Summary
Questo protocollo introduce la mappatura ottica a doppio colorante di cuori di topo ottenuti da animali wild-type e knock-in affetti da tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica, comprese le misurazioni elettrofisiologiche del voltaggio transmembrana e dei transitori intracellulari di Ca2+ con un'elevata risoluzione temporale e spaziale.
Abstract
La tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) si manifesta con episodi di tachicardia ventricolare polimorfa a seguito di attività fisica, stress o provocazione di catecolamine, che possono deteriorarsi in fibrillazione ventricolare potenzialmente fatale. Il cuore di topo è una specie molto diffusa per la modellazione di malattie aritmiche cardiache ereditarie, tra cui la CPVT. La mappatura ottica simultanea del potenziale transmembrana (Vm) e dei transienti di calcio (CaT) da cuori di topo perfusi con Langendorff ha il potenziale per chiarire i meccanismi alla base dell'aritmogenesi. Rispetto all'indagine a livello cellulare, la tecnica di mappatura ottica può testare alcuni parametri elettrofisiologici, come la determinazione dell'attivazione, la velocità di conduzione, la durata del potenziale d'azione e la durata del CaT. Questo articolo presenta la configurazione della strumentazione e la procedura sperimentale per la mappatura ottica ad alto rendimento di CaT e Vm in cuori murini wild-type ed eterozigoti RyR2-R2474S/+, combinati con la stimolazione elettrica programmata prima e durante la sfida con isoproterenolo. Questo approccio ha dimostrato un metodo fattibile e affidabile per lo studio meccanicistico della malattia CPVT in una preparazione cardiaca di topo ex vivo.
Introduction
Tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) si manifesta con episodi di tachicardia ventricolare polimorfica (PVT) a seguito di attività fisica, stress o provocazione di catecolamine, che possono degenerare in fibrillazione ventricolare potenzialmente fatale 1,2,3,4 . Recenti evidenze a seguito del suo primo rapporto come sindrome clinica nel 1995 implicavano mutazioni in sette geni, tutti coinvolti nel rilascio di Ca 2+ del reticolo sarcoplasmatico (SR) in questa condizione: il più frequentemente riportato RYR2 che codifica per il recettore 2 della rianodina (RyR2) dei canali di rilascio di Ca2+ 5,6, FKBP12.67, CASQ2 che codifica per la calsequestrina cardiaca8, TRDN che codificano per la proteina SR giunzionale triadina 9, e CALM19, CALM2 10 e CALM3 codificano in modo identico per calmodulina11,12. Questi pattern genotipici attribuiscono gli eventi aritmici al rilascio patologico non regolato del deposito di SR Ca2+12.
Il rilascio spontaneo di Ca 2+ da SR può essere rilevato come scintille di Ca 2+ o onde di Ca 2+, che attivano lo scambiatore Na+/Ca 2+ (NCX). Lo scambiatore di un Ca2+ per tre Na+ genera una corrente verso l'interno, che accelera la depolarizzazione diastolica e porta la tensione di membrana alla soglia del potenziale d'azione (AP). Nei topi knock-in di RyR2, l'aumento dell'attività di RyR2R4496C nel nodo senoatriale (SAN) porta a una diminuzione imprevista dell'automaticità di SAN da parte di Ca 2+-dipendente della deplezione di ICa,L e SR Ca2+ durante la diastole, identificando alterazioni fisiopatologiche subcellulari che contribuiscono alla disfunzione SAN nei pazienti con CPVT 13,14. L'insorgenza delle relative onde citosoliche di Ca 2+ dei cardiomiociti è più probabile a seguito di aumenti del [Ca2+] citosolico di fondo a seguito della sensibilizzazione a RyR da parte delle catecolamine, incluso l'isoproterenolo (ISO).
Cambiamenti cinetici dettagliati nella segnalazione di Ca 2+ a seguito del rilascio di Ca2+ mediato da RyR2 in risposta all'attivazione del potenziale d'azione (AP) che potrebbe essere la causa delle aritmie ventricolari osservate nei modelli cardiaci intatti di CPVT rimangono da determinare per l'intera gamma di genotipi RyR2 riportati12. Questo articolo presenta la configurazione della strumentazione e la procedura sperimentale per la mappatura ad alto rendimento dei segnali Ca2+ e dei potenziali transmembrana (Vm) in cuori murini wild-type (WT) ed eterozigoti RyR2-R2474S/+, combinati con la stimolazione elettrica programmata prima e dopo la sfida con isoproterenolo. Questo protocollo fornisce un metodo per lo studio meccanicistico della malattia CPVT in cuori di topo isolati.
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Protocol
Per gli esperimenti vengono utilizzati topi maschi di età compresa tra 10 e 14 settimane di età o topi RyR2-R2474S/+ (sfondo C57BL/6) del peso di 20-25 g. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato per la cura e l'uso degli animali della Southwest Medical University, Sichuan, Cina (approvazione n.: 20160930) in conformità con le linee guida nazionali in base alle quali opera l'istituto.
