Summary
Este protocolo introduce el mapeo óptico de doble colorante de corazones de ratón obtenidos de animales de tipo salvaje y knock-in afectados por taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, incluyendo mediciones electrofisiológicas de voltaje transmembrana y transitorios intracelulares de Ca2+ con alta resolución temporal y espacial.
Abstract
El trastorno cardíaco proarrítmico taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT) se manifiesta como episodios de taquicardia ventricular polimórfica después de la actividad física, el estrés o la provocación con catecolaminas, que pueden deteriorarse hasta convertirse en una fibrilación ventricular potencialmente mortal. El corazón de ratón es una especie muy extendida para modelar enfermedades arrítmicas cardíacas hereditarias, incluida la CPVT. El mapeo óptico simultáneo del potencial transmembrana (Vm) y los transitorios de calcio (CaT) de corazones de ratón perfundidos por Langendorff tiene el potencial de dilucidar los mecanismos subyacentes a la arritmogénesis. En comparación con la investigación a nivel celular, la técnica de mapeo óptico puede probar algunos parámetros electrofisiológicos, como la determinación de la activación, la velocidad de conducción, la duración del potencial de acción y la duración de CaT. En este artículo se presenta la configuración de la instrumentación y el procedimiento experimental para el mapeo óptico de alto rendimiento de CaT y Vm en corazones murinos de tipo salvaje y heterocigotos RyR2-R2474S/+, combinados con estimulación eléctrica programada antes y durante el desafío con isoproterenol. Este enfoque ha demostrado ser un método factible y fiable para el estudio mecánico de la enfermedad por TVPC en una preparación cardíaca de ratón ex vivo.
Introduction
La taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVPC) se manifiesta como episodios de taquicardia ventricular polimórfica (TVP) después de la actividad física, el estrés o la provocación con catecolaminas, que pueden deteriorarse hasta convertirse en una fibrilación ventricular potencialmente mortal 1,2,3,4 . La evidencia reciente después de su primer informe como un síndrome clínico en 1995 implicó mutaciones en siete genes, todos involucrados en la liberación de Ca2+ del almacén reticular sarcoplásmico (SR) en esta condición: el receptor de rianodina 2 (RyR2) que codifica el receptor de rianodina 2 (RyR2) de los canales de liberación de Ca2+ 5,6, FKBP12.67, CASQ2 que codifica la calsequestinacardíaca 8, TRDN codificando la proteína SR de unión triadina 9, y CALM1 9, CALM2 10 y CALM3 codificando de manera idéntica la calmodulina11,12. Estos patrones genotípicos atribuyen los eventos arrítmicos a la liberación patológica no regulada del almacén de SR Ca2+12.
La liberación espontánea de Ca 2+ de SR se puede detectar como chispas de Ca 2+ u ondas de Ca 2+, lo que activa el intercambiador de Na+/Ca 2+ (NCX). El intercambiador de un Ca2+ por tres Na+ genera una corriente hacia adentro, que acelera la despolarización diastólica y conduce el voltaje de la membrana al umbral del potencial de acción (AP). En ratones knock-in de RyR2, el aumento de la actividad de RyR2R4496C en el nódulo sinoauricular (SAN) conduce a una disminución imprevista de la automaticidad de la SAN por la disminución dependiente de Ca 2+ de la depleción de ICa,L y SR Ca2+ durante la diástole, identificando alteraciones fisiopatológicas subcelulares que contribuyen a la disfunción de la SAN en pacientes con CPVT13,14. La aparición de las ondas Ca 2+ citosólicas cardiomiocíticas relacionadas es más probable después de los aumentos en el citosólico de fondo [Ca2+] después de la sensibilización a RyR por catecolamina, incluido el isoproterenol (ISO).
Quedan por determinar los cambios cinéticos detallados en la señalización de Ca 2+ después de la liberación de Ca2+ mediada por RyR2 en respuesta a la activación del potencial de acción (PA) que puede ser la causa de las arritmias ventriculares observadas en modelos de CPVT cardíaca intacta para toda la gama de genotipos de RyR2 notificados12. Este artículo presenta la configuración de la instrumentación y el procedimiento experimental para el mapeo de alto rendimiento de las señales de Ca2+ y los potenciales transmembrana (Vm) en corazones murinos de tipo salvaje (WT) y heterocigotos RyR2-R2474S/+, combinados con estimulación eléctrica programada antes y después del desafío con isoproterenol. Este protocolo proporciona un método para el estudio mecanicista de la enfermedad CPVT en corazones aislados de ratón.
