Summary
Detta protokoll introducerar optisk kartläggning av mushjärtan med dubbla färgämnen erhållna från vildtyps- och knock-in-djur som drabbats av katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi, inklusive elektrofysiologiska mätningar av transmembranspänning och intracellulära Ca2+ -transienter med hög tidsmässig och rumslig upplösning.
Abstract
Den proarytmiska hjärtsjukdomen katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi (CPVT) manifesterar sig som polymorfa ventrikulära takykardiepisoder efter fysisk aktivitet, stress eller katekolaminprovokation, som kan försämras till potentiellt dödligt ventrikelflimmer. Mushjärtat är en utbredd art för modellering av ärftliga hjärtarytmisjukdomar, inklusive CPVT. Samtidig optisk kartläggning av transmembranpotential (Vm) och kalciumtransienter (CaT) från Langendorff-perfunderade mushjärtan har potential att belysa mekanismer som ligger till grund för arytmogenes. Jämfört med undersökningen på cellnivå kan den optiska kartläggningstekniken testa vissa elektrofysiologiska parametrar, såsom bestämning av aktivering, ledningshastighet, aktionspotentialvaraktighet och CaT-varaktighet. Denna artikel presenterar instrumenteringsuppställningen och den experimentella proceduren för optisk kartläggning av CaT och Vm med hög genomströmning i murina vildtyps- och heterozygota RyR2-R2474S/+-hjärtan, kombinerat med programmerad elektrisk stimulering före och under isoprotereno-provokationen. Detta tillvägagångssätt har visat sig vara en genomförbar och tillförlitlig metod för mekanistisk studie av CPVT-sjukdom i ett ex vivo-hjärtpreparat för mus.
Introduction
Ärftlig hjärtsjukdom katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi (CPVT) yttrar sig som polymorf ventrikulär takykardi (PVT) efter fysisk aktivitet, stress eller katekolaminprovokation, som kan försämras till potentiellt dödligt ventrikelflimmer 1,2,3,4 . Nya bevis efter den första rapporten som ett kliniskt syndrom 1995 implicerade mutationer i sju gener, alla involverade i sarkoplasmatisk retikulär (SR) lagrar Ca 2+-frisättning i detta tillstånd: den mest frekvent rapporterade RYR2-kodande ryanodinreceptorn 2 (RyR2) i Ca2+ frisättningskanalerna5,6, FKBP12.67, CASQ2 som kodar för hjärtkalsekvestrin8, TRDN som kodar för det korsande SR-proteinet triadin 9 och CALM1 9, CALM2 10 och CALM3 kodar identiskt för kalmodulin11,12. Dessa genotypiska mönster tillskriver de arytmiska händelserna till den oreglerade patologiska frisättningen av SR store Ca2 + 12.
Spontan Ca 2+-frisättning från SR kan detekteras som Ca 2+-gnistor eller Ca 2+-vågor, vilket aktiverar Na+/Ca 2+-växlaren (NCX). Växlaren av en Ca2+ för tre Na+ genererar en inåtgående ström, vilket påskyndar den diastoliska depolarisationen och driver membranspänningen till tröskeln för aktionspotential (AP). I RyR2 knock-in-möss leder den ökade aktiviteten av RyR2R4496C i sinusknutan (SAN) till en oväntad minskning av SAN-automaticiteten genom Ca 2+-beroende minskning av ICa,L och SR Ca2+ utarmning under diastole, vilket identifierar subcellulära patofysiologiska förändringar som bidrar till SAN-dysfunktionen hos CPVT-patienter13,14. Förekomst av de besläktade kardiomyocytcytosoliska Ca 2+-vågorna är mer sannolik efter ökningar av cytosoliska bakgrundsvågor [Ca2+] efter RyR-sensibilisering med katekolamin, inklusive isoproterenol (ISO), provokation.
Detaljerade kinetiska förändringar i Ca 2+-signalering efter RyR2-medierad Ca2+-frisättning som svar på aktivering av aktionspotential (AP) som kan vara orsaken till de observerade ventrikulära arytmierna i intakta hjärt-CPVT-modeller återstår att bestämma för hela skalan av rapporterade RyR2-genotyper12. Denna artikel presenterar instrumenteringsuppställningen och den experimentella proceduren för kartläggning av Ca2+-signaler och transmembranpotentialer (Vm) i murina vildtyps- (WT) och heterozygota RyR2-R2474S/+-hjärtan, kombinerat med programmerad elektrisk stimulering före och efter isoproterenolackprovokation. Detta protokoll tillhandahåller en metod för mekanistisk studie av CPVT-sjukdom i isolerade mushjärtan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hanmöss av 10 till 14 veckor gamla vildtypsmöss eller RyR2-R2474S/+-möss (C57BL/6 bakgrund) som väger 20-25 g används för försöken. Alla procedurer har godkänts av djurvårds- och användningskommittén vid Southwest Medical University, Sichuan, Kina (godkännande NO:20160930) i enlighet med de nationella riktlinjer som institutionen arbetar under.