1. Preparazione
- Soluzioni di magazzino
- Soluzione madre di blebbistatina: aggiungere 1 mL di dimetilsolfossido (DMSO) al 100% nel matraccio originale contenente 2,924 mg di (-) polvere di blebbistatina per raggiungere una concentrazione di 10 mM.
- Indicatore di tensione RH237 soluzione madre: Aggiungere 1 mL di DMSO al 100% nel matraccio originale con 1 mg di polvere RH237 per ottenere una concentrazione di 2,01 mM.
- Indicatore di calcio Rhod-2 AM soluzione madre: Aggiungere 1 mL di DMSO al 100% in 1 mg di Rhod-2 AM in polvere per raggiungere una concentrazione di 0,89 mM.
- Soluzione madre Pluronic F127: Aggiungere 1 mL di DMSO al 100% in 200 mg di Pluronic F127 per raggiungere una concentrazione del 20% p/v (0,66 mM).
- Aliquotare le soluzioni madre in provette PCR da 200 μL in 21-51 μL (21 μL di RH237, 31 μL di Rhod-2 AM e 51 μL di blebbistatina) per uso singolo o doppio per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti. Quindi, avvolgere le soluzioni con un foglio di alluminio e conservare a -20 °C, ad eccezione della soluzione madre Pluronic F127 posta in una stanza buia a temperatura ambiente.
- Soluzione di perfusione
- Soluzione di Krebs (in mM): Preparare 1 L di soluzione di Krebs (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1.0, KCl4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35 e glucosio 10).
- Filtrare la soluzione con un filtro ad ago asettico da 0,22 μm e ossigenare con il 95% di O 2/5% di CO2 .
- Prelevare 40 mL di soluzione di Krebs in una provetta centrifuga da 50 mL e conservarla a 4 °C per l'isolamento cardiaco di follow-up.
- Il sistema di perfusione Langendorff e il dispositivo di mappatura ottica
- Configurare il sistema di perfusione Langendorff.
- Aprire il bagnomaria e impostare la temperatura a 37 °C.
- Lavare il sistema di perfusione Langendorff con 1 L di acqua deionizzata.
- Perfondere la soluzione dal tratto di aspirazione e regolare la velocità di deflusso a 3,5-4 mL/min. Quindi, ossigenare il perfusato con O 2/CO2 (95%/5%) gas a 37 °C.
NOTA: Una bolla non è mai ammessa nel sistema di perfusione.
- Preparare il sistema di mappatura ottica.
- Installare la fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica a moltiplicazione di elettroni (EMCCD) (512 × 512 pixel), l'obiettivo (ingrandimento 40x), i diodi emettitori di luce (LED) dello splitter di lunghezza d'onda, il monitor dell'elettrocardiogramma (ECG) e l'elettrodo di stimolazione (Figura 1).
- Regolare la corretta distanza di lavoro dall'obiettivo alla posizione del cuore.
- Impostare due LED nella posizione diagonale del bagno termostatico per un'illuminazione uniforme, fornendo una lunghezza d'onda di 530 nm per generare luce di eccitazione. Utilizzare un filtro con rivestimento antisputtering ET525/50 per rimuovere qualsiasi luce fuori banda per i LED.
- Regolare l'interruttore della maniglia per ottenere un quadrato uguale della superficie di destinazione, facendo in modo che le immagini di tensione e calcio appaiano adeguatamente sull'interfaccia di acquisizione.
- Ruotare l'apertura dell'obiettivo al diametro massimo per evitare perdite di tensione o segnali di calcio.
- Regolare l'obiettivo della fotocamera a un'altezza adeguata, poiché serve una buona distanza di lavoro dal bagno termostatico, vengono utilizzati principalmente 10 cm.
- Accendere la fotocamera per una temperatura di campionamento stabile a -50 °C.
- Configurare il sistema di perfusione Langendorff.
2. Procedure
- Prelievo, incannulamento e perfusione del cuore di topo
- Iniettare per via intraperitoneale negli animali una soluzione di avertin (1,2%, 0,5-0,8 ml) ed eparina (200 unità) per ridurre al minimo la sofferenza e il riflesso del dolore e prevenire la formazione di coaguli di sangue. Dopo 15 minuti, sacrificare gli animali mediante lussazione cervicale.
- Aprire il torace con le forbici, prelevare il cuore con cura e metterlo nella soluzione fredda di Krebs (4 °C, 95% O 2, 5% CO2 ) per rallentare il metabolismo e proteggere il cuore.
- Rimuovere il tessuto circostante l'aorta, incannulare l'aorta utilizzando un ago cannulante su misura (diametro esterno: 0,8 mm, diametro interno: 0,6 mm, lunghezza: 27 mm) e fissarlo con una sutura di seta 4-0.
