Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

וסקולריזציה יעילה של אורגנואידים בכליות באמצעות השתלה אינטרסלומית בעוברי תרנגולות

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/65090
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2,4, 1,2,4
1Department of Internal Medicine - Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory of Vascular and Regenerative Medicine, Leiden University Medical Center, 3IBPS, CNRS UMR7622, Developmental Biology Laboratory, Sorbonne Université, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להשתלת אורגנואידים בכליות בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות. שיטה זו גורמת לכלי דם ולהבשלה משופרת של האורגנואידים תוך 8 ימים וניתן להשתמש בה כדי ללמוד תהליכים אלה בצורה יעילה.

Abstract

אורגנואידים בכליות שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מכילים מבנים דמויי נפרון הדומים במידה מסוימת לאלה שבכליה הבוגרת. למרבה הצער, היישום הקליני שלהם נפגע על ידי היעדר כלי דם תפקודי וכתוצאה מכך הבשלה מוגבלת במבחנה. השתלת אורגנואידים בכליות בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות גורמת לכלי דם מחוררים, כולל היווצרות נימים גלומרולריים, ומשפרת את התבגרותם. טכניקה זו יעילה מאוד, ומאפשרת השתלה וניתוח של מספר רב של אורגנואידים. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט להשתלה אטרקלומית של אורגנואידים בכליות בעוברי תרנגולות, ואחריו הזרקת לקטין מסומן פלואורסצנטית כדי להכתים את כלי הדם המחוררים, ואיסוף אורגנואידים מושתלים לניתוח הדמיה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לגרום ולחקור כלי דם אורגנואידים והתבגרות כדי למצוא רמזים לשיפור תהליכים אלה במבחנה ולשפר מודלים של מחלות.

Introduction

אורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC) הוכחו כבעלי פוטנציאל למחקרים התפתחותיים 1,2,3,4, בדיקת רעילות 5,6 ומידול מחלות5,7,8,9,10,11,12,13. עם זאת, תחולתם למטרות השתלה קלינית אלה ובסופו של דבר מוגבלת על ידי היעדר רשת כלי דם. במהלך התפתחות הכליות העובריות, פודוציטים, תאים מזנגיאליים ותאי אנדותל וסקולריים (ECs) מתקשרים כדי ליצור את המבנה המורכב של הגלומרולוס. ללא אינטראקציה זו, מחסום הסינון הגלומרולרי, המורכב מפודוציטים, קרום המרתף הגלומרולרי (GBM) ו- ECs, אינו יכול להתפתח כראוי14,15,16. למרות שאורגנואידים במבחנה בכליות מכילים כמה ECs, אלה אינם מצליחים ליצור רשת כלי דם תקינה ופוחתים עם הזמן17. לכן אין זה מפתיע שהאורגנואידים נותרים לא בשלים. השתלה בעכברים גורמת לכלי דם ולהבשלה של אורגנואידי הכליה 18,19,20,21. למרבה הצער, זהו תהליך עתיר עבודה שאינו מתאים לניתוח של מספר רב של אורגנואידים.

עוברי תרנגולות שימשו לחקר כלי דם והתפתחות במשך יותר ממאה שנה22. הם נגישים בקלות, דורשים תחזוקה נמוכה, חסרים מערכת חיסונית מתפקדת במלואה, ויכולים להתפתח באופן תקין לאחר פתיחת קליפת הביצה 23,24,25,26. השתלת אורגנואידים על הממברנה הכוריואלנטית שלהם (CAM) הוכחה כמובילה לכלי דם27. עם זאת, משך ההשתלה על CAM, כמו גם את רמת ההבשלה של השתל, מוגבלים על ידי היווצרות CAM, אשר לוקח עד יום 7 העוברי כדי להשלים. לכן, פותחה לאחרונה שיטה לכלי דם יעילים ולהבשיל אורגנואידים בכליה באמצעות השתלה אטרסלומית בעוברי תרנגולות28. החלל הצלומי של עוברי תרנגולות ידוע מאז שנות השלושים כסביבה נוחה להתמיינות רקמות עובריות29,30. ניתן לגשת אליו בשלב מוקדם של ההתפתחות העוברית ומאפשר הרחבה בלתי מוגבלת יחסית של השתל לכל הכיוונים.

מאמר זה מתאר פרוטוקול להשתלת אורגנואידים שמקורם בכליות hiPSC בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות ביום 4. שיטה זו גורמת לכלי דם ולהבשלה משופרת של האורגנואידים תוך 8 ימים. הזרקת עדשה בעלת תווית פלואורסצנטית culinaris agglutinin (LCA) לפני הקרבת העוברים מאפשרת הדמיה של כלי דם מחוררים בתוך האורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בהתאם לחוק ההולנדי, לא נדרש אישור של הוועדה לרווחת בעלי חיים למחקר זה.

