Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Transplantation von Nierenorganoiden in die Zölomhöhle von Hühnerembryonen vor. Diese Methode induziert eine Vaskularisierung und eine verbesserte Reifung der Organoide innerhalb von 8 Tagen und kann verwendet werden, um diese Prozesse auf effiziente Weise zu untersuchen.
Abstract
Nierenorganoide, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, enthalten nephronähnliche Strukturen, die denen in der erwachsenen Niere bis zu einem gewissen Grad ähneln. Leider wird ihre klinische Anwendbarkeit durch das Fehlen eines funktionellen Gefäßsystems und die daraus resultierende eingeschränkte Reifung in vitro erschwert. Die Transplantation von Nierenorganoiden in die Zölomhöhle von Hühnerembryonen induziert die Vaskularisierung durch perfundierte Blutgefäße, einschließlich der Bildung glomerulärer Kapillaren, und fördert deren Reifung. Diese Technik ist sehr effizient und ermöglicht die Transplantation und Analyse einer großen Anzahl von Organoiden. Diese Arbeit beschreibt ein detailliertes Protokoll für die intracelome Transplantation von Nierenorganoiden in Hühnerembryonen, gefolgt von der Injektion von fluoreszenzmarkiertem Lektin zur Färbung des perfundierten Gefäßsystems und der Entnahme von transplantierten Organoiden für die bildgebende Analyse. Diese Methode kann verwendet werden, um die Organoid-Vaskularisierung und -Reifung zu induzieren und zu untersuchen, um Hinweise zur Verbesserung dieser Prozesse in vitro zu finden und die Krankheitsmodellierung zu verbessern.
Introduction
Es hat sich gezeigt, dass aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) gewonnenen Nierenorganoiden Potenzial für Entwicklungsstudien 1,2,3,4, Toxizitätsscreening 5,6 und Krankheitsmodellierung5,7,8,9,10,11,12,13 haben. Ihre Anwendbarkeit für diese und spätere klinische Transplantationszwecke ist jedoch durch das Fehlen eines vaskulären Netzwerks eingeschränkt. Während der embryonalen Nierenentwicklung interagieren Podozyten, Mesangialzellen und vaskuläre Endothelzellen (ECs), um die komplizierte Struktur des Glomerulus zu bilden. Ohne diese Wechselwirkung kann sich die glomeruläre Filtrationsbarriere, bestehend aus Podozyten, der glomerulären Basalmembran (GBM) und ECs, nicht richtig entwickeln14,15,16. Obwohl Nierenorganoide in vitro einige ECs enthalten, bilden diese kein richtiges Gefäßnetzwerk und nehmen mit der Zeit ab17. Es ist daher nicht verwunderlich, dass die Organoide unreif bleiben. Die Transplantation in Mäusen induziert eine Vaskularisierung und Reifung der Nierenorganoide 18,19,20,21. Leider ist dies ein arbeitsintensiver Prozess, der für die Analyse einer großen Anzahl von Organoiden ungeeignet ist.
Hühnerembryonen werden seit über einem Jahrhundert verwendet, um die Vaskularisierung und Entwicklung zu untersuchen22. Sie sind leicht zugänglich, wartungsarm, verfügen nicht über ein voll funktionsfähiges Immunsystem und können sich nach dem Öffnen der Eierschale normal entwickeln23,24,25,26. Es konnte gezeigt werden, dass die Transplantation von Organoiden auf deren chorioallantoische Membran (CAM) zu einer Vaskularisation führt27. Die Dauer der Transplantation auf dem CAM sowie der Reifegrad des Transplantats sind jedoch durch die CAM-Bildung begrenzt, die bis zum 7. Embryonaltag dauert. Daher wurde kürzlich eine Methode entwickelt, um Nierenorganoide durch intracelome Transplantation in Hühnerembryonen effizient zu vaskularisieren und reifenzu lassen 28. Seit den 1930er Jahren ist bekannt, dass die Zölomhöhle von Hühnerembryonen eine günstige Umgebung für die Differenzierung von embryonalem Gewebedarstellt 29,30. Es ist früh in der Embryonalentwicklung zugänglich und ermöglicht eine relativ unbegrenzte Ausdehnung des Transplantats in alle Richtungen.
In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden in die Zölomhöhle von Tag-4-Hühnerembryonen beschrieben. Diese Methode induziert eine Vaskularisierung und eine verbesserte Reifung der Organoide innerhalb von 8 Tagen. Die Injektion von fluoreszenzmarkiertem Lens culinaris Agglutinin (LCA) vor der Opferung der Embryonen ermöglicht die Visualisierung von perfundierten Blutgefäßen in den Organoiden durch konfokale Mikroskopie.
