्पहै 26,27,28,29. यह बहु-पैरामीटर इमेजिंग का भी पता लगा सकता है, उदाहरण के लिए, वोल्टेज और कैल्शियम-संवेदनशील डाई से भरे हुए एक ही दिल24,30 या ऊतक31,32 के झिल्ली क्षमता और इंट्रासेल्युलर कैल्शियम का माप। दोहरी डाई इमेजिंग कार्रवाई क्षमता और कैल्शियम के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए फायदेमंद है, इस तरह के झिल्ली (एम) घड़ी और सीए2 + (सी) घड़ी या सहज कैल्शियम रिलीज और विध्रुवण (डीएडी) के बाद देरी के बीच संबंध. सामान्य हृदय उत्तेजना के लिए दो घड़ियों में चक्रीय घटनाओं को संरेखित करने की आवश्यकता होती है। इस संरेखण में व्यवधान अतालता25 की ओर जाता है. सहज कैल्शियम रिलीज और डीएडी के बीच संबंध दिल की विफलता 33 में गतिविधियों को ट्रिगर करने का तंत्र है। हालांकि, रंगों के संयोजन को सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए। RH-237/Rhod-2 या di-4-ANEPPS/Indo-1 का संयोजन एक साथ रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है, जबकि Fluo-3/4/di-4-ANEPPS दो रंगों के अतिव्यापी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा30,34,35 के कारण त्रुटियों का कारण बनेगा। इस प्रयोग ने दिल को लोड करने के लिए आरएच 237 और रोड -2 एएम का चयन किया और अच्छी इमेजिंग गुणवत्ता हासिल की।

इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कैमरे में दो लक्ष्य सतहें हैं, जो इसे एक नमूना इंटरफ़ेस पर विभाजित संकेतों को पकड़ने में सक्षम बनाती हैं और एक एकल कैमरे को दो अलग-अलग उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का पता लगाने की अनुमति देती हैं। ऑप्टिकल एपी और सीएटी के इस तरह के एक साथ मानचित्रण विभिन्न फोटोइलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी (पीईएस) प्रोटोकॉल के संयोजन से हमें तनाव की स्थिति में असामान्य [सीए2+] आई और विद्युत अस्थिरता और इन विसंगतियों पर पोस्ट-सक्रियण पोटेंशिएशन के प्रभाव के बीच अंतर्संबंध निर्धारित करने की अनुमति मिलेगी। एसआर सीए2+ साइक्लिंग की स्थानिक रूप से विषम प्रकृति और यह विद्युत अल्टरनेंस और अतालता व्यवहार के उद्भव, गंभीरता और सामंजस्य को कैसे प्रभावित करता है, जैसे कि स्थानिक रूप से असंगत विकल्प और परिणामी वीटी, विभिन्न समूहों में बरकरार दिल में अध्ययन किया जाएगा। SR Ca 2+ अल्टरनेंस, RyR2 रिफ्रैक्टिवनेस और SR Ca2+ और APD अल्टरनेन्स में उनकी भूमिका का पता लगाया जाएगा।

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Disclosures

किसी भी लेखक के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह अध्ययन चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81700308 से XO और 31871181 से ML, और 82270334 से XT), सिचुआन प्रांत विज्ञान और प्रौद्योगिकी सहायता कार्यक्रम (CN) (2021YJ0206 से XO, 23ZYZYTS0433, और 2022YFS0607 से XT, और 2022NSFSC1602 से TC) और औषधीय संसाधनों के रसायन विज्ञान और आणविक इंजीनियरिंग के लिए राज्य कुंजी प्रयोगशाला (गुआंग्शी सामान्य विश्वविद्यालय) (CMEMR2017-B08 से XO), एमआरसी (G10031871181 से ML02647, G1002082, एमएल), बीएचएफ (पीजी/14/80/31106, पीजी/16/67/32340, पीजी/12/21/29473, पीजी/11/59/29004 एमएल), ऑक्सफोर्ड (एमएल) अनुदान में बीएचएफ सीआरई।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm syringe filter Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China N/A To filter solution
15 mL centrifuge tube Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China CFT011150
1 mL Pasteur pipette Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China 00900026
1 mL Syringe B. Braun Medical Inc. YZB/GER-5474-2014
200 μL PCR tube Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China F611541-0010 Aliquote the stock solutions  to avoid repeated freezing and thawing
50 mL centrifuge tube Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China CFT011500 Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation
585/40 nm filter Chroma Technology N/A Filter for calcium signal
630 nm long-pass filter Chroma Technology G15604AJ Filter for voltage signal
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom T48402-100G To minimize suffering and pain reflex
Blebbistatin Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States SLBV5564 Excitation-contraction uncoupler to  eliminate motion artifact during mapping
CaCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States SLBK1794V For Tyrode's solution
Custom-made thermostatic bath MappingLab, United Kingdom TBC-2.1 To keep temperature of perfusion solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich (RNBT7442) Solvent for dyes
Dumont forceps Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China YAF030
ElectroMap software University of Birmingham N/A Quantification of electrical parameters
EMCCD camera Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States A18G150001 Acquire images for optical signals
ET525/36 sputter coated filter Chroma Technology 319106 Excitation filter
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States SLBT4811V For Tyrode's solution
Heparin Sodium Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China (H51021209) To prevent blood clots in the coronary artery
 Iris forceps Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China YAA010
Isoproterenol MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States HY-B0468/CS-2582
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States SLBS5003 For Tyrode's solution
MacroLED Cairn Research, Faversham, United Kingdom 7355/7356 The excitation light of fluorescence probes
MacroLED light source Cairn Research, Faversham, United Kingdom 7352 Control the LEDs
Mayo scissors Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China YBC010
MetaMorph Molecular Devices N/A Optical signals sampling
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States BCBS6841V For Tyrode's solution
MICRO3-1401 Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom M5337 Connect the electrical stimulator and Spike2 software
MyoPacer EP field stimulator Ion Optix Co, Milton, MA, United States S006152 Electric stimulator
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States SLBS2340V For Tyrode's solution
NaH2PO4  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States BCBW9042 For Tyrode's solution
NaHCO3 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States SLBX3605 For Tyrode's solution
NeuroLog System Digitimer NL905-229 For ECG amplifier
OmapScope5 MappingLab, United Kingdom N/A Calcium alternans and arrhythmia analysis
Ophthalmic scissors Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China T4-3904
OptoSplit Cairn Research, Faversham, United Kingdom 6970 Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm  simultaneously
Peristalic pump Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, BT100-2J To pump the solution
Petri dish BIOFIL TCD010060
Pluronic F127 Invitrogen, Carlsbad, CA, United States 1899021 To enhance the loading with Rhod2AM
RH237 Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States 1971387 Voltage-sensitive dye
Rhod-2 AM Invitrogen, Carlsbad, CA, United States 1890519 Calcium indicator
Silica gel tube Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, 96402-16 Connect with the peristaltic pump
Silk suture Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China 20172650032 To fix the aorta
Spike2 Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom N/A To record and analyze ECG data
Stimulation electrode MappingLab, United Kingdom SE1600-35-2020
T510lpxr Chroma Technology 312461 For light source
T565lpxr Chroma Technology 321343 For light source

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References

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Li, Y., Yang, J., Zhang, R., Chen, T., Zhang, S., Zheng, Y., Wen, Q., Li, T., Tan, X., Lei, M., Ou, X. Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia. J. Vis. Exp. (202), e65082, doi:10.3791/65082 (2023).

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