1. הכנת אורגנואידים שמקורם בכליות hiPSC להשתלה

  1. להבדיל hiPSCs לאורגנואידים בכליות באמצעות הפרוטוקול שפותח על ידי Takasato et al.4,18,31. תרבית את האורגנואידים לפי פרוטוקול זה על תוספות תרבית תאי פוליאסטר עם נקבוביות 0.4 מיקרומטר (תוספות תרבית תאים) עד ליום 7 + 12 להתמיינות. כל תוספת תרבית תאים תכיל שלושה אורגנואידים.
  2. הסר את האורגנואידים מעלון תרבית התא.
    1. לעשות חור באמצע הקרום של תרבית התא להכניס עם זוג מלקחיים ניתוח. בעזרת מספריים מנתחים, לבצע שלושה חתכים בקרום מן החור באמצע לקצה של תרבית התא להחדיר, לחתוך בין אורגנואידים. התוצאה תהיה שלוש חתיכות של קרום, שלכל אחת מהן מחובר אורגנואיד אחד, שעדיין מחוברות לתרבית התא המוחדרת בקצה החיצוני שלהן.
    2. אחזו באחת מפיסות הקרום הקרובות לקצהו החיצוני בעזרת זוג מלקחיים וקרעו אותה מתרבית התא. מניחים את חתיכת הממברנה עם האורגנואיד המחובר בצלחת פטרי. הוסף כמה טיפות של מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS) ללא סידן ומגנזיום (DPBS-/-) לאורגנואיד כדי למנוע התייבשות. חזור על הפעולה עבור שני האורגנואידים האחרים.
  3. חתכו את האורגנואידים על ידי החזקת הממברנה שלהם במקומה עם מלקחיים וחתכו אותם לשניים עם סכין גילוח מפלדת אל-חלד בעלת קצה כפול (אורגנואיד שלם גדול מכדי שהסלום יוכל להכיל בשלב זה של ההתפתחות). דוחפים בעדינות את שני חצאי האורגנואידים מהממברנה עם דיסקטור דורה. יש להשליך את הממברנה ולהשאיר את האורגנואידים ב-DPBS-/- עד להשתלה.
    הערה: הכינו עד שלושה אורגנואידים בכל פעם להשתלה כדי למנוע לחץ על האורגנואידים לפני ההשתלה. באופן אידיאלי, אדם אחד מכין את האורגנואידים בעוד אחר מבצע את ההשתלה.

2. הכנת עוברי תרנגולות להשתלה

  1. לדגור על ביצי לגורן לבנות מופרות. התחל את הדגירה של הביציות ביום התמיינות אורגנואידים בכליות יום 7 + 8 כדי להבטיח את העיתוי הנכון של ההשתלה.
    1. הניחו את ביצי הרגל הלבנות המופרות (Gallus domesticus) בצורה אופקית על מחזיק (איור 1A; יום 0), סימון אמצע הצד הפונה כלפי מעלה בעיפרון.
      הערה: מחזיקי פלסטיק בהתאמה אישית או קרטוני ביצים יכולים לשמש כמחזיקים כדי לדגור על הביצים.
    2. הניחו את המחזיק עם הביצים באינקובטור לח בטמפרטורה של 38 ± 1 מעלות צלזיוס (איור 1A; יום 0).
    3. דוגרים על הביצים במשך 3 ימים, תוך שמירה על אגן המים באינקובטור מלא.
  2. צרו חלון בקליפת הביצה ביום השלישי של הדגירה.
    1. ביום השלישי של הדגירה, מניחים חתיכה קטנה (~ 1 ס"מ x 0.5 ס"מ) של סרט שקוף על הקצה המחודד של הביצה (קצה קטן). צור חור קטן בקליפת הביצה באמצע הסרט השקוף על ידי הקשה עליו עם הקצה החד של זוג מספריים מנתחים.
    2. הכניסו מחט 19 גרם על מזרק 5 מ"ל לתוך החור בזווית של 45 מעלות, כדי למנוע נזק לשק החלמון, ושאפו 2-3 מ"ל אלבומן מהביצה כדי להוריד את העובר בתוך הביצית. אטמו את החור בחתיכה שנייה (~ 1 ס"מ x 0.5 ס"מ) של סרט שקוף.
    3. מניחים חתיכה גדולה (~ 5 ס"מ x 5 ס"מ) של סרט שקוף על הצד המסומן בעיפרון ופונה כלפי מעלה של הביצה. צרו חור בקליפת הביצה במרכז הסרט השקוף על-ידי הקשה עליו עם הקצה החד של זוג מספריים מנתחים (איור 1A; יום 3).
    4. מתחילים מהחור הזה, חותכים חלון עגול קטן בקליפת הביצה באמצעות מספריים מנתחים מעוקלים. הסתכלו דרך החלון הזה כדי לאתר את העובר, ואז הגדילו את החלון כדי למטב את הגישה לעובר (איור 1A; יום 3).
    5. הסר חתיכות גדולות של קליפת ביצה שאולי נפלו על גבי העובר באמצעות מלקחיים. הסר חתיכות קטנות יותר על ידי הנחת כמה טיפות של DPBS עם סידן ומגנזיום (DPBS+/+) על העובר עם פיפטה העברת פלסטיק, ולאחר מכן שאיפה DPBS+/+ עם קליפת הביצה לתוך פיפטה.
    6. הוסף שלוש טיפות של DPBS+/+ בתוספת 0.5% פניצילין/סטרפטומיצין לביצה באמצעות פיפטה להעברת פלסטיק.
    7. אטמו בזהירות את החלון עם חתיכה גדולה (~ 5 ס"מ x 5 ס"מ) של סרט שקוף לפני החזרת הביצית לאינקובטור עד ליום 4 של הדגירה, כאשר העובר נמצא בשלב המבורגר-המילטון 23-24 (HH 23-24)32.
      הערה: איטום החלון חשוב מאוד כדי למנוע התייבשות ומוות של העובר.
    8. בדוק את העוברים מדי יום עבור קיימא על ידי הסתכלות עליהם דרך הסרט (לא להסיר את הסרט כדי למנוע התייבשות). במהלך הימים הראשונים של הדגירה, צבע חלמון הביצה משתנה מצהוב בהיר לצהוב מט עם מות העובר. השליכו עוברים שנפטרו.
    9. שמור על אגן המים באינקובטור מלא.

