Summary
Этот протокол вводит оптическое картирование сердца мышей с двойным окрасителем, полученное от животных дикого типа и животных, пораженных катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардией, включая электрофизиологические измерения трансмембранного напряжения и внутриклеточных транзиентовCa2+ с высоким временным и пространственным разрешением.
Abstract
Проаритмическое заболевание сердца, катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия (КПВТ), проявляется в виде эпизодов полиморфной желудочковой тахикардии после физической активности, стресса или катехоламиновой нагрузки, которая может ухудшиться до потенциально смертельной фибрилляции желудочков. Сердце мыши является широко распространенным видом для моделирования наследственных заболеваний сердечной аритмии, включая CPVT. Одновременное оптическое картирование трансмембранного потенциала (Vm) и кальциевых транзиентов (CaT) из перфузионных сердец мышей по методу Лангендорфа может пролить свет на механизмы, лежащие в основе аритмогенеза. По сравнению с исследованием на клеточном уровне, метод оптического картирования позволяет проверить некоторые электрофизиологические параметры, такие как определение активации, скорости проводимости, длительности потенциала действия и длительности CaT. В данной работе представлена приборная установка и экспериментальная методика для высокопроизводительного оптического картирования CaT и Vm в мышиных сердцах дикого типа и гетерозиготных сердец RyR2-R2474S/+ в сочетании с программируемой электрической стимуляцией до и во время испытания изопротеренолом. Этот подход продемонстрировал осуществимый и надежный метод механистического изучения заболевания ЦПВТ в препарате сердца мыши ex vivo .
Introduction
Наследственное заболевание сердца, катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия (КПВТ), проявляется в виде эпизодов полиморфной желудочковой тахикардии (ПВТ) после физической активности, стресса или катехоламиновой нагрузки, которая может перерасти в потенциально смертельную фибрилляцию желудочков 1,2,3,4 . Недавние данные, полученные после первого сообщения о клиническом синдроме в 1995 году, указывают на мутации в семи генах, все из которых участвуют в высвобождении Са2+ в саркоплазматическом ретикулярном (СР) запасе Ca2+ при этом состоянии: наиболее часто сообщаемый RYR2, кодирующий рианодиновый рецептор 2 (RyR2) каналов высвобожденияCa2+ 5,6, FKBP12.67, CASQ2, кодирующий сердечный кальсеквестрин8, TRDN кодирует соединительный белок SR триадин 9, а CALM1 9, CALM2 10 и CALM3 идентично кодирует кальмодулин11,12. Эти генотипические паттерны связывают аритмические события с нерегулируемым патологическим высвобождением запаса SR Ca2+12.
Спонтанное высвобождение Ca2+ из SR может быть обнаружено в виде искр Ca2+ или волн Ca2+, что активирует обменник Na+/Ca2+ (NCX). Обменник одного Ca2+ на три Na+ генерирует внутренний ток, который ускоряет диастолическую деполяризацию и доводит мембранное напряжение до порога потенциала действия (AP). У мышей с нокаутом RyR2 повышенная активность RyR2R4496C в синоатриальном узле (SAN) приводит к непредвиденному снижению автоматизма SAN за счет Ca2+-зависимого снижения истощения ICa,L и SRCa2+ во время диастолы, что позволяет выявить субклеточные патофизиологические изменения, способствующие дисфункции SAN у пациентов с CPVT13,14. Возникновение соответствующих цитозольных волн Ca2+ кардиомиоцитов более вероятно после увеличения фонового цитозольного [Ca2+] после сенсибилизации RyR катехоламином, включая изопротеренол (ISO).
Детальные кинетические изменения в передаче сигналов Ca2+ после RyR2-опосредованного высвобожденияCa2+ в ответ на активацию потенциала действия (AP), которые могут быть причиной наблюдаемых желудочковых аритмий в интактных моделях CPVT сердца, еще предстоит определить для всего спектра зарегистрированных генотипов RyR212. В данной работе представлена приборная настройка и экспериментальная методика высокопроизводительного картирования сигналов Ca2+ и трансмембранных потенциалов (Vм) в мышиных сердцах дикого типа (WT) и гетерозиготных RyR2-R2474S/+ в сочетании с программируемой электрической стимуляцией до и после изопротеренолового вызова. Этот протокол представляет собой метод механистического изучения заболевания ЦПВТ в изолированных сердцах мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Для экспериментов использовали самцов мышей дикого типа в возрасте от 10 до 14 недель или мышей RyR2-R2474S/+ (на фоне C57BL/6) массой 20-25 г. Все процедуры были одобрены комитетом по уходу за животными и их использованию Юго-Западного медицинского университета, Сычуань, Китай (одобрение NO:20160930) в соответствии с национальными руководящими принципами, в соответствии с которыми работает учреждение.
1. Подготовка
- Складские решения
- Исходный раствор блеббистатина: Добавьте 1 мл 100% диметилсульфоксида (ДМСО) в исходную колбу, содержащую 2,924 мг (-) порошка блеббистатина, до достижения концентрации 10 мМ.
- Индикатор напряжения Исходный раствор RH237: Добавьте 1 мл 100% ДМСО в оригинальную колбу с 1 мг порошка RH237 до достижения концентрации 2,01 мМ.
- Кальциевый индикатор Исходный раствор Rhod-2 AM: Добавьте 1 мл 100% ДМСО в 1 мг порошка Rhod-2 AM до достижения концентрации 0,89 мМ.
- Исходный раствор Pluronic F127: Добавьте 1 мл 100% ДМСО в 200 мг Pluronic F127 до достижения концентрации 20% по массе (0,66 мМ).
- Аликвотируют исходные растворы в 200-мкл ПЦР-пробирок в 21-51 мкл (21 мкл RH237, 31 мкл Rhod-2 AM и 51 мкл блеббистатина) для однократного или двукратного использования, чтобы избежать повторного замораживания и размораживания. Затем оберните растворы алюминиевой фольгой и храните при температуре -20 °C, за исключением исходного раствора Pluronic F127, помещенного в темное помещение при температуре окружающей среды.
- Раствор для перфузии
- Раствор Кребса (в мМ): Приготовьте 1 л раствора Кребса (NaCl 119, NaHCO3 25, 2 PO 4 1,0, KCl4,7, MgCl 2 1,05, CaCl2 1,35 и глюкоза 10).
- Отфильтруйте раствор с помощью асептического игольчатого фильтра 0,22 мкм и насыщайте кислородом 95% O 2/5% CO2.
- Возьмите 40 мл раствора Кребса в центробежную пробирку объемом 50 мл и храните ее при температуре 4 °C для последующей изоляции сердца.
- Перфузионная система Лангендорфа и устройство оптического картирования
- Установите перфузионную систему Лангендорфа.
- Включите водяную баню и установите температуру 37 °C.
- Промойте перфузионную систему Лангендорфа 1 л деионизированной воды.
- Прокачать раствор из впускного тракта и отрегулировать скорость оттока до 3,5-4 мл/мин. Затем насыщают перфузат кислородом O 2 / CO2 (95%/5%) при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки никогда не допускаются в системе перфузии.
- Подготовьте систему оптического картографирования.
- Установите камеру с электронным умножением зарядовой связи (EMCCD) (512 × 512 пикселей), объектив (40-кратное увеличение), светоизлучающие диоды (LED) с делителем длины волны, монитор электрокардиограммы (ЭКГ) и электрод стимуляции (рис. 1).
- Отрегулируйте правильное рабочее расстояние от объектива до положения сердца.
- Установите два светодиода в диагональном положении термостатической ванны для равномерного освещения, обеспечивая длину волны 530 нм для генерации возбуждающего света. Используйте фильтр ET525/50 с напылением для удаления внешнего света для светодиодов.
- Отрегулируйте переключатель ручки так, чтобы он был равен квадрату целевой поверхности, чтобы изображения напряжения и кальция отображались адекватно на интерфейсе сбора данных.
- Поверните диафрагму объектива до максимального диаметра, чтобы избежать утечки сигналов напряжения или кальция.
- Отрегулируйте объектив камеры на правильной высоте, так как он служит прекрасным рабочим расстоянием до термостатической ванны, в основном используется 10 см.
- Включите камеру, чтобы обеспечить стабильную температуру отбора проб при -50 °C.
- Установите перфузионную систему Лангендорфа.
2. Процедуры
- Сбор, канюляция и перфузия сердца мыши
- Животным внутрибрюшинно вводят раствор авертина (1,2%, 0,5-0,8 мл) и гепарин (200 ЕД), чтобы свести к минимуму страдания и болевой рефлекс и предотвратить образование тромбов. Через 15 минут жертвуют животных при вывихе шейки матки.
- Вскройте грудную клетку ножницами, осторожно соберите сердце и поместите его в холодный раствор Кребса (4 °C, 95% O 2, 5% CO2), чтобы замедлить обмен веществ и защитить сердце.