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Protocol
Para los experimentos se utilizaron ratones machos de tipo salvaje de 10 a 14 semanas de edad o ratones RyR2-R2474S/+ (fondo C57BL/6) con un peso de 20-25 g. Todos los procedimientos han sido aprobados por el comité de cuidado y uso de animales de la Universidad Médica del Sudoeste, Sichuan, China (aprobación NO:20160930) de conformidad con las directrices nacionales bajo las que opera la institución.
1. Preparación
- Soluciones de stock
- Solución madre de blebistatina: Añadir 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) al 100% en el matraz original que contiene 2,924 mg de (-) blebbistatina en polvo hasta alcanzar una concentración de 10 mM.
- Indicador de voltaje RH237 solución madre: Añadir 1 mL de DMSO al 100% en el matraz original con 1 mg de polvo RH237 para lograr una concentración de 2,01 mM.
- Solución madre indicadora de calcio Rhod-2 AM: Agregue 1 mL de DMSO al 100% en 1 mg de polvo Rhod-2 AM para alcanzar una concentración de 0.89 mM.
- Solución madre de Pluronic F127: Añadir 1 ml de DMSO al 100 % en 200 mg de Pluronic F127 para alcanzar una concentración del 20 % p/v (0,66 mM).
- Aliquotar las soluciones madre en tubos de PCR de 200 μL en 21-51 μL (21 μL de RH237, 31 μL de Rhod-2 AM y 51 μL de blebbistatina) para uso único o doble para evitar la congelación y descongelación repetidas. A continuación, envuelva las soluciones con papel de aluminio y guárdelas a -20 °C, excepto la solución madre Pluronic F127 colocada en una habitación oscura a temperatura ambiente.
- Solución de perfusión
- Solución de Krebs (en mM): Prepare 1 L de solución de Krebs (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1.0, KCl4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35 y glucosa 10).
- Filtrar la solución con un filtro de aguja aséptico de 0,22 μm y oxigenar con 95% Ø 2/5% CO2.
- Tome 40 ml de solución de Krebs en un tubo centrífugo de 50 ml y guárdelo a 4 °C para el aislamiento cardíaco de seguimiento.
- El sistema de perfusión y el dispositivo de mapeo óptico de Langendorff
- Configure el sistema de perfusión de Langendorff.
- Abra el baño de agua y ajuste la temperatura a 37 °C.
- Lavar el sistema de perfusión Langendorff con 1 L de agua desionizada.
- Perfundir la solución del tracto de admisión y ajustar la velocidad de salida a 3,5-4 ml/min. A continuación, oxigenar la perfusión con gas O 2/CO2 (95%/5%) a 37 °C.
NOTA: Nunca se permite una burbuja en el sistema de perfusión.
- Prepare el sistema de mapeo óptico.
- Instale la cámara del dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones (EMCCD), la cámara (512 × 512 píxeles), la lente (aumento de 40x), los diodos emisores de luz (LED) divisores de longitud de onda, el monitor de electrocardiograma (ECG) y el electrodo de estimulación (Figura 1).
- Ajuste la distancia de trabajo adecuada desde la lente hasta la posición del corazón.
- Coloque dos LED en la posición diagonal del baño termostático para una iluminación uniforme, proporcionando una longitud de onda de 530 nm para generar luz de excitación. Utilice un filtro con recubrimiento catódico ET525/50 para eliminar cualquier luz fuera de banda de los LED.
- Ajuste el interruptor de la manija para lograr un cuadrado igual de la superficie objetivo, haciendo que las imágenes de voltaje y calcio aparezcan adecuadamente en la interfaz de adquisición.
- Gire la apertura de la lente al diámetro máximo para evitar cualquier fuga de señales de voltaje o calcio.
- Ajuste la lente de la cámara a una altura adecuada, ya que sirve una distancia de trabajo fina al baño termostático, se usa principalmente 10 cm.
- Encienda la cámara para obtener una temperatura de muestreo estable a -50 °C.
- Configure el sistema de perfusión de Langendorff.
2. Procedimientos
- Extracción de corazón de ratón, canulación y perfusión
- Inyectar intraperitonealmente a los animales con solución de avertina (1,2%, 0,5-0,8 mL) y heparina (200 unidades) para minimizar el sufrimiento y el reflejo del dolor y prevenir la formación de coágulos sanguíneos. Después de 15 minutos, sacrifique a los animales por luxación cervical.
- Abra el cofre con unas tijeras, extraiga el corazón con cuidado y colóquelo en la solución fría de Krebs (4 °C, 95%Ø2, 5% CO2) para ralentizar el metabolismo y proteger el corazón.
- Extraer el tejido circundante de la aorta, canular la aorta con una aguja de canulación hecha a medida (diámetro exterior: 0,8 mm, diámetro interior: 0,6 mm, longitud: 27 mm) y fijarla con una sutura de seda 4-0.