3. השתלה Intracelomic ביום 4 של הדגירה

  1. קבלת גישה לחלל הצלומי
    1. גזור את הקלטת מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקל.
    2. מניחים את הביצה תחת מיקרוסקופ נתיחה על מחזיק גומי או קרטון ביצים.
    3. עובר התרנגולת נמצא כעת ב-HH 23-24 ושוכב על צדו השמאלי, כשצדו הימני פונה אל הצופה (איור 1A; יום 4). אתר את הכנף הימנית ואת ניצן הרגל של העובר, כמו celom יהיה נגיש בין שני ניצני הגפיים האלה. באזור שבין הכנף הימנית לניצן הרגל, יוצרים פתח רציף בקרום הוויטליין, בכוריון ובמי השפיר, על ידי החזקתם בשני זוגות מלקחיים מנתחים ומשיכה עדינה שלהם לכיוונים מנוגדים.
      הערה: קרום ויטלין הוא הקרום הראשון שנתקלים בו לאחר פתיחת הביצית, ובמקרים מסוימים, כבר ניזוק לאחר ביצוע החלון ביום השלישי. אם מסובבים את העובר, שוכבים על צדו הימני כשצדו השמאלי פונה אל הצופה (איור 1A; יום 4), יש צורך להפוך אותו כדי לאפשר השתלה. כדי לעשות זאת, לעשות פתח גדול בקרום vitelline ו chorion, ולאחר מכן בזהירות להפוך את העובר סביב באמצעות מלקחיים.
    4. בדקו אם יש גישה ללא הפרעה לחלל הצלומי: אחזו בעדינות בקצה דופן הגוף שבין הכנף לניצן הגפה בעזרת זוג מלקחיים מנתחים ומשכו אותו מעט לכיוון הצופה. החלל הצלומי חייב להיות גלוי בבירור. הכניסו בזהירות מכשיר קהה אך דק (למשל, חוט טונגסטן קהה במחזיק מיקרואזמל) לתוך חלל הצלומי.
      הערה: אם החדרת המכשיר הקהה לחלל הצלומי אינה אפשרית, פירוש הדבר שאחד או יותר מהקרומים לא נפתחו כראוי.
  2. השתלת
    1. מניחים חצי אורגנואיד בתוך הביצה על גבי האלנטואי באמצעות דיסקטור דורה.
    2. בעזרת מלקחיים מנתחים, אחזו בזהירות בקצה דופן הגוף ומשכו אותו מעט לכיוון הצופה כדי להפוך את הפתח לסלום לגלוי.
      הערה: יש להימנע מפגיעה בכלי הדם בדופן הגוף.
    3. העבירו בעדינות את האורגנואיד לכיוון ודרך הפתח בדופן הגוף לתוך הסלום בעזרת חוט טונגסטן קהה במחזיק מיקרו-אזמל. דחפו את האורגנואיד מעט בצורה גולגולתית כדי לתקוע אותו בתוך הצלום. כעת הוא נראה ממש מאחורי ניצן הכנף (איור 1A; יום 4).
    4. הוסיפו שלוש טיפות של DPBS+/+ לביצה באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק.
    5. אטמו בזהירות את החלון עם חתיכה גדולה (~ 5 ס"מ x 5 ס"מ) של סרט שקוף לפני החזרת הביצה לאינקובטור עד ליום 12 של הדגירה (8 ימים לאחר ההשתלה).
    6. המשך לבדוק את העוברים מדי יום לקיום על ידי התבוננות בהם דרך הקלטת (אל תסיר את הסרט כדי למנוע התייבשות). השליכו עוברים שנפטרו.
      הערה: ככל שהעוברים והקרומים הכוריאואלנטיים שלהם גדלים, הם הופכים גלויים יותר דרך הקלטת. חוסר תנועה של העובר וכלי דם שקרסו או דלילים הם סימן למוות של העובר.
    7. בדוק את אגן המים באינקובטור מדי יום ושמור אותו מלא.

