Summary
Здесь мы представляем подробный протокол трансплантации органоидов почек в поломическую полость куриных эмбрионов. Этот метод индуцирует васкуляризацию и ускоренное созревание органоидов в течение 8 дней и может быть использован для эффективного изучения этих процессов.
Abstract
Органоиды почек, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, содержат нефроноподобные структуры, которые в определенной степени напоминают таковые во взрослой почке. К сожалению, их клиническая применимость затруднена отсутствием функциональной сосудистой сети и, следовательно, ограниченным созреванием in vitro. Трансплантация органоидов почек в хеломическую полость куриных эмбрионов индуцирует васкуляризацию перфузированными кровеносными сосудами, в том числе образование клубочковых капилляров, и усиливает их созревание. Этот метод очень эффективен, позволяя проводить трансплантацию и анализ большого количества органоидов. В этой статье описывается подробный протокол интрацеломической трансплантации органоидов почек у куриных эмбрионов с последующей инъекцией флуоресцентно меченного лектина для окрашивания перфузированной сосудистой сети и сбора трансплантированных органоидов для анализа изображений. Этот метод может быть использован для индукции и изучения васкуляризации и созревания органоидов, чтобы найти ключи к усилению этих процессов in vitro и улучшить моделирование заболеваний.
Introduction
Было показано, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (hiPSC), полученные из органоидов почек, обладают потенциалом для исследований развития 1,2,3,4, скрининга токсичности 5,6 и моделирования заболеваний5,7,8,9,10,11,12,13. Однако их применимость для этих и возможных клинических целей трансплантации ограничена отсутствием сосудистой сети. Во время эмбрионального развития почек подоциты, мезангиальные клетки и эндотелиальные клетки сосудов (ЭК) взаимодействуют, образуя сложную структуру клубочка. Без этого взаимодействия клубочковый фильтрационный барьер, состоящий из подоцитов, клубочковой базальной мембраны (GBM) и ECs, не может нормально развиваться14,15,16. Хотя органоиды почек in vitro содержат некоторые ЭК, они не образуют надлежащую сосудистую сеть и со временемуменьшаются 17. Поэтому неудивительно, что органоиды остаются незрелыми. Трансплантация мышам индуцирует васкуляризацию и созревание органоидов почек 18,19,20,21. К сожалению, это трудоемкий процесс, который не подходит для анализа большого количества органоидов.
Куриные эмбрионы используются для изучения васкуляризации и развития уже болеевека 22. Они легко доступны, требуют минимального ухода, не имеют полностью функциональной иммунной системы и могут нормально развиваться после вскрытия яичной скорлупы23,24,25,26. Было показано, что трансплантация органоидов на их хориоаллантоисную мембрану (CAM) приводит к васкуляризации27. Однако продолжительность трансплантации на CAM, а также уровень созревания трансплантата ограничены образованием CAM, которое завершается до 7-го эмбрионального дня. Поэтому недавно был разработан метод эффективной васкуляризации и созревания органоидов почек посредством интрасиломической трансплантации куриным эмбрионам28. С 1930-х годов известно, что целомическая полость куриных эмбрионов является благоприятной средой для дифференцировки эмбриональных тканей29,30. Он может быть доступен на ранних стадиях эмбрионального развития и позволяет относительно неограниченно расширять трансплантат во всех направлениях.
В этой статье изложен протокол трансплантации органоидов почек, полученных из hiPSC, в поломическую полость куриных эмбрионов 4-го дня. Этот метод индуцирует васкуляризацию и усиленное созревание органоидов в течение 8 дней. Инъекция флуоресцентно меченного хрусталика culinaris agglutinin (LCA) перед принесением эмбрионов в жертву позволяет визуализировать перфузированные кровеносные сосуды в органоидах с помощью конфокальной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В соответствии с законодательством Нидерландов, для этого исследования не требовалось одобрения комитета по защите животных.
1. Подготовка органоидов почек, полученных из hiPSC, к трансплантации
- Дифференцируйте ИПСК до органоидов почек с использованием протокола, разработанного Takasato et al.4,18,31. Культивируйте органоиды в соответствии с этим протоколом на вставках для культивирования полиэфирных клеток с порами 0,4 мкм (вставки для клеточных культур) до 7 + 12 дня дифференцировки. Каждая вставка клеточной культуры будет содержать три органоида.