- Удалить окружающие ткани аорты, канюлировать аорту с помощью специально изготовленной канюлирующей иглы (наружный диаметр: 0,8 мм, внутренний диаметр: 0,6 мм, длина: 27 мм) и зафиксировать шелковым швом 4-0.
- Перфузия сердца системой Лангендорфа с постоянной скоростью 3,5-4,0 мл/мин и поддержание температуры на уровне 37 ± 1 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие процедуры выполняются в этом состоянии. - Вставьте небольшую пластиковую трубку (диаметр 0,7 мм, длина 20 мм) в левый желудочек, чтобы уменьшить скопление раствора в камере и избежать перегрузки.
- Разъединитель возбуждения-сжатия и двойной нагрузки красителя
- Вставьте два провода в перфузат в ванне, включите питание блока усилителя ЭКГ и контроллера электростимуляции, а затем запустите указанное программное обеспечение ЭКГ и непрерывно контролируйте ЭКГ.
- Последующие действия выполняйте в темноте, когда сердце достигнет стабильного состояния (сердце ритмично бьется с частотой ~400 уд/мин).
- Смешайте 50 мкл 10 мМ исходного раствора блеббистатина с 50 мл раствора Кребса до достижения концентрации 10 мкМ. Постоянно вводите смесь раствора блеббистатина-Кребса в сердце в течение 10 минут, чтобы отделить сокращение от возбуждения и избежать артефактов сокращения во время съемки.
- Используйте красный фонарик, чтобы проверить, полностью ли прекращается сокращение сердца, потому что сокращение повлияет на качество загрузки красителя.
- После развязки возбуждения-сжатия смешать 15 мкл исходного раствора Rhod-2 AM с 15 мкл исходного раствора Pluronic F127 в 50 мл раствора Кребса до достижения конечных концентраций 0,267 мкМ Rhod-2 AM и 0,198 мкМ Pluronic F127. Затем непрерывно перфузии сердца рабочим раствором Rhod-2 AM в течение 15 мин в перфузионной системе Лангендорфа.
- Поддерживайте поступление кислорода во время внутриклеточной загрузки кальциевым красителем. Поскольку в Pluronic F127 легко образуются пузырьки, вставьте пузырьковую ловушку в перфузионную систему, чтобы избежать газовой эмболизации коронарных артерий.
- Разбавьте 10 мкл исходного раствора RH237 в 50 мл перфузата до достижения конечной концентрации в 0,402 мкМ и выполняйте нагрузку в течение 10 минут.
- В конце загрузки двойного красителя сделайте серию фотографий, чтобы убедиться, что сигналы напряжения и кальция достаточны для анализа (нет взаимодействия между двумя сигналами).
- Оптическое картирование и индукция аритмии
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическое картирование начинается после прекращения схваток и соответствующей загрузки красителя, и сердце последовательно перфузируется, как описано выше в 2.1 (4).- Включите два светодиода для возбуждающих ламп и отрегулируйте их интенсивность в нужном диапазоне (достаточно мощном для освещения и относительно простой съемки, но не слишком сильном для передержки).
- Поместите сердце под устройство обнаружения, убедитесь, что оно находится под достаточным освещением двух светодиодов, и отрегулируйте диаметр светового пятна до 2 см.
- Установите рабочее расстояние от объектива до сердца на 10 см, что даст частоту дискретизации почти 500 Гц и пространственное разрешение 120 x 120 мкм на пиксель.
- Откройте программное обеспечение для выборки сигналов, чтобы управлять камерой в цифровом виде для одновременного захвата сигналов напряжения и кальция.
- Запустите стимулятор поля миопака и установите паттерн стимуляции на Transistor Transistor Logic (TTL), длительность кардиостимуляции 2 мс для каждого импульса и 0,3 В в качестве начальной интенсивности.
- Используйте 30 последовательных стимулов S1 с частотой 10 Гц для проверки порога диастолического напряжения сердца, управляемого программным обеспечением для записи ЭКГ. Постепенно увеличивайте амплитуду напряжения до тех пор, пока не будет реализован захват 1:1 (проверьте волну QRS с монитора ЭКГ, потенциал действия (AP) и сигналы переходных процессов кальция (CaT).
- После определения порога напряжения обработайте сердце с интенсивностью, в 2 раза превышающей порог диастолического напряжения, с помощью пары платиновых электродов, прикрепленных к эпикарду верхушки левого желудочка (LV) (ELVA).