4. הזרקה של לקטין מסומן פלואורסצנטית

  1. הכנה להזרקה
    1. הפוך מחטי מיקרו-הזרקה מזכוכית על ידי משיכת מיקרו-נימי זכוכית במושך מיקרופיפטה עם ההגדרות הבאות: חום 533, משיכה 60, מהירות 150, זמן 200. תוך כדי התבוננות דרך המיקרוסקופ המנתח, שברו בזהירות את קצות מחטי המיקרו-הזרקה באמצעות מלקחיים מנתחים ליצירת פתח.
      הערה: ההגדרות הנדרשות עבור מושך מיקרופיפטה עשויות להשתנות בהתאם להתקן.
    2. להרכיב את מערכת ההזרקה. קחו שתי חתיכות של צינורות סיליקון בקוטר 38 ס"מ וחברו אותן זו לזו על ידי הצבת מסנן של 0.2 מיקרומטר ביניהן. הכנס פיה לקצה הצינור המחובר לשקע המסנן (צינור סיליקון 1), ומחבר לקצה הצינור המחובר לכניסת המסנן (צינור סיליקון 2). לבסוף, הכניסו את מחט המיקרו-הזרקה למחבר (איור 1B).
    3. לדלל את העדשה culinaris agglutinin (LCA) עם תווית פלואורסצנטית עם DPBS-/ - לריכוז של 2.5 מ"ג mL-1 בצינור 0.5 מ"ל ולהסתובב למטה במשך ~ 30 שניות במיקרוצנטריפוגה כדי להזיז את האגרגטים לתחתית הצינור.
    4. פיפטה 20 μL של LCA על חתיכת parafilm.
    5. שאפו את 20 μL של LCA מן parafilm לתוך מחט microcapillary של מערכת ההזרקה התאספו.
  2. זריקה
    1. גזור את הקלטת מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקל. מניחים את הביצה תחת מיקרוסקופ ניתוח במחזיק גומי.
    2. העריכו את כלי הדם ואתרו את הוורידים, שניתן להבדיל בינם לבין העורקים על-ידי צבעם האדום הבהיר מעט יותר (איור 1A; יום 12). כדי לשפר את הגישה לכלי הדם, הגדל בזהירות את החלון על ידי חיתוך עם מספריים ניתוח מעוקל. בחר וריד להזרקה על סמך נגישות וגודל.
    3. הכנס את קצה המחט המיקרוקפילרית לווריד שנבחר בזווית של 0°-20º. ודא שהמחט נמצאת בווריד על ידי הזזת הקצה בעדינות מצד לצד. נשפו בעדינות ובהתמדה לתוך מערכת ההזרקה כדי להזריק את ה-LCA (איור 1A; יום 12).
      הערה: אם המחט בווריד נמצאת במיקום הנכון, היא צריכה להישאר בגבולות הווריד.
    4. מחזירים את הביצה לאינקובטור למשך 10 דקות כדי לאפשר ל-LCA לזרום.
      הערה: אין צורך לאטום את הביצה עם סרט במהלך תקופה זו.

