Summary
该协议介绍了从受儿茶酚胺能多形性室性心动过速影响的野生型和敲入动物获得的小鼠心脏的双染料光学映射,包括具有高时间和空间分辨率的跨膜电压和细胞内Ca2 + 瞬变的电生理测量。
Abstract
促心律失常性心脏病儿茶酚胺能性多形性室性心动过速 (CPVT) 表现为体力活动、应激或儿茶酚胺激发后多形性室性心动过速发作,可恶化为可能致命的心室颤动。小鼠心脏是用于模拟遗传性心律失常疾病(包括CPVT)的广泛物种。来自Langendorff灌注的小鼠心脏的跨膜电位(Vm)和钙瞬变(CaT)的同时光学映射有可能阐明心律失常发生的潜在机制。与细胞水平研究相比,光学映射技术可以测试一些电生理参数,如活化、传导速度、动作电位持续时间和CaT持续时间的测定。本文介绍了在异丙肾上腺素攻击前和异丙肾上腺素激发之前和期间,结合程序化电起搏,在小鼠野生型和杂合子 RyR2-R2474S/+ 心脏中高通量光学映射 CaT 和 V m 的仪器设置和实验程序。该方法为体外小鼠心脏制剂中CPVT疾病的机理研究提供了一种可行且可靠的方法。
Introduction
遗传性心脏病儿茶酚胺能性多形性室性心动过速 (CPVT) 表现为体力活动、应激或儿茶酚胺激发后多形性室性心动过速 (PVT) 发作,可恶化为可能致命的心室颤动 1,2,3,4 .在 1995 年首次报告为临床综合征后,最近的证据表明涉及七个基因的突变,这些基因都与肌浆网状 (SR) 存储在这种情况下的 Ca 2+ 释放有关:最常报道的编码 Ca 2+ 释放通道的 RyR2 编码 Ca2+ 释放通道 5,6、FKBP12.67、编码心脏钙螯合蛋白 8、TRDN 的 CASQ2编码连接 SR 蛋白 triadin 9,以及编码钙调蛋白 11,12 的 CALM1 9、CALM210 和 CALM3。这些基因型模式将心律失常事件归因于 SR 储存 Ca2+12 不受调节的病理释放。
SR 自发释放的 Ca 2+ 可以检测为 Ca 2+ 火花或 Ca 2+ 波,从而激活 Na+/Ca 2+ 交换剂 (NCX)。一个 Ca2+ 换三个 Na+ 的交换器产生向内电流,加速舒张去极化并将膜电压驱动到动作电位 (AP) 阈值。在 RyR2 敲入小鼠中,窦房结 (SAN) 中 RyR2R4496C 活性的增加导致 SAN 自动性意外降低,舒张期 I Ca,L 和 SR Ca 2+ 耗竭的 Ca2+ 依赖性降低,确定导致 CPVT 患者 SAN 功能障碍的亚细胞病理生理学改变13,14。在儿茶酚胺(包括异丙肾上腺素 (isoproterenol, ISO)激发后,背景胞质 [Ca 2+] 增加后,相关心肌细胞胞质 Ca2+ 波的发生更可能。
RyR2 介导的 Ca2+ 释放后 Ca2+ 信号转导响应动作电位 (AP) 激活的详细动力学变化,这可能是在完整心脏 CPVT 模型中观察到的室性心律失常的原因,仍有待确定所有报告的 RyR2 基因型12。本文介绍了小鼠野生型 (WT) 和杂合子 RyR2-R2474S/+ 心脏中 Ca2+ 信号和跨膜电位 (V m) 的高通量定位仪器设置和实验程序,并结合异丙肾上腺素攻击前后的程序化电起搏。该方案为分离小鼠心脏中CPVT疾病的机制研究提供了一种方法。
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Protocol
使用体重为20-25g的雄性10至14周龄野生型小鼠或RyR2-R2474S / +小鼠(C57BL / 6背景)进行实验。所有程序均已获得中国四川西南医科大学动物护理和使用委员会(批准号:20160930)的批准,符合该机构运营所依据的国家指南。
1. 准备工作
- 库存解决方案
- 布比司他汀储备液:在含有 2.924 mg (-) 布比司他汀粉末的原始烧瓶中加入 1 mL 100% 二甲基亚砜 (DMSO),以达到 10 mM 的浓度。