- Реализуйте протокол S1S1 для измерения кальция или альтернативных свойств потенциала действия и реституции. Последовательно выполняйте сердечный ритм с основной продолжительностью 100 мс, уменьшая длину цикла на 10 мс с каждой последующей последовательностью, пока не будет достигнуто 50 мс. Каждый эпизод включает в себя 30 последовательных стимулов с длительностью импульса 2 мс. В то же время перед стимуляцией начинайте оптическое картирование (время выборки включает ~10 синусовых ритмов и длительность стимуляции).
- Чтобы измерить эффективный рефрактерный период желудочков (ERP) с помощью протокола стимуляции S1S2, начните с длительности цикла стимуляции S1S1 100 мс с S2 в сочетании с 60 мс с шагом 2 мс до тех пор, пока S2 не захватит эктопический QRS-комплекс.
- Для индукции аритмии проводят непрерывную импульсную стимуляцию с частотой 50 Гц (50 непрерывных электрических стимуляций с длительностью импульса 2 мс) и выполняют тот же эпизод стимуляции после 2-секундного интервала отдыха.
- Внимательно наблюдайте за записями ЭКГ в течение непрерывного периода высокочастотной стимуляции, чтобы одновременная запись оптического картирования могла начаться сразу при возникновении интересной аритмичной волны ЭКГ (поскольку большинство сердечных аритмий индуцируются электрической стимуляцией, оптические сигналы дискретизируются за 2-3 с до пиковой стимуляции в случае потери важных сердечных событий).
- Изображение получено с помощью камеры EMCCD (частота дискретизации: 500 Гц, размер пикселя: 64 x 64).
- Анализ данных
- Загрузка изображений и обработка сигналов
- Нажмите Select Folder and Load Images, чтобы загрузить изображения в программное обеспечение для получения изображений для полуавтоматического анализа массивных видеоданных в соответствии с настройками и протоколами, описанными выше15,16.
- Введите правильные параметры выборки (например, размер пикселя и частоту кадров).
- Установите порог изображения с помощью ручного ввода и выберите область интереса (ROI).
- Реализуйте пространственный фильтр Гаусса размером 3 x 3 пикселя, фильтр Савицкого-Гоали и коррекцию базовой линии цилиндра.
- Нажмите Process Images, чтобы удалить базовую линию и рассчитать электрофизиологические параметры, такие как APD80 и CaTD50.
- Анализ электрофизиологических параметров
- Установите время начала APD на пике и конечную точку на 80% реполяризации (APD80) для расчета APD80. Аналогично, время начала CaTD определяется как пик, а конечная точка определяется как 80%-ная релаксация.
- Измерение скорости проводимости (CV) зависит от размера пикселя и времени проводимости потенциала действия между двумя пикселями или более. Вычислите среднюю скорость из всех выбранных пикселей - это средняя скорость проводимости выделенной области. Одновременное создание соответствующих изохрональных карт для четкого представления направления проводимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: O'Shea et al.15 подробно сообщили об измерении CV. - Для анализа альтернанов и аритмий кальциевые альтернаны определяются как непрерывная большая и малая пиковая амплитуда, появляющаяся попеременно. Используйте коэффициент пиковой амплитуды для оценки тяжести частотно-зависимых альтернанов (1-A2/A1). Применяйте фазовые карты для анализа сложных аритмий, таких как желудочковая тахикардия (ЖТ). Обратите внимание на роторы, отчетливо появляющиеся в определенной области при их смещении.
- Загрузка изображений и обработка сигналов
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оптическое картирование является популярным подходом при изучении сложных сердечных аритмий в последнее десятилетие. Установка оптического картографирования состоит из камеры EMCCD, обеспечивающей частоту дискретизации до 1 000 Гц и пространственное разрешение 74 x 74 мкм для каждого пикселя. Это обеспечивает достаточно высокое соотношение сигнал/шум при дискретизации сигнала (рис. 1). После того, как сердце, перфузионированное по Лангендорфу, достигает стабильного состояния и завершается загрузка красителя, сердце помещается в гомоэотермическую камеру под освещением двух светодиодов с длиной волны 530 нм, которые используются для возбуждения индикатора напряжения RH237 и индикатора Ca2+ Rhod-2 AM. Излучение разделяется на две длины волн 600 нм (для Ca2+) и 670 нм (для Vм), которые одновременно регистрируются с помощью камеры EMCCD. После перфузии авертина и гепарина в течение 15 мин хирургическими инструментами (рис. 2А) вскрывают грудную клетку и быстро извлекают сердце, затем переносят его в холодный раствор Кребса (4 °С, 95% О 2, 5 % СО 2) (рис. 2Б). Тщательно очищают окружающие ткани, фиксируют аорту швом 4-0 и вводят в левый желудочек пластиковую трубку диаметром 0,7 мм (рис. 2В), чтобы снять застой перфузата в камере левого желудочка. Поместите провода ЭКГ в перфузат (рис. 2D) и убедитесь, что сердце бьется ритмично в соответствии с мониторингом ЭКГ, управляемым программным обеспечением для записи ЭКГ. Затем выполните двойную загрузку красителя в темноте (Рисунок 2E).
