Summary
ここでは、ニワトリ胚のセロミック腔への腎臓オルガノイドの移植のための詳細なプロトコルを提示します。この方法は、8日以内にオルガノイドの血管新生と成熟の促進を誘発し、これらのプロセスを効率的に研究するために使用できます。
Abstract
ヒト人工多能性幹細胞由来の腎臓オルガノイドは、成人腎臓のネフロン様構造にある程度類似した構造を持っています。残念ながら、それらの臨床的適用性は、機能的な血管系の欠如、およびその結果としてのin vitroでの成熟の制限によって妨げられています。ニワトリ胚のセロミック腔への腎臓オルガノイドの移植は、糸球体毛細血管の形成を含む灌流血管による血管新生を誘発し、それらの成熟を促進する。この技術は非常に効率的であり、多数のオルガノイドの移植と分析を可能にします。この論文では、ニワトリ胚における腎臓オルガノイドの細胞内移植、それに続く灌流血管系を染色するための蛍光標識レクチンの注入、およびイメージング分析のための移植オルガノイドの収集のための詳細なプロトコルについて説明します。この方法は、オルガノイドの血管新生と成熟を誘導および研究するために使用でき、 in vitro でこれらのプロセスを強化し、疾患モデリングを改善するための手がかりを見つけることができます。
Introduction
ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)由来の腎臓オルガノイドは、発生研究1,2,3,4、毒性スクリーニング5,6、および疾患モデリング5,7,8,9,10,11,12,13の可能性があることを示しています。.しかしながら、これらおよび最終的な臨床移植目的へのそれらの適用性は、血管網の欠如によって制限される。胚性腎臓の発生中、足細胞、メサンギウム細胞、および血管内皮細胞(EC)が相互作用して糸球体の複雑な構造を形成します。この相互作用がなければ、足細胞、糸球体基底膜(GBM)、およびECからなる糸球体濾過バリアは、適切に発達することができません14,15,16。in vitroの腎臓オルガノイドにはいくつかのECが含まれていますが、これらは適切な血管網を形成できず、時間の経過とともに減少します17。したがって、オルガノイドが未熟なままであることは驚くべきことではありません。マウスにおける移植は、腎臓オルガノイドの血管新生および成熟を誘導する18、19、20、21。残念ながら、これは労働集約的なプロセスであり、多数のオルガノイドの分析には適していません。
ニワトリ胚は、1世紀以上にわたって血管新生と発生の研究に使用されてきました22。それらは容易にアクセスでき、低メンテナンスを必要とし、完全に機能する免疫システムを欠いており、卵殻23,24,25,26を開いた後に正常に発達する可能性があります。絨毛尿膜(CAM)へのオルガノイドの移植は、血管新生につながることが示されています27。しかしながら、CAM上の移植期間、ならびに移植片の成熟レベルは、CAM形成によって制限され、それは胚の7日目まで完了する。そこで、最近、ニワトリ胚のセロム内移植により、腎臓オルガノイドを効率的に血管新生・成熟させる方法が開発されました28。ニワトリ胚のセロミック腔は、1930年代から胚組織の分化に好ましい環境であることが知られている29,30。それは胚発生の早い段階でアクセスすることができ、移植片の全方向への比較的無制限の拡大を可能にする。
この論文は、4日目のニワトリ胚のセロミック腔へのhiPSc由来腎臓オルガノイドの移植のためのプロトコルを概説します。この方法は、8日以内に血管新生を誘導し、オルガノイドの成熟を促進します。胚を犠牲にする前に蛍光標識された水晶体凝集素(LCA)を注入することで、共焦点顕微鏡によるオルガノイド内の灌流血管の可視化が可能になります。
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Protocol
オランダの法律に従い、この研究には動物福祉委員会の承認は必要ありませんでした。
1. hiPS細胞由来腎オルガノイドの移植用調製
- 高里らが開発したプロトコールを用いて、hiPS細胞を腎臓オルガノイドに分化させる4,18,31.このプロトコルに従ったオルガノイドを、0.4 μmの細孔を有するポリエステル細胞培養インサート(細胞培養インサート)上で、分化の7日目+12日目まで培養します。各細胞培養インサートには3つのオルガノイドが含まれます。
- 細胞培養インサートからオルガノイドを取り外します。
- 一対の解剖鉗子で細胞培養インサートの膜の中央に穴を開けます。解剖ハサミを使用して、細胞培養インサートの中央の穴から端まで膜に3つの切り込みを入れ、オルガノイド間を切ります。これにより、3つの膜が得られ、それぞれに1つのオルガノイドが付着し、それらは外縁で細胞培養インサートに接続されています。