- 电压指示器 RH237 储备溶液:在装有 1 mg RH237 粉末的原始烧瓶中加入 1 mL 100% DMSO,以达到 2.01 mM 的浓度。
- 钙指示剂Rhod-2 AM储备溶液:将1mL 100%DMSO加入1mg Rhod-2 AM粉末中,达到0.89mM的浓度。
- Pluronic F127储备溶液:将1mL 100% DMSO加入200mg Pluronic F127中,以达到20% w / v(0.66mM)的浓度。
- 将储备溶液分装到 21-51 μL(21 μL RH237、31 μL Rhod-2 AM 和 51 μL 布比司他丁)的 200 μL PCR 管中,用于单次或两次使用,以避免反复冻融。然后,用铝箔包裹溶液并储存在-20°C,除了在环境温度下放置在暗室中的Pluronic F127储备溶液。
- 灌注液
- 克雷布斯溶液(以mM计):制备1 L克雷布斯溶液(NaCl 119,NaHCO3 25,NaH 2 PO 4 1.0,KCl 4.7,MgCl 2 1.05,CaCl2 1.35和葡萄糖10)。
- 用0.22μm无菌针头过滤器过滤溶液,并用95%O 2 / 5%CO2氧化。
- 将40mL克雷布斯溶液放入50mL离心管中,并将其储存在4°C下用于后续心脏分离。
- Langendorff灌注系统和光学映射装置
- 设置 Langendorff 灌注系统。
- 打开水浴,将温度设置为37°C。
- 用 1 L 去离子水洗涤 Langendorff 灌注系统。
- 从进气道灌注溶液,并将流出速率调节至 3.5-4 mL/min。然后,在37°C下用O 2 / CO2(95%/ 5%)气体对灌注液进行氧化。
注意:灌注系统中绝不允许出现气泡。
- 准备光学测绘系统。
- 安装电子倍增电荷耦合器件 (EMCCD) 相机(512 × 512 像素)、镜头(40 倍放大倍率)、分波器发光二极管 (LED)、心电图 (ECG) 监视器和刺激电极(图 1)。
- 调整从镜头到心脏位置的适当工作距离。
- 在恒温浴槽的对角线位置设置两个 LED 以实现均匀照明,提供 530 nm 的波长以产生激发光。使用 ET525/50 溅射镀膜滤光片去除 LED 的任何带外光。
- 调整手柄开关,使目标表面的平方相等,使电压和钙图像充分出现在采集界面上。
- 将镜头的光圈调到最大直径,以避免任何泄漏tage 或钙信号。
- 将相机镜头调整到适当的高度,因为它与恒温浴槽的工作距离很远,通常使用 10 厘米。
- 打开相机以获得稳定的采样温度在-50°C。
- 设置 Langendorff 灌注系统。
2. 程序
- 小鼠心脏采集、插管和灌注
- 腹膜内注射动物阿弗丁溶液(1.2%,0.5-0.8mL)和肝素(200单位),以尽量减少痛苦和疼痛反射,防止血凝块形成。15分钟后,通过颈椎脱位处死动物。
- 用剪刀打开胸部,小心地采摘心脏,放入冷的克雷布斯溶液(4°C,95%O 2,5%CO2)中,以减缓新陈代谢,保护心脏。
- 去除主动脉周围组织,使用定制的插管针(外径:0.8 mm,内径:0.6 mm,长度:27 mm)插管主动脉,并用 4-0 丝线缝合固定。
- 用Langendorff系统以3.5-4.0 mL / min的恒定速度灌注心脏,并将温度保持在37±1°C。
注意:所有后续过程都在此条件下执行。 - 将一根小塑料管(直径 0.7 毫米,长度 20 毫米)插入左心室,以释放腔室中溶液的充血,以避免超负荷。
- 激发-收缩和双染料负载的解耦器
- 将两根导线放入浴槽的灌注液中,打开心电图放大器盒和电刺激控制器的电源,然后启动参考心电图软件并连续监测心电图。
- 当心脏达到稳定状态(心脏以 ~400 bpm 的速度有节奏地跳动)时,在黑暗中执行后续步骤。
- 将 50 μL 的 10 mM blebbistatin 储备溶液与 50 mL 的 Krebs 溶液混合,以达到 10 μM 的浓度。 不断将 blebbistatin-Krebs 溶液混合物灌注到心脏中 10 分钟,以解除收缩与兴奋的耦合,并避免拍摄过程中的收缩伪影。