- Удалите органоиды из вкладыша для клеточной культуры.
- Сделайте отверстие посередине мембраны клеточной культуры, вставьте парой рассекающих щипцов. С помощью рассекающих ножниц сделайте три надреза в мембране от отверстия посередине до края вставки клеточной культуры, разрезав между органоидами. Это приведет к трем частям мембраны, к каждой из которых прикреплен один органоид, которые все еще соединены со вставкой клеточной культуры на внешнем крае.
- Возьмитесь за один из кусочков мембраны близко к ее внешнему краю с помощью щипцов и оторвите его от вкладыша для клеточной культуры. Поместите кусочек мембраны с прикрепленным органоидом в чашку Петри. Добавьте несколько капель фосфатно-буферного физиологического раствора Дульбекко (DPBS) без кальция и магния (DPBS-/-) в органоид, чтобы избежать обезвоживания. Повторите то же самое для двух других органоидов.
- Разделите органоиды пополам, удерживая их мембрану на месте щипцами и разрезая их пополам лезвием бритвы из нержавеющей стали с двумя лезвиями (весь органоид слишком велик для целома, чтобы вместить его на этой стадии развития). Аккуратно отожмите две половинки органоида от мембраны с помощью диссектора твердой мозговой оболочки. Откажитесь от мембраны и оставьте органоиды в DPBS-/- до пересадки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте максимум три органоида одновременно для трансплантации, чтобы избежать стресса для органоидов перед трансплантацией. В идеале, один человек подготавливает органоиды, а другой выполняет трансплантацию.
2. Подготовка куриных эмбрионов к трансплантации
- Инкубируют оплодотворенные яйца белого леггорна. Начинайте инкубацию яиц на почечной органоидной дифференцировке 7+8 дня, чтобы обеспечить правильные сроки трансплантации.
- Поместите оплодотворенные яйца белого леггорна (Gallus domesticus) горизонтально на держатель (рис. 1A; День 0), отмечая карандашом середину обращенной вверх стороны.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве держателей для инкубации яиц можно использовать как изготовленные на заказ пластиковые держатели, так и картонные коробки для яиц. - Поместите держатель с яйцами в увлажненный инкубатор при температуре 38 ± 1 ºC (рис. 1A; День 0).
- Инкубируйте яйца в течение 3 дней, поддерживая таз с водой в инкубаторе заполненным.
- Поместите оплодотворенные яйца белого леггорна (Gallus domesticus) горизонтально на держатель (рис. 1A; День 0), отмечая карандашом середину обращенной вверх стороны.
- Создайте окно в яичной скорлупе на 3-й день инкубации.
- На 3-й день инкубации поместите небольшой кусочек (~1 см х 0,5 см) прозрачной ленты на заостренный кончик яйца (маленький конец). Сделайте небольшое отверстие в яичной скорлупе посередине прозрачной ленты, постукивая по ней острым концом рассекающих ножниц.
- Вставьте иглу 19 г на шприце объемом 5 мл в отверстие под углом 45 °, избегая повреждения желточного мешка, и аспирируйте 2-3 мл белка из яйца, чтобы опустить эмбрион внутрь яйца. Запечатайте отверстие вторым куском (~1 см x 0,5 см) прозрачной ленты.
- Положите большой кусок (~ 5 см x 5 см) прозрачной ленты на отмеченную карандашом сторону яйца, обращенную вверх. Сделайте отверстие в яичной скорлупе посередине прозрачной ленты, постукивая по ней острым концом рассекающих ножниц (рис. 1А; День 3).
- Начиная с этого отверстия, вырежьте небольшое круглое окошко в яичной скорлупе с помощью изогнутых рассекающих ножниц. Посмотрите в это окно, чтобы найти эмбрион, затем увеличьте окно, чтобы оптимизировать доступ к эмбриону (рис. 1A; День 3).
- Удалите все большие куски яичной скорлупы, которые могли упасть на эмбрион, с помощью щипцов. Удалите более мелкие кусочки, поместив несколько капель DPBS с кальцием и магнием (DPBS +/+) на эмбрион с помощью пластиковой пипетки для переноса, а затем аспирировав DPBS + / + с яичной скорлупой в пипетку.
- Добавьте в яйцо три капли DPBS+/+ с добавлением 0,5% пенициллина/стрептомицина с помощью пластиковой пипетки для переноса.