5. איסוף אורגנואידים מושתלים ביום ה-12 לדגירה

  1. הקרבת עובר התרנגולת
    1. מניחים את הביצה במחזיק גומי על הספסל. גזור את הקלטת מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקל. לאחר מכן, חותכים דרך הקרומים המקיפים את העובר עם מספריים מנתחים מעוקלים.
      הערה: מיקרוסקופ מנתח אינו נדרש לשלב זה.
    2. גרפו את העובר מהביצית עם כף מחוררת ומיד ערפו את ראשו של העובר באמצעות מספריים. מניחים את גוף העובר בצלוחית פטרי מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה.
  2. איתור ואיסוף אורגנואידים
    1. הניחו את העובר על גבו בצלוחית הפטרי ופרשו את איבריו.
    2. פתח בזהירות את דופן הבטן של העובר לאורך ציר האורך באמצעות מלקחיים.
    3. אתר את האורגנואיד בתוך העובר. האורגנואיד נקשר לרוב לאונה הימנית של הכבד, בקצה הקאודלי או ממש מתחת לכלוב הצלעות (איור 1A; יום 12). לכן מומלץ להתחיל בחיפוש במקומות אלה.
    4. ברגע שהאורגנואיד מאותר, הוציאו אותו מהעובר על ידי חיתוך סביבו עם מספריים מיקרו. הניחו את האורגנואיד ואת רקמת העוף המחוברת אליו באופן בלתי נמנע בצלוחית פטרי מתחת למיקרוסקופ המנתח. הסר כמה שיותר רקמת עוף עם סכין גילוח מפלדת אל-חלד בעלת קצה כפול.
    5. עבד את האורגנואיד בהתאם לניתוח הרצוי.

6. צביעה אימונופלואורסצנטית בהר שלם

  1. מניחים אורגנואיד מושתל בצלחת של 24 בארות ומקבעים ב-500 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-4°C למשך 24 שעות. לשטוף 3x עם DPBS-/-.
  2. חדרו וחסמו את האורגנואיד ב-300 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת (0.3% טריטון-X ב-DPBS-/- המכיל 10% נסיוב חמורים) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  3. הכינו את תערובת הנוגדנים הראשונית: עבור אורגנואיד אחד, לדלל נוגדנים ראשוניים NPHS1 (כבש-α-אדם, דילול של 1:100), CD31 (עכבר-α-אדם, דילול של 1:100), ו-LTL (ביוטין-מצומד, דילול של 1:300) ב-300 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת. מוסיפים את תערובת הנוגדנים לאורגנואיד ודגרים במשך 72 שעות ב-4°C.
  4. יש לשטוף 3x עם 0.3% TritonX ב-DPBS-/-.
  5. הכינו את תערובת הנוגדנים המשנית: עבור אורגנואיד אחד, לדלל נוגדנים משניים חמור-α-כבש Alexa Fluor 647 (דילול של 1:500), חמור-α-עכבר Alexa Fluor 488 (דילול של 1:500), ו streptavidin Alexa Fluor 405 (דילול של 1:200) ב 300 μL של פתרון חוסם. מוסיפים את תערובת הנוגדנים המשנית לאורגנואיד ודגרים במשך 2-4 שעות בטמפרטורת החדר. יש לכסות ברדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה של הנוגדנים המשניים לאור.
  6. לשטוף 3x עם DPBS-/-.
  7. הטמע את האורגנואיד ב~30 μL של אמצעי הרכבה בצלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ ואפשר להתייבש לילה בטמפרטורת החדר, מכוסה ברדיד אלומיניום. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  8. תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השיטה וציר הזמן להבחנה של hiPSCs לאורגנואידים בכליות, דגירה של ביצי תרנגולות מופרות, השתלת אורגנואידים בכליות, הזרקת LCA ואיסוף האורגנואידים מסוכמים באיור 1A. חשוב לתאם את עיתוי התמיינות האורגנואידים והדגירה של ביצי תרנגולת, ולהתחיל את ההתמיינות 15 יום לפני הדגירה. הפעולות ביום 0, 3, 4 ו-12 של הדגירה מודגמות על ידי תמונות מתחת לציר הזמן. אורגנואידים מושתלים ביום 7 + 12 של התמיינות ליום 4 (HH 23-24) עוברי תרנגולות. LCA מוזרק למערכת הוורידית של העובר 8 ימים לאחר ההשתלה כדי להכתים את כלי הדם המחוררים, לפני הקרבת העובר ושליפת האורגנואיד. מערכת ההזרקה שהורכבה מוצגת באיור 1B.

עוברי תרנגולות מוקרבים ביום הדגירה ה-12 (איור 1A). לאחר דיסקציה זהירה של העובר, ניתן למצוא בדרך כלל את האורגנואיד המושתל מחובר לכבד. במבט דרך מיקרוסקופ דיסקציה הוא נראה כלי דם (איור 1A; יום 12; שלב 5.2.3). הדמיה קונפוקלית של אורגנואידים מושתלים שהוזרקו עם LCA ומוכתמים עבור מבני נפרון ותאי EC אנושיים מאשרת כלי דם מחוררים (איור 2A), שגם הם פולשים למבנים גלומרולריים (איור 2B). כלי הדם הם כימריים: ניתן להבחין בין ECs אנושיים מחוררים (CD31+, LCA+), ECs אנושיים לא מחוררים (CD31+, LCA-), ו-ECs שמקורם בעוף מחורר (CD31-, LCA+) (איור 2A, לוחות III, IV, V).