- 一対の鉗子で外縁に近い膜片の1つをつかみ、細胞培養インサートから引き裂きます。オルガノイドを付着させた膜片をペトリ皿に入れる。脱水症状を避けるために、カルシウムとマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)(DPBS-/-)を数滴オルガノイドに追加します。他の2つのオルガノイドについても繰り返します。
- オルガノイドを鉗子で膜を所定の位置に保持し、両刃のステンレス鋼のかみそりの刃で半分に切断することにより、オルガノイドを二等分します(オルガノイド全体が大きすぎて、開発のこの段階ではセロムが収容できません)。2つのオルガノイドの半分を硬膜離片で膜からそっと押し出します。膜を廃棄し、移植までオルガノイドをDPBS-/- のままにします。
注:移植前にオルガノイドへのストレスを避けるために、一度に最大3つのオルガノイドを移植用に準備してください。理想的には、ある人がオルガノイドを準備し、別の人が移植を行います。
2.移植のための鶏胚の準備
- 受精した白いレッグホーン卵を孵化させます。移植の正しいタイミングを確実にするために、腎臓オルガノイド分化7 + 8日目に卵の孵卵を開始します。
- 受精した白いレッグホーン卵(Gallus domestic us) をホルダーに水平に置きます(図1A; 0日目)、上向きの側面の中央を鉛筆でマークします。
注意: カスタムメイドのプラスチックホルダーまたは卵パックのいずれかをホルダーとして使用して、卵を孵化させることができます。 - 卵の入ったホルダーを38 ± 1ºCの加湿インキュベーターに入れます(図1A; 0日目)。
- インキュベーター内の流域を満たしたまま、卵を3日間インキュベートします。
- 受精した白いレッグホーン卵(Gallus domestic us) をホルダーに水平に置きます(図1A; 0日目)、上向きの側面の中央を鉛筆でマークします。
- 孵卵の3日目に卵殻に窓を作ります。
- 孵卵の3日目に、卵の先のとがった先端(小さい方の端)に透明なテープの小片(~1 cm x 0.5 cm)を置きます。透明なテープの真ん中にある卵殻に、解剖ハサミの鋭い端で軽くたたくことで小さな穴を開けます。
- 卵黄嚢の損傷を避けて、5 mLシリンジの19 G針を45°の角度で穴に挿入し、卵から2〜3 mLの卵白を吸引して卵の中の胚を下げます。2枚目(~1 cm x 0.5 cm)の透明テープで穴を塞ぎます。
- 卵の鉛筆でマークされた上向きの側に透明なテープの大きな部分(~5 cm x 5 cm)を置きます。透明なテープの中央にある卵殻に、解剖ハサミの鋭い端で軽くたたくことによって穴を開けます(図1A; 3日目)。
- この穴から始めて、湾曲した解剖ハサミを使って卵殻の小さな円形の窓を切ります。このウィンドウを通して胚を見つけ、ウィンドウを拡大して胚へのアクセスを最適化します(図1A; 3日目)。
- 鉗子を使用して、胚の上に落ちた可能性のある大きな卵殻を取り除きます。プラスチックトランスファーピペットで胚にカルシウムとマグネシウム(DPBS+/+)を含むDPBSを数滴入れ、卵殻でDPBS+/+をピペットに吸引して、小さな断片を取り除きます。
- プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、0.5%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDPBS+/+ を卵に3滴加えます。
- 大きな部分(~5 cm x 5 cm)の透明テープで窓を慎重に密封してから、胚がハンバーガー-ハミルトンステージ23-24(HH 23-24)32にある孵卵4日目まで卵をインキュベーターに戻します。
注:窓を密閉することは、胚の脱水や死を避けるために非常に重要です。 - テープを通して胚を見て、胚の生存率を毎日チェックします(脱水症状を避けるためにテープを剥がさないでください)。孵卵の最初の数日間、卵黄の色は胚の死時に明るい黄色からつや消しの黄色に変わります。死亡した胚を捨てる。
- インキュベーター内の流域を満たしたままにします。
3.インキュベーション4日目のイントラロミック移植
- セロミックキャビティへのアクセスを取得する
- 湾曲した解剖ハサミで窓からテープを切り取ります。
- 卵を解剖顕微鏡下のゴムホルダーまたは卵パックの上に置きます。