1. Förberedelse
- Lagerlösningar
- Stamlösning för blebbistatin: Tillsätt 1 ml 100 % dimetylsulfoxid (DMSO) i originalkolven innehållande 2,924 mg (-) blebbistatinpulver till en koncentration av 10 mM.
- Spänningsindikator RH237 stamlösning: Tillsätt 1 ml 100 % DMSO i originalkolven med 1 mg RH237-pulver för att uppnå en koncentration på 2,01 mM.
- Kalciumindikator Rhod-2 AM stamlösning: Tillsätt 1 ml 100 % DMSO till 1 mg Rhod-2 AM-pulver för att nå en koncentration på 0,89 mM.
- Pluronic F127 stamlösning: Tillsätt 1 ml 100 % DMSO till 200 mg Pluronic F127 för att uppnå en koncentration på 20 % w/v (0,66 mM).
- Fördela stamlösningarna i 200 μL PCR-rör i 21-51 μL (21 μL RH237, 31 μL Rhod-2 AM och 51 μL blebbistatin) för enkel eller dubbel användning för att undvika upprepad frysning och upptining. Slå sedan in lösningarna med aluminiumfolie och förvara vid -20 °C, med undantag för Pluronic F127-stamlösningen som placeras i ett mörkt rum vid rumstemperatur.
- Perfusionslösning
- Krebs-lösning (i mM): Bered 1 l Krebs-lösning (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1,0, KCl4,7, MgCl 2 1,05, CaCl 21,35 och glukos 10).
- Filtrera lösningen med ett 0,22 μm aseptiskt nålfilter och syresätt med 95 % O 2/5 % CO2 %.
- Ta 40 ml Krebs-lösning i ett 50 ml centrifugalrör och förvara det vid 4 °C för uppföljande hjärtisolering.
- Langendorffs perfusionssystem och optiska kartläggningsanordning
- Ställ in Langendorffs perfusionssystem.
- Sätt på vattenbadet och ställ in temperaturen på 37 °C.
- Tvätta Langendorffs perfusionssystem med 1 liter avjoniserat vatten.
- Perfrun lösningen från insugningskanalen och justera utflödeshastigheten till 3.5-4 ml/min. Syresätt sedan perfusatet med O 2/CO2 (95 %/5 %) gas vid 37 °C.
OBS: En bubbla är aldrig tillåten i perfusionssystemet.
- Förbered det optiska mappningssystemet.
- Installera EMCCD-kameran (Charge-Coupled Device) med elektronmultiplicerande enhet (512 × 512 pixlar), objektivet (40x förstoringen), lysdioderna (LED) för våglängdsdelaren, EKG-monitorn och stimuleringselektroden (bild 1).
- Justera rätt arbetsavstånd från linsen till hjärtpositionen.
- Ställ in två lysdioder i det diagonala läget på termostatbadet för jämn belysning, vilket ger en våglängd på 530 nm för att generera excitationsljus. Använd ett ET525/50 sputterbelagt filter för att ta bort eventuellt out-of-band-ljus för lysdioderna.
- Justera handtagsomkopplaren för att uppnå en lika stor kvadrat på målytan, så att voltage och kalciumbilder visas tillräckligt på det förvärvande gränssnittet.
- Vrid objektivets bländare till maximal diameter för att undvika läckage av voltage eller kalciumsignaler.
- Justera kameralinsen i rätt höjd, eftersom den tjänar ett fint arbetsavstånd till termostatbadet, används oftast 10 cm.
- Slå på kameran för stabil sampling temperatur vid -50 °C.
- Ställ in Langendorffs perfusionssystem.
2. Förfaranden
- Skörd, kanylering och perfusion av mushjärta
- Injicera djuren intraperitonealt med avertinlösning (1,2 %, 0,5-0,8 ml) och heparin (200 enheter) för att minimera lidande och smärtreflex och förhindra blodproppsbildning. Efter 15 minuter offrar du djuren genom cervikal luxation.
- Öppna bröstkorgen med en sax, skörda hjärtat försiktigt och lägg det i den kalla Krebs-lösningen (4 °C, 95 % O 2, 5 % CO2) för att sakta ner ämnesomsättningen och skydda hjärtat.