После того, как артефакты сокращения были сведены к минимуму с помощью блеббистатина (10 мкМ) и была завершена адекватная загрузка красителя, съемка начиналась примерно за 10 синусовых ударов перед протоколом стимуляции S1S1 для оценки частотно-зависимых свойств восстановления электрофизиологических параметров и кальция альтернанов после введения изопротеренола (1 мкМ ISO) (рис. 3A). На рисунке 3B показан репрезентативный волновой фронт ЭКГ VT и соответствующие следы потенциала действия (AP) и CaT, индуцированные последовательностью импульсной стимуляции 50 Гц у мышей CPVT. Программное обеспечение для визуализации оптических сигналов используется для полуавтоматического анализа больших объемов видеоданных.
На рисунках 4A,B показаны типичные трассы и тепловые карты APD80 и CaTD80 соответственно. ISO укорачивает APD80 у мышей WT и CPVT, но не было обнаружено различий между мышами WT и CPVT до и после испытания ISO (рис. 4C, **P < 0,01. n = 5/6). На рисунке 4D показано, что CaTD80 у мышей CPVT дольше, чем у WT после введения ISO, в то время как до обработки ISO значимости не было (**P < 0,01. n = 6.).
Для измерения проводимости на рисунке 5A представлен одновекторный алгоритм количественной оценки CV. Согласно сигналам напряжения, сердца WT и CPVT обладают одинаковой проводимостью по всему эпикарду на исходном уровне и после вмешательства ISO (рис. 5B). На рисунке 5C, D показаны репрезентативные карты активации напряжения и кальция в сердцах WT и CPVT до и после испытания ISO.
Кальций альтернанс является критическим параметром при аритмии. Амплитуду кальция рассчитывают в соответствии с рецептурой, показанной на рисунке 6А. Кальциевые сигналы в сердцах WT остаются стабильными на исходном уровне во время последовательной стимуляции S1S1 на частотах 14,29 и 16,67 Гц (рис. 6B), в то время как сердца CPVT демонстрируют частотно-зависимые альтернаны (рис. 6C). После испытания по ISO сердца CPVT демонстрируют частотно-зависимые альтернаны в сигнале кальция во время кардиостимуляции S1S1, в то время как сердца WT не подвержены влиянию (рис. 6D, E). После непрерывной кардиостимуляции S1S1 выполняется протокол импульсной стимуляции для индуцирования летальных аритмий. Сердца WT и CPVT демонстрируют нормальную проводимость при пиковой частоте 50 Гц на исходном уровне (рис. 7A). После перфузии с ИСО сердца CPVT демонстрируют высокочастотные роторы после пиковой стимуляции 50 Гц, в то время как сердца WT сохраняют нормальную проводимость (рис. 7B).
Рисунок 1: Аппаратура оптического картографирования. В состав системы входит специально разработанная EMCCD-камера с высоким пространственно-временным разрешением (частота дискретизации до 1 000 Гц, минимальный дискретизирующий пиксель 74 x 74 мкм). Контроллер электростимуляции используется для отбора проб и выходного протокола электростимуляции. Два зеленых светодиода используются для возбуждающего света флуоресцентных зондов. Длиннопроходное дихроичное зеркало (610 нм) и соответствующие излучатели разделяют напряжение и кальциевую флуоресцентную лампу. RH237, чувствительный к напряжению краситель, излучает свет на пиковой длине волны 670 нм, в то время как Rhod-2 AM, чувствительный к кальцию краситель, обладает эмиссионным светом на пиковой длине волны 600 нм. Незначительные изменения обоих флуоресцентных сигналов могут быть зафиксированы камерой одновременно благодаря высокой частоте дискретизации и чувствительности датчика камеры. Сокращения: EMCCD = электронно-умножающее зарядовое устройство; LED = светодиод; ЭКГ = электрокардиограмма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Подготовка и двойная загрузка красителя . (А) Хирургические инструменты. (Б) Жатва мышиного сердца. (C) Аккуратно отрежьте ненужную ткань для четкого обзора аорты и вставьте пластиковую трубку 0,7 мм из аорты в левый желудочек. (D) Сердце быстро удаляется в перфузионную систему Лангендорфа. (E) Двойная загрузка красителя и прекращение возбуждения-сжатия в темноте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Протокол S1S1 и протокол индукции аритмии. (A) Репрезентативный волновой фронт ЭКГ и