- Perfundir el corazón con el sistema Langendorff a una velocidad constante de 3,5-4,0 mL/min y mantener la temperatura a 37 ± 1 °C.
NOTA: Todos los procedimientos posteriores se realizan en esta condición. - Inserte un pequeño tubo de plástico (0,7 mm de diámetro, 20 mm de longitud) en el ventrículo izquierdo para liberar la congestión de la solución en la cámara y evitar la sobrecarga.
- Desacoplador de excitación-contracción y carga de doble colorante
- Coloque dos cables en la perfusión en el baño, encienda las potencias de la caja del amplificador de ECG y el controlador de estimulación eléctrica, y luego inicie el software de ECG de referencia y monitoree el ECG continuamente.
- Realice los pasos siguientes en la oscuridad cuando el corazón alcance una condición de estado estable (el corazón late rítmicamente a ~ 400 lpm).
- Mezcle 50 μL de solución madre de blebbistatina de 10 mM con 50 mL de solución de Krebs para alcanzar una concentración de 10 μM. Perfunda constantemente la mezcla de solución de blebbistatina-Krebs en el corazón durante 10 minutos para desacoplar la contracción de la excitación y evitar artefactos de contracción durante la filmación.
- Use una linterna roja para verificar si la contracción del corazón se detiene por completo, ya que la contracción influirá en la calidad de la carga de tinte.
- Después de desacoplar la excitación-contracción, mezcle 15 μL de solución madre Rhod-2 AM con 15 μL de solución madre Pluronic F127 en 50 ml de solución Krebs para lograr las concentraciones finales de 0,267 μM Rhod-2 AM y 0,198 μM Pluronic F127. A continuación, perfundir el corazón de forma continua con la solución de trabajo Rhod-2 AM durante 15 minutos en el sistema de perfusión de Langendorff.
- Mantenga el suministro de oxígeno durante la carga del colorante de calcio intracelular. Dado que las burbujas se forman fácilmente en Pluronic F127, inserte una trampa de burbujas en el sistema de perfusión para evitar la embolización gaseosa de las coronarias.
- Diluir 10 μL de solución madre RH237 en 50 mL de perfusión para alcanzar la concentración final a 0,402 μM y realizar la carga durante 10 minutos.
- Al final de la carga de doble colorante, tome una secuencia de fotos para asegurarse de que tanto las señales de voltaje como las de calcio sean adecuadas para el análisis (sin interacción entre dos señales).
- Mapeo óptico e inducción de arritmias
NOTA: El mapeo óptico comienza después del cese de la contracción y una carga de tinte adecuada, y el corazón se perfunde consecutivamente como en los pasos descritos anteriormente en 2.1 (4).- Encienda los dos LED para las luces de excitación y ajuste su intensidad en un rango adecuado (lo suficientemente fuerte para la iluminación y una filmación relativamente sencilla, pero no demasiado robusto para la sobreexposición).
- Coloque el corazón debajo del dispositivo de detección, asegúrese de que esté bajo la iluminación adecuada de dos LED y ajuste el diámetro del punto de luz a 2 cm.
- Ajuste la distancia de trabajo desde la lente hasta el corazón en 10 cm, lo que proporciona una frecuencia de muestreo de casi 500 Hz y una resolución espacial de 120 x 120 μm por píxel.
- Abra el software de muestreo de señal para controlar la cámara digitalmente y capturar señales de voltaje y calcio simultáneamente.
- Inicie el estimulador de campo miopacer y establezca el patrón de estimulación en Lógica de transistor de transistores (TTL), 2 ms de duración de estimulación para cada pulso y 0,3 V como intensidad inicial.
- Utilice 30 estímulos consecutivos de 10 Hz S1 para probar el umbral de tensión diastólica del corazón impulsado por el software de registro de ECG. Aumente gradualmente la amplitud del voltaje hasta que se realice la captura 1:1 (verifique la onda QRS del monitor de ECG, el potencial de acción (AP) y las señales transitorias de calcio (CaT).
- Después de determinar el umbral de voltaje, marque el ritmo del corazón a una intensidad de 2 veces el umbral de voltaje diastólico con un par de electrodos de platino conectados al epicardio del ápice del ventrículo izquierdo (VI).
- Implementar el protocolo S1S1 para medir el calcio o el potencial de acción de las alternativas y las propiedades de restitución. Mantenga el ritmo del corazón consecutivamente a una duración de ciclo básico de 100 ms, disminuyendo 10 ms de la duración del ciclo cada secuencia siguiente hasta alcanzar los 50 ms. Cada episodio incluye 30 estímulos consecutivos con un ancho de pulso de 2 ms. Al mismo tiempo, inicie el mapeo óptico antes de la estimulación (el tiempo de muestreo incluye ~ 10 ritmos sinusales y la duración de la estimulación).