- Ta bort den omgivande vävnaden i aortan, kanylera aortan med en skräddarsydd kanylnål (ytterdiameter: 0,8 mm, innerdiameter: 0,6 mm, längd: 27 mm) och fixera den med en 4-0 silkessutur.
- Genomborra hjärtat med Langendorff-systemet med en konstant hastighet på 3,5-4,0 ml/min och håll temperaturen på 37 ± 1 °C.
OBS: Alla efterföljande procedurer utförs i detta tillstånd. - Sätt in ett litet plaströr (0,7 mm i diameter, 20 mm långt) i vänster kammare för att frigöra överbelastning av lösningen i kammaren för att undvika överbelastning.
- Frånkoppling av excitationskontraktion och dubbelfärgsbelastning
- Sätt två ledningar i perfusatet i badet, slå på strömmen till EKG-förstärkarboxen och den elektriska stimuleringskontrollen och starta sedan den refererade EKG-programvaran och övervaka EKG kontinuerligt.
- Utför de efterföljande stegen i mörkret när hjärtat når ett stabilt tillstånd (hjärtat slår rytmiskt med ~400 slag per minut).
- Blanda 50 μl 10 mM stamlösning av blebbistatin med 50 ml Krebs-lösning för att uppnå en koncentration på 10 μM. Perfusionera ständigt blebbistatin-Krebs-lösningsblandningen i hjärtat i 10 minuter för att koppla bort sammandragning från excitation och undvika sammandragningsartefakter under filmning.
- Använd en röd ficklampa för att kontrollera om hjärtats sammandragning upphör helt eftersom sammandragningen kommer att påverka färgladdningskvaliteten.
- Efter frikoppling av excitation-kontraktion, blanda 15 μl stamlösning Rhod-2 AM med 15 μl stamlösning av Pluronic F127 i 50 ml Krebs-lösning för att uppnå de slutliga koncentrationerna 0,267 μM Rhod-2 AM och 0,198 μM Pluronic F127. Perfundera sedan hjärtat kontinuerligt med Rhod-2 AM arbetslösning i 15 minuter i Langendorffs perfusionssystem.
- Behåll syretillförseln under intracellulär laddning av kalciumfärgämne. Eftersom bubblor lätt bildas i Pluronic F127, sätt in en bubbelfälla i perfusionssystemet för att undvika gasembolisering av kranskärlen.
- Späd 10 μL RH237 stamlösning i 50 ml perfusat för att nå den slutliga koncentrationen vid 0,402 μM och utför laddning i 10 minuter.
- I slutet av dubbelfärgsladdningen, ta en sekvens av foton för att säkerställa att både spännings- och kalciumsignalerna är tillräckliga för analys (ingen interaktion mellan två signaler).
- Optisk kartläggning och arytmiinduktion
OBS: Optisk kartläggning startar efter att kontraktionen upphört och en lämplig färgladdning, och hjärtat perfunderas i följd som i stegen som beskrivs ovan i 2.1 (4).- Slå på de två lysdioderna för excitationsljus och justera deras intensitet till rätt intervall (tillräckligt stark för belysning och relativt enkel filmning men inte för robust för överexponering).
- Placera hjärtat under detektionsanordningen, se till att det är under tillräcklig belysning av två lysdioder och justera ljuspunktens diameter till 2 cm.
- Ställ in arbetsavståndet från linsen till hjärtat till 10 cm, vilket ger en samplingsfrekvens på nästan 500 Hz och en rumslig upplösning på 120 x 120 μm per pixel.
- Öppna signalsamplingsprogrammet för att styra kameran digitalt för att fånga voltage och kalciumsignaler samtidigt.
- Starta myopacer-fältstimulatorn och ställ in stimuleringsmönstret på Transistor Transistor Logic (TTL), 2 ms stimuleringstid för varje puls och 0,3 V som en initial intensitet.
- Använd 30 på varandra följande 10 Hz S1-stimuli för att testa hjärtats diastoliska spänningströskel som drivs av EKG-registreringsprogrammet. Öka gradvis voltage amplitud tills 1:1-upptagning realiseras (kontrollera QRS-våg från EKG-monitorn, aktionspotential (AP) och kalciumtransienter (CaT) signaler).
- Efter att ha bestämt spänningströskeln, tempo hjärtat med en intensitet på 2x den diastoliska spänningströskeln med ett par platinaelektroder fästa vid epikardiell av vänster kammare (LV) apex (ELVA).