- 使用红色手电筒检查心脏收缩是否完全停止,因为收缩会影响染料负载质量。
- 解除激发-收缩后,将 15 μL Rhod-2 AM 储备溶液与 15 μL Pluronic F127 储备溶液在 50 mL Krebs 溶液中混合,以达到 0.267 μM Rhod-2 AM 和 0.198 μM Pluronic F127 的终浓度。然后,在Langendorff灌注系统中用Rhod-2 AM工作溶液连续灌注心脏15分钟。
- 在细胞内钙染料加载期间保持氧气供应。由于 Pluronic F127 中很容易形成气泡,因此在灌注系统中插入气泡阱以避免冠状动脉气体栓塞。
- 将 10 μL RH237 储备溶液稀释到 50 mL 灌注液中,以达到 0.402 μM 的终浓度,并进行加载 10 分钟。
- 在双染料上样结束时,拍摄一系列照片,以确保电压和钙信号都足以进行分析(两个信号之间没有相互作用)。
- 光学标测和心律失常诱导
注:在收缩停止和适当的染料加载后开始光学映射,并按照上述步骤2.1(4)连续灌注心脏。- 打开两个激发灯的 LED,并在适当的范围内调整其强度(足够强的照明和相对简单的拍摄,但不要太坚固而过度曝光)。
- 将心脏放在检测装置下方,确保其处于两个 LED 的足够照明下,并将光斑直径调整为 2 厘米。
- 将镜头到心脏的工作距离设置为 10 厘米,采样率接近 500 Hz,空间分辨率为每像素 120 x 120 μm。
- 打开信号采样软件,对相机进行数字控制,同时采集电压和钙信号。
- 启动肌起搏器场刺激器,并将起搏模式设置为晶体管晶体管逻辑 (TTL),每个脉冲的起搏持续时间为 2 ms,初始强度为 0.3 V。
- 使用 30 个连续的 10 Hz S1 刺激来测试由心电图记录软件驱动的心脏舒张压阈值。逐渐增加电压幅度,直到实现 1:1 捕获(检查来自 ECG 监护仪的 QRS 波、动作电位 (AP) 和钙瞬变 (CaT) 信号)。
- 确定电压阈值后,将一对铂电极连接到左心室 (LV) 心尖 (ELVA) 的心外膜,以舒张压阈值的 2 倍强度起搏心脏。
- 实施 S1S1 方案以测量钙或动作电位交替和恢复特性。以 100 毫秒的基本周期长度连续起搏心脏,每隔一个序列减少 10 毫秒的周期长度,直到达到 50 毫秒。每集包括 30 个脉冲宽度为 2 ms 的连续刺激。同时,在刺激前开始光学映射(采样时间包括~10个窦性心律和起搏持续时间)。
- 要使用 S1S2 刺激方案测量心室有效不应期 (ERP),从 100 ms 的 S1S1 起搏周期长度开始,S2 以 60 ms 耦合,步长递减 2 ms,直到 S2 无法捕获异位 QRS 波群。
- 对于心律失常诱发,进行永久 50 Hz 突发起搏(50 次连续电刺激,脉冲宽度为 2 ms),并在休息 2 秒间隔后进行相同的起搏发作。
- 在连续高频起搏期间仔细观察心电图记录,以便在产生有趣的心律失常心电图波时立即开始同步光学映射记录(由于大多数心律失常是由电起搏引起的,因此在失去重要心脏事件的情况下,在突发起搏前 2-3 秒对光学信号进行采样)。
- 使用EMCCD相机拍摄的图像(采样率:500 Hz,像素大小:64 x 64)。
- 数据分析
- 图像加载和信号处理
- 按“选择文件夹”和“加载图像”,将图像加载到图像采集软件中,根据前面描述的设置和协议进行半自动海量视频数据分析15,16。
- 输入正确的采样参数(例如 像素大小 和 帧速率)。
- 通过手动输入设置图像阈值,然后选择感兴趣区域 (ROI)。
- 实现 3 x 3 像素高斯空间滤波器、Savitzky-Goaly 滤波器和顶帽基线校正。
- 按 处理图像 删除基线并计算电生理参数,例如 APD80 和 CaTD50。
- 电生理参数分析