- Para medir el período refractario efectivo (ERP) ventricular mediante el protocolo de estímulo S1S2, comience con una duración del ciclo de estimulación S1S1 de 100 ms con un S2 acoplado a 60 ms con una disminución de paso de 2 ms hasta que S2 no pueda capturar el complejo QRS ectópico.
- Para la inducción de arritmias, realice estimulación continua perpetua de 50 Hz (50 estimulaciones eléctricas continuas con un ancho de pulso de 2 ms) y realice el mismo episodio de estimulación después de un intervalo de reposo de 2 s.
- Observe cuidadosamente los registros de ECG durante el período continuo de estimulación de alta frecuencia para que los registros de mapeo óptico simultáneos puedan comenzar rápidamente cuando se genere una onda de ECG arrítmica interesante (dado que la mayoría de las arritmias cardíacas son inducidas por estimulación eléctrica, las señales ópticas se muestrean 2-3 s antes de la estimulación de ráfaga en caso de pérdida de eventos cardíacos importantes).
- Imagen con cámara EMCCD (frecuencia de muestreo: 500 Hz, tamaño de píxel: 64 x 64).
- Análisis de datos
- Carga de imágenes y procesamiento de señales
- Presione Seleccionar carpeta y cargar imágenes para cargar las imágenes en el software de adquisición de imágenes para el análisis de datos de video masivo semiautomático de acuerdo con la configuración y el protocolo descritos anteriormente15,16.
- Introduzca los parámetros de muestreo correctos (como el tamaño de píxel y la velocidad de fotogramas).
- Establezca el umbral de la imagen mediante la entrada manual y seleccione la región de interés (ROI).
- Implemente un filtro espacial gaussiano de 3 x 3 píxeles, un filtro Savitzky-Goaly y una corrección de línea de base de sombrero de copa.
- Pulse Imágenes de proceso para eliminar la línea de base y calcular los parámetros electrofisiológicos, como APD80 y CaTD50.
- Análisis de parámetros electrofisiológicos
- Establezca el tiempo de inicio de APD en el pico y el punto terminal en 80% de repolarización (APD80) para el cálculo de APD80. Del mismo modo, la hora de inicio de CaTD se define como el pico, y el punto terminal se define como la relajación del 80%.
- La medición de la velocidad de conducción (CV) depende del tamaño del píxel y del tiempo de conducción del potencial de acción entre dos píxeles o más. Calcule la velocidad promedio de todos los píxeles elegidos: esta es la velocidad media de conducción de la región seleccionada. Genere simultáneamente los mapas isócronos correspondientes para obtener una visión clara de la dirección de conducción.
NOTA: O'Shea et al.15 reportaron la medición CV en detalle. - Para el análisis de alternancias y arritmias, las alternancias de calcio se definen como una amplitud de pico grande y pequeña continua que aparece alternativamente. Utilice la relación de amplitud de pico para evaluar la gravedad de las alternancias dependientes de la frecuencia (1-A2/A1). Aplicar mapas de fase para analizar arritmias complejas como la taquicardia ventricular (TV). Busque los rotores que aparecen claramente en una región específica a medida que los rotores se desplazan.
- Carga de imágenes y procesamiento de señales
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Representative Results
El mapeo óptico ha sido un enfoque popular en el estudio de arritmias cardíacas complejas en la última década. La configuración de mapeo óptico consiste en una cámara EMCCD, que proporciona una frecuencia de muestreo de hasta 1.000 Hz y una resolución espacial de 74 x 74 μm para cada píxel. Permite una relación señal-ruido bastante alta durante el muestreo de la señal (Figura 1). Una vez que el corazón perfundido por Langendorff alcanza un estado estable y finaliza la carga de colorante, el corazón se coloca en la cámara homoetérmica bajo la iluminación de dos LED de 530 nm, que se utilizan para la excitación del indicador de voltaje RH237 y el indicador Ca2+ Rhod-2 AM. La luz de emisión se divide en dos longitudes de onda de 600 nm (para Ca2+) y 670 nm (para Vm), que se detectan simultáneamente utilizando la cámara EMCCD. Después de la perfusión de avertina y heparina durante 15 minutos, utilizar los instrumentos quirúrgicos (Figura 2A) para abrir el tórax y extraer rápidamente el corazón, luego transferirlo a la solución fría de Krebs (4 °C, 95% Ø2, 5% CO2) (Figura 2B). Limpie cuidadosamente los tejidos circundantes, fije la aorta con una sutura 4-0 y se insertará un tubo de plástico de 0,7 mm en el ventrículo izquierdo (Figura 2C) para liberar la congestión de la perfusión en la cámara ventricular izquierda. Coloque los cables de ECG en el perfusado (Figura 2D) y asegúrese de que el corazón lata rítmicamente de acuerdo con la monitorización del ECG impulsada por el software de registro de ECG. Luego, realice la carga de tinte doble en la oscuridad (Figura 2E).