- Implementera S1S1-protokollet för att mäta kalcium- eller aktionspotentialalternaner och restitutionsegenskaper. Styr hjärtats konjunkturtakt med en grundcykellängd på 100 ms, med en minskning av cykellängden med 10 ms för varje följande sekvens tills 50 ms uppnås. Varje episod innehåller 30 på varandra följande stimuli med en pulsbredd på 2 ms. Starta samtidigt optisk kartläggning före stimulering (samplingstiden inkluderar ~10 sinusrytmer och stimuleringstid).
- För att mäta den ventrikulära effektiva refraktära perioden (ERP) med hjälp av S1S2-stimulusprotokollet, börja med en S1S1-stimuleringscykellängd på 100 ms med en S2 kopplad vid 60 ms med en stegminskning på 2 ms tills S2 misslyckas med att fånga ektopiskt QRS-komplex.
- För arytmiinduktion, utför evig 50 Hz burst pacing (50 kontinuerliga elektriska stimuleringar med en pulsbredd på 2 ms) och utför samma stimuleringsepisod efter ett vilointervall på 2 s.
- Observera EKG-registreringar noggrant under den kontinuerliga högfrekventa stimuleringsperioden så att de samtidiga optiska kartläggningsinspelningarna kan starta omedelbart när en intressant arytmisk EKG-våg genereras (eftersom de flesta hjärtarytmier induceras av elektrisk stimulering, samplas de optiska signalerna 2-3 s före burst-stimulering i händelse av förlust av viktiga hjärthändelser).
- Bild med EMCCD-kamera (samplingsfrekvens: 500 Hz, pixelstorlek: 64 x 64).
- Analys av data
- Bildinläsning och signalbehandling
- Tryck på Välj mapp och ladda bilder för att ladda bilderna i bildinsamlingsprogrammet för halvautomatisk massiv videodataanalys enligt inställningarna och protokollet som beskrivits tidigare15,16.
- Ange rätt samplingsparametrar (t.ex. pixelstorlek och bildrutehastighet).
- Ställ in bildtröskeln genom manuell inmatning och välj intresseområde (ROI).
- Implementera ett gaussiskt rumsligt filter på 3 x 3 bildpunkter, ett Savitzky-Goaly-filter och en baslinjekorrigering med hög hatt.
- Tryck på Processbilder för att ta bort baslinjen och beräkna de elektrofysiologiska parametrarna, såsom APD80 och CaTD50.
- Analys av elektrofysiologiska parametrar
- Ställ in initieringstiden för APD vid toppen och slutpunkten vid 80 % repolarisering (APD80) för beräkning av APD80. På samma sätt definieras CaTD-starttiden som toppen, och slutpunkten definieras som 80 % relaxation.
- Mätning av ledningshastighet (CV) beror på pixelstorleken och den potentiella ledningstiden mellan två pixlar eller mer. Beräkna medelhastigheten från alla valda pixlar - detta är den genomsnittliga ledningshastigheten för det valda området. Generera motsvarande isokronala kartor samtidigt för en tydlig bild av ledningsriktningen.
OBS: O'Shea et al.15 rapporterade CV-mätningen i detalj. - För alternaner och arytmianalys definieras kalciumalternaner som en kontinuerlig stor och liten toppamplitud som uppträder omväxlande. Använd toppamplitudförhållandet för att bedöma svårighetsgraden av frekvensberoende alternaner (1-A2/A1). Tillämpa faskartor för att analysera komplexa arytmier som ventrikulär takykardi (VT). Leta efter rotorerna som visas tydligt i ett visst område när rotorerna skiftar.
- Bildinläsning och signalbehandling
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optisk kartläggning har varit en populär metod för att studera komplexa hjärtarytmier under det senaste decenniet. Den optiska kartläggningen består av en EMCCD-kamera, som ger en samplingsfrekvens på upp till 1 000 Hz och en rumslig upplösning på 74 x 74 μm för varje pixel. Det möjliggör ett ganska högt signalbrusförhållande under signalsampling (figur 1). När det Langendorff-perfunderade hjärtat når ett stabilt tillstånd och färgladdningen avslutas, placeras hjärtat i den homeoterma kammaren under belysning av två 530 nm lysdioder, som används för excitation av spänningsindikatorn RH237 och Ca2+-indikatorn Rhod-2 AM. Emissionsljuset delas upp i två våglängder på 600 nm (för Ca2+) och 670 nm (för Vm), som detekteras samtidigt med hjälp av EMCCD-kameran. Efter perfusion av avertin och heparin i 15 minuter, använd de kirurgiska instrumenten (Figur 2A) för att öppna bröstkorgen och snabbt extrahera hjärtat, överför den sedan till den kalla Krebs-lösningen (4 °C, 95 % O 2, 5 % CO2) (Figur 2B). Rengör de omgivande vävnaderna noggrant, fixera aortan med en 4-0-sutur och en 0,7 mm plastslang förs in i vänster kammare (Figur 2C) för att frigöra trängseln i perfusatet i vänster kammare. Sätt in EKG-kablarna i perfusatet (Figur 2D) och se till att hjärtat slår rytmiskt enligt EKG-övervakning som drivs av EKG-registreringsprogrammet. Utför sedan dubbelfärgning i mörkret (Figur 2E).