- 设置APD在峰值处的起始时间,在80%复极化(APD80)处设置终点的起始时间,以计算APD80。同样,CaTD开始时间定义为峰值,终点定义为80%的弛豫。
- 传导速度 (CV) 的测量取决于像素大小和两个或更多像素之间的动作电位传导时间。计算所有选定像素的平均速度 - 这是所选区域的平均传导速度。同时生成相应的等时图,以清晰地了解传导方向。
注:O'Shea等人15 详细报告了CV测量结果。 - 对于交替体和心律失常分析,交替钙被定义为连续的大和小峰值振幅交替出现。使用峰值振幅比来评估频率依赖替 (1-A2/A1) 的严重程度。应用相位图来分析复杂的心律失常,如室性心动过速 (VT)。寻找转子移动时明显出现在特定区域的转子。
- 图像加载和信号处理
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Representative Results
在过去十年中,光学标测一直是研究复杂心律失常的流行方法。光学映射装置由EMCCD相机组成,每个像素的采样率高达1,000 Hz,空间分辨率为74 x 74 μm。它在信号采样期间实现了相当高的信噪比(图 1)。一旦朗根道夫灌注的心脏达到稳定状态并且染料上样完成,心脏在两个 530 nm LED 的照射下放置在等温室中,用于激励电压指示器 RH237 和 Ca2+ 指示器 Rhod-2 AM。发射光被分成 600 nm(对于 Ca2+)和 670 nm(对于 Vm)两个波长,使用 EMCCD 相机同时检测。灌注芦苇素和肝素15分钟后,使用手术器械(图2A)打开胸腔并快速提取心脏,然后将其转移到冷的克雷布斯溶液(4°C,95%O 2,5%CO2)(图2B)。仔细清理周围组织,用4-0缝合线固定主动脉,将0.7mm塑料管插入左心室(图2C)以释放左心室中灌注液的充血。将心电图导线放入灌注液中(图2D),并确保心脏根据心电图记录软件驱动的心电图监测有节奏地跳动。然后,在黑暗中进行双染料加载(图2E)。
在通过blebbistatin(10μM)最小化收缩伪影并完成足够的染料加载后,在S1S1起搏方案之前开始拍摄约10次窦性搏动,以评估频率依赖性电生理参数恢复特性和异丙肾上腺素(1μM ISO)攻击后的交替钙(图3A)。 图 3B 显示了 CPVT 小鼠中 50 Hz 突发起搏序列诱导的 VT 的代表性 ECG 波前以及相应的动作电位 (AP) 和 CaT 迹线。采用光信号成像软件完成海量视频数据的半自动分析。
图 4A、B 分别显示了 APD80 和 CaTD80 的典型迹线图和热图。ISO 缩短了 WT 和 CPVT 小鼠的 APD80,但在 ISO 攻击前后 WT 和 CPVT 小鼠之间没有发现差异(图 4C,**P < 0.01。 n = 5/6)。图4D表明,在ISO攻击后,CPVT小鼠中的CaTD80比WT中的CaTD80长,而在ISO处理前没有意义(**P < 0.01。 n = 6。
对于传导测量,图5A显示了用于CV定量的单矢量算法。根据电压信号,WT和CPVT心脏在基线和ISO干预后对心外膜具有相同的传导能力(图5B)。图 5C,D 显示了 ISO 攻击前后 WT 和 CPVT 心脏中电压和钙的代表性激活图。
交替钙是心律失常的关键参数。根据图6A所示的公式计算交替钙振幅。在14.29和16.67 Hz的连续S1S1起搏期间,WT心脏中的钙信号在基线时保持稳定(图6B),而CPVT心脏显示出频率依赖替(图6C)。ISO 挑战后,CPVT 心脏在 S1S1 起搏期间在钙信号中表现出频率依赖替,而 WT 心脏不受影响(图 6D,E)。连续 S1S1 起搏后,执行突发起搏方案以诱发致死性心律失常。WT 和 CPVT 心脏在基线时 50 Hz 突发起搏期间表现出正常传导(图 7A)。用 ISO 灌注后,CPVT 心脏在 50 Hz 突发起搏后显示高频转子,而 WT 心脏保持正常传导(图 7B)。