- Perfondere il cuore con il sistema Langendorff a una velocità costante di 3,5-4,0 mL/min e mantenere la temperatura a 37 ± 1 °C.
NOTA: Tutte le procedure successive vengono eseguite in questa condizione. - Inserire un piccolo tubo di plastica (0,7 mm di diametro, 20 mm di lunghezza) nel ventricolo sinistro per rilasciare la congestione della soluzione nella camera ed evitare il sovraprecarico.
- Disaccoppiatore di eccitazione-contrazione e caricamento a doppio colorante
- Inserire due derivazioni nel perfuso nella vasca da bagno, accendere l'alimentazione della scatola dell'amplificatore ECG e del controller di stimolazione elettrica, quindi avviare il software ECG di riferimento e monitorare continuamente l'ECG.
- Eseguire i passaggi successivi al buio quando il cuore raggiunge una condizione di stato stabile (il cuore batte ritmicamente a ~400 bpm).
- Miscelare 50 μL di soluzione madre di blebbistatina 10 mM con 50 mL di soluzione di Krebs per raggiungere una concentrazione di 10 μM. Perfondere costantemente la miscela di soluzione di blebbistatina-Krebs nel cuore per 10 minuti per disaccoppiare la contrazione dall'eccitazione ed evitare artefatti di contrazione durante le riprese.
- Usa una torcia rossa per verificare se la contrazione cardiaca si ferma completamente perché la contrazione influenzerà la qualità del caricamento del colorante.
- Dopo aver disaccoppiato eccitazione-contrazione, miscelare 15 μL di soluzione madre Rhod-2 AM con 15 μL di soluzione madre Pluronic F127 in 50 mL di soluzione di Krebs per ottenere le concentrazioni finali di 0,267 μM Rhod-2 AM e 0,198 μM Pluronic F127. Quindi, perfondere continuamente il cuore con la soluzione di lavoro Rhod-2 AM per 15 minuti nel sistema di perfusione Langendorff.
- Mantenere l'apporto di ossigeno durante il caricamento intracellulare del colorante di calcio. Poiché le bolle si formano facilmente in Pluronic F127, inserire una trappola per bolle nel sistema di perfusione per evitare l'embolizzazione gassosa delle coronarie.
- Diluire 10 μL di soluzione madre RH237 in 50 mL di perfuso per raggiungere la concentrazione finale a 0,402 μM ed eseguire il caricamento per 10 minuti.
- Al termine del caricamento del doppio colorante, scattare una sequenza di foto per assicurarsi che sia i segnali di tensione che quelli di calcio siano adeguati per l'analisi (nessuna interazione tra due segnali).
- Mappatura ottica e induzione dell'aritmia
NOTA: La mappatura ottica inizia dopo la cessazione della contrazione e un appropriato caricamento del colorante, e il cuore viene perfuso consecutivamente come nei passaggi descritti sopra al punto 2.1 (4).- Accendi i due LED per le luci di eccitazione e regola la loro intensità a una gamma adeguata (abbastanza forte per l'illuminazione e le riprese relativamente semplici, ma non troppo robusta per la sovraesposizione).
- Posizionare il cuore sotto il dispositivo di rilevamento, assicurarsi che sia illuminato adeguatamente da due LED e regolare il diametro del punto luminoso a 2 cm.
- Impostare la distanza di lavoro tra l'obiettivo e il cuore a 10 cm, ottenendo una frequenza di campionamento di quasi 500 Hz e una risoluzione spaziale di 120 x 120 μm per pixel.
- Aprire il software di campionamento del segnale per controllare digitalmente la telecamera e acquisire contemporaneamente i segnali di tensione e calcio.
- Avviare lo stimolatore di campo miopacante e impostare il modello di stimolazione su Transistor Transistor Logic (TTL), 2 ms di durata della stimolazione per ogni impulso e 0,3 V come intensità iniziale.
- Utilizzare 30 stimoli consecutivi S1 a 10 Hz per testare la soglia di tensione diastolica del cuore guidata dal software di registrazione ECG. Aumentare gradualmente l'ampiezza della tensione fino a realizzare l'acquisizione 1:1 (controllare l'onda QRS dal monitor ECG, i segnali del potenziale d'azione (AP) e dei transienti di calcio (CaT)).
- Dopo aver determinato la soglia di tensione, stimolare il cuore a un'intensità pari a 2 volte la soglia di tensione diastolica con una coppia di elettrodi di platino attaccati all'epicardio dell'apice del ventricolo sinistro (LV) (ELVA).
- Implementare il protocollo S1S1 per misurare il calcio o le alternative del potenziale d'azione e le proprietà di restituzione. Regolare il cuore consecutivamente a una durata del ciclo di base di 100 ms, diminuendo di 10 ms la durata del ciclo ogni sequenza successiva fino a raggiungere i 50 ms. Ogni episodio include 30 stimoli consecutivi con un'ampiezza dell'impulso di 2 ms. Allo stesso tempo, avviare la mappatura ottica prima della stimolazione (il tempo di campionamento include ~10 ritmi sinusali e la durata della stimolazione).