Efter att kontraktionsartefakter har minimerats med blebbistatin (10 μM) och en adekvat färgladdning har slutförts, påbörjades inspelningen i cirka 10 sinusslag före S1S1-stimuleringsprotokollet för att utvärdera frekvensberoende elektrofysiologiska parameterrestitutionsegenskaper och kalciumalternaner efter isoproterenol (1 μM ISO) utmaning (Figur 3A). Figur 3B visar en representativ EKG-vågfront för VT och motsvarande aktionspotential (AP) och CaT-spår inducerade av en 50 Hz burst-stimuleringssekvens i en CPVT-mus. Programvara för optisk signalavbildning används för att slutföra en halvautomatisk analys av massiva videodata.
Figur 4A,B visar typiska spår och värmekartor för APD80 respektive CaTD80. ISO förkortar APD80 hos WT- och CPVT-möss, men ingen skillnad hittades mellan WT- och CPVT-möss före och efter ISO-provokationen (Figur 4C, **P < 0,01. n = 5/6). Figur 4D visar att CaTD80 i CPVT-möss är längre än i WT efter ISO-provokationen, medan det inte fanns någon signifikans före ISO-behandling (**P < 0,01. n = 6.).
För ledningsmätning visar figur 5A en enda vektoralgoritm för kvantifiering av CV. Enligt spänningssignalerna har WT- och CPVT-hjärtana samma ledningsförmåga över epikardiet vid baslinjen och efter ISO-intervention (figur 5B). Figur 5C,D visar de representativa aktiveringskartorna för spänning och kalcium i WT- och CPVT-hjärtan före och efter ISO-provokationen.
Kalciumalternaner är en kritisk parameter för arytmi. Alternaner för kalciumamplitud beräknas enligt den formulering som visas i figur 6A. Kalciumsignalerna i WT-hjärtan förblir stabila vid baslinjen under konsekutiv S1S1-stimulering vid 14,29 och 16,67 Hz (Figur 6B), medan CPVT-hjärtan uppvisar frekvensberoende alternaner (Figur 6C). Efter ISO-provokationen uppvisar CPVT-hjärtan frekvensberoende alternans i kalciumsignalen under S1S1-stimulering, medan WT-hjärtan inte påverkas (Figur 6D,E). Efter kontinuerlig stimulering av S1S1 utförs ett stimuleringsprotokoll för att inducera letala arytmier. WT- och CPVT-hjärtan uppvisar normal ledning under 50 Hz burst-stimulering vid baslinjen (Figur 7A). Efter perfusion med ISO uppvisar CPVT-hjärtan högfrekventa rotorer efter 50 Hz burst-stimulering, medan WT-hjärtan bibehåller normal ledning (Figur 7B).