- Тщательно закройте окно большим куском (~ 5 см x 5 см) прозрачной ленты, прежде чем помещать яйцо обратно в инкубатор до 4-го дня инкубации, когда эмбрион находится на стадии Гамбургера-Гамильтона 23-24 (HH 23-24)32.
ПРИМЕЧАНИЕ: Герметизация окна очень важна, чтобы избежать обезвоживания и гибели эмбриона. - Ежедневно проверяйте эмбрионы на жизнеспособность, глядя на них через ленту (не снимайте ленту, чтобы избежать обезвоживания). В течение первых дней инкубации цвет яичного желтка меняется с яркого на матово-желтый после гибели эмбриона. Откажитесь от умерших эмбрионов.
- Держите таз с водой в инкубаторе заполненным.
3. Интрасиломическая трансплантация на 4-й день инкубации
- Получение доступа к поломической полости
- Отрежьте ленту от окна изогнутыми рассекающими ножницами.
- Поместите яйцо под препарирующий микроскоп на резиновый держатель или картонную коробку для яиц.
- Куриный эмбрион теперь находится в HH 23-24 и лежит на левом боку, а правый бок обращен к зрителю (рис. 1А; День 4). Найдите правую почку крыла и ноги эмбриона, так как между этими двумя почками конечностей будет доступ к целому. В области между правым крылом и почкой ноги последовательно создайте отверстие в вителлиновой мембране, хорионе и амнионе, удерживая их двумя парами рассекающих щипцов и осторожно потянув их в противоположных направлениях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вителлиновая мембрана является первой мембраной, которая встречается после вскрытия яйца, а в некоторых случаях уже повреждена после того, как она сделала окно на 3-й день. Если эмбрион повернут, лежа на правом боку левым боком лицом к зрителю (рис. 1А; День 4), необходимо перевернуть его, чтобы сделать возможной пересадку. Для этого делают большое отверстие в вителлине и оболочке хориона, после чего аккуратно переворачивают эмбрион с помощью щипцов. - Проверьте, нет ли беспрепятственного доступа к селомической полости: аккуратно возьмитесь за край стенки тела между крылом и почкой конечности парой рассекающих щипцов и слегка потяните его к зрителю. Целомическая полость должна быть хорошо видна. Осторожно вставьте тупой, но тонкий инструмент (например, тупую вольфрамовую проволоку в держателе микроскальпеля) в полость живота.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если введение тупого инструмента в полость живота невозможно, это означает, что одна или несколько мембран не были должным образом открыты.
- Пересадка
- Поместите половину органоида внутрь яйца поверх аллантоиса с помощью диссектора твердой мозговой оболочки.
- С помощью рассекающих щипцов осторожно возьмитесь за край стенки тела и слегка потяните его к зрителю, чтобы было видно отверстие в цоколь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повреждения кровеносных сосудов в стенке тела. - Осторожно переместите органоид к отверстию в стенке тела и через него в целом желобе с помощью тупой вольфрамовой проволоки в держателе микроскальпеля. Слегка подтолкните органоид к черепу, чтобы поместить его внутрь целома. Теперь он виден сразу за почкой крыла (рис. 1А; День 4).
- Добавьте три капли DPBS+/+ в яйцо с помощью пластиковой пипетки для переноса.
- Аккуратно заклейте окно большим куском (~5 см х 5 см) прозрачной ленты, прежде чем поместить яйцо обратно в инкубатор до 12-го дня инкубации (8 дней после пересадки).
- Продолжайте ежедневно проверять эмбрионы на жизнеспособность, глядя на них через ленту (не снимайте ленту, чтобы избежать обезвоживания). Откажитесь от умерших эмбрионов.
ПРИМЕЧАНИЕ: По мере роста эмбрионов и их хориоаллантоисных оболочек они становятся более отчетливо видимыми через ленту. Отсутствие движения эмбриона и разрушенные или редкие кровеносные сосуды являются признаком гибели эмбриона. - Ежедневно проверяйте резервуар с водой в инкубаторе и держите его заполненным.