图1:光学测绘装置。 该系统包括一个定制设计的EMCCD相机,具有高时空分辨率(采样率高达1,000 Hz,最小采样像素74 x 74 μm)。电刺激控制器用于采样和输出电刺激协议。两个绿色LED用于荧光探针的激发光。长通二向色镜 (610 nm) 和相应的发射器将电压和钙荧光发射光分开。电压敏敏染料 RH237 的发射光峰值波长为 670 nm,而钙敏染料 Rhod-2 AM 的发射光峰值波长为 600 nm。由于相机传感器的高采样率和灵敏度,相机可以同时捕获两种荧光信号的微小变化。缩写:EMCCD=电子倍增电荷耦合器件;LED = 发光二极管;ECG = 心电图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:制备和双染料上样 。 (A) 手术器械。(B)收获小鼠心脏。(C) 小心地切掉不必要的组织,以便清楚地看到主动脉,并将一根 0.7 毫米的塑料管从主动脉插入左心室。(D) 心脏被迅速转移到 Langendorff 灌注系统。(E)黑暗中双染料负载和激发收缩停止。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:S1S1 方案和心律失常诱导方案。 (A) ISO 挑战后使用 S1S1 起搏方案的代表性心电图波前和相应的 AP 和钙信号迹线。(B) 在 CPVT 小鼠中灌注 ISO 后,通过 50 Hz 突发起搏序列诱导 VT。缩写:ECG=心电图;AP = 动作电位;ISO = 异丙肾上腺素;VT = 室性心动过速;CPVT = 儿茶酚胺能多形性室性心动过速。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:ISO 挑战前后 10 Hz 的 APD80 和 CaTD80 分析。 (A) ISO 处理前后 WT 和 CPVT 心脏的代表性 AP 迹线和 APD80 热图。(B) ISO 挑战前后 WT 和 CPVT 心脏的典型 CaT 迹线和 CaTD80 热图。(C) ISO 缩短了 WT 和 CPVT 小鼠的 APD80,但在 ISO 攻击前后 WT 和 CPVT 小鼠之间没有发现差异。(D) ISO 攻击后 CPVT 小鼠的 CaTD80 比 WT 长,而在 ISO 处理前没有显着性。(* P < 0.05, **P < 0.01. n =5/6.)缩写:AP = 动作电位;APD80 = 80% 复极化时的峰值;ISO = 异丙肾上腺素;CPVT = 儿茶酚胺能多形性室性心动过速;WT = 野生型。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:10 Hz 下的传导速度分析。 (A)传导速度的单向量算法。(B) WT 和 CPVT 小鼠 AP 的 CV 没有差异。(C)代表性热图表明,根据电压信号,CPVT小鼠在ISO挑战前后具有与WT小鼠相同的传导能力。(D) 在 ISO 挑战前后,两组动作电位诱导的 CaT80 等时线没有显着差异。缩写:AP = 动作电位;ISO = 异丙肾上腺素;CPVT = 儿茶酚胺能多形性室性心动过速;WT = 野生型;AT = 激活时间;CV = 传导速度。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6:钙振幅交替分析。 (A)钙振幅交替计算算法。(B) 在 14.29 和 16.67 Hz 的连续 S1S1 起搏期间,WT 心脏中的钙信号在基线时保持稳定,而 (C) CPVT 心脏显示出频率依赖替。(D) WT 心脏不受 ISO 挑战的影响,而 (E) 在 ISO 挑战后,CPVT 心脏在 S1S1 起搏期间在钙信号中表现出频率依赖替。缩写:ISO=异丙肾上腺素;CPVT = 儿茶酚胺能多形性室性心动过速;WT = 野生型。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7:使用相位图进行快速性心律失常分析。 (A) WT 和 CPVT 心脏在基线时 50 Hz 爆发起搏期间表现出正常传导。(B) 用 ISO 灌注后,CPVT 心脏在 50 Hz 突发起搏后显示高频转子,而 WT 心脏保持正常传导。缩写:ISO=异丙肾上腺素;CPVT = 儿茶酚胺能多形性室性心动过速;WT = 野生型。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