- Per misurare il periodo refrattario effettivo ventricolare (ERP) utilizzando il protocollo di stimolo S1S2, iniziare con una durata del ciclo di stimolazione S1S1 di 100 ms con un S2 accoppiato a 60 ms con un decremento a passi di 2 ms fino a quando S2 non riesce a catturare il complesso QRS ectopico.
- Per l'induzione dell'aritmia, eseguire una stimolazione a raffica perpetua di 50 Hz (50 stimolazioni elettriche continue con un'ampiezza dell'impulso di 2 ms) ed eseguire lo stesso episodio di stimolazione dopo un intervallo di riposo di 2 secondi.
- Osservare attentamente le registrazioni ECG durante il periodo di stimolazione continua ad alta frequenza in modo che le registrazioni simultanee della mappatura ottica possano iniziare prontamente quando si genera un'onda ECG aritmica interessante (poiché la maggior parte delle aritmie cardiache sono indotte dalla stimolazione elettrica, i segnali ottici vengono campionati 2-3 secondi prima della stimolazione a raffica in caso di perdita di eventi cardiaci importanti).
- Immagine con telecamera EMCCD (frequenza di campionamento: 500 Hz, dimensione pixel: 64 x 64).
- Analisi dei dati
- Caricamento delle immagini ed elaborazione del segnale
- Premere Seleziona cartella e carica immagini per caricare le immagini nel software di acquisizione delle immagini per l'analisi semiautomatica dei dati video massivi in base alla configurazione e al protocollo descritti in precedenza15,16.
- Immettere i parametri di campionamento corretti (ad esempio Dimensione pixel e Frequenza fotogrammi).
- Impostare la soglia dell'immagine tramite l'inserimento manuale e selezionare la regione di interesse (ROI).
- Implementa un filtro spaziale gaussiano da 3 x 3 pixel, un filtro Savitzky-Goaly e una correzione della linea di base top-hat.
- Premere Elabora immagini per rimuovere la linea di base e calcolare i parametri elettrofisiologici, ad esempio APD80 e CaTD50.
- Analisi dei parametri elettrofisiologici
- Impostare il tempo di avvio dell'APD al picco e il punto terminale all'80% di ripolarizzazione (APD80) per il calcolo dell'APD80. Allo stesso modo, l'ora di inizio CaTD è definita come il picco e il punto terminale è definito come il rilassamento dell'80%.
- La misurazione della velocità di conduzione (CV) dipende dalla dimensione dei pixel e dal tempo di conduzione del potenziale d'azione tra due o più pixel. Calcola la velocità media da tutti i pixel scelti: questa è la velocità media di conduzione della regione selezionata. Genera simultaneamente le mappe isocronali corrispondenti per una visione chiara della direzione di conduzione.
NOTA: O'Shea et al.15 hanno riportato la misurazione CV in dettaglio. - Per l'analisi delle alternanze e delle aritmie, le alternanze di calcio sono definite come un'ampiezza di picco continua grande e piccola che appare alternativamente. Utilizzare il rapporto di ampiezza di picco per valutare la gravità delle alternative dipendenti dalla frequenza (1-A2/A1). Applicare mappe di fase per analizzare aritmie complesse come la tachicardia ventricolare (TV). Cerca i rotori che appaiono distintamente in una regione specifica mentre i rotori si spostano.
- Caricamento delle immagini ed elaborazione del segnale
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Representative Results
La mappatura ottica è stata un approccio popolare nello studio delle aritmie cardiache complesse nell'ultimo decennio. La configurazione di mappatura ottica è costituita da una telecamera EMCCD, che fornisce una frequenza di campionamento fino a 1.000 Hz e una risoluzione spaziale di 74 x 74 μm per ogni pixel. Consente un rapporto segnale-rumore piuttosto elevato durante il campionamento del segnale (Figura 1). Una volta che il cuore perfuso di Langendorff raggiunge uno stato stabile e il carico di colorante termina, il cuore viene posto nella camera omeotermica sotto l'illuminazione di due LED da 530 nm, che vengono utilizzati per l'eccitazione dell'indicatore di tensione RH237 e dell'indicatore Ca2+ Rhod-2 AM. La luce di emissione viene suddivisa in due lunghezze d'onda di 600 nm (per Ca2+) e 670 nm (per Vm), che vengono rilevate contemporaneamente utilizzando la telecamera EMCCD. Dopo aver perfuso avertin ed eparina per 15 minuti, utilizzare gli strumenti chirurgici (Figura 2A) per aprire il torace ed estrarre rapidamente il cuore, quindi trasferirlo nella soluzione fredda di Krebs (4 °C, 95% O 2, 5% CO2 ) (Figura 2B). Pulire accuratamente i tessuti circostanti, fissare l'aorta con una sutura 4-0 e inserire un tubo di plastica da 0,7 mm nel ventricolo sinistro (Figura 2C) per rilasciare la congestione del perffato nella camera ventricolare sinistra. Inserire le derivazioni ECG nel perfuso (Figura 2D) e assicurarsi che il cuore batta ritmicamente in base al monitoraggio ECG guidato dal software di registrazione ECG. Quindi, eseguire il caricamento a doppio colorante al buio (Figura 2E).