соответствующие трассы сигналов АР и кальция с использованием протокола стимуляции S1S1 после испытания по ISO. (B) Индукция VT с помощью последовательности импульсной стимуляции 50 Гц после перфузии ISO в мыши CPVT. Сокращения: ЭКГ = электрокардиограмма; AP = потенциал действия; ISO = изопротеренол; VT = желудочковая тахикардия; CPVT = катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ APD80 и CaTD80 при частоте 10 Гц до и после испытания по ISO. (A) Репрезентативные трассы AP и тепловые карты APD80 сердец WT и CPVT до и после обработки ISO. (B) Типичные трассы CaT и тепловые карты CaTD80 сердец WT и CPVT до и после испытания ISO. (C) ISO укорачивает APD80 у мышей WT и CPVT, но не обнаружено различий между мышами WT и CPVT до и после испытания ISO. (D) CaTD80 у мышей CPVT дольше, чем у WT после введения ISO, в то время как до обработки ISO не было значимости. (* P < 0,05, **P < 0,01. n =5/6.) Сокращения: AP = потенциал действия; APD80 = пик при 80% реполяризации; ISO = изопротеренол; CPVT = катехоламингическая полиморфная желудочковая тахикардия; WT = дикий тип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Анализ скорости проводимости при частоте 10 Гц. (А) Одновекторный алгоритм скорости проводимости. (B) Отсутствие различий в CV AP у мышей WT и CPVT. (C) Репрезентативные тепловые карты показывают, что мыши CPVT обладают той же проводимостью, что и мыши WT до и после испытания ISO в соответствии с сигналами напряжения. (D) Не обнаружено существенных различий в двух группах по индуцированным потенциалом действия изохронов CaT80 до и после вызова ISO. Сокращения: AP = потенциал действия; ISO = изопротеренол; CPVT = катехоламингическая полиморфная желудочковая тахикардия; WT = дикий тип; AT = время активации; CV = скорость проводимости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Анализ амплитуды кальция в чередах. (А) Алгоритм вычисления амплитуды кальция чередующимися. (B) Кальциевые сигналы в сердцах WT остаются стабильными на исходном уровне во время последовательной стимуляции S1S1 на частотах 14,29 и 16,67 Гц, в то время как (C) сердца CPVT демонстрируют частотно-зависимые альтернаны. (D) Сердца WT не подвержены влиянию вызова ISO, в то время как (E) после испытания ISO, сердца CPVT демонстрируют частотно-зависимые альтернаны в сигнале кальция во время кардиостимуляции S1S1. Сокращения: ISO = изопротеренол; CPVT = катехоламингическая полиморфная желудочковая тахикардия; WT = дикий тип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Анализ тахиаритмии с использованием фазовых карт . (A) Сердца WT и CPVT демонстрируют нормальную проводимость при пиковой частоте 50 Гц на исходном уровне. (B) После перфузии с ИСО сердца CPVT демонстрируют высокочастотные роторы после пиковой стимуляции 50 Гц, в то время как сердца WT сохраняют нормальную проводимость. Сокращения: ISO = изопротеренол; CPVT = катехоламингическая полиморфная желудочковая тахикардия; WT = дикий тип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основываясь на нашем опыте, мы пришли к выводу, что ключом к успешному оптическому картированию сердца мыши с использованием двойного красителя являются хорошо подготовленный раствор и загрузка сердца, красителя, достижение наилучшего соотношения сигнал/шум и уменьшение артефактов движения.
Приготовление раствора
Раствор Кребса необходим для успешного эксперимента на сердце. Исходные растворы MgCl2 и CaCl2 (1 моль/л) готовят заранее с учетом их водопоглощения и добавляют в раствор Кребса после растворения всех остальных компонентов в чистой воде, так как Mg2+ и Ca2+ могут легко выпадать в осадок вместе с CO32+. Раствор Кребса барботируют с 95% O 2/5% CO2 в течение не менее 30 минут для обеспечения оксигенации. Поскольку сердце мыши особенно чувствительно к рН, рН раствора должен быть около 7,4 после оксигенации. Даже если в растворе находятся крошечные частицы, это может повлиять на результаты эксперимента, поскольку эти частицы могут блокировать капилляры и влиять на перфузионный эффект. Поэтому перед использованием раствор фильтруют с помощью асептического игольчатого фильтра 0,22 мкм.