Figur 1: Optisk kartläggningsapparatur. Systemet innehåller en specialdesignad EMCCD-kamera med hög rumslig och tidsmässig upplösning (samplingsfrekvens upp till 1 000 Hz, minimal samplingspixel 74 x 74 μm). En elektrisk stimuleringsregulator används för provtagning och utmatning av elektriskt stimuleringsprotokoll. Två gröna lysdioder används för excitationsljuset från fluorescenssonder. En långpassspegel (610 nm) och motsvarande sändare delar på spännings- och kalciumfluorescensemissionslamporna. RH237, det spänningskänsliga färgämnet, har ett emissionsljus vid en toppvåglängd på 670 nm, medan Rhod-2 AM, det kalciumkänsliga färgämnet, har ett emissionsljus vid en toppvåglängd på 600 nm. Mindre förändringar i båda fluorescenssignalerna kunde fångas av kameran samtidigt på grund av kamerasensorns höga samplingshastighet och känslighet. Förkortningar: EMCCD = elektronmultiplicerande laddningskopplad enhet; LED = lysdiod; EKG = EKG. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Förberedelse och dubbelfärgning . (A) De kirurgiska instrumenten. (B) Skörd av mushjärta. (C) Klipp försiktigt bort onödig vävnad för att få fri sikt över aortan och för in en 0,7 mm plastslang från aortan i vänster kammare. (D) Hjärtat flyttas snabbt till Langendorffs perfusionssystem. (E) Dubbelfärgämnesladdning och upphörande av excitation-kontraktion i mörker. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: S1S1-protokoll och arytmiinduktionsprotokoll. (A) Representativ EKG-vågfront och motsvarande AP- och kalciumsignalspår med användning av S1S1-stimuleringsprotokoll efter ISO-provokation. (B) VT-induktion genom en 50 Hz burst stimuleringssekvens efter perfusion av ISO i en CPVT-mus. Förkortningar: EKG = elektrokardiogram; AP = aktionspotential, ISO = isoproterenol, VT = ventrikulär takykardi; CPVT = katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: APD80- och CaTD80-analys vid 10 Hz före och efter ISO-provokation. A) Representativa AP-spår och APD80-värmekartor över WT- och CPVT-hjärtan före och efter ISO-behandling. (B) Typiska CaT-spår och CaTD80-värmekartor över WT- och CPVT-hjärtan före och efter ISO-utmaningen. (C) ISO förkortar APD80 hos WT- och CPVT-möss, men ingen skillnad finns mellan WT- och CPVT-möss före och efter ISO-provokationen. (D) CaTD80 i CPVT-möss är längre än i WT efter ISO-provokation, medan det inte fanns någon signifikans före ISO-behandling. (* P < 0,05, **P < 0,01. n =5/6.) Förkortningar: AP = aktionspotential; APD80 = topp vid 80 % repolarisering; ISO = isoproterenol, CPVT = katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi; WT = vildtyp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Analys av ledningshastighet vid 10 Hz. (A) Envektoralgoritmen för ledningshastighet. (B) Ingen skillnad i CV för AP hos WT- och CPVT-möss. C) Representativa värmekartor visar att CPVT-möss har samma ledningsförmåga som WT-möss före och efter ISO-provokationen enligt spänningssignaler. (D) Ingen signifikant skillnad har hittats i de två grupperna för aktionspotentialinducerade CaT80-isokroner före och efter ISO-provokationen. Förkortningar: AP = aktionspotential; ISO = isoproterenol, CPVT = katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi; WT = vildtyp; AT = aktiveringstid; CV = ledningshastighet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Analys av kalciumamplitudalternaner. (A) Algoritmen för beräkning av kalciumamplitudalternaner. (B) Kalciumsignalerna i WT-hjärtan förblir stabila vid baslinjen under konsekutiv S1S1-stimulering vid 14,29 och 16,67 Hz, medan (C) CPVT-hjärtan uppvisar frekvensberoende alternaner. (D) WT-hjärtan påverkas inte av ISO-provokationen, medan (E) efter ISO-provokationen uppvisar CPVT-hjärtan frekvensberoende alternans i kalciumsignalen under S1S1-stimuleringen. Förkortningar: ISO = isoproterenol; CPVT = katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi; WT = vildtyp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Analys av takyarytmi med hjälp av faskartor . (A) WT- och CPVT-hjärtan uppvisar normal ledning under 50 Hz burst-stimulering vid baslinjen. (B) Efter perfusion med ISO uppvisar CPVT-hjärtan högfrekventa rotorer efter 50 Hz burst-stimulering, medan WT-hjärtan bibehåller normal ledning. Förkortningar: ISO = isoproterenol; CPVT = katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi; WT = vildtyp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Baserat på vår erfarenhet inkluderar nycklarna till en framgångsrik optisk kartläggning av ett mushjärta med dubbla färgämnen en väl förberedd lösning och hjärta, färgladdning, att uppnå det bästa signal-brusförhållandet och att minska rörelseartefakten.
Beredning av lösning
Krebs lösning är avgörande för ett lyckat hjärtexperiment. MgCl 2 och CaCl 2 stamlösningar (1 mol/L) bereds i förväg med tanke på deras vattenabsorption och tillsätts Krebs-lösningen efter att alla andra komponenter har lösts i rent vatten eftersom Mg 2 + och Ca 2 + lätt kan fällas ut med CO32+. Krebs-lösningen bubblas med 95 % O 2/5 % CO2 i minst 30 minuter för att säkerställa syresättning. Eftersom mushjärtat är särskilt känsligt för pH bör lösningens pH vara runt 7,4 efter syresättning. Även om det finns små partiklar i lösningen kan de experimentella resultaten påverkas eftersom dessa partiklar kan blockera kapillärerna och påverka perfusionseffekten. Därför filtreras lösningen med ett 0,22 μm aseptiskt nålfilter före användning.