Después de que los artefactos de contracción han sido minimizados por la blebistatina (10 μM) y se ha completado una carga adecuada de colorante, la filmación comenzó durante aproximadamente 10 latidos sinusales antes del protocolo de estimulación S1S1 para evaluar las propiedades de restitución de parámetros electrofisiológicos dependientes de la frecuencia y las alternancias de calcio después del desafío con isoproterenol (1 μM ISO) (Figura 3A). La Figura 3B muestra un frente de onda de ECG representativo de VT y las trazas correspondientes de potencial de acción (AP) y CaT inducidas por una secuencia de estimulación de ráfaga de 50 Hz en un ratón CPVT. El software de imágenes de señales ópticas se utiliza para completar un análisis semiautomático de datos de vídeo masivos.
La Figura 4A, B muestra trazas típicas y mapas de calor de APD80 y CaTD80, respectivamente. ISO acorta APD80 en ratones WT y CPVT, pero no se encontraron diferencias entre los ratones WT y CPVT antes y después del desafío ISO (Figura 4C, **P < 0.01. n = 5/6). La Figura 4D indica que los CaTD80 en ratones CPVT son más largos que en WT después del desafío ISO, mientras que no hubo significación antes del tratamiento con ISO (**P < 0.01. n = 6.).
Para la medición de la conducción, la Figura 5A presenta un algoritmo de un solo vector para la cuantificación de CV. De acuerdo con las señales de voltaje, los corazones WT y CPVT poseen la misma capacidad de conducción a través del epicardio al inicio y después de la intervención ISO (Figura 5B). La Figura 5C, D muestra los mapas representativos de activación de voltaje y calcio en corazones WT y CPVT antes y después del desafío ISO.
El calcio alternante es un parámetro crítico para la arritmia. La amplitud alternante de calcio se calcula de acuerdo con la formulación como se muestra en la Figura 6A. Las señales de calcio en los corazones WT permanecen estables en la línea de base durante la estimulación consecutiva de S1S1 a 14,29 y 16,67 Hz (Figura 6B), mientras que los corazones CPVT muestran alternancias dependientes de la frecuencia (Figura 6C). Después del desafío ISO, los corazones CPVT exhiben alternancias dependientes de la frecuencia en la señal de calcio durante la estimulación S1S1, mientras que los corazones WT no se ven influenciados (Figura 6D, E). Después de la estimulación continua de S1S1, se realiza un protocolo de estimulación en ráfaga para inducir arritmias letales. Los corazones WT y CPVT exhiben una conducción normal durante la estimulación de ráfaga de 50 Hz al inicio del estudio (Figura 7A). Después de la perfusión con ISO, los corazones CPVT muestran rotores de alta frecuencia después de la estimulación de ráfaga de 50 Hz, mientras que los corazones WT mantienen la conducción normal (Figura 7B).