Подготовка сердца
Перед забором сердец мышей сначала гепаринизируют, чтобы избежать образования тромбов в коронарной системе, предотвращая плохую перфузию красителя, вызванную застойным сердцем, на последующую визуализацию. Чем короче время ишемии сердца, тем лучше состояние сердца. Таким образом, время ишемии контролируется в течение 2-3 минут с момента забора сердца до канюляции через аорту по системе Лангендорфа. Кроме того, важно поддерживать перфузионное давление. Следовательно, тонкая силиконовая (пластиковая) трубка вводится в полость левого желудочка, чтобы избежать слишком высокого давления в левом желудочке во время сокращения желудочков после перевязки выхода левого желудочка, что может привести к плохой перфузии миокарда и закислению бескислородной ткани.
Загрузка красителя
Эти эксперименты осуществляют загрузку красителя путем перфузии сердца в системе Лангендорфа. Очень важно следить за сердечным ритмом, потому что плохая нагрузка красителем возникает, когда аномальный ритм вызван хирургическими операциями или ишемически-реперфузионным повреждением. Сердце должно быть достаточно здоровым, чтобы выполнять последующие шаги. Rhod-2 AM, чувствительный к Ca2+ краситель, представляет собой производное ацетилметилового эфира Rhod 2, которое легко загружается в клетки в форме АМ. Увеличение интенсивности флуоресценции молекулы в 100 раз происходит в результате хелатированияCa2+ 17. Pluronic F127 включен в загрузочный раствор Rhod-2 AM, чтобы предотвратить полимеризацию Rhod-2 AM в буфере и помочь ему проникнуть в клетки. Pluronic F127 может снижать стабильность Rhod-2 AM, поэтому его рекомендуется добавлять только при приготовлении рабочего раствора, но не в раствор для хранения для длительного хранения. Потенциал-чувствительный краситель RH237 использован в данном исследовании благодаря своим благоприятным спектральным свойствам для использования с индикатором Ca2+ Rhod-2 AM.
Достижение наилучшего соотношения сигнал/шум
Целью визуализации является получение изображений с высоким отношением сигнал/шум, но шум подобен призрачному призраку, который всегда доставляет неприятности. Из-за слабых сигналов низкий уровень шума особенно важен в некоторых высокоскоростных приложениях микроскопической визуализации, таких как оптическое картографирование. Отношение сигнал/шум (SNR) вычисляется как отношение среднеквадратичной амплитуды к среднеквадратичному шуму, где амплитуда шума оценивается при потенциале покоя18. Некоторые факторы, такие как источник света, оптические фильтры, фокусирующая оптика и фотоприемники, имеют важное значение для достижения наилучшего отношения сигнал/шум. В исследовании фоновая область образца исследуется на наличие шума, который часто колеблется на крошечном уровне. Оптический сигнал, регистрируемый каждым пикселем, представляет собой среднее значение света, излучаемого его поверхностью. Активность АФ и кальция колеблется во время аритмии, и амплитуда обоих сигналов относительно невелика. Даже незначительные помехи могут привести к искажению оптических сигналов и ошибкам при анализе данных. Поэтому интерпретация оптических сигналов должна быть осторожной, когда локальная гетерогенность вызвана электрической функцией при таких аритмиях, как ЖТ.
Уменьшение артефакта движения
По сравнению с электродной регистрацией, оптические сигналы часто зависят от активности сокращения перфузированных сердец Лангендорфа из-за артефактов движения. Для улавливания точных оптических сигналов в основном используются фармакологические ингибиторы возбуждения-сокращения. Чтобы свести к минимуму артефакт движения во время визуализации, используется блеббистатин, чтобы остановить сердцебиение. Является селективным ингибитором активности АТФазы немышечного миозина II и эффективно разъединяет процесс возбуждения-сокращения сердца 19,20,21. Несмотря на то, что некоторые исследования предполагают некоторые побочные эффекты при использовании соединения22, мы используем самую низкую рабочую концентрацию при 10 мкМ, чтобы свести к минимуму возможное повреждение сердца.