4. Инъекция флуоресцентно меченного лектина
- Подготовка к инъекции
- Сделайте стеклянные иглы для микроинъекций, вытягивая стеклянные микрокапилляры в съемнике микропипеток со следующими настройками: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200. Глядя в рассекающий микроскоп, осторожно отломите кончики игл для микроинъекций с помощью рассекающих щипцов, чтобы создать отверстие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимые настройки съемника микропипеток могут отличаться в зависимости от устройства. - Соберите систему впрыска. Возьмите два куска силиконовой трубки диаметром 38 см и соедините их друг с другом, поместив между ними фильтр 0,2 мкм. Вставьте мундштук в конец трубки, который соединен с выпускным отверстием фильтра (силиконовая трубка 1), и разъем на конец трубки, который соединен с входным отверстием фильтра (силиконовая трубка 2). Наконец, вставьте иглу для микроинъекций в разъем (рис. 1B).
- Разбавьте флуоресцентно меченый агглютинин хрусталика culinaris (LCA) с DPBS-/- до концентрации 2,5 мг мл-1 в пробирке 0,5 мл и вращайте вниз в течение ~ 30 с в микроцентрифуге, чтобы переместить агрегаты на дно пробирки.
- Пипетка 20 мкл LCA на кусок парапленки.
- Аспирируйте 20 мкл LCA из парапленки в микрокапиллярную иглу собранной инъекционной системы.
- Сделайте стеклянные иглы для микроинъекций, вытягивая стеклянные микрокапилляры в съемнике микропипеток со следующими настройками: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200. Глядя в рассекающий микроскоп, осторожно отломите кончики игл для микроинъекций с помощью рассекающих щипцов, чтобы создать отверстие.
- Инъекция
- Отрежьте ленту от окна изогнутыми рассекающими ножницами. Поместите яйцо под препарирующий микроскоп в резиновый держатель.
- Оцените сосудистую сеть и найдите вены, которые можно отличить от артерий по их немного более яркому красному цвету (рис. 1А; День 12). Чтобы улучшить доступ к сосудистой сети, аккуратно увеличьте окно, разрезав изогнутыми рассекающими ножницами. Выбирайте вену для инъекции исходя из доступности и размера.
- Вставьте кончик микрокапиллярной иглы в выбранную вену под углом 0°-20º. Убедитесь, что игла находится в вене, осторожно перемещая кончик из стороны в сторону. Осторожно и неуклонно подуйте в систему впрыска, чтобы впрыснуть LCA (рис. 1A; День 12).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла в вене находится в правильном положении, она должна оставаться в границах вены. - Поместите яйцо обратно в инкубатор на 10 минут, чтобы дать LCA циркулировать.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого времени не нужно заклеивать яйцо скотчем.
5. Сбор пересаженных органоидов на 12-й день инкубации
- Принесение в жертву куриного эмбриона
- Поместите яйцо в резиновый держатель на скамейке. Отрежьте ленту от окна изогнутыми рассекающими ножницами. Затем прорежьте мембраны, окружающие эмбрион, изогнутыми препарирующими ножницами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага не требуется препарирующий микроскоп. - Зачерпните эмбрион из яйца перфорированной ложкой и сразу же обезглавьте эмбрион с помощью ножниц. Поместите тело эмбриона в чашку Петри под диссекционным микроскопом.
- Поместите яйцо в резиновый держатель на скамейке. Отрежьте ленту от окна изогнутыми рассекающими ножницами. Затем прорежьте мембраны, окружающие эмбрион, изогнутыми препарирующими ножницами.
- Поиск и сбор органоидов
- Поместите эмбрион на спину в чашку Петри и раздвиньте конечности.
- Аккуратно вскрывают брюшную стенку эмбриона по продольной оси с помощью щипцов.
- Найдите органоид внутри зародыша. Органоид чаще всего прикрепляется к правой доле печени либо на каудальном кончике, либо краниально чуть ниже грудной клетки (рис. 1А; День 12). Поэтому рекомендуется начать с поиска в этих местах.
- Как только органоид будет найден, удалите его из эмбриона, разрезав его микроножницами. Поместите органоид и куриную ткань, которая неизбежно прикрепляется к нему, в чашку Петри под препарирующим микроскопом. Удалите как можно больше куриной ткани лезвием бритвы из нержавеющей стали с двумя лезвиями.
- Обрабатывают органоид в зависимости от желаемого анализа.
6. Цельное иммунофлуоресцентное окрашивание
- Поместите пересаженный органоид в 24-луночную пластину и зафиксируйте в 500 мкл 4% параформальдегида (PFA) при 4 ° C в течение 24 часов. Стирайте 3 раза с DPBS-/-.
- Пермеабилизируют и блокируют органоид в 300 мкл блокирующего раствора (0,3% Triton-X в DPBS-/- , содержащем 10% ослиной сыворотки) в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Приготовьте смесь первичных антител: для одного органоида разбавьте первичные антитела NPHS1 (овца α человек, разведение 1:100), CD31 (мышь α человек, разведение 1:100) и LTL (биотин-конъюгированный, разведение 1:300) в 300 мкл блокирующего раствора. Добавьте смесь антител к органоиду и инкубируйте в течение 72 ч при 4 °C.
- Стирайте 3 раза с 0,3% TritonX в DPBS-/-.
- Приготовьте смесь вторичных антител: для одного органоида разбавьте вторичные антитела осела α овец Alexa Fluor 647 (разведение 1:500), ослиного α мыши Alexa Fluor 488 (разведение 1:500) и стрептавидина Alexa Fluor 405 (разведение 1:200) в 300 мкл блокирующего раствора. Добавьте смесь вторичных антител к органоиду и инкубируйте в течение 2-4 ч при комнатной температуре. Накройте алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия вторичных антител на свет.
- Стирайте 3 раза с DPBS-/-.
- Поместите органоид в ~ 30 мкл монтажной среды в чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм и дайте высохнуть в течение ночи при комнатной температуре, накрыв алюминиевой фольгой. Хранить при температуре 4 °C.
- Изображение с помощью конфокального микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод и сроки дифференциации hiPSC в органоиды почек, инкубации оплодотворенных куриных яиц, трансплантации органоидов почек, инъекции LCA и сбора органоидов обобщены на рисунке 1A. Важно согласовывать сроки дифференцировки органоидов и инкубации куриных яиц, начиная дифференциацию за 15 дней до инкубации. Действия на 0, 3, 4 и 12 день инкубации проиллюстрированы фотографиями под временной шкалой. Органоиды пересаживают на 7 + 12 день дифференцировки в куриные эмбрионы 4-го дня (HH 23-24). LCA вводят в венозную систему эмбриона через 8 дней после трансплантации, чтобы окрасить перфузированную сосудистую сеть, прежде чем пожертвовать эмбрионом и извлечь органоид. Система впрыска в собранном виде показана на рисунке 1B.
Куриные эмбрионы приносят в жертву на 12-й день инкубации (рис. 1А). При тщательном вскрытии эмбриона трансплантированный органоид обычно можно обнаружить прикрепленным к печени. Глядя в диссекционный микроскоп, он кажется васкуляризированным (рис. 1А; 12-й день; этап 5.2.3). Конфокальная визуализация трансплантированных органоидов, введенных LCA и окрашенных для структур нефронов и EC человека, подтверждает васкуляризацию перфузированными кровеносными сосудами (рис. 2A), которые также вторгаются в клубочковые структуры (рис. 2B). Сосудистая сеть является химерной: можно различить перфузированные человеческие EC (CD31+, LCA+), неперфузированные EC человека (CD31+, LCA-) и перфузированные EC, полученные из курицы (CD31-, LCA+) (рис. 2A, панели III, IV, V).