Figura 1: Aparato de mapeo óptico. El sistema incluye una cámara EMCCD diseñada a medida con una alta resolución espacio-temporal (frecuencia de muestreo de hasta 1.000 Hz, píxel de muestreo mínimo de 74 x 74 μm). Se utiliza un controlador de estimulación eléctrica para el protocolo de estimulación eléctrica de muestreo y salida. Se utilizan dos LED verdes para la luz de excitación de las sondas de fluorescencia. Un espejo dicroico de paso largo (610 nm) y los emisores correspondientes dividen las luces de emisión de voltaje y fluorescencia de calcio. RH237, el colorante sensible al voltaje, tiene una luz de emisión a una longitud de onda máxima de 670 nm, mientras que Rhod-2 AM, el colorante sensible al calcio, posee una luz de emisión a una longitud de onda máxima de 600 nm. La cámara podría capturar cambios menores en ambas señales de fluorescencia simultáneamente debido a la alta frecuencia de muestreo y sensibilidad del sensor de la cámara. Abreviaturas: EMCCD = dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones; LED = diodo emisor de luz; ECG = electrocardiograma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación y carga de doble colorante . (A) El instrumental quirúrgico. (B) Cosecha del corazón de ratón. (C) Corte el tejido innecesario con cuidado para una visión clara de la aorta e inserte un tubo de plástico de 0,7 mm desde la aorta hasta el ventrículo izquierdo. (D) El corazón se retira rápidamente al sistema de perfusión de Langendorff. (E) Carga de doble colorante y cese de excitación-contracción en la oscuridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Protocolo S1S1 y protocolo de inducción de arritmias. (A) Frente de onda de ECG representativo y trazas de señal de AP y calcio correspondientes utilizando el protocolo de estimulación S1S1 después del desafío ISO. (B) Inducción de VT mediante una secuencia de estimulación en ráfaga de 50 Hz después de la perfusión de ISO en un ratón CPVT. Abreviaturas: ECG = electrocardiograma; PA = potencial de acción; ISO = isoproterenol; TV = taquicardia ventricular; CPVT = taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de APD80 y CaTD80 a 10 Hz antes y después del desafío ISO. (A) Trazas AP representativas y mapas de calor APD80 de corazones WT y CPVT antes y después del tratamiento ISO. (B) Trazas típicas de CaT y mapas de calor de CaTD80 de corazones WT y CPVT antes y después del desafío ISO. (C) ISO acorta APD80 en ratones WT y CPVT, pero no se encuentra ninguna diferencia entre los ratones WT y CPVT antes y después del desafío ISO. (D) El CaTD80 en ratones CPVT es más largo que en WT después del desafío ISO, mientras que no hubo significación antes del tratamiento con ISO. (* P < 0,05, **P < 0,01. n = 5/6.) Abreviaturas: PA = potencial de acción; APD80 = pico con una repolarización del 80%; ISO = isoproterenol; CPVT = taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica; WT = tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de la velocidad de conducción a 10 Hz. (A) El algoritmo de vector único de la velocidad de conducción. (B) No hay diferencia en el CV de AP en ratones WT y CPVT. (C) Los mapas de calor representativos demuestran que los ratones CPVT tienen la misma capacidad de conducción que los ratones WT antes y después del desafío ISO de acuerdo con las señales de voltaje. (D) No se encuentra diferencia significativa en los dos grupos para las isócronas de CaT80 inducidas por potencial de acción antes y después del desafío ISO. Abreviaturas: PA = potencial de acción; ISO = isoproterenol; CPVT = taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica; WT = tipo salvaje; AT = tiempo de activación; CV = velocidad de conducción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Análisis de alternancias de amplitud de calcio. (A) El algoritmo de cálculo de las alternancias de amplitud de calcio. (B) Las señales de calcio en los corazones WT permanecen estables en la línea de base durante la estimulación consecutiva de S1S1 a 14,29 y 16,67 Hz, mientras que los corazones (C) CPVT muestran alternancias dependientes de la frecuencia. (D) Los corazones WT no se ven influenciados por el desafío ISO, mientras que (E) después del desafío ISO, los corazones CPVT exhiben alternancias dependientes de la frecuencia en la señal de calcio durante la estimulación S1S1. Abreviaturas: ISO = isoproterenol; CPVT = taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica; WT = tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Análisis de taquiarritmias mediante mapas de fase . (A) Los corazones WT y CPVT exhiben una conducción normal durante la estimulación de ráfaga de 50 Hz al inicio del estudio. (B) Después de la perfusión con ISO, los corazones CPVT muestran rotores de alta frecuencia después de la estimulación de ráfaga de 50 Hz, mientras que los corazones WT mantienen la conducción normal. Abreviaturas: ISO = isoproterenol; CPVT = taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica; WT = tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Basándonos en nuestra experiencia, las claves para un mapeo óptico de doble colorante exitoso de un corazón de ratón incluyen una solución y un corazón bien preparados, la carga de colorante, lograr la mejor relación señal-ruido y reducir el artefacto de movimiento.
Preparación de la solución
La solución de Krebs es esencial para el éxito de un experimento cardíaco. Las soluciones madre de MgCl 2 y CaCl2 (1 mol/L) se preparan de antemano teniendo en cuenta su absorción de agua y se añaden a la solución de Krebs después de que todos los demás componentes se disuelven en agua pura, ya que el Mg 2+ y el Ca 2+ pueden precipitar fácilmente con CO3 2+. La solución de Krebs se burbujea con 95% de O 2/5% de CO2 durante al menos 30 minutos para garantizar la oxigenación. Debido a que el corazón del ratón es particularmente sensible al pH, el pH de la solución debe ser de alrededor de 7,4 después de la oxigenación. Incluso si hay partículas diminutas en la solución, los resultados experimentales pueden verse afectados porque estas partículas pueden bloquear los capilares y afectar el efecto de perfusión. Por lo tanto, la solución se filtra con un filtro de aguja aséptico de 0,22 μm antes de su uso.