Figure 1
איור 1: שיטת השתלה אינטרטלומית . (A) ציר הזמן של התמיינות של hiPSCs לאורגנואידים בכליות, דגירה של ביצי תרנגולות מופרות והשתלה אינטרטלומית של אורגנואידים בכליות. התמיינות של hiPSCs לאורגנואידים בכליות מתחילה 15 יום לפני תחילת הדגירה של ביצי התרנגולת (יום התמיינות 0 = יום הדגירה -15) כדי לאפשר השתלת אורגנואידים של הכליה ביום 7 + 12 של התמיינות בעוברי תרנגולות ביום 4 של הדגירה. ימי הדגירה: יום 0: ביצי תרנגולות מופרות ממוקמות אופקית על המחזיקים (שלב 2.1.1), אשר ממוקמות באינקובטור בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס ± 1 מעלות צלזיוס (שלב פרוטוקול 2.1.2). יום 3: בכל ביצה נוצר חלון על ידי יצירת חור קטן בצד הפונה כלפי מעלה של הביצה עם קצה חד של זוג מספריים מנתחים מעוקלים (שלב 2.2.3) וחיתוך חלון עגול החל מחור זה (שלב 2.2.4). החלון נאטם בסרט שקוף לפני החזרת הביצה לאינקובטור. יום 4: השתלה אינטרסלומית של אורגנואידים בכליה ביום 7 + 12 של התמיינות מבוצעת. העובר נמצא ב- HH 23-24 ושוכב על צדו השמאלי, כאשר צדו הימני פונה לצופה (שלב 3.1.3). בין ניצן הכנף לניצן הרגל, נוצר פתח בקרום ויטלין, כוריון ומי שפיר כדי לקבל גישה לחלל הצלומי, והאורגנואיד מוחדר דרך פתחים אלה לתוך הצלום. לאחר ההשתלה, האורגנואיד נראה כמבנה לבן הממוקם ממש מאחורי ניצן הכנף. ניתן לראות את קצוות קרומי הוויטל ומי השפיר הפתוחים (שלבים 3.2.3 ו-3.2.3-זום). במקרים מסוימים, העוברים מסובבים, שוכבים על צד ימין במקום שמאל (3.1.3 הערה), ויש להפוך אותם לפני ההשתלה. יום 12: לקטין המסומן פלואורסצנטית מוזרק לווריד. ורידים נבדלים מן העורקים על ידי צבעם; הדם בוורידים עשיר בחמצן, מגיע מה- CAM, ולכן הם אדומים מעט בהירים יותר מהעורקים שמגיעים מהעובר (שלבים 4.2.2., 4.2.2-זום ו- 4.2.3). העובר מוקרב והאורגנואיד מוחזר. האורגנואיד (המעוגל) נקשר לכבד העוף ונראה שהוא וסקולרי (שלב 5.2.3). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. התמונה הסכמטית המתארת את תמונת ההשתלה האינטרסלומית בלוח העליון הודפסה מחדש באישור Koning et al.28. (B) תמונה של מערכת ההזרקה שהורכבה, המורכבת מפה, שתי חתיכות של צינורות סיליקון בקוטר 38 ס"מ, מסנן 0.2 מיקרומטר, מחבר ומחט מיקרו-הזרקה מזכוכית שנוצרה על ידי משיכת מיקרו-נימי זכוכית במושך מיקרופיפטה. קיצורים: A = allantois; Am = מי שפיר; C = celom; CC = קרום כוריון חתוך; CHIR = CHIR99021; FGF9 = גורם גדילה פיברובלסט 9; hiPSCs = תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם; IM = מזודרם ביניים; Lb = ניצן רגל; O = אורגנואיד; PS = פס פרימיטיבי; U = טבעת הטבור; V = קרום ויטלין; Wb = ניצן כנף; Y = גבעול חלמון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אורגנואידים מושתלים של כליה וסקולרית. (A) תמונות אימונופלואורסצנטיות של (I) אורגנואיד כליה לא מושתל ו-(II) אורגנואיד כליה מושתל. בשני התנאים, מבנים גלומרולריים (NPHS1+, ציאן) וצינוריים (LTL+, צהוב) גלויים. באורגנואידים שלא הושתלו, קיימים כמה ECs אנושיים (CD31+, ירוק). באורגנואיד המושתל נראית רשת כלי דם מחוררת (CD31+, ירוק; מוזרק רודמין המסומן LCA+, לבן) בכל האורגנואיד. בלוחות III, IV ו-V מוצגות הגדלות של האזורים הארוזים בלוח II, כדי להדגים את שלושת סוגי ה-ECs שניתן להבחין בהם באורגנואידים מושתלים. לוח III מכיל ECs אנושיים מחוררים (CD31+, LCA+), המסומנים בראשי חץ. לוח IV מכיל ECs אנושיים לא מחוררים (CD31+, LCA-), המסומנים בראשי חץ. לוח V מכיל ECs שמקורם בעוף (CD31-, LCA+), המסומנים בראשי חץ. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) באורגנואידים לא מושתלים (I), ECs (CD31+, ירוק) מקיפים מבנים גלומרולריים (NPHS1+, ציאן) אך אינם פולשים אליהם. באורגנואידים מושתלים (II), מבנים גלומרולריים (NPHS1+, כחול) הם כלי דם על ידי נימים מחוררים (LCA+, לבן; CD31+, ירוק). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בכתב יד זה מודגם פרוטוקול להשתלה אינטרטלומית של אורגנואידים שמקורם ב-hiPSC בעוברי תרנגולות. עם ההשתלה, אורגנואידים הם כלי דם על ידי כלי דם מחוררים המורכבים משילוב של ECs שמקורם באורגנואידים אנושיים ומקורם בעוף. אלה מפוזרים ברחבי האורגנואיד ופולשים למבנים הגלומרולריים, ומאפשרים אינטראקציה בין ECs ופודוציטים. בעבר הוכח כי זה מוביל להבשלה משופרת של מבנים גלומרולריים וצינוריים אורגנואידים28. ההשתלה יעילה מאוד, אורכת ~5 דקות לעובר, והתחזוקה היחידה שהעוברים דורשים היא מילוי קבוע של אגן המים באינקובטור. שיטה זו מתאימה מאוד לניתוח של מספר רב של אורגנואידים.