Dopo che gli artefatti di contrazione sono stati ridotti al minimo dalla blebbistatina (10 μM) e un adeguato carico di colorante è stato completato, la ripresa è iniziata per circa 10 battiti sinusali prima del protocollo di stimolazione S1S1 per valutare le proprietà di restituzione dei parametri elettrofisiologici dipendenti dalla frequenza e gli alternani di calcio dopo la sfida con isoproterenolo (ISO 1 μM) (Figura 3A). La Figura 3B mostra un fronte d'onda ECG rappresentativo della TV e il corrispondente potenziale d'azione (AP) e le tracce CaT indotte da una sequenza di stimolazione a raffica a 50 Hz in un topo CPVT. Il software di imaging del segnale ottico viene utilizzato per completare un'analisi semiautomatica di enormi dati video.
Le Figure 4A,B mostrano le tracce tipiche e le mappe termiche di APD80 e CaTD80, rispettivamente. L'ISO accorcia l'APD80 nei topi WT e CPVT, ma non è stata riscontrata alcuna differenza tra i topi WT e CPVT prima e dopo la sfida ISO (Figura 4C, **P < 0,01. n = 5/6). La Figura 4D indica che CaTD80 nei topi CPVT è più lungo rispetto al WT dopo la sfida ISO, mentre non c'era alcun significato prima del trattamento ISO (**P < 0,01. n = 6.).
Per la misurazione della conduzione, la Figura 5A presenta un algoritmo a vettore singolo per la quantificazione della CV. Secondo i segnali di tensione, i cuori WT e CPVT possiedono la stessa capacità di conduzione attraverso l'epicardio al basale e dopo l'intervento ISO (Figura 5B). La Figura 5C,D mostra le mappe di attivazione rappresentative del voltaggio e del calcio nei cuori WT e CPVT prima e dopo la sfida ISO.
Il calcio alternante è un parametro critico per l'aritmia. L'ampiezza alternans del calcio è calcolata in base alla formulazione mostrata nella Figura 6A. I segnali di calcio nei cuori WT rimangono stabili al basale durante la stimolazione consecutiva di S1S1 a 14,29 e 16,67 Hz (Figura 6B), mentre i cuori CPVT mostrano alternanze dipendenti dalla frequenza (Figura 6C). Dopo la sfida ISO, i cuori CPVT mostrano alternanze dipendenti dalla frequenza nel segnale del calcio durante la stimolazione S1S1, mentre i cuori WT non sono influenzati (Figura 6D,E). Dopo la stimolazione continua di S1S1, viene eseguito un protocollo di stimolazione a raffica per indurre aritmie letali. I cuori WT e CPVT mostrano una conduzione normale durante la stimolazione a raffica a 50 Hz al basale (Figura 7A). Dopo la perfusione con ISO, i cuori CPVT mostrano rotori ad alta frequenza dopo una stimolazione a raffica di 50 Hz, mentre i cuori WT mantengono una conduzione normale (Figura 7B).
Figura 1: Apparato di mappatura ottica. Il sistema include una telecamera EMCCD progettata su misura con un'elevata risoluzione spazio-temporale (frequenza di campionamento fino a 1.000 Hz, pixel di campionamento minimo 74 x 74 μm). Un controller di stimolazione elettrica viene utilizzato per il campionamento e il protocollo di stimolazione elettrica in uscita. Due LED verdi sono utilizzati per la luce di eccitazione delle sonde a fluorescenza. Uno specchio dicroico passa-lungo (610 nm) e i corrispondenti emettitori dividono le luci di emissione di tensione e fluorescenza del calcio. RH237, il colorante sensibile al voltaggio, ha una luce di emissione a una lunghezza d'onda di picco di 670 nm, mentre Rhod-2 AM, il colorante sensibile al calcio, possiede una luce di emissione a una lunghezza d'onda di picco di 600 nm. Piccole variazioni in entrambi i segnali di fluorescenza potrebbero essere catturate contemporaneamente dalla fotocamera a causa dell'elevata frequenza di campionamento e sensibilità del sensore della fotocamera. Abbreviazioni: EMCCD = dispositivo ad accoppiamento di carica che moltiplica elettroni; LED = diodo emettitore di luce; ECG = elettrocardiogramma. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Preparazione e caricamento del doppio colorante . (A) Gli strumenti chirurgici. (B) Raccolta del cuore di topo. (C) Tagliare con cura il tessuto non necessario per una visione chiara dell'aorta e inserire un tubo di plastica da 0,7 mm dall'aorta nel ventricolo sinistro. (D) Il cuore viene rimosso rapidamente nel sistema di perfusione di Langendorff. (E) Caricamento a doppio colorante e cessazione dell'eccitazione-contrazione al buio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Protocollo S1S1 e protocollo di induzione dell'aritmia. (A) Fronte d'onda ECG rappresentativo e corrispondenti tracce di segnale AP e calcio utilizzando il protocollo di stimolazione S1S1 dopo la sfida ISO. (B) Induzione VT mediante una sequenza di stimolazione a raffica a 50 Hz dopo la perfusione di ISO in un mouse CPVT. Abbreviazioni: ECG = elettrocardiogramma; AP = potenziale d'azione; ISO = isoproterenolo; VT = tachicardia ventricolare; CPVT = tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi APD80 e CaTD80 a 10 Hz prima e dopo la verifica ISO. (A) Tracce AP rappresentative e mappe termiche APD80 dei cuori WT e CPVT prima e dopo il trattamento ISO. (B) Tracce tipiche di CaT e mappe di calore CaTD80 di cuori WT e CPVT prima e dopo la sfida ISO. (C) L'ISO accorcia l'APD80 nei topi WT e CPVT, ma non si trova alcuna differenza tra i topi WT e CPVT prima e dopo la sfida ISO. (D) CaTD80 nei topi CPVT è più lungo rispetto al WT dopo il challenge ISO, mentre non c'era alcun significato prima del trattamento ISO. (* P < 0,05, **P < 0,01. n =5/6.) Abbreviazioni: AP = potenziale d'azione; APD80 = picco all'80% di ripolarizzazione; ISO = isoproterenolo; CPVT = tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica; WT = tipo selvatico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi della velocità di conduzione a 10 Hz. (A) L'algoritmo a vettore singolo della velocità di conduzione. (B) Nessuna differenza nel CV di AP nei topi WT e CPVT. (C) Mappe termiche rappresentative dimostrano che i topi CPVT hanno la stessa capacità di conduzione dei topi WT prima e dopo la sfida ISO in base ai segnali di tensione. (D) Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nei due gruppi per le isocrone CaT80 indotte dal potenziale d'azione prima e dopo la sfida ISO. Abbreviazioni: AP = potenziale d'azione; ISO = isoproterenolo; CPVT = tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica; WT = tipo selvatico; AT = tempo di attivazione; CV = velocità di conduzione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Analisi dell'ampiezza alternans del calcio. (A) L'algoritmo di calcolo dell'ampiezza alternans del calcio. (B) I segnali di calcio nei cuori WT rimangono stabili al basale durante la stimolazione consecutiva di S1S1 a 14,29 e 16,67 Hz, mentre (C) i cuori CPVT mostrano alternanze dipendenti dalla frequenza. (D) I cuori WT non sono influenzati dalla sfida ISO, mentre (E) dopo la sfida ISO, i cuori CPVT mostrano alternanze dipendenti dalla frequenza nel segnale del calcio durante la stimolazione S1S1. Abbreviazioni: ISO = isoproterenolo; CPVT = tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica; WT = tipo selvatico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Analisi della tachiaritmia utilizzando mappe di fase . (A) I cuori WT e CPVT mostrano una conduzione normale durante la stimolazione a raffica a 50 Hz al basale. (B) Dopo la perfusione con ISO, i cuori CPVT mostrano rotori ad alta frequenza dopo una stimolazione a raffica di 50 Hz, mentre i cuori WT mantengono una conduzione normale. Abbreviazioni: ISO = isoproterenolo; CPVT = tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica; WT = tipo selvatico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sulla base della nostra esperienza, le chiavi per una mappatura ottica a doppio colorante di successo di un cuore di topo includono una soluzione e un cuore ben preparati, il caricamento del colorante, il raggiungimento del miglior rapporto segnale/rumore e la riduzione dell'artefatto da movimento.
Preparazione della soluzione
La soluzione di Krebs è essenziale per il successo di un esperimento sul cuore. Le soluzioni madre di MgCl 2 e CaCl2 (1 mol/L) vengono preparate in anticipo considerando il loro assorbimento d'acqua e aggiunte alla soluzione di Krebs dopo che tutti gli altri componenti sono stati disciolti in acqua pura perché Mg 2+ e Ca 2+ possono facilmente precipitare con CO3 2+. La soluzione di Krebs viene fatta gorgogliare con il 95% di O 2/5% di CO2 per almeno 30 minuti per garantire l'ossigenazione. Poiché il cuore del topo è particolarmente sensibile al pH, il pH della soluzione dovrebbe essere di circa 7,4 dopo l'ossigenazione. Anche se nella soluzione sono presenti minuscole particelle, i risultati sperimentali possono essere influenzati perché queste particelle possono bloccare i capillari e influenzare l'effetto di perfusione. Pertanto, la soluzione viene filtrata utilizzando un filtro ad ago asettico da 0,22 μm prima dell'uso.
Preparazione del cuore
Prima che i cuori vengano prelevati, i topi vengono prima eparinizzati per evitare la formazione di coaguli nel sistema delle arterie coronarie, impedendo che la scarsa perfusione del colorante causata dalla congestione cardiaca influisca sull'imaging successivo. Più breve è il tempo ischemico del cuore, migliori sono le condizioni del cuore. Pertanto, il tempo ischemico è controllato entro 2-3 minuti dal prelievo cardiaco all'incannulamento attraverso l'aorta sul sistema di Langendorff. Inoltre, è essenziale anche una pressione di perfusione ben mantenuta. Quindi, un sottile tubo di silicone (plastica) viene inserito nella cavità ventricolare sinistra per evitare che la pressione ventricolare sinistra sia troppo alta durante la contrazione ventricolare dopo che lo sbocco ventricolare sinistro è stato legato, il che potrebbe causare una scarsa perfusione miocardica e acidificazione del tessuto anossico.
Caricamento del colorante
Questi esperimenti eseguono il caricamento del colorante perfondendo il cuore nel sistema di Langendorff. È fondamentale monitorare il ritmo cardiaco perché si verifica uno scarso carico di colorante quando il ritmo anomalo è causato da operazioni chirurgiche o danni da ischemia-riperfusione. Il cuore deve essere abbastanza sano per eseguire i passaggi successivi. Rhod-2 AM, un colorante sensibile al Ca2+, è un derivato dell'estere metilico acetilico di Rhod 2, che viene facilmente caricato nelle cellule nella sua forma AM. Un aumento di 100 volte dell'intensità della fluorescenza della molecola deriva dalla chelazione di Ca2+ 17. Pluronic F127 è incorporato nella soluzione di caricamento Rhod-2 AM per impedire a Rhod-2 AM di polimerizzare nel tampone e aiutarlo a entrare nelle cellule. Pluronic F127 può ridurre la stabilità di Rhod-2 AM, quindi si consiglia di aggiungerlo solo durante la preparazione della soluzione di lavoro, ma non nella soluzione di conservazione per la conservazione a lungo termine. Il colorante sensibile al voltaggio RH237 viene utilizzato in questo studio grazie alle sue proprietà spettrali favorevoli per l'uso con l'indicatore Ca2+ Rhod-2 AM.
Ottenere il miglior rapporto segnale/rumore
Ottenere immagini con un elevato rapporto segnale/rumore è l'obiettivo dell'imaging, ma il rumore è come un fantasma oscuro che causa sempre problemi. A causa della debolezza dei segnali, la riduzione del rumore è particolarmente importante in alcune applicazioni di imaging microscopico ad alta velocità, come la mappatura ottica. Il rapporto segnale/rumore (SNR) viene calcolato come rapporto tra l'ampiezza quadratica media e il rumore quadratico medio, dove l'ampiezza del rumore viene valutata al potenziale di riposo18. Alcuni fattori, come la sorgente luminosa, i filtri ottici, le ottiche di messa a fuoco e i fotorivelatori, sono essenziali per ottenere il miglior SNR. Nello studio, la regione di fondo del campione viene esaminata per il rumore, che spesso fluttua a un livello minimo. Il segnale ottico rilevato da ciascun pixel è la media della luce emessa dalla sua superficie. Le attività di AP e calcio oscillano durante l'aritmia e l'ampiezza di entrambi i segnali è relativamente bassa. Anche piccole interferenze possono portare alla distorsione dei segnali ottici e causare errori nell'analisi dei dati. Pertanto, l'interpretazione dei segnali ottici dovrebbe essere attenta quando l'eterogeneità locale è causata dalla funzione elettrica durante aritmie come la TV.
Riduci l'artefatto da movimento
Rispetto alla registrazione degli elettrodi, i segnali ottici sono spesso influenzati dall'attività di contrazione dei cuori perfusi di Langendorff a causa dell'artefatto del movimento. Per catturare segnali ottici accurati, vengono utilizzati principalmente inibitori farmacologici dell'eccitazione-contrazione. Per ridurre al minimo l'artefatto da movimento durante l'imaging, la blebbistatina viene adottata per fermare il battito cardiaco. È un inibitore selettivo dell'attività dell'ATPasi della miosina II non muscolare e disaccoppia efficacemente il processo di eccitazione-contrazione del cuore 19,20,21. Sebbene alcuni studi implichino alcuni effetti collaterali utilizzando il composto22, utilizziamo la concentrazione di lavoro più bassa a 10 μM per ridurre al minimo i possibili danni al cuore.
Software ElectroMap per l'analisi di set di dati di mappatura ottica cardiaca
ElectroMap è un software open-source ad alto rendimento per l'analisi di set di dati di mappatura ottica cardiaca. Fornisce un'analisi dei principali parametri elettrofisiologici cardiaci, tra cui la morfologia di AP e CaT, CV, intervallo diastolico, frequenza dominante, time-to-peak e costante di rilassamento (τ) 15,23. Il software consente diverse opzioni di filtraggio, tra cui il filtro gaussiano, il filtro Savitzky-Goaly e la correzione della linea di base Top-hat. Il filtro gaussiano è uno smoothing bidimensionale calcolando lo smoothing medio ponderato di ciascun canale e dei canali adiacenti. È comunemente usato per il rumore glitch del picco. Il filtro Savitzky-Goaly si adatta a un sottoinsieme polinomiale inferiore e continuo di set di dati adiacenti attraverso il metodo dei minimi quadrati, che soddisfa la necessità di vari filtri uniformi ed è anche efficace per l'elaborazione di set di dati non periodici e non lineari derivati dal rumore. La correzione della linea di base top-hat può regolare i segnali ottici alla stessa altezza in base ai picchi delle tracce, calcolando parametri come la durata del potenziale d'azione (APD) e la durata del transitorio del calcio (CaTD) in modo molto più accurato. La deriva della linea di base si verifica occasionalmente durante il campionamento di segnali di tensione e fluorescenza del calcio. È utile anche per calcolare le alternanze e l'ampiezza del calcio. Entrambi i ventricoli sono stati selezionati per l'indagine elettrofisiologica.
Vantaggi e svantaggi della mappatura a doppio colorante e metodi per limitare le interferenze
Negli ultimi anni, ci si è resi conto che è fondamentale chiarire la depolarizzazione o la ripolarizzazione cellulare e l'eterogeneità della conduzione intercellulare in tutto il cuore, nonché l'accoppiamento dell'orologio di membrana e dell'orologio del calcio, che è fondamentale per comprendere il meccanismo di malattie come l'aritmia24,25. La mappatura ottica ha un'elevata risoluzione spazio-temporale per determinare le proprietà di attivazione ventricolare e ripolarizzazione del cuore di topi transgenici26,27,28,29. Può anche rilevare l'imaging multiparametrico, ad esempio, la misurazione del potenziale di membrana e del calcio intracellulare dello stesso cuore24,30 o tessuto31,32 caricato con voltaggio e colorante sensibile al calcio. L'imaging a doppio colorante è utile per studiare la relazione tra potenziale d'azione e calcio, come la relazione tra l'orologio di membrana (M) e l'orologio Ca2+ (C) o il rilascio spontaneo di calcio e ritardato dopo la depolarizzazione (DAD). La normale eccitazione cardiaca richiede quindi che gli eventi ciclici nei due orologi siano allineati. L'interruzione di questo allineamento porta all'aritmia25. La relazione tra il rilascio spontaneo di calcio e la DAD è il meccanismo di innesco delle attività nell'insufficienza cardiaca 33. Tuttavia, la combinazione di coloranti deve essere selezionata con cura. La combinazione di RH-237/Rhod-2 o di-4-ANEPPS/Indo-1 consente la registrazione simultanea, mentre Fluo-3/4/di-4-ANEPPS porterà a errori dovuti alla sovrapposizione degli spettri di emissione di due coloranti30,34,35. Questo esperimento ha selezionato RH237 e Rhod-2 AM per caricare il cuore e ha acquisito una buona qualità di imaging.
Inoltre, la telecamera utilizzata in questo protocollo ha due superfici target, che le consentono di catturare i segnali divisi su un'interfaccia di campionamento e consente a una singola telecamera di rilevare due diverse lunghezze d'onda di emissione. Tale mappatura simultanea di AP e CaT ottici combinando vari protocolli di spettroscopia fotoelettronica (PES) ci permetterà di determinare l'interrelazione tra [Ca2+]i anormale e instabilità elettrica in condizioni di stress e l'effetto del potenziamento post-attivazione su queste anomalie. La natura spazialmente eterogenea del ciclo SR Ca2+ e come questo influenzi l'emersione, la gravità e la concordanza delle alternanze elettriche e il comportamento aritmogeno, come le alternanze spazialmente discordanti e le conseguenti TV, saranno studiate nel cuore intatto in diversi gruppi. Verranno esplorati gli alternani SR Ca 2+, la refrattarietà di RyR2 e il loro ruolo negli alternans SR Ca2+ e APD.
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Disclosures
Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo studio è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (81700308 a XO e 31871181 a ML e da 82270334 a XT), dal Programma di supporto alla scienza e alla tecnologia della provincia di Sichuan (CN) (da 2021YJ0206 a XO, 23ZYZYTS0433 e 2022YFS0607 a XT e da 2022NSFSC1602 a TC) e dal Laboratorio chiave statale per la chimica e l'ingegneria molecolare delle risorse medicinali (Guangxi Normal University) (da CMEMR2017-B08 a XO), MRC (G10031871181 a ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE a Oxford (ML) sovvenzioni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
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