根据我们的经验,成功对小鼠心脏进行双染料光学成像的关键包括精心准备的溶液和心脏、染料上样、实现最佳信噪比以及减少运动伪影。
溶液的制备
克雷布斯解决方案对于成功的心脏实验至关重要。MgCl 2 和 CaCl2 储备溶液 (1 mol/L) 是预先制备的,考虑到它们的吸水性,并在所有其他组分都溶解在纯水中后加入克雷布斯溶液中,因为 Mg 2+ 和 Ca 2+ 很容易与 CO3 2+ 沉淀。克雷布斯溶液用 95% O 2/5% CO2 鼓泡至少 30 分钟以确保氧化。由于小鼠心脏对pH值特别敏感,因此氧合后溶液pH值应在7.4左右。即使溶液中含有微小颗粒,实验结果也可能受到影响,因为这些颗粒可能会堵塞毛细管并影响灌注效果。因此,在使用前使用0.22μm无菌针式过滤器过滤溶液。
心脏准备
在采集心脏之前,首先对小鼠进行肝素化,以避免冠状动脉系统中形成凝块,防止心脏淤血引起的染料灌注不良影响后续成像。心脏缺血时间越短,心脏状况越好。因此,缺血时间控制在2-3分钟内,从心脏被收获到通过Langendorff系统上的主动脉插管。此外,保持良好的灌注压力也是必不可少的。因此,在左心室腔内插入一根细硅胶(塑料)管,以避免结扎左心室出口后心室收缩时左心室压力过高,从而导致心肌灌注不良和缺氧组织酸化。
染料装载
这些实验通过灌注Langendorff系统中的心脏来进行染料加载。监测心律至关重要,因为当异常心律是由外科手术或缺血再灌注损伤引起的时,会出现染料负荷不良。心脏必须足够健康才能执行后续步骤。Rhod-2 AM 是一种对 Ca2+ 敏感的染料,是 Rhod 2 的乙酰基甲酯衍生物,很容易以 AM 形式加载到细胞中。分子的荧光强度增加了 100 倍,这是由 Ca2+ 螯合引起的17。将 Pluronic F127 掺入 Rhod-2 AM 上样溶液中,以防止 Rhod-2 AM 在缓冲液中聚合并帮助其进入细胞。Pluronic F127会降低Rhod-2 AM的稳定性,因此建议仅在配制工作溶液时添加,而不要在长期储存的储存液中添加。本研究使用了电压敏敏染料 RH237,因为它具有与 Ca2+ 指示剂 Rhod-2 AM 一起使用的良好光谱特性。
实现最佳信噪比
获取高信噪比的图像是成像的目标,但噪声就像一个阴暗的幽灵,总是会引起麻烦。由于信号微弱,较低的噪声在一些高速显微成像应用中尤为重要,例如光学成像。信噪比 (SNR) 计算为均方根振幅与均方根噪声的比值,其中噪声振幅在静息电位18 处评估。一些因素,如光源、滤光片、聚焦光学器件和光电探测器,对于实现最佳信噪比至关重要。在这项研究中,检查样品的背景区域是否存在噪声,这些噪声通常在很小的水平上波动。每个像素检测到的光信号是其表面积发射光的平均值。在心律失常期间,AP和钙活动振荡,并且两个信号的振幅都相对较低。即使是很小的干扰也可能导致光信号失真,并导致数据分析错误。因此,当局部异质性是由心律失常(如 VT)期间的电功能引起的时,应小心解释光信号。
减少运动伪影
与电极记录相比,由于运动伪影,光信号经常受到朗根氏夫灌注心脏收缩活动的影响。为了捕获准确的光信号,主要使用激发收缩的药理学抑制剂。为了尽量减少成像过程中的运动伪影,采用布比司他汀来阻止心脏跳动。它是非肌肉肌球蛋白II的ATP酶活性的选择性抑制剂,可有效解偶联心脏的兴奋 - 收缩过程19,20,21。尽管一些研究暗示使用化合物22 会产生一些副作用,但我们利用 10 μM 的最低工作浓度来最大限度地减少对心脏的可能损害。
用于分析心脏光学标测数据集的 ElectroMap 软件