Рисунок 1: Метод интраселомной трансплантации . (A) Хронология дифференцировки ИПСК в органоиды почек, инкубация оплодотворенных куриных яиц и интраломная трансплантация органоидов почек. Дифференциацию ИПСК в органоиды почек начинают за 15 дней до начала инкубации куриных яиц (день дифференцировки 0 = день инкубации -15), чтобы обеспечить возможность трансплантации органоидов почек на 7 + 12 день дифференцировки у куриных эмбрионов на 4 день инкубации. Дни инкубации: День 0: Оплодотворенные куриные яйца располагают горизонтально на держателях (этап 2.1.1), которые помещают в инкубатор при температуре 38 ºC ± 1 °C (этап протокола 2.1.2). День 3: В каждом яйце создается окно путем проделывания небольшого отверстия на обращенной вверх стороне яйца острым концом пары изогнутых рассекающих ножниц (шаг 2.2.3) и вырезания круглого окна, начиная с этого отверстия (этап 2.2.4). Окно закрывают прозрачной лентой перед тем, как поместить яйцо обратно в инкубатор. День 4: Проводится интрацемомная трансплантация органоидов почек на 7 + 12 день дифференцировки. Эмбрион находится в HH 23-24 и лежит на левом боку, правым боком лицом к зрителю (этап 3.1.3). Между крылом и почкой ноги в оболочке вителлина, хориона и амниона делается отверстие для получения доступа к поломной полости, и органоид вставляется через эти отверстия в. После пересадки органоид виден в виде белой структуры, расположенной сразу за почкой крыла. Видны края вскрытой вителлиновой и амнионной мембран (шаги 3.2.3 и 3.2.3-Zoom). В некоторых случаях эмбрионы поворачиваются, лежа на правом, а не на левом боку (3.1.3 ПРИМЕЧАНИЕ), и должны быть перевернуты перед трансплантацией. День 12: Внутривенно вводится флуоресцентно меченый лектин. Вены отличаются от артерий своим цветом; кровь в венах богата кислородом, поступает из CAM, поэтому они немного ярче красные, чем артерии, идущие от эмбриона (шаги 4.2.2., 4.2.2-Zoom и 4.2.3.). Эмбрион приносится в жертву, а органоид извлекается. Органоид (обведенный) прикрепился к куриной печени и, по-видимому, васкуляризирован (этап 5.2.3). Масштабная линейка = 1 мм. Схематическое изображение, изображающее интрацеломическое изображение трансплантации на верхней панели, было перепечатано с разрешения Koning et al.28. (B) Изображение собранной системы впрыска, состоящей из мундштука, двух частей силиконовой трубки диаметром 38 см, фильтра 0,2 мкм, разъема и стеклянной иглы для микроинъекций, которая была получена путем вытягивания стеклянных микрокапилляров в съемнике микропипетки. Сокращения: А = аллантоис; Am = амнион; С = целом; CC = разрезанная мембрана хориона; CHIR = CHIR99021; FGF9 = фактор роста фибробластов 9; hiPSCs = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека; IM = промежуточная мезодерма; Lb = почка ножки; O = органоид; PS = примитивная полоса; U = пупочное кольцо; V = вителлиновая мембрана; Wb = почка крыла; Y = стебель желтка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Васкуляризированные трансплантированные органоиды почек . (A) Иммунофлуоресцентные изображения (I) нетрансплантированного органоида почки и (II) трансплантированного органоида почки. В обоих случаях видны клубочковые (NPHS1+, голубой) и канальцевые (LTL+, желтые) структуры. В нетрансплантированных органоидах присутствуют некоторые человеческие EC (CD31+, зеленый). В трансплантированном органоиде перфузированная сосудистая сетка (CD31+, зеленый; введенный меченый родамином LCA+, белый) видна по всему органоиду. На панелях III, IV и V показаны увеличения коробочных областей на панели II, чтобы продемонстрировать три типа ЭК, которые можно различить в трансплантированных органоидах. Панель III содержит перфузированные человеческие EC (CD31+, LCA+), отмеченные наконечниками стрелок. Панель IV содержит неперфузированные человеческие ЭК (CD31+, LCA-), отмеченные наконечниками стрелок. Панель V содержит перфузированные ЭК, полученные из курицы (CD31-, LCA+), отмеченные наконечниками стрелок. Масштабная линейка = 200 мкм. (B) В нетрансплантированных органоидах (I) EC (CD31+, зеленый) окружают клубочковые структуры (NPHS1+, голубой), но не вторгаются в них. В трансплантированных органоидах (II) клубочковые структуры (NPHS1+, синий) васкуляризируются перфузированными капиллярами (LCA+, белый; CD31+, зеленый). Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи демонстрируется протокол интрасиломической трансплантации органоидов почек, полученных из hiPSC, у куриных эмбрионов. При трансплантации органоиды васкуляризируются перфузированными кровеносными сосудами, которые состоят из комбинации ЭК, полученных из органоидов человека и курицы. Они распространяются по всему органоиду и проникают в клубочковые структуры, обеспечивая взаимодействие между ЭК и подоцитами. Ранее было показано, что это приводит к усиленному созреванию органоидных клубочковых и трубчатых структур28. Трансплантация очень эффективна, занимает ~ 5 минут на эмбрион, и единственный уход, который требуется эмбрионам, - это регулярное пополнение бассейна с водой в инкубаторе. Поэтому этот метод очень подходит для анализа большого количества органоидов.