Preparación del corazón
Antes de que se extraigan los corazones, los ratones se heparinizan primero para evitar la formación de coágulos en el sistema de arterias coronarias, evitando que la mala perfusión del colorante causada por la congestión cardíaca afecte las imágenes posteriores. Cuanto más corto sea el tiempo isquémico del corazón, mejor será su estado. Por lo tanto, el tiempo isquémico se controla en 2-3 minutos desde que se extraen los corazones hasta la canulación a través de la aorta en el sistema de Langendorff. Además, también es esencial mantener bien la presión de perfusión. Por lo tanto, se inserta un tubo delgado de silicona (plástico) en la cavidad ventricular izquierda para evitar que la presión ventricular izquierda sea demasiado alta durante la contracción ventricular después de que se liga la salida del ventrículo izquierdo, lo que podría resultar en una mala perfusión miocárdica y acidificación del tejido anóxico.
Carga de tinte
Estos experimentos realizan la carga de tinte mediante la perfusión del corazón en el sistema de Langendorff. Es crucial controlar el ritmo cardíaco porque se producirá una carga deficiente de tinte cuando el ritmo anormal sea causado por operaciones quirúrgicas o daño por isquemia-reperfusión. El corazón debe estar lo suficientemente sano como para realizar los pasos siguientes. Rhod-2 AM, un colorante sensible al Ca2+, es un derivado del éster acetilmetílico del Rhod 2, que se carga fácilmente en las células en su forma AM. Un aumento de 100 veces en la intensidad de fluorescencia de la molécula resulta de la quelación de Ca2+ 17. Pluronic F127 se incorpora a la solución de carga de Rhod-2 AM para evitar que Rhod-2 AM se polimerice en el tampón y ayudar a que ingrese a las células. Pluronic F127 puede reducir la estabilidad de Rhod-2 AM, por lo que solo se recomienda agregarlo al preparar la solución de trabajo, pero no en la solución de almacenamiento para almacenamiento a largo plazo. El colorante sensible al voltaje RH237 se utiliza en este estudio debido a sus propiedades espectrales favorables para su uso con el indicador de Ca2+ Rhod-2 AM.
Lograr la mejor relación señal-ruido
La obtención de imágenes con una alta relación señal-ruido es el objetivo de las imágenes, pero el ruido es como un fantasma sombrío que siempre causa problemas. Debido a las señales débiles, la reducción del ruido es particularmente importante en algunas aplicaciones de imágenes microscópicas de alta velocidad, como el mapeo óptico. La relación señal/ruido (SNR) se calcula como la relación entre la amplitud cuadrada media y el ruido cuadrático medio, donde la amplitud del ruido se evalúa al potencial de reposo18. Algunos factores, como la fuente de luz, los filtros ópticos, la óptica de enfoque y los fotodetectores, son esenciales para lograr la mejor SNR. En el estudio, se examina la región de fondo de la muestra en busca de ruido, que a menudo fluctúa a un nivel pequeño. La señal óptica detectada por cada píxel es el promedio de la luz emitida desde su superficie. Las actividades de PA y calcio oscilan durante la arritmia, y la amplitud de ambas señales es relativamente baja. Incluso una interferencia menor puede provocar la distorsión de las señales ópticas y dar lugar a errores en el análisis de datos. Por lo tanto, la interpretación de las señales ópticas debe ser cuidadosa cuando la heterogeneidad local es causada por la función eléctrica durante arritmias como la TV.
Reducir el artefacto de movimiento
En comparación con el registro de electrodos, las señales ópticas a menudo están influenciadas por la actividad de contracción de los corazones perfundidos de Langendorff debido al artefacto de movimiento. Para capturar señales ópticas precisas, se utilizan principalmente inhibidores farmacológicos de excitación-contracción. Para minimizar el artefacto de movimiento durante la toma de imágenes, se adopta blebbistatina para detener el latido del corazón. Es un inhibidor selectivo de la actividad ATPasa de la miosina II no muscular y desacopla eficazmente el proceso de excitación-contracción del corazón 19,20,21. Aunque algunos estudios implican algunos efectos secundarios utilizando el compuesto22, utilizamos la concentración de trabajo más baja a 10 μM para minimizar el posible daño al corazón.