Förberedelse för hjärtat
Innan hjärtan skördas hepariniseras mössen först för att undvika att proppar bildas i kranskärlssystemet, vilket förhindrar att dålig färgperfusion orsakad av hjärtstockning påverkar den efterföljande avbildningen. Ju kortare hjärtats ischemiska tid är, desto bättre är hjärtats tillstånd. Därför kontrolleras den ischemiska tiden inom 2-3 minuter från det att hjärtat skördas till kanylering via aortan på Langendorff-systemet. Dessutom är det viktigt att perfusionstrycket upprätthålls väl. Därför förs ett tunt silikonrör (plast) in i vänster kammarekavitet för att undvika att trycket i vänster kammare blir för högt under ventrikulär sammandragning efter att vänster kammares utlopp har ligerats, vilket kan resultera i dålig myokardperfusion och syrefri vävnadsförsurning.
Laddning av färgämne
Dessa experiment utför färgladdning genom att perfusionera hjärtat i Langendorff-systemet. Det är viktigt att övervaka hjärtrytmen eftersom dålig färgbelastning kommer att uppstå när den onormala rytmen orsakas av kirurgiska ingrepp eller ischemi-reperfusionsskador. Hjärtat måste vara tillräckligt friskt för att utföra de efterföljande stegen. Rhod-2 AM, ett Ca2+-känsligt färgämne, är ett acetylmetylesterderivat av Rhod 2, som lätt laddas in i celler i sin AM-form. En 100-faldig ökning av molekylens fluorescensintensitet är resultatet av Ca2+ kelatering17. Pluronic F127 är inkorporerad i Rhod-2 AM-laddningslösningen för att förhindra att Rhod-2 AM polymeriseras i bufferten och hjälper den att komma in i cellerna. Pluronic F127 kan minska stabiliteten hos Rhod-2 AM, så det rekommenderas endast att tillsätta det när du förbereder arbetslösningen men inte i lagringslösningen för långtidsförvaring. Det spänningskänsliga färgämnet RH237 används i denna studie på grund av dess gynnsamma spektrala egenskaper för användning med Ca2+ -indikatorn Rhod-2 AM.
Uppnå det bästa signal-brusförhållandet
Att få bilder med höga signal-brusförhållanden är målet för bildbehandling, men brus är som ett skuggigt spöke som alltid orsakar problem. På grund av svaga signaler är lägre brus särskilt viktigt i vissa höghastighetsmikroskopiska avbildningsapplikationer, såsom optisk kartläggning. Signal-brusförhållandet (SNR) beräknas som kvadratamplitudförhållandet från rotmedelvärdet till kvadratbruset, där brusamplituden utvärderas vid vilopotentialen18. Vissa faktorer, såsom ljuskälla, optiska filter, fokuseringsoptik och fotodetektorer, är viktiga för att uppnå bästa SNR. I studien undersöks provets bakgrundsområde med avseende på brus, som ofta fluktuerar på en liten nivå. Den optiska signalen som detekteras av varje pixel är genomsnittet av utsänt ljus från dess yta. AP- och kalciumaktiviteter oscillerar under arytmi, och båda signalernas amplitud är relativt låg. Även mindre störningar kan leda till förvrängning av optiska signaler och resultera i misstag i dataanalysen. Därför bör tolkningen av optiska signaler vara försiktig när den lokala heterogeniteten orsakas av elektrisk funktion under arytmier som VT.
Minska rörelseartefakten
Jämfört med elektrodinspelning påverkas optiska signaler ofta av kontraktionsaktiviteten hos de Langendorff-perfunderade hjärtana på grund av rörelseartefakter. För att fånga exakta optiska signaler används främst farmakologiska hämmare av excitationskontraktion. För att minimera rörelseartefakten under avbildning används blebbistatin för att stoppa hjärtat från att slå. Det är en selektiv hämmare av ATPas-aktiviteten hos icke-muskelmyosin II och kopplar effektivt bort excitations- och kontraktionsprocessen i hjärtat 19,20,21. Även om vissa studier tyder på vissa biverkningar med föreningen22, använder vi den lägsta arbetskoncentrationen vid 10 μM för att minimera eventuella skador på hjärtat.