וסקולריזציה והבשלה של אורגנואידים בכליות הודגמו בעבר באמצעות השתלה בעכברים 18,20. במודלים אלה של עכברים עתירי עבודה, אורגנואידים הושתלו במשך 2 עד 12 שבועות. בניסויי ההשתלה האינטרטלומיים המוצגים כאן, משך ההשתלה הוגבל ל-8 ימים. זה מאפשר להקריב את העוברים לפני היום ה -13 של הדגירה, כאשר הם נחשבים להתחיל לחוות כאב33,34. מכיוון שעוברי תרנגולות בוקעים ביום ה-21, ניתן להאריך את משך ההשתלה ל-15 יום, ולהקריב את העוברים ביום ה-19 כדי למנוע בקיעה. עם זאת, הדבר יחייב שימוש בחומרי הרדמה. למרות משך ההשתלה הקצר יחסית במודל זה, הוא גורם לכלי דם נרחבים ולהבשלה משמעותית של נפרונים אורגנואידים בהשוואה לאורגנואידים במבחנה, כולל היווצרות GBM בין פודוציטים אורגנואידים לבין ECs28 הפולש.

בעת ביצוע ניסויי השתלה אינטרטלומיים, חשוב לקחת בחשבון שלא כל עוברי התרנגולות מתפתחים באופן תקין ושורדים. בדרך כלל, ~65% מהעוברים שהונחו באינקובטור ביום 0 מגיעים לנקודת הסיום של הניסוי. זאת בשל שילוב של דימום חריף הנגרם מנזק לכלי הדם במהלך ההשתלה (5%-10% בידינו) והלחץ הנגרם על ידי הליכי החלונות וההשתלה. כאשר עוברים נמצאים בשלב מוקדם או מאוחר יותר מאשר HH 23-24, ההשתלה הופכת מסובכת עקב שטח מוגבל וכלי דם נרחבים יותר, בהתאמה. אם העוברים אינם בשלב הנכון בזמן הצפוי, זה יכול להיות בגלל הטמפרטורה של הדגירה, כמו טמפרטורה גבוהה יותר בדרך כלל מוביל להתפתחות מהירה יותר.

יתר על כן, שמירה על ביציות מופרות בטמפרטורת החדר לתקופה ממושכת לפני הדגירה גורמת לשונות רבה יותר בהתפתחות. כדי למנוע זאת, יש לשמור על טמפרטורת האינקובטור יציבה לאורך ובין הניסויים, ויש להתחיל את הדגירה תוך 3 ימים לאחר מסירת הביציות המופרות. אחוזים גבוהים באופן בלתי צפוי של מוות עובר בין הליכים יכולים להיגרם על ידי התייבשות. כדי למנוע זאת, חיוני להוסיף שתיים או שלוש טיפות של DPBS + / + לכל ביצה לאחר פתיחתה ולאחר ההשתלה ולאטום את הביצה בזהירות רבה עם קלטת, להחליק קמטים בקלטת ככל האפשר. שילוב שלבי החלון וההשתלה כדי להפחית את מספר הפעמים שהביציות נפתחות אינו מומלץ, שכן חלון ביום 4 מגדיל משמעותית את תמותת העוברים. זוהי תוצאה של נזק לכלי דם שהוצמדו לעיתים קרובות לקליפת הביצה בשלב זה.