Васкуляризация и созревание органоидов почек ранее были продемонстрированы путем трансплантации мышам18,20. В этих трудоемких моделях мышей органоиды пересаживали на срок от 2 до 12 недель. В экспериментах по интраселомной трансплантации, показанных здесь, продолжительность трансплантации была ограничена 8 днями. Это позволяет принести в жертву эмбрионы до 13-го дня инкубации, когда, как считается, они начинают испытывать боль33,34. Поскольку куриные эмбрионы вылупляются на 21-й день, продолжительность трансплантации может быть увеличена до 15 дней, жертвуя эмбрионами на 19-й день, чтобы избежать вылупления. Это, однако, потребует использования анестетиков. Несмотря на относительно короткую продолжительность трансплантации в этой модели, она индуцирует обширную васкуляризацию и значительное созревание органоидных нефронов по сравнению с органоидами in vitro, включая образование GBM между органоидными подоцитами и вторгшимися ECs28.
При проведении экспериментов по интрасиломической трансплантации важно учитывать, что не все куриные эмбрионы нормально развиваются и выживают. Обычно ~65% эмбрионов, помещенных в инкубатор на 0-й день, достигают конечной точки эксперимента. Это связано с сочетанием острого кровотечения, вызванного повреждением сосудов во время трансплантации (5-10% в наших руках), и стресса, вызванного процедурами окон и трансплантации. Когда эмбрионы находятся на более ранней или более поздней стадии, чем HH 23-24, трансплантация усложняется из-за ограниченного пространства и более обширной сосудистой сети соответственно. Если эмбрионы не находятся на правильной стадии в ожидаемое время, это может быть связано с температурой инкубации, поскольку более высокая температура обычно приводит к более быстрому развитию.
Кроме того, хранение оплодотворенных яиц при комнатной температуре в течение длительного периода до инкубации вызывает большую изменчивость в развитии. Чтобы этого избежать, температура инкубатора должна поддерживаться стабильной на протяжении всего эксперимента и между ними, а инкубация должна быть начата в течение 3 дней после доставки оплодотворенных яиц. Неожиданно высокий процент гибели эмбрионов между процедурами может быть вызван обезвоживанием. Чтобы этого избежать, необходимо добавить две-три капли DPBS+/+ в каждое яйцо после вскрытия и после трансплантации и очень тщательно заклеить яйцо скотчем, максимально разглаживая складки на ленте. Совмещение этапов окна и трансплантации для уменьшения количества вскрытий яйцеклеток не рекомендуется, так как окошко на 4-й день значительно увеличивает гибель эмбриона. Это результат повреждения кровеносных сосудов, которые часто прикрепляются к яичной скорлупе на этом этапе.
В заключение, этот метод является эффективным и мощным инструментом для индукции васкуляризации и ускорения созревания органоидов почек. Он может быть использован для изучения этих процессов в большом количестве органоидов и имеет потенциал для моделирования почечных заболеваний, требующих более высокого уровня созревания, чем в настоящее время может быть получено in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Джорджа Галариса (LUMC, Лейден, Нидерланды) за помощь с инъекцией куриных эмбрионов. Мы выражаем благодарность за поддержку Саскии ван дер Валь-Маас (Департамент анатомии и эмбриологии, LUMC, Лейден, Нидерланды), Конни ван Мюнстерен (Департамент анатомии и эмбриологии, LUMC, Лейден, Нидерланды), Манон Зуурмонд (LUMC, Лейден, Нидерланды) и Аннемари де Грааф (LUMC, Лейден, Нидерланды). М. Конинг поддерживается 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'. Эта работа была частично поддержана Фондом Лейденского университета «Фонд профессора Яапа де Граффа-Линглинга Виядханрмы» GWF2019-02. Эта работа поддерживается партнерами Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) и Health Holland, Top Sector Life Sciences & Health. К.В. ван ден Берг и Т.Д. Рабелинк поддерживаются Центром медицины стволовых клеток Фонда Ново Нордиск (reNEW), Центр медицины стволовых клеток Фонда Ново Нордиск поддерживается грантами Фонда Ново Нордиск (NNF21CC0073729).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
References
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
- Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
- Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
- Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
- Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
- Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
- Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
- Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
- Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
- vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
- Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
- vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
- Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
- Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
- Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
- Rawles, M. E.
- Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
- Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
- Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
- Dossel, W. E.
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