Software ElectroMap para el análisis de conjuntos de datos de mapeo óptico cardíaco
ElectroMap es un software de código abierto de alto rendimiento para el análisis de conjuntos de datos de mapeo óptico cardíaco. Proporciona un análisis de los principales parámetros de electrofisiología cardíaca, incluyendo la morfología de la PA y la Cad, CV, intervalo diastólico, frecuencia dominante, tiempo hasta el pico y constante de relajación (τ) 15,23. El software permite múltiples opciones de filtrado, incluido el filtro gaussiano, el filtro Savitzky-Goaly y la corrección de la línea de base de sombrero de copa. El filtro gaussiano es un suavizado bidimensional mediante el cálculo del suavizado promedio ponderado de cada canal y canales adyacentes. Se usa comúnmente para el ruido de fallas de picos. El filtro Savitzky-Goaly se ajusta a un polinomio inferior y a un subconjunto continuo de conjuntos de datos adyacentes a través del método de mínimos cuadrados, que satisface la necesidad de varios filtros suaves y también es eficaz para procesar conjuntos de datos no periódicos y no lineales derivados del ruido. La corrección de la línea de base de sombrero de copa puede ajustar las señales ópticas a la misma altura de acuerdo con los picos de las trazas, calculando parámetros como la duración del potencial de acción (APD) y la duración transitoria del calcio (CaTD) con mucha más precisión. La deriva de la línea de base ocurre ocasionalmente cuando se muestrean señales de voltaje y fluorescencia de calcio. También es útil para calcular las alternancias y la amplitud del calcio. Ambos ventrículos fueron seleccionados para la investigación electrofisiológica.
Ventajas y desventajas del mapeo de doble colorante y métodos para limitar la interferencia
En los últimos años, se ha tomado conciencia de que es vital aclarar la despolarización o repolarización celular y la heterogeneidad de la conducción intercelular en todo el corazón, así como el acoplamiento del reloj de membrana y el reloj de calcio, lo cual es crítico para comprender el mecanismo de enfermedades como la arritmia24,25. El mapeo óptico tiene una alta resolución espacio-temporal para determinar las propiedades de activación ventricular y repolarización del corazón de ratones transgénicos26,27,28,29. También puede detectar imágenes multiparamétricas, por ejemplo, la medición del potencial de membrana y el calcio intracelular del mismo corazón24,30 o tejido31,32 cargado con voltaje y colorante sensible al calcio. Las imágenes de doble colorante son beneficiosas para estudiar la relación entre el potencial de acción y el calcio, como la relación entre el reloj de membrana (M) y el reloj de Ca2+ (C) o la liberación espontánea de calcio y el retraso después de la despolarización (DAD). La excitación cardíaca normal requiere que los eventos cíclicos en los dos relojes estén alineados. La alteración de esta alineación conduce a una arritmia25. La relación entre la liberación espontánea de calcio y el DAD es el mecanismo de activación de las actividades en la insuficiencia cardíaca 33. Sin embargo, la combinación de tintes debe seleccionarse cuidadosamente. La combinación de RH-237/Rhod-2 o di-4-ANEPPS/Indo-1 permite el registro simultáneo, mientras que Fluo-3/4/di-4-ANEPPS dará lugar a errores debido a la superposición de espectros de emisión de dos colorantes30,34,35. Este experimento seleccionó RH237 y Rhod-2 AM para cargar el corazón y adquirió una buena calidad de imagen.
Además, la cámara utilizada en este protocolo tiene dos superficies objetivo, lo que le permite capturar las señales divididas en una interfaz de muestreo y permite que una sola cámara detecte dos longitudes de onda de emisión diferentes. Este mapeo simultáneo de AP óptico y CaT combinando varios protocolos de espectroscopia de fotoelectrones (PES) nos permitirá determinar la interrelación entre la inestabilidad anormal [Ca2+]i y eléctrica en condiciones de estrés y el efecto de la potenciación post-activación sobre estas anomalías. Se estudiará la naturaleza espacialmente heterogénea del ciclo SR Ca2+ y cómo esto afecta la aparición, la gravedad y la concordancia de las alternancias eléctricas y el comportamiento arritmogénico, como las alternancias espacialmente discordantes y las consiguientes VT, en el corazón intacto en diferentes grupos. Se explorarán los alternantes SR Ca 2+, la refractariedad de RyR2 y su papel en los alternantes SR Ca2+ y APD.
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Disclosures
Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este estudio cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81700308 a XO y 31871181 a ML, y 82270334 a XT), el Programa de Apoyo a la Ciencia y la Tecnología (CN) de la provincia de Sichuan (2021YJ0206 a XO, 23ZYZYTS0433 y 2022YFS0607 a XT, y 2022NSFSC1602 a TC) y el Laboratorio Estatal Clave de Química e Ingeniería Molecular de Recursos Medicinales (Universidad Normal de Guangxi) (CMEMR2017-B08 a XO), MRC (G10031871181 a ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE en Oxford (ML) subvenciones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
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