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Protocol
Nach niederländischem Recht war für diese Forschung keine Genehmigung durch den Tierschutzausschuss erforderlich.
1. Vorbereitung von hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden für die Transplantation
- Unterscheidung von hiPS-Zellen zu Nierenorganoiden unter Verwendung des von Takasato et al.4,18,31 entwickelten Protokolls. Kultivieren Sie die Organoide nach diesem Protokoll auf Polyester-Zellkultureinsätzen mit 0,4 μm Poren (Zellkultureinsätze) bis zum Tag 7 + 12 der Differenzierung. Jeder Zellkultureinsatz enthält drei Organoide.
- Entfernen Sie die Organoide aus dem Zellkultureinsatz.
- Machen Sie mit einer Präparierzange ein Loch in die Mitte der Membran des Zellkultureinsatzes. Machen Sie mit einer Präparierschere drei Schnitte in die Membran vom Loch in der Mitte bis zum Rand des Zellkultureinsatzes und schneiden Sie zwischen den Organoiden. So entstehen drei Membranstücke mit je einem Organoid, die an ihrem äußeren Rand noch mit dem Zellkultureinsatz verbunden sind.
- Fassen Sie eines der Membranstücke in der Nähe des äußeren Randes mit einer Pinzette und reißen Sie es vom Zellkultureinsatz ab. Legen Sie das Stück Membran mit dem angehängten Organoid in eine Petrischale. Geben Sie ein paar Tropfen der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco ohne Kalzium und Magnesium (DPBS-/-) in das Organoid, um eine Austrocknung zu vermeiden. Wiederholen Sie dies für die anderen beiden Organoide.
- Halbieren Sie die Organoide, indem Sie ihre Membran mit einer Pinzette festhalten und sie mit einer zweischneidigen Rasierklinge aus rostfreiem Stahl in zwei Hälften schneiden (ein ganzes Organoid ist zu groß, als dass das Celom es in diesem Entwicklungsstadium aufnehmen könnte). Drücken Sie die beiden Organoidhälften vorsichtig mit einem Dura-Dissektor von der Membran ab. Die Membran wird verworfen und die Organoide bis zur Transplantation in DPBS-/- belassen.
HINWEIS: Bereiten Sie maximal drei Organoide gleichzeitig für die Transplantation vor, um Stress für die Organoide vor der Transplantation zu vermeiden. Im Idealfall bereitet eine Person die Organoide vor, während eine andere die Transplantation durchführt.
2. Vorbereitung von Hühnerembryonen für die Transplantation
- Befruchtete weiße Leghorn-Eier ausbrüten. Beginnen Sie mit der Inkubation der Eizellen am Tag 7 + 8 der Nierenorganoid-Differenzierung, um den richtigen Zeitpunkt der Transplantation zu gewährleisten.
- Legen Sie die befruchteten weißen Leghorn-Eier (Gallus domesticus) waagerecht auf einen Halter (Abbildung 1A; Tag 0), markieren Sie mit einem Bleistift die Mitte der nach oben gerichteten Seite.
Anmerkungen: Als Halter für die Bebrütung der Eier können entweder maßgefertigte Kunststoffhalter oder Eierkartons verwendet werden. - Stellen Sie den Halter mit den Eiern in einen befeuchteten Inkubator bei 38 ± 1 ºC (Abbildung 1A; Tag 0).
- Bebrüten Sie die Eier 3 Tage lang und halten Sie das Wasserbecken im Inkubator gefüllt.
- Legen Sie die befruchteten weißen Leghorn-Eier (Gallus domesticus) waagerecht auf einen Halter (Abbildung 1A; Tag 0), markieren Sie mit einem Bleistift die Mitte der nach oben gerichteten Seite.
- Erstellen Sie an Tag 3 der Inkubation ein Fenster in der Eierschale.
- Legen Sie am 3. Tag der Inkubation ein kleines Stück (~1 cm x 0,5 cm) transparentes Klebeband auf die spitze Spitze des Eies (kleines Ende). Machen Sie ein kleines Loch in die Eierschale in der Mitte des transparenten Klebebandes, indem Sie mit dem scharfen Ende einer Sezierschere darauf klopfen.
- Führen Sie eine 19-G-Nadel mit einer 5-ml-Spritze in einem Winkel von 45° in das Loch ein, um eine Beschädigung des Dottersacks zu vermeiden, und saugen Sie 2-3 ml Eiweiß aus der Eizelle ab, um den Embryo in die Eizelle zu senken. Verschließen Sie das Loch mit einem zweiten Stück (~1 cm x 0,5 cm) transparentem Klebeband.
- Lege ein großes Stück (~5 cm x 5 cm) transparentes Klebeband auf die mit Bleistift markierte, nach oben zeigende Seite des Eies. Machen Sie ein Loch in die Eierschale in der Mitte des transparenten Klebebandes, indem Sie mit dem scharfen Ende einer Sezierschere darauf klopfen (Abbildung 1A; Tag 3).
- Schneiden Sie von diesem Loch aus mit einer gebogenen Präparierschere ein kleines kreisförmiges Fenster in die Eierschale. Schauen Sie durch dieses Fenster, um den Embryo zu lokalisieren, und vergrößern Sie dann das Fenster, um den Zugang zum Embryo zu optimieren (Abbildung 1A; Tag 3).
- Entfernen Sie alle großen Stücke der Eierschale, die möglicherweise auf den Embryo gefallen sind, mit einer Pinzette. Entfernen Sie kleinere Stücke, indem Sie einige Tropfen DPBS mit Kalzium und Magnesium (DPBS+/+) mit einer Kunststofftransferpipette auf den Embryo geben und dann das DPBS+/+ mit der Eierschale in die Pipette aspirieren.
- Geben Sie drei Tropfen DPBS+/+ , ergänzt mit 0,5 % Penicillin/Streptomycin, mit einer Plastikpipette in die Eizelle.
- Verschließen Sie das Fenster vorsichtig mit einem großen Stück (~5 cm x 5 cm) transparentem Klebeband, bevor Sie das Ei bis zum 4. Tag der Inkubation wieder in den Inkubator legen, wenn sich der Embryo im Hamburger-Hamilton-Stadium 23-24 (HH 23-24)32 befindet.
HINWEIS: Das Versiegeln des Fensters ist sehr wichtig, um eine Austrocknung und den Tod des Embryos zu vermeiden. - Überprüfen Sie die Embryonen täglich auf Lebensfähigkeit, indem Sie sie durch das Klebeband betrachten (entfernen Sie das Klebeband nicht, um eine Austrocknung zu vermeiden). Während dieser ersten Tage der Inkubation ändert sich die Farbe des Eigelbs nach dem Tod des Embryos von hellgelb zu mattgelb. Entsorgen Sie verstorbene Embryonen.
- Halten Sie das Wasserbecken im Inkubator gefüllt.
3. Intracelomische Transplantation am 4. Tag der Inkubation
- Zugang zum Zölom-Hohlraum
- Schneiden Sie das Klebeband mit einer gebogenen Präparierschere vom Fenster ab.
- Legen Sie das Ei unter ein Seziermikroskop auf einen Gummihalter oder Eierkarton.
- Der Hühnerembryo befindet sich nun in HH 23-24 und liegt auf der linken Seite, wobei die rechte Seite dem Betrachter zugewandt ist (Abbildung 1A; Tag 4). Suchen Sie den rechten Flügel und die Beinknospe des Embryos, da das Celom zwischen diesen beiden Gliedmaßenknospen zugänglich ist. Schaffen Sie im Bereich zwischen rechtem Flügel und Beinknospe nacheinander eine Öffnung in der Vitellinmembran, dem Chorion und dem Amnion, indem Sie sie mit zwei Paaren Präparierzangen halten und vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen ziehen.
Anmerkungen: Die Vitellin-Membran ist die erste Membran, die nach dem Öffnen des Eies auftritt, und in einigen Fällen ist sie bereits nach dem Herstellen des Fensters am 3. Tag beschädigt. Wenn der Embryo gedreht wird, liegt er auf der rechten Seite und zeigt mit der linken Seite dem Betrachter zu (Abbildung 1A; Tag 4), ist es notwendig, es umzudrehen, um eine Transplantation zu ermöglichen. Machen Sie dazu eine große Öffnung in die Vitellin- und Chorionmembran und drehen Sie den Embryo vorsichtig mit einer Pinzette um. - Prüfen Sie, ob ein ungehinderter Zugang zur Zölomhöhle besteht: Fassen Sie den Rand der Körperwand zwischen Flügel und Gliedmaßenknospe vorsichtig mit einer Präparierzange und ziehen Sie sie leicht in Richtung des Betrachters. Der Zölomhohlraum muss deutlich sichtbar sein. Führen Sie vorsichtig ein stumpfes, aber schlankes Instrument (z. B. einen stumpfen Wolframdraht in einem Mikroskalpellhalter) in die Zölomhöhle ein.
HINWEIS: Wenn das stumpfe Instrument nicht in die Zölomhöhle eingeführt werden kann, bedeutet dies, dass eine oder mehrere der Membranen nicht richtig geöffnet wurden.
- Transplantation
- Legen Sie ein halbes Organoid in das Ei auf die Allantois mit einem Dura-Dissektor.
- Fassen Sie mit einer Präparierzange vorsichtig den Rand der Körperwand und ziehen Sie ihn leicht in Richtung des Betrachters, um die Öffnung zum Celom sichtbar zu machen.
Anmerkungen: Vermeiden Sie es, die Blutgefäße in der Körperwand zu beschädigen. - Bewegen Sie das Organoid vorsichtig in Richtung und durch die Öffnung in der Körperwand in das Celom mit einem stumpfen Wolframdraht in einem Mikroskalpellhalter. Drücken Sie das Organoid leicht nach kranial, um es im Celom zu verankern. Er ist nun direkt hinter der Flügelknospe sichtbar (Abbildung 1A; Tag 4).
- Geben Sie drei Tropfen DPBS+/+ mit einer Transferpipette aus Kunststoff in das Ei.
- Verschließen Sie das Fenster vorsichtig mit einem großen Stück (~5 cm x 5 cm) transparentem Klebeband, bevor Sie die Eizelle bis zum 12. Tag der Inkubation (8 Tage nach der Transplantation) wieder in den Inkubator legen.
- Kontrollieren Sie die Embryonen täglich auf Lebensfähigkeit, indem Sie sie durch das Klebeband betrachten (entfernen Sie das Klebeband nicht, um eine Austrocknung zu vermeiden). Entsorgen Sie verstorbene Embryonen.
HINWEIS: Wenn die Embryonen und ihre Chorioallantoismembranen wachsen, werden sie durch das Klebeband deutlicher sichtbar. Mangelnde Bewegung des Embryos und kollabierte oder spärliche Blutgefäße sind ein Zeichen für den Tod des Embryos. - Überprüfen Sie das Wasserbecken im Inkubator täglich und halten Sie es gefüllt.
4. Injektion von fluoreszenzmarkiertem Lektin
- Vorbereitung der Injektion
- Stellen Sie Mikroinjektionsnadeln aus Glas her, indem Sie Glasmikrokapillaren in einem Mikropipettenzieher mit den folgenden Einstellungen ziehen: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200. Während Sie durch das Präpariermikroskop schauen, brechen Sie die Spitzen vorsichtig mit einer Präparierzange von den Mikroinjektionsnadeln ab, um eine Öffnung zu schaffen.
Anmerkungen: Die erforderlichen Einstellungen für den Mikropipettenabzieher können je nach Gerät unterschiedlich sein. - Montieren Sie das Einspritzsystem. Nehmen Sie zwei Stücke 38 cm Silikonschlauch und verbinden Sie sie miteinander, indem Sie einen 0,2 μm Filter dazwischen legen. Führen Sie ein Mundstück in das Ende des Schlauchs ein, der mit dem Filterauslass (Silikonschlauch 1) verbunden ist, und einen Anschluss in das Ende des Schlauchs, der mit dem Filtereinlass (Silikonschlauch 2) verbunden ist. Führen Sie abschließend die Mikroinjektionsnadel in den Konnektor ein (Abbildung 1B).
- Fluoreszenzmarkiertes Linsen-culinaris-Agglutinin (LCA) mit DPBS-/- auf eine Konzentration von 2,5 mg ml-1 in einem 0,5-ml-Röhrchen verdünnen und für ~30 s in einer Mikrozentrifuge herunterschleudern, um die Aggregate zum Boden des Röhrchens zu bewegen.
- Pipettieren Sie 20 μl LCA auf ein Stück Parafilm.
- Saugen Sie die 20 μl LCA aus dem Parafilm in die Mikrokapillarnadel des zusammengebauten Injektionssystems ab.
- Stellen Sie Mikroinjektionsnadeln aus Glas her, indem Sie Glasmikrokapillaren in einem Mikropipettenzieher mit den folgenden Einstellungen ziehen: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200. Während Sie durch das Präpariermikroskop schauen, brechen Sie die Spitzen vorsichtig mit einer Präparierzange von den Mikroinjektionsnadeln ab, um eine Öffnung zu schaffen.
- Injektion
- Schneiden Sie das Klebeband mit einer gebogenen Präparierschere vom Fenster ab. Legen Sie das Ei unter ein Seziermikroskop in einen Gummihalter.
- Beurteilen Sie das Gefäßsystem und lokalisieren Sie die Venen, die sich durch ihre etwas hellere rote Farbe von den Arterien unterscheiden lassen (Abbildung 1A; Tag 12). Um den Zugang zum Gefäßsystem zu verbessern, vergrößern Sie das Fenster vorsichtig, indem Sie es mit einer gebogenen Präparierschere schneiden. Wählen Sie eine Vene für die Injektion basierend auf Zugänglichkeit und Größe aus.
- Führen Sie die Spitze der Mikrokapillarnadel in einem Winkel von 0°-20º in die ausgewählte Vene ein. Stellen Sie sicher, dass sich die Nadel in der Vene befindet, indem Sie die Spitze vorsichtig von einer Seite zur anderen bewegen. Blasen Sie vorsichtig und gleichmäßig in das Einspritzsystem, um die Ökobilanz einzuspritzen (Abbildung 1A; Tag 12).
HINWEIS: Wenn sich die Nadel in der Vene in der richtigen Position befindet, sollte sie innerhalb der Grenzen der Vene bleiben. - Legen Sie das Ei für 10 Minuten zurück in den Inkubator, damit die LCA zirkulieren kann.
Anmerkungen: Es ist nicht notwendig, das Ei während dieser Zeit mit Klebeband zu verschließen.
5. Sammeln von transplantierten Organoiden am 12. Tag der Inkubation
- Den Hühnerembryo opfern
- Legen Sie das Ei in einen Gummihalter auf die Bank. Schneiden Sie das Klebeband mit einer gebogenen Präparierschere vom Fenster ab. Schneiden Sie dann die Membranen, die den Embryo umgeben, mit einer gebogenen Präparierschere durch.
HINWEIS: Ein Präpariermikroskop ist für diesen Schritt nicht erforderlich. - Schöpfen Sie den Embryo mit einem perforierten Löffel aus dem Ei und enthaupten Sie den Embryo sofort mit einer Schere. Legen Sie den Körper des Embryos in eine Petrischale unter das Seziermikroskop.
- Legen Sie das Ei in einen Gummihalter auf die Bank. Schneiden Sie das Klebeband mit einer gebogenen Präparierschere vom Fenster ab. Schneiden Sie dann die Membranen, die den Embryo umgeben, mit einer gebogenen Präparierschere durch.
- Auffinden und Sammeln von Organoiden
- Legen Sie den Embryo auf den Rücken in die Petrischale und spreizen Sie seine Gliedmaßen.
- Öffnen Sie die Bauchdecke des Embryos vorsichtig mit einer Pinzette entlang der Längsachse.
- Lokalisieren Sie das Organoid im Inneren des Embryos. Das Organoid wird am häufigsten am rechten Leberlappen befestigt, entweder an der Schwanzspitze oder kranial direkt unter dem Brustkorb (Abbildung 1A; Tag 12). Es wird daher empfohlen, zunächst an diesen Orten zu suchen.
- Sobald das Organoid lokalisiert ist, entfernen Sie es aus dem Embryo, indem Sie es mit einer Mikroschere umschneiden. Legen Sie das Organoid und das unweigerlich daran haftende Hühnergewebe in eine Petrischale unter das Präpariermikroskop. Entfernen Sie so viel Hühnerfleisch wie möglich mit einer zweischneidigen Rasierklinge aus Edelstahl.
- Verarbeiten Sie das Organoid je nach gewünschter Analyse.
6. Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung
- Ein transplantiertes Organoid wird in eine 24-Well-Platte gegeben und in 500 μl 4%igem Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C für 24 h fixiert. 3x mit DPBS-/- waschen.
- Permeabilisieren und blockieren Sie das Organoid in 300 μL Blockierlösung (0,3 % Triton-X in DPBS-/- mit 10 % Eselsserum) für 2 h bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie die primäre Antikörpermischung vor: Für ein Organoid verdünnen Sie die primären Antikörper NPHS1 (Schaf-α-Mensch, Verdünnung 1:100), CD31 (Maus-α-Mensch, Verdünnung 1:100) und LTL (Biotin-konjugiert, Verdünnung 1:300) in 300 μl Blockierungslösung. Die Antikörpermischung wird in das Organoid gegeben und 72 h bei 4 °C inkubiert.
- 3x mit 0,3% TritonX in DPBS-/- waschen.
- Bereiten Sie die Sekundärantikörpermischung vor: Für ein Organoid verdünnen Sie die Sekundär α antikörper Alexa Fluor 647 (Verdünnung 1:500), Esel-α-Maus Alexa Fluor 488 (Verdünnung 1:500) und Streptavidin Alexa Fluor 405 (Verdünnung 1:200) in 300 μl Blockierlösung. Die sekundäre Antikörpermischung zum Organoid geben und 2-4 h bei Raumtemperatur inkubieren. Mit Alufolie abdecken, um eine Lichtexposition der Sekundärantikörper zu vermeiden.
- 3x mit DPBS-/- waschen.
- Das Organoid in ~30 μL Eindeckmedium in eine 35 mm Glasbodenschale einbetten und über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen, abgedeckt mit Alufolie. Bei 4 °C lagern.
- Aufnahme mit einem konfokalen Mikroskop.
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Representative Results
Die Methode und der Zeitplan für die Differenzierung von hiPS-Zellen zu Nierenorganoiden, die Inkubation von befruchteten Hühnereiern, die Transplantation von Nierenorganoiden, die Injektion von LCA und die Entnahme der Organoide sind in Abbildung 1A zusammengefasst. Es ist wichtig, den Zeitpunkt der Organoid-Differenzierung und der Hühnerei-Inkubation zu koordinieren und mit der Differenzierung 15 Tage vor der Inkubation zu beginnen. Die Aktionen an Tag 0, 3, 4 und 12 der Inkubation werden durch Fotos unterhalb der Zeitleiste veranschaulicht. Organoide werden am Tag 7 + 12 der Differenzierung in Hühnerembryonen am Tag 4 (HH 23-24) transplantiert. LCA wird 8 Tage nach der Transplantation in das Venensystem des Embryos injiziert, um das perfundierte Gefäßsystem zu färben, bevor der Embryo geopfert und das Organoid entnommen wird. Das montierte Einspritzsystem ist in Abbildung 1B dargestellt.
Hühnerembryonen werden am 12. Tag der Inkubation geopfert (Abbildung 1A). Nach sorgfältiger Präparation des Embryos kann das transplantierte Organoid in der Regel an der Leber befestigt werden. Schaut man durch ein Präpariermikroskop, erscheint es vaskularisiert (Abbildung 1A; Tag 12; Schritt 5.2.3). Die konfokale Bildgebung von transplantierten Organoiden, die mit LCA injiziert und auf Nephronstrukturen und humane ECs gefärbt wurden, bestätigt die Vaskularisierung durch perfundierte Blutgefäße (Abbildung 2A), die auch in glomeruläre Strukturen eindringen (Abbildung 2B). Das Gefäßsystem ist chimärisch: Es können perfundierte humane ECs (CD31+, LCA+), undurchblutete humane ECs (CD31+, LCA-) und perfundierte Hühner-ECs (CD31-, LCA+) unterschieden werden (Abbildung 2A, Tafeln III, IV, V).
Abbildung 1: Intracelome Transplantationsmethode . (A) Zeitleiste der Differenzierung von hiPS-Zellen zu Nierenorganoiden, Inkubation von befruchteten Hühnereiern und intracelomer Transplantation von Nierenorganoiden. Die Differenzierung der hiPS-Zellen zu Nierenorganoiden wird 15 Tage vor Beginn der Inkubation der Hühnereier eingeleitet (Differenzierungstag 0 = Inkubationstag -15), um die Transplantation der Nierenorganoide am Tag 7 + 12 der Differenzierung in Hühnerembryonen am Tag 4 der Inkubation zu ermöglichen. Tage der Inkubation: Tag 0: Die befruchteten Hühnereier werden horizontal auf Halterungen gelagert (Schritt 2.1.1), die in einen Inkubator bei 38 ºC ± 1 °C gestellt werden (Protokollschritt 2.1.2). Tag 3: In jedem Ei wird ein Fenster erzeugt, indem man mit dem scharfen Ende einer gebogenen Präparierschere ein kleines Loch in die nach oben gerichtete Seite des Eies bohrt (Schritt 2.2.3) und von diesem Loch aus ein kreisförmiges Fenster schneidet (Schritt 2.2.4). Das Fenster wird mit transparentem Klebeband verschlossen, bevor das Ei wieder in den Inkubator gelegt wird. Tag 4: Intracelome Transplantation von Nierenorganoiden am Tag 7 + 12 der Differenzierung wird durchgeführt. Der Embryo befindet sich in HH 23-24 und liegt auf der linken Seite, mit der rechten Seite dem Betrachter zugewandt (Schritt 3.1.3). Zwischen dem Flügel und der Beinknospe wird eine Öffnung in der Vitellinmembran, dem Chorion und dem Amnion gemacht, um Zugang zur Zölomhöhle zu erhalten, und das Organoid wird durch diese Öffnungen in das Zölom eingeführt. Nach der Transplantation ist das Organoid als weiße Struktur sichtbar, die sich direkt hinter der Flügelknospe befindet. Die Ränder der geöffneten Vitellin- und Amnionmembranen sind sichtbar (Schritte 