ElectroMap-programvara för analys av data från hjärtats optiska kartläggning
ElectroMap är en programvara med öppen källkod med hög genomströmning för analys av datamängder för optisk kartläggning av hjärtan. Den ger en analys av de viktigaste hjärtelektrofysiologiska parametrarna, inklusive AP- och CaT-morfologi, CV, diastoliskt intervall, dominant frekvens, tid till topp och relaxationskonstant (τ) 15,23. Programvaran tillåter flera filtreringsalternativ, inklusive Gaussian-filtret, Savitzky-Goaly-filtret och Top-hat baslinjekorrigering. Gaussiskt filter är en tvådimensionell utjämning genom att beräkna den viktade genomsnittliga utjämningen för varje kanal och intilliggande kanaler. Det används ofta för spikfelsljud. Savitzky-Goaly-filtret passar en lägre polynom och kontinuerlig delmängd av intilliggande datauppsättningar genom minsta kvadratmetoden, vilket uppfyller behovet av olika smidiga filtreringar och också är effektivt för bearbetning av icke-periodiska och icke-linjära datauppsättningar som härleds från brus. Top-hat baslinjekorrigering kan justera de optiska signalerna till samma höjd beroende på spårens toppar, och beräkna parametrar som aktionspotentialvaraktighet (APD) och kalciumtransientvaraktighet (CaTD) mycket mer exakt. Baslinjedrift uppstår ibland vid sampling av spännings- och kalciumfluorescenssignaler. Det är också användbart vid beräkning av kalciumalternaner och amplitud. Båda kamrarna valdes ut för elektrofysiologisk undersökning.
För- och nackdelar med dual-dye mapping och metoder för att begränsa störningar
Under de senaste åren har man insett att det är viktigt att klargöra celldepolarisering eller repolarisering och intercellulär ledningsheterogenitet i hela hjärtat, samt koppling av membranklockan och kalciumklockan, vilket är avgörande för att förstå mekanismen för sjukdomar som arytmi24,25. Optisk kartläggning har en hög spatiotemporal upplösning för att bestämma de ventrikulära aktiverings- och repolarisationsegenskaperna hos hjärtat hos transgena möss26,27,28,29. Den kan också detektera avbildning med flera parametrar, till exempel mätning av membranpotential och intracellulärt kalcium i samma hjärta24,30 eller vävnad31,32 laddad med spännings- och kalciumkänsligt färgämne. Dubbelfärgsavbildning är fördelaktig för att studera förhållandet mellan aktionspotential och kalcium, såsom förhållandet mellan membranklockan (M) och Ca2+ (C)-klockan eller spontan kalciumfrisättning och fördröjd efter depolarisering (DAD). Normal hjärtexcitation kräver då att de cykliska händelserna i de två klockorna justeras. Störningar i denna anpassning leder till arytmi25. Sambandet mellan spontan kalciumfrisättning och DAD är den mekanism som utlöser aktiviteter vid hjärtsvikt 33. Kombinationen av färgämnen bör dock väljas noggrant. Kombinationen av RH-237/Rhod-2 eller di-4-ANEPPS/Indo-1 möjliggör samtidig inspelning, medan Fluo-3/4/di-4-ANEPPS leder till fel på grund av överlappande emissionsspektra för två färgämnen30,34,35. Detta experiment valde RH237 och Rhod-2 AM för att belasta hjärtat och fick god bildkvalitet.
Dessutom har kameran som används i detta protokoll två målytor, vilket gör det möjligt för den att fånga de delade signalerna på ett samplingsgränssnitt och gör det möjligt för en enda kamera att detektera två olika emissionsvåglängder. En sådan samtidig kartläggning av optisk AP och CaT genom att kombinera olika protokoll för fotoelektronspektroskopi (PES) kommer att göra det möjligt för oss att bestämma sambandet mellan onormal [Ca2+]i och elektrisk instabilitet under stressförhållanden och effekten av potentiering efter aktivering på dessa anomalier. Den rumsligt heterogena karaktären hos SR Ca2+-cykling och hur detta påverkar uppkomsten, svårighetsgraden och konkordansen av elektriska alternaner och arytmogent beteende, såsom rumsligt disharmoniska alternaner och därav följande VT, kommer att studeras i det intakta hjärtat i olika grupper. SR Ca 2+ alternans, RyR2 eldfasta och deras roll i SR Ca2+ och APD alternans kommer att undersökas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har några intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Denna studie stöds av National Natural Science Foundation of China (81700308 till XO och 31871181 till ML, och 82270334 till XT), Sichuan-provinsens vetenskaps- och teknikstödprogram (CN) (2021YJ0206 till XO, 23ZYZYTS0433 och 2022YFS0607 till XT och 2022NSFSC1602 till TC) och State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 till XO), MRC (G10031871181 till ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE i Oxford (ML) bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
References
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
- Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
- Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
- Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
- Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
- Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al.
- Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
- Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
- Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
- Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
- Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
- O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
- Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
- Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
- Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
- Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
- Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
- Mal Baudot,, et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
- Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
- Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
- Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
- Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
- He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
- Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).