Программное обеспечение ElectroMap для анализа наборов данных оптического картирования сердца
ElectroMap — это высокопроизводительное программное обеспечение с открытым исходным кодом для анализа наборов данных оптического картирования сердца. Он обеспечивает анализ основных параметров электрофизиологии сердца, включая морфологию AP и CaT, CV, диастолический интервал, доминантную частоту, время достижения пика и константу релаксации (τ) 15,23. Программное обеспечение допускает несколько вариантов фильтрации, включая фильтр Гаусса, фильтр Савицкого-Голи и коррекцию базовой линии цилиндра. Фильтр Гаусса представляет собой двумерное сглаживание путем вычисления средневзвешенного сглаживания каждого канала и смежных каналов. Он обычно используется для спайкового глитч-шума. Фильтр Савицкого-Гоали подходит для нижнего полиномиального и непрерывного подмножества смежных наборов данных с помощью метода наименьших квадратов, который удовлетворяет потребность в различных плавных фильтрах, а также эффективен для обработки непериодических и нелинейных наборов данных, полученных из шума. Коррекция базовой линии цилиндра позволяет настраивать оптические сигналы на одну и ту же высоту в соответствии с пиками дорожек, гораздо точнее рассчитывая такие параметры, как длительность потенциала действия (APD) и длительность переходного процесса кальция (CaTD). Дрейф базовой линии иногда происходит при выборке сигналов напряжения и флуоресценции кальция. Он также полезен при расчете кальциевых альтернанов и амплитуды. Для электрофизиологического исследования были отобраны оба желудочка.
Преимущества и недостатки картирования с двойным окрашиванием и методы ограничения интерференции
В последние годы было осознано, что жизненно важно прояснить деполяризацию или реполяризацию клеток и гетерогенность межклеточной проводимости во всем сердце, а также сопряжение мембранных часов и кальциевых часов, что имеет решающее значение для понимания механизма таких заболеваний, как аритмия24,25. Оптическое картирование имеет высокое пространственно-временное разрешение для определения свойств активации и реполяризации желудочков сердца трансгенных мышей26,27,28,29. Он также может обнаруживать многопараметрическую визуализацию, например, измерение мембранного потенциала и внутриклеточного кальция одного и того же сердца24,30 или ткани 31,32, нагруженной напряжением и кальций-чувствительным красителем. Визуализация с использованием двух красителей полезна для изучения взаимосвязи между потенциалом действия и кальцием, например, взаимосвязи между мембранными (М) часами и часами Ca2+ (C) или спонтанным высвобождением кальция и задержкой после деполяризации (DAD). Нормальное сердечное возбуждение требует, чтобы циклические события в двух часах были согласованы. Нарушение этого выравнивания приводит к аритмии25. Взаимосвязь между спонтанным высвобождением кальция и ДАД является механизмом запуска активности при сердечной недостаточности 33. Однако комбинацию красителей следует тщательно подбирать. Комбинация RH-237/Rhod-2 или di-4-ANEPPS/Indo-1 позволяет вести одновременную запись, в то время как Fluo-3/4/di-4-ANEPPS приведет к ошибкам из-за перекрывающихся спектров излучения двух красителей30,34,35. В этом эксперименте были выбраны RH237 и Rhod-2 AM для загрузки сердца и получено хорошее качество изображения.
Кроме того, камера, используемая в этом протоколе, имеет две целевые поверхности, что позволяет ей захватывать разделенные сигналы на одном интерфейсе дискретизации и позволяет одной камере обнаруживать две разные длины волны излучения. Такое одновременное картирование оптических AP и CaT, комбинируя различные протоколы фотоэлектронной спектроскопии (PES), позволит определить взаимосвязь между аномальными [Ca2+]i и электрической нестабильностью в условиях стресса и влияние постактивационного потенцирования на эти аномалии. Пространственно гетерогенная природа цикла SRCa2+ и то, как это влияет на возникновение, тяжесть и конкордантность электрических альтернанов и аритмогенного поведения, таких как пространственно дискордантные альтернаны и последующие VT, будут изучены в интактном сердце в разных группах. Будут исследованы альтернаны SR Ca2+, тугоплавкость RyR2 и их роль в чередованиях SR Ca2+ и APD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни у кого из авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Acknowledgments
Это исследование поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (81700308 для XO и 31871181 для ML и 82270334 для XT), Программой поддержки науки и технологий провинции Сычуань (CN) (2021YJ0206 для XO, 23ZYZYTS0433 и 2022YFS0607 для XT и 2022NSFSC1602 для TC) и Государственной ключевой лабораторией химии и молекулярной инженерии медицинских ресурсов (Педагогический университет Гуанси) (CMEMR2017-B08 для XO), MRC (от G10031871181 до ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE в Оксфорде (ML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
References
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
- Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
- Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
- Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
- Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
- Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al.
- Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
- Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
- Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
- Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
- Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
- O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
- Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
- Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
- Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
- Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
- Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
- Mal Baudot,, et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
- Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
- Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
- Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
- Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
- He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
- Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).