לסיכום, שיטה זו מספקת כלי יעיל ורב עוצמה להשראת כלי דם ולשיפור ההבשלה באורגנואידים בכליות. זה יכול לשמש כדי ללמוד תהליכים אלה במספר רב של אורגנואידים ויש לו פוטנציאל מודלים של מחלות כליות הדורשות רמה גבוהה יותר של התבגרות מאשר ניתן לרכוש כיום במבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לג'ורג' גאלריס (LUMC, ליידן, הולנד) על עזרתו בהזרקת עובר תרנגולת. אנו מודים על תמיכתם של ססקיה ואן דר וול-מאס (המחלקה לאנטומיה ואמבריולוגיה, LUMC, ליידן, הולנד), קוני ואן מינסטרן (המחלקה לאנטומיה ואמבריולוגיה, LUMC, ליידן, הולנד), מאנון זורמונד (LUMC, ליידן, הולנד) ואנמארי דה גראף (LUMC, ליידן, הולנד). M. Koning נתמך על ידי 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן אוניברסיטת ליידן "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. עבודה זו נתמכת על ידי השותפים של רפואה רגנרטיבית חוצה גבולות (RegMedXB) ובריאות הולנד, מגזר עליון, מדעי החיים ובריאות. C.W. van den Berg ו- T.J. Rabelink נתמכים על ידי מרכז קרן נובו נורדיסק לרפואת תאי גזע (reNEW), מרכז קרן נובו נורדיסק לרפואת תאי גזע נתמך על ידי מענקי קרן נובו נורדיסק (NNF21CC0073729).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm Whatman 10462200
35 mm glass bottom dishes  MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177-5EA Contains silicone tubes, mouth piece and connector
Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope  Leica TCS SP8
Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips Hammacher Karl HAMMHTC091-10
Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips Hammacher Karl HAMMHTC090-11
Dissecting microscope  Wild Heerbrugg 355110
Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp Hammacher Karl HAMMHSB391-10
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-212-02 dilution 1:500
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 ThermoFisher Scientific A-21448 dilution 1:500
Double edged stainless steel razor blades Electron Microsopy Sciences 72000
DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) ThermoFisher Scientific 14040133
DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) ThermoFisher Scientific 14190094
Egg cartons or custom made egg holders  NA NA
Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)  Drost Loosdrecht B.V. NA
Incubator Elbanton BV ET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated Vector Laboratories B-1325 dilution 1:300
Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm Hammacher Karl HAMMHSB500-09
Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament World Precision Instruments TW150F-3
Micropipette puller Sutter Instrument Company Model P-97 We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. Euronexia L-120
Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant  ThermoFisher Scientific P36930
Olivecrona dura dissector 18 cm  Reda 41146-18
Parafilm  Heathrow Scientific HS234526B
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL ThermoFisher Scientific 15070063
Perforated spoon  Euronexia S-20-P
Petri dish 60 x 15 mm  CELLSTAR 628160
Plastic transfer pipettes  ThermoFisher Scientific PP89SB
Purified mouse anti-human CD31 antibody BD Biosciences 555444 dilution 1:100
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) Vector Laboratories RL-1042 This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)
Sheep anti-human NPHS1 antibody R&D systems AF4269 dilution 1:100
Sterile hypodermic needles, 19 G BD microlance 301500
Streptavidin Alexa Fluor 405 ThermoFisher Scientific S32351 dilution 1:200
Syringe 5 mL BD Emerald 307731
Transparent tape  Tesa 4124 Available at most hardware stores
Triton X Sigma-Aldrich T9284
Tungsten wire, 0.25 mm dia  ThermoFisher Scientific 010404.H2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
  2. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  3. Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
  4. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  5. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
  6. Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
  7. Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
  8. Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
  9. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
  10. Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
  11. Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
  12. Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
  13. Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
  14. Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
  15. Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
  16. Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
  17. Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
  18. vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
  19. Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
  20. Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
  21. vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
  22. Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
  23. Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
  24. Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
  25. Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
  26. Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
  27. Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
  28. Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
  29. Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
  30. Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
  31. Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
  32. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  33. Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
  34. ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , Available from: https://www.cpp.edu/research/research-compliance/iacuc/docs/iacuc-guidelines-on-euthanasia-of-chicken-and-embryos.pdf (2012).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 192
וסקולריזציה יעילה של אורגנואידים בכליות באמצעות השתלה אינטרסלומית בעוברי תרנגולות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koning, M., Lievers, E., Jaffredo,… More

Koning, M., Lievers, E., Jaffredo, T., van den Berg, C. W., Rabelink, T. J. Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (192), e65090, doi:10.3791/65090 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter