Summary
在这里，我们提出了在鸡胚胎的天体腔中移植肾脏类器官的详细方案。该方法在8天内诱导类器官的血管形成和增强成熟，可用于以有效的方式研究这些过程。
Abstract
源自人类诱导的多能干细胞的肾脏类器官含有肾单位样结构，在一定程度上类似于成人肾脏中的结构。不幸的是，由于缺乏功能性脉管系统，因此体 外成熟有限，它们的临床适用性受到阻碍。在鸡胚胎的天体腔中移植肾脏类器官通过灌注血管诱导血管形成，包括肾小球毛细血管的形成，并增强其成熟。这种技术非常有效，可以移植和分析大量的类器官。本文描述了鸡胚胎中肾类器官的细胞内移植的详细方案，然后注射荧光标记的凝集素以染色灌注的脉管系统，并收集移植的类器官进行成像分析。该方法可用于诱导和研究类器官血管化和成熟，以寻找在 体外 增强这些过程和改善疾病建模的线索。
Introduction
人类诱导的多能干细胞（hiPSC）来源的肾脏类器官已被证明具有发育研究的潜力1，2，3，4，毒性筛查5，6和疾病建模5，7，8，9，10，11，12，13.然而，由于缺乏血管网络，它们对这些和最终临床移植目的的适用性受到限制。在胚胎肾脏发育过程中，足细胞、系膜细胞和血管内皮细胞 （EC） 相互作用形成肾小球的复杂结构。没有这种相互作用，由足细胞、肾小球基底膜（GBM）和EC组成的肾小球滤过屏障就无法正常发育14，15，16。尽管体外的肾脏类器官确实含有一些EC，但这些EC无法形成适当的血管网络并随着时间的推移而减少17。因此，类器官仍然不成熟也就不足为奇了。小鼠移植诱导肾脏类器官18，19，20，21的血管化和成熟。不幸的是，这是一个劳动密集型过程，不适合分析大量类器官。
一个多世纪以来，鸡胚一直被用来研究血管形成和发育22。它们易于接近，需要低维护，缺乏功能齐全的免疫系统，并且在打开蛋壳23，24，25，26后可以正常发育。类器官在其脉络膜尿囊膜（CAM）上的移植已被证明可导致血管形成27。然而，CAM上的移植持续时间以及移植物的成熟水平受到CAM形成的限制，CAM形成需要直到胚胎第7天才能完成。因此，最近开发了一种通过鸡胚胎中鞘内移植来有效血管化和成熟肾脏类器官的方法28。自 1930 年代以来，众所周知，鸡胚胎的天体腔是胚胎组织分化的有利环境29，30。它可以在胚胎发育的早期进入，并允许移植物在各个方向上相对无限地扩张。
本文概述了在第 4 天鸡胚胎的天体腔中移植 hiPSC 衍生的肾类器官的方案。该方法在8天内诱导类器官的血管形成和增强成熟。在牺牲胚胎之前注射荧光标记的晶状体凝集素（LCA），可以通过共聚焦显微镜可视化类器官内的灌注血管。
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Protocol
根据荷兰法律，这项研究不需要动物福利委员会的批准。
1. 制备用于移植的hiPSC来源的肾类器官
- 使用高里等人开发的协议将hiPSCs与肾脏类器官分化4，18，31。按照该协议在具有0.4μm孔的聚酯细胞培养插入物（细胞培养插入物）上培养类器官，直到分化的第7 + 12天。每个细胞培养插入片段将包含三个类器官。
- 从细胞培养插入物中取出类器官。
- 用一对解剖钳在细胞培养插入物的膜中间开一个孔。使用解剖剪刀，从中间的孔到细胞培养插入物的边缘在膜上切开三个切口，在类器官之间切割。这将产生三片膜，每片膜连接一个类器官，它们仍然连接到其外边缘的细胞培养插入物。
- 用一对镊子抓住靠近其外边缘的一块膜，并将其从细胞培养插入物上撕开。将带有附着类器官的膜片放入培养皿中。在类器官中加入几滴不含钙和镁（DPBS-/-）的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS），以避免脱水。对其他两个类器官重复此操作。
- 通过用镊子将其膜固定到位并用双刃不锈钢剃须刀片将它们切成两半（整个类器官太大，塞隆无法适应这个发育阶段），从而将类器官一分为二。用硬脑膜解剖器轻轻地将两个类器官的两半从膜上推开。丢弃膜并将类器官留在DPBS-/- 中，直到移植。
注意：一次最多准备三个类器官进行移植，以避免移植前对类器官的压力。理想情况下，一个人准备类器官，而另一个人进行移植。
2. 准备移植鸡胚
- 孵化受精白腿角卵。在第7 + 8天开始在肾脏类器官分化时孵化卵子，以确保移植的正确时间。
- 将受精的白腿角卵（家畜瘿） 水平放置在支架上（图1A; 第 0 天），用铅笔标记朝上一侧的中间。
注意：定制的塑料支架或鸡蛋盒都可以用作支架来孵化鸡蛋。 - 将装有鸡蛋的支架置于38±1ºC的加湿培养箱中（图1A; 第 0 天）。
- 将种蛋孵化 3 天，保持孵化器中的水盆充满。
- 将受精的白腿角卵（家畜瘿） 水平放置在支架上（图1A; 第 0 天），用铅笔标记朝上一侧的中间。
- 在孵化的第3天在蛋壳中创建一个窗口。
- 在孵化的第3天，将一小块（~1厘米x 0.5厘米）透明胶带放在鸡蛋的尖头（小端）。用一把解剖剪刀的锋利末端敲击透明胶带中间的蛋壳，在蛋壳上打一个小孔。
- 将 5 mL 注射器上的 19 G 针头以 45° 角插入孔中，避免损坏卵黄囊，并从卵子中吸出 2-3 mL 蛋白以降低卵子内的胚胎。用第二块（~1 cm x 0.5 cm）透明胶带密封孔。
- 将一大块（~5 厘米 x 5 厘米）透明胶带放在鸡蛋的铅笔标记的朝上一侧。用一把解剖剪刀的尖端敲击透明胶带中间的蛋壳，在蛋壳上打一个洞（图1A; 第3天）。
- 从这个洞开始，用弯曲的解剖剪刀在蛋壳上剪一个小圆形窗口。通过此窗口查看以找到胚胎，然后放大窗口以优化对胚胎的访问（图1A; 第3天）。
- 用镊子去除任何可能落在胚胎顶部的大块蛋壳。用塑料移液管将几滴含有钙和镁的DPBS滴在胚胎上（DPBS+/+），然后用蛋壳将DPBS+/+吸入移液器中，以取出较小的碎片。
- 使用塑料移液管将三滴补充有 0.5% 青霉素/链霉素的 DPBS+/+ 添加到鸡蛋中。
- 用一大块（~5 cm x 5 cm）透明胶带小心地密封窗口，然后将鸡蛋放回培养箱中，直到孵化的第 4 天，此时胚胎处于汉堡-汉密尔顿阶段 23-24 （HH 23-24）32。
注意：密封窗口对于避免胚胎脱水和死亡非常重要。 - 每天通过胶带观察胚胎的生存能力（不要取下胶带以避免脱水）。在孵化的最初几天，胚胎死亡后蛋黄颜色从明亮变为哑光黄色。丢弃已故胚胎。
- 保持培养箱中的水盆充满。
3.孵育第4天的腹内移植
- 进入天体腔
- 用弯曲的解剖剪刀从窗户上剪下胶带。
- 将鸡蛋放在橡胶架或鸡蛋盒上的解剖显微镜下。
- 鸡胚现在处于 HH 23-24 中，位于左侧，右侧面向观察者（图 1A; 第4天）。找到胚胎的右翼和腿芽，因为塞隆将在这两个肢芽之间进入。在右翼和腿芽之间的区域，用两对解剖镊子握住它们并轻轻地将它们拉向相反的方向，在卵黄膜、绒毛膜和羊膜上连续开一个开口。
注意：卵黄膜是打开鸡蛋后遇到的第一个膜，在某些情况下，在第 3 天开窗后已经损坏。如果胚胎旋转，则躺在其右侧，左侧面向观察者（图1A; 第4天），有必要将其转过来以使移植成为可能。为此，在卵黄和绒毛膜上开一个大口，然后用镊子小心地转动胚胎。 - 检查是否有畅通无阻的进入天体腔：用一对解剖镊子轻轻抓住翅膀和肢芽之间的体壁边缘，并将其稍微拉向观察者。天体腔必须清晰可见。小心地将钝而纤细的器械（例如，微型手术刀支架中的钝钨丝）插入天体腔。
注意：如果无法将钝器插入天体腔，则表示一个或多个膜未正确打开。
- 移植
- 使用硬脑膜解剖器将半个类器官放在蛋内尿囊顶部。
- 使用解剖镊子，小心地抓住体壁的边缘，并将其稍微拉向观察者，以使塞隆的开口可见。
注意：避免损坏体壁中的血管。 - 用微手术刀支架中的钝钨丝轻轻地将类器官移向并通过体壁的开口进入赛隆。稍微颅推类器官，使其卡在塞隆内。现在在翼芽后面可以看到它（图1A; 第4天）。
- 使用塑料移液管将三滴DPBS+/+ 添加到鸡蛋中。
- 用一大块（~5 cm x 5 cm）透明胶带小心地密封窗口，然后将鸡蛋放回孵化器中，直到孵化第 12 天（移植后 8 天）。
- 每天通过胶带观察胚胎的生存能力（不要取下胶带以避免脱水）。丢弃已故胚胎。
注意：随着胚胎及其脉络膜尿囊膜的生长，它们通过胶带变得更加清晰可见。胚胎缺乏运动和血管塌陷或稀疏是胚胎死亡的标志。 - 每天检查培养箱中的水盆并保持充满。
4.注射荧光标记的凝集素
- 准备注射
- 通过在微量移液器拉拔器中拉动玻璃微毛细管来制作玻璃显微注射针，设置如下： 加热533，拉60，速度150，时间200。通过解剖显微镜观察时，使用解剖镊子小心地将尖端从显微注射针上折断以形成一个开口。
注意：微量移液器拉拔器所需的设置可能因机器而异。 - 组装注射系统。取两根 38 厘米硅胶管，通过在它们之间放置一个 0.2 μm 过滤器将它们相互连接。将吹嘴插入与过滤器出口连接的管端（硅胶管 1），并将连接器插入与过滤器入口连接的管端（硅胶管 2）。最后，将显微注射针插入连接器（图1B）。
- 用DPBS-/- 将荧光标记的晶状体凝集素（LCA）稀释至0.5 mL管中的2.5 mg mL-1 浓度，并在微量离心机中向下旋转~30 s，将聚集体移动到管底部。
- 将 20 μL LCA 移液到一块封口膜上。
- 将 20 μL LCA 从封口膜中吸入组装好的进样系统的微毛细管针中。
- 通过在微量移液器拉拔器中拉动玻璃微毛细管来制作玻璃显微注射针，设置如下： 加热533，拉60，速度150，时间200。通过解剖显微镜观察时，使用解剖镊子小心地将尖端从显微注射针上折断以形成一个开口。
- 注射
- 用弯曲的解剖剪刀从窗户上剪下胶带。将鸡蛋放在橡胶架中的解剖显微镜下。
- 评估脉管系统并定位静脉，静脉可以通过其略亮的红色与动脉区分开来（图1A; 第12天）。为了改善对脉管系统的访问，请用弯曲的解剖剪刀切割来小心地扩大窗口。根据可及性和大小选择要注射的静脉。
- 将微毛细管针尖以0°-20º角插入所选静脉。通过轻轻地将尖端从一侧移动到另一侧来确保针头在静脉中。轻轻稳定地吹入注射系统以注入LCA（图1A; 第12天）。
注意：如果静脉中的针头处于正确的位置，则应保持在静脉边界内。 - 将鸡蛋放回培养箱中10分钟，让LCA循环。
注意：在此期间，无需用胶带密封鸡蛋。
5. 在孵育的第 12 天收集移植的类器官
- 牺牲鸡胚
- 将鸡蛋放入长凳上的橡胶架中。用弯曲的解剖剪刀从窗户上剪下胶带。然后，用弯曲的解剖剪刀切开胚胎周围的膜。
注意：此步骤不需要解剖显微镜。 - 用穿孔的勺子从鸡蛋中舀出胚胎，并立即用剪刀将胚胎斩首。将胚胎的身体放在解剖显微镜下的培养皿中。
- 将鸡蛋放入长凳上的橡胶架中。用弯曲的解剖剪刀从窗户上剪下胶带。然后，用弯曲的解剖剪刀切开胚胎周围的膜。
- 定位和收集类器官
- 将胚胎仰卧在培养皿中并展开四肢。
- 使用镊子沿纵轴小心地打开胚胎的腹壁。
- 在胚胎内找到类器官。类器官最常附着在右肝叶上，无论是在尾端还是在肋骨正下方的颅骨上（图1A; 第12天）。因此，建议从查看这些位置开始。
- 找到类器官后，用微型剪刀将其从胚胎中取出。将类器官和不可避免地附着在其上的鸡组织放在解剖显微镜下的培养皿中。用双刃不锈钢剃须刀片尽可能多地去除鸡肉组织。
- 根据所需的分析处理类器官。
6. 全接口免疫荧光染色
- 将移植的类器官置于24孔板中，并在4°C下固定在500μL4%多聚甲醛（PFA）中24小时。用DPBS清洗3次。
- 在室温下将类器官在300μL封闭溶液（含有 10%驴血清的DPBS中的0.3%Triton-X）中透化并封闭2小时。
- 制备一抗混合物：对于一个类器官，在 300 μL 封闭溶液中稀释一抗 NPHS1（绵羊α人，稀释度为 1：100）、CD31（小鼠α人，稀释度为 1：100）和 LTL（生物素偶联，稀释度为 1：300）。将抗体混合物添加到类器官中，并在4°C下孵育72小时。
- 用 0.3% TritonX 在 DPBS 中洗涤 3 倍。
- 制备二抗混合物：对于一种类器官，在 300 μL 封闭溶液中稀释驴α羊 Alexa Fluor 647（稀释度为 1：500）、驴α小鼠 Alexa Fluor 488（稀释度为 1：500）和链霉亲和素 Alexa Fluor 405（稀释度为 1：200）。将二抗混合物添加到类器官中，并在室温下孵育2-4小时。用铝箔覆盖，以避免二抗暴露在光线下。
- 用DPBS清洗3次。
- 将类器官嵌入 35 mm 玻璃底培养皿中的 ~30 μL 封片剂中，并在室温下干燥过夜，并用铝箔覆盖。储存在4°C。
- 使用共聚焦显微镜成像。
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Representative Results
图1A总结了hiPSCs分化为肾类器官、受精鸡蛋孵化、肾类器官移植、LCA注射和类器官收集的方法和时间表。协调类器官分化和鸡蛋孵化的时间很重要，在孵化前 15 天开始分化。孵化第 0、3、4 和 12 天的操作由时间线下方的照片说明。类器官在分化的第7 + 12天移植到第4天（HH 23-24）鸡胚中。移植后8天将LCA注射到胚胎的静脉系统中，以染色灌注的脉管系统，然后牺牲胚胎并取回类器官。组装好的注射系统如图1B所示。
在孵化的第12天处死鸡胚（图1A）。在仔细解剖胚胎后，通常可以发现移植的类器官附着在肝脏上。通过解剖显微镜观察，它似乎血管化（图1A;第12天;步骤5.2.3）。注射LCA并染色肾单位结构和人EC的移植类器官的共聚焦成像证实了灌注血管的血管形成（图2A），这些血管也侵入肾小球结构（图2B）。脉管系统是嵌合的：可以区分灌注的人 EC（CD31+、LCA+）、未灌注的人 EC（CD31+、LCA-）和灌注的鸡源性 EC（CD31-、LCA+）（图 2A，面板 III、IV、V）。
图1：内嵌层移植方法 。 （A）hiPSCs分化为肾类器官，受精鸡蛋的孵化和肾类器官的细胞内移植的时间表。在鸡蛋开始孵化前 15 天开始将 hiPSC 分化为肾脏类器官（分化第 0 天 = 孵育日 -15），以便在孵化第 4 天鸡胚分化的第 7 天 + 12 天移植肾类器官。孵化天数：第0天：将受精鸡蛋水平放置在支架上（步骤2.1.1），将其放置在38ºC±1°C的培养箱中（方案步骤2.1.2）。第3天：用一把弯曲的解剖剪刀的锋利末端在鸡蛋的朝上侧开一个小孔（步骤2.2.3），并从这个孔开始切一个圆形窗口（步骤2.2.4），在每个鸡蛋中创建一个窗口。在将种蛋放回孵化器之前，用透明胶带密封窗口。第4天：在分化的第7 + 12天进行肾类器官的内切移植。胚胎位于HH 23-24中，位于左侧，右侧面向观察者（步骤3.1.3）。在翅膀和腿芽之间，在玻璃膜、绒毛膜和羊膜上开一个开口，以进入塞洛膜腔，并将类器官通过这些开口插入塞隆。移植后，类器官可见为位于翼芽后面的白色结构。打开的卵黄膜和羊膜的边缘可见（步骤3.2.3和3.2.3-Zoom）。在某些情况下，胚胎被旋转，躺在右侧而不是左侧（3.1.3注），并且必须在移植前转身。第12天：静脉注射荧光标记的凝集素。静脉与动脉的区别在于其颜色;静脉中的血液富含氧气，来自CAM，因此它们比来自胚胎的动脉略亮红色（步骤4.2.2.，4.2.2-Zoom和4.2.3）。处死胚胎并取回类器官。类器官（圆圈）附着在鸡肝上，似乎血管化（步骤5.2.3）。比例尺 = 1 毫米。顶部面板中描述鞘内移植图像的示意图经Koning等人许可转载28。（B） 组装好的进样系统的图像，由一个吹嘴、两根 38 cm 硅胶管、一个 0.2 μm 过滤器、一个连接器和一个玻璃显微注射针组成，玻璃显微注射针是通过在微量移液器拉拔器中拉动玻璃微毛细管而产生的。缩写：A = 尿囊;am = 羊膜;C = 塞隆;CC = 切开绒毛膜膜;CHIR = CHIR99021;FGF9 = 成纤维细胞生长因子 9;hiPSC = 人诱导的多能干细胞;IM = 中间中胚层;Lb = 腿芽;O = 类器官;PS = 原始条纹;U = 脐带环;V = 卵黄碱膜;Wb = 翼芽;Y = 蛋黄茎。 请点击此处查看此图的大图。
图2：血管化移植的肾脏类器官 。 （A）（I）未移植的肾类器官和（II）移植的肾类器官的免疫荧光图像。在这两种情况下，肾小球（NPHS1+，青色）和管状（LTL+，黄色）结构都是可见的。在未移植的类器官中，存在一些人类EC（CD31+，绿色）。在移植的类器官中，灌注的血管网络（CD31+，绿色;注射的罗丹明标记的LCA+，白色）在整个类器官中可见。在图III，IV和V中，显示了图II中盒装区域的放大倍数，以演示在移植类器官中可以区分的三种类型的EC。图III包含灌注的人类ECs（CD31+，LCA+），用箭头标记。图IV包含未灌注的人类EC（CD31+，LCA-），用箭头标记。图V包含灌注鸡源的EC（CD31-，LCA+），用箭头标记。比例尺 = 200 μm。 （B）在未移植的类器官（I）中，ECs（CD31+，绿色）包围着肾小球结构（NPHS1+，青色），但不侵犯它们。在移植的类器官（II）中，肾小球结构（NPHS1+，蓝色）通过灌注的毛细血管（LCA+，白色;CD31+，绿色）。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在这份手稿中，展示了鸡胚胎中hiPSC衍生的肾类器官的细胞内移植方案。移植后，类器官通过灌注的血管进行血管化，这些血管由人类器官来源和鸡来源的EC的组合组成。它们遍布整个类器官并侵入肾小球结构，使EC和足细胞之间的相互作用成为可能。先前表明，这导致类器官肾小球和管状结构的成熟增强28。移植非常有效，每个胚胎需要~5分钟，胚胎唯一需要的维护是定期补充培养箱中的水盆。因此，该方法非常适合分析大量类器官。
肾脏类器官的血管化和成熟先前已通过移植在小鼠中得到证实18，20。在这些劳动密集型小鼠模型中，类器官被移植2至12周。在这里显示的细胞内移植实验中，移植的持续时间限制为8天。这允许在孵化的第13天之前牺牲胚胎，当时它们被认为开始经历疼痛33，34。由于鸡胚胎在第21天孵化，移植的持续时间可以延长到15天，在第19天牺牲胚胎以避免孵化。然而，这将需要使用麻醉剂。尽管该模型中的移植持续时间相对较短，但与 体外 类器官相比，它诱导了类器官肾单位的广泛血管形成和显着成熟，包括在类器官足细胞和入侵的EC之间形成GBM28。
在进行细胞内移植实验时，重要的是要考虑到并非所有鸡胚胎都能正常发育并存活。通常，在第0天放置在培养箱中的~65%的胚胎到达实验终点。这是由于移植过程中血管损伤引起的急性出血（我们手中的5%-10%）以及开窗和移植手术引起的压力。当胚胎处于比HH 23-24更早或更晚的阶段时，移植分别由于有限的空间和更广泛的脉管系统而变得复杂。如果胚胎在预期时间没有处于正确的阶段，这可能是由于孵化的温度，因为较高的温度通常会导致更快的发育。
此外，在孵化前将受精卵长时间保持在室温下会导致发育的更多变化。为避免这种情况，培养箱的温度必须在整个实验过程中和实验之间保持稳定，并且应在受精卵交付后3天内开始孵化。意外的高百分比胚胎死亡可能是由脱水引起的。为避免这种情况，必须在打开每个卵子后和移植后向每个卵子添加两到三滴DPBS + / + ，并用胶带非常小心地密封卵子，尽可能平滑胶带上的折痕。不建议结合窗口和移植步骤以减少卵子打开的次数，因为第4天的窗口大大增加了胚胎死亡。这是在这个阶段经常附着在蛋壳上的血管受损的结果。
总之，该方法提供了一种有效而强大的工具来诱导肾类器官的血管形成和增强成熟。它可用于在大量类器官中研究这些过程，并具有模拟肾脏疾病的潜力，这些肾脏疾病需要比目前体 外获得的成熟度更高。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢George Galaris（LUMC，莱顿，荷兰）在鸡胚注射方面的帮助。我们感谢Saskia van der Wal-Maas（荷兰莱顿LUMC解剖与胚胎学系），Conny van Munsteren（荷兰莱顿LUMC解剖与胚胎学系），Manon Zuurmond（LUMC，莱顿，荷兰）和Annemarie de Graaf（LUMC，莱顿，荷兰）的支持。M. Koning由'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'提供支持。这项工作部分得到了莱顿大学基金“Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund”GWF2019-02 的支持。这项工作得到了再生医学跨境（RegMedXB）和Health Holland，Top Sector Life Sciences & Health的合作伙伴的支持。C.W. van den Berg和T.J. Rabelink由诺和诺德基金会干细胞医学中心（reNEW）支持，诺和诺德基金会干细胞医学中心由诺和诺德基金会资助（NNF21CC0073729）支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
References
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