3.2.3 und 3.2.3-Zoom). In einigen Fällen werden die Embryonen gedreht, liegen auf der rechten statt auf der linken Seite (3.1.3 ANMERKUNG) und müssen vor der Transplantation umgedreht werden. Tag 12: Fluoreszenzmarkiertes Lektin wird intravenös injiziert. Venen unterscheiden sich von Arterien durch ihre Farbe; Das Blut in den Venen ist sauerstoffreich und kommt aus dem CAM, so dass sie etwas heller rot sind als die Arterien, die vom Embryo kommen (Schritte 4.2.2., 4.2.2-Zoom und 4.2.3.). Der Embryo wird geopfert und das Organoid entnommen. Das Organoid (eingekreist) hat sich an der Hühnerleber festgesetzt und scheint vaskularisiert zu sein (Schritt 5.2.3). Maßstabsleiste = 1 mm. Das schematische Bild, das das Bild der intracelomischen Transplantation in der oberen Tafel zeigt, wurde mit Genehmigung von Koning et al.28 nachgedruckt. (B) Abbildung des zusammengebauten Injektionssystems, bestehend aus einem Mundstück, zwei Stücken 38 cm Silikonschlauch, einem 0,2 μm Filter, einem Konnektor und einer Glas-Mikroinjektionsnadel, die durch Ziehen von Glasmikrokapillaren in einem Mikropipettenzieher erzeugt wurde. Abkürzungen: A = allantois; Am = Amnion; C = celom; CC = durchtrennte Chorionmembran; CHIR = CHIR99021; FGF9 = Fibroblasten-Wachstumsfaktor 9; hiPSCs = humane induzierte pluripotente Stammzellen; IM = intermediäres Mesoderm; Lb = Beinknospe; O = Organoid; PS = primitiver Streifen; U = Nabelschnurring; V = vitelline Membran; Wb = Flügelknospe; Y = Dotterstiel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vaskularisierte transplantierte Nierenorganoide . (A) Immunfluoreszenzbilder von (I) einem nicht transplantierten Nierenorganoid und (II) einem transplantierten Nierenorganoid. Unter beiden Bedingungen sind glomeruläre (NPHS1+, cyan) und tubuläre (LTL+, gelb) Strukturen sichtbar. In den nicht transplantierten Organoiden sind einige humane ECs (CD31+, grün) vorhanden. Im transplantierten Organoid ist ein perfundiertes Gefäßnetzwerk (CD31+, grün; injiziertes Rhodamin-markiertes LCA+, weiß) im gesamten Organoid sichtbar. In den Tafeln III, IV und V werden Vergrößerungen der Boxenbereiche in Tafel II gezeigt, um die drei Arten von ECs zu demonstrieren, die in transplantierten Organoiden unterschieden werden können. Panel III enthält perfundierte humane ECs (CD31+, LCA+), die mit Pfeilspitzen gekennzeichnet sind. Panel IV enthält undurchblutete humane ECs (CD31+, LCA-), die mit Pfeilspitzen gekennzeichnet sind. Panel V enthält perfundierte ECs (CD31-, LCA+), die mit Pfeilspitzen gekennzeichnet sind. Maßstabsbalken = 200 μm. (B) In untransplantierten Organoiden (I) umgeben ECs (CD31+, grün) glomeruläre Strukturen (NPHS1+, cyan), dringen aber nicht in diese ein. In transplantierten Organoiden (II) werden glomeruläre Strukturen (NPHS1+, blau) durch perfundierte Kapillaren (LCA+, weiß; CD31+, grün). Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In diesem Manuskript wird ein Protokoll für die intracelome Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden in Hühnerembryonen demonstriert. Nach der Transplantation werden Organoide durch perfundierte Blutgefäße vaskularisiert, die aus einer Kombination von aus menschlichen Organoiden und Hühnern bestehen. Diese verteilen sich über das Organoid und dringen in die glomerulären Strukturen ein, was eine Wechselwirkung zwischen den ECs und Podozyten ermöglicht. Es konnte bereits gezeigt werden, dass dies zu einer verstärkten Reifung der glomerulären und tubulären Strukturen der Organoide führt28. Die Transplantation ist sehr effizient und dauert ~5 Minuten pro Embryo, und die einzige Wartung, die die Embryonen benötigen, ist ein regelmäßiges Nachfüllen des Wasserbeckens im Inkubator. Diese Methode eignet sich daher sehr gut für die Analyse einer großen Anzahl von Organoiden.
Die Vaskularisierung und Reifung von Nierenorganoiden wurde bereits durch Transplantation bei Mäusen nachgewiesen 18,20. In diesen arbeitsintensiven Mausmodellen wurden Organoide für 2 bis 12 Wochen transplantiert. In den hier gezeigten intracelomischen Transplantationsexperimenten war die Dauer der Transplantation auf 8 Tage begrenzt. Dies ermöglicht die Opferung der Embryonen vor dem 13. Tag der Inkubation, wenn angenommen wird, dass sie Schmerzen haben33,34. Da Hühnerembryonen am 21. Tag schlüpfen, könnte die Dauer der Transplantation auf 15 Tage verlängert werden, wobei die Embryonen am 19. Tag geopfert werden, um ein Schlüpfen zu vermeiden. Dies würde jedoch den Einsatz von Anästhetika erfordern. Trotz der relativ kurzen Transplantationsdauer in diesem Modell induziert es eine umfangreiche Vaskularisierung und signifikante Reifung von Organoidnephronen im Vergleich zu in vitro Organoiden, einschließlich der Bildung eines GBM zwischen Organoid-Podozyten und den eindringenden ECs28.
Bei der Durchführung von intracelomischen Transplantationsexperimenten ist es wichtig zu berücksichtigen, dass sich nicht alle Hühnerembryonen normal entwickeln und überleben. Normalerweise erreichen ~65% der Embryonen, die an Tag 0 in den Inkubator gelegt werden, den Endpunkt des Experiments. Dies ist auf eine Kombination aus akuten Blutungen zurückzuführen, die durch eine Gefäßschädigung während der Transplantation (5%-10% in unseren Händen) verursacht werden, und dem Stress, der durch die Fenster- und Transplantationsverfahren verursacht wird. Wenn sich die Embryonen in einem früheren oder späteren Stadium als HH 23-24 befinden, wird die Transplantation aufgrund des begrenzten Platzes bzw. der umfangreicheren Gefäße kompliziert. Wenn sich die Embryonen zum erwarteten Zeitpunkt nicht im richtigen Stadium befinden, könnte dies an der Temperatur der Inkubation liegen, da eine höhere Temperatur in der Regel zu einer schnelleren Entwicklung führt.
Darüber hinaus führt die Lagerung befruchteter Eier bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum vor der Inkubation zu einer größeren Variabilität in der Entwicklung. Um dies zu vermeiden, muss die Temperatur des Inkubators während und zwischen den Experimenten stabil gehalten werden, und die Inkubation sollte innerhalb von 3 Tagen nach Lieferung der befruchteten Eizellen begonnen werden. Unerwartet hohe Prozentsätze des Embryotods zwischen den Eingriffen können durch Dehydrierung verursacht werden. Um dies zu vermeiden, ist es wichtig, nach dem Öffnen und nach der Transplantation zwei oder drei Tropfen DPBS+/+ in jede Eizelle zu geben und die Eizelle sehr sorgfältig mit Klebeband zu versiegeln, um Falten im Klebeband so weit wie möglich zu glätten. Es wird nicht empfohlen, die Windowing- und Transplantationsschritte zu kombinieren, um die Anzahl der Öffnungen der Eizellen zu reduzieren, da das Windowing an Tag 4 den Tod des Embryos erheblich erhöht. Dies ist die Folge einer Schädigung der Blutgefäße, die sich in diesem Stadium häufig an der Eierschale festgesetzt haben.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode ein effizientes und leistungsfähiges Werkzeug darstellt, um die Vaskularisierung zu induzieren und die Reifung in Nierenorganoiden zu verbessern. Es kann verwendet werden, um diese Prozesse in einer großen Anzahl von Organoiden zu untersuchen, und hat Potenzial für die Modellierung von Nierenerkrankungen, die einen höheren Reifegrad erfordern, als dies derzeit in vitro möglich ist.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken George Galaris (LUMC, Leiden, Niederlande) für seine Hilfe bei der Injektion von Hühnerembryonen. Wir bedanken uns für die Unterstützung von Saskia van der Wal-Maas (Institut für Anatomie und Embryologie, LUMC, Leiden, Niederlande), Conny van Munsteren (Institut für Anatomie und Embryologie, LUMC, Leiden, Niederlande), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Niederlande) und Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Niederlande). M. Koning wird unterstützt von "Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC". Diese Arbeit wurde zum Teil durch den Fonds der Universität Leiden "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02 unterstützt. Diese Arbeit wird von den Partnern Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) und Health Holland, Top Sector Life Sciences &; Health unterstützt. C.W. van den Berg und T.J. Rabelink werden vom Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW) unterstützt, das Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine wird durch Zuschüsse der Novo Nordisk Foundation unterstützt (NNF21CC0073729).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
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