ElectroMap 是一款用于分析心脏光学标测数据集的高通量开源软件。它提供了主要心脏电生理学参数的分析,包括 AP 和 CaT 形态、CV、舒张期、主频率、达峰时间和弛豫常数 (τ) 15,23。该软件支持多种滤波选项,包括高斯滤波器、Savitzky-Goaly 滤波器和 Top-hat 基线校正。高斯滤波器是一种二维平滑,通过计算每个通道和相邻通道的加权平均平滑。它通常用于尖峰毛刺噪声。Savitzky-Goaly滤波通过最小二乘法拟合相邻数据集的较低多项式和连续子集,满足了各种平滑滤波的需要,对于处理由噪声衍生的非周期性和非线性数据集也很有效。平顶基线校正可以根据迹线的峰值将光信号调整到相同的高度,从而更准确地计算动作电位持续时间 (APD) 和钙瞬态持续时间 (CaTD) 等参数。当采样电压和钙荧光信号时,偶尔会发生基线漂移。在计算钙交替和振幅时也很有用。选择两个心室进行电生理检查。
双染料映射的优缺点和限制干扰的方法
近年来,人们已经认识到,阐明全心细胞去极化或复极化和细胞间传导异质性,以及膜钟和钙钟的偶联至关重要,这对于理解心律失常等疾病的机制至关重要24,25。光学映射具有很高的时空分辨率,可确定转基因小鼠心脏的心室活化和复极化特性26,27,28,29。它还可以检测多参数成像,例如,测量加载电压和钙敏感染料的同一心脏24,30或组织31,32的膜电位和细胞内钙。双染料成像有利于研究动作电位与钙的关系,如膜(M)时钟与Ca2+(C)时钟或自发钙释放和去极化后延迟(DAD)之间的关系。正常的心脏兴奋需要两个时钟中的循环事件对齐。这种对齐的破坏会导致心律失常25.自发钙释放与DAD之间的关系是心力衰竭活动的触发机制33。但是,应仔细选择染料的组合。RH-237/Rhod-2 或 di-4-ANEPPS/Indo-1 的组合允许同时记录,而 Fluo-3/4/di-4-ANEPPS 会由于两种染料的重叠发射光谱30、34、35 而导致误差。本实验选择RH237和Rhod-2 AM对心脏进行负荷,并获得了良好的成像质量。
此外,该协议中使用的相机具有两个目标表面,这使其能够在一个采样接口上捕获分离信号,并允许单个相机检测两种不同的发射波长。这种结合各种光电子能谱 (PES) 协议的光学 AP 和 CaT 同时映射将使我们能够确定异常 [Ca2+]i 与应力条件下的电不稳定性之间的相互关系,以及活化后增强对这些异常的影响。SR Ca2+ 循环的空间异质性以及它如何影响电交替和致心律失常行为的出现、严重程度和一致性,例如空间不一致的交替和随之而来的 VT,将在不同组的完整心脏中进行研究。将探讨 SR Ca 2+ 交替体、RyR2 耐火度及其在 SR Ca2+ 和 APD 交替体中的作用。
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Disclosures
所有作者均无任何利益冲突可声明。
Acknowledgments
本研究得到了国家自然科学基金(81700308 至 XO,31871181 至 ML,82270334 至 XT)、四川省科技支撑计划(CN)(2021YJ0206 至 XO、23ZYZYTS0433、2022YFS0607 至 XT、2022NSFSC1602 至 TC)和广西师范大学化学与分子工程国家重点实验室(CMEMR2017-B08 至 XO), MRC(G10031871181 至 ML02647、G1002082、ML)、BHF(PG/14/80/31106、PG/16/67/32340、PG/12/21/29473、PG/11/59/29004 ML)、BHF CRE 在牛津 (ML) 赠款。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
References
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