- ニワトリ胚は現在HH 23-24にあり、左側に横たわり、右側が視聴者に面しています(図1A; 4日目)。セロムはこれらの2つの四肢芽の間でアクセスされるため、胚の右翼と脚のつぼみを見つけます。右翼と脚のつぼみの間の領域に、2対の解剖鉗子で保持し、反対方向にゆっくりと引っ張ることにより、卵子膜、絨毛膜、羊膜に連続して開口部を作ります。
注:卵子膜は、卵を開いた後に最初に遭遇した膜であり、場合によっては、3日目に窓を作った後にすでに損傷しています。胚が回転している場合、左側が視聴者に面して右側に横たわっています(図1A; 4日目)、移植を可能にするためにそれを好転させる必要があります。これを行うには、卵子膜と絨毛膜に大きな開口部を作り、次に鉗子を使用して慎重に胚を回転させます。 - セロミック腔への遮るもののないアクセスがあるかどうかを確認します:一対の解剖鉗子で翼と四肢のつぼみの間の体壁の端をそっとつかみ、それを視聴者に向かってわずかに引っ張ります。セロミックキャビティははっきりと見えなければなりません。鈍いが細い器具(例:マイクロメスホルダーの鈍いタングステン線)をセロミックキャビティに挿入します。
注意: 鈍い器具をセロミックキャビティに挿入できない場合は、1つまたは複数のメンブレンが適切に開かれていないことを意味します。
- 移植
- 硬膜ディセクタを使用して、尿膜の上の卵の中に半分のオルガノイドを置きます。
- 解剖鉗子を使用して、体壁の端を注意深くつかみ、それを視聴者に向かってわずかに引っ張って、セロムへの開口部が見えるようにします。
注意: 体壁の血管を傷つけないでください。 - マイクロメスホルダーに鈍いタングステンワイヤーを使用して、オルガノイドを体壁の開口部に向かってゆっくりとセロムに移動します。オルガノイドを少し頭蓋骨に押して、セロムの中に閉じ込めます。これで、翼のつぼみのすぐ後ろに見えるようになりました(図1A; 4日目)。
- プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、DPBS+/+ を卵に3滴加えます。
- 大きな部分(~5 cm x 5 cm)の透明テープで窓を慎重に密封してから、孵卵の12日目(移植後8日)まで卵をインキュベーターに戻します。
- テープを通して胚を見て、胚の生存率を毎日チェックし続けます(脱水症状を避けるためにテープをはがさないでください)。死亡した胚を捨てる。
注:胚とその絨毛尿膜が成長するにつれて、それらはテープを通してよりはっきりと見えるようになります。胚による動きの欠如および虚脱またはまばらな血管は、胚死の兆候である。 - インキュベーター内の流域を毎日チェックし、満たしてください。
4. 蛍光標識レクチンの注入
- 注射の準備
- 次の設定でマイクロピペットプラーでガラスマイクロキャピラリーを引っ張って、ガラスマイクロ注射針を作ります: ヒート533、プル60、速度150、時間200。解剖顕微鏡を覗きながら、解剖鉗子を使用してマイクロインジェクション針の先端を慎重に切り離し、開口部を作ります。
注意: マイクロピペットプラーに必要な設定は、機械によって異なる場合があります。 - 注入システムを組み立てます。38 cmのシリコンチューブを2本取り、0.2 μmのフィルターを挟んで互いに接続します。フィルター出口に接続されているチューブの端にマウスピースを挿入し(シリコンチューブ1)、フィルター入口に接続されているチューブの端にコネクタを挿入します(シリコンチューブ2)。最後に、マイクロインジェクションニードルをコネクタに挿入します(図1B)。
- 蛍光標識した水晶体凝集素(LCA)をDPBS-/- で0.5 mLチューブ中で2.5 mg mL-1 の濃度に希釈し、微量遠心分離機で~30秒間スピンダウンして凝集体をチューブの底に移動します。
- 20 μLのLCAをパラフィルム片にピペットで移します。
- パラフィルムから20 μLのLCAを組み立てられた注入システムのマイクロキャピラリー針に吸引します。
- 次の設定でマイクロピペットプラーでガラスマイクロキャピラリーを引っ張って、ガラスマイクロ注射針を作ります: ヒート533、プル60、速度150、時間200。解剖顕微鏡を覗きながら、解剖鉗子を使用してマイクロインジェクション針の先端を慎重に切り離し、開口部を作ります。
- 注射
- 湾曲した解剖ハサミで窓からテープを切り取ります。卵を解剖顕微鏡下のゴム製ホルダーに入れます。
- 血管系を評価し、わずかに明るい赤色で動脈と区別できる静脈を見つけます(図1A; 12日目)。血管系へのアクセスを改善するために、湾曲した解剖ハサミで切断することによって慎重に窓を拡大する。アクセス可能性とサイズに基づいて注射する静脈を選択します。
- マイクロキャピラリー針の先端を選択した静脈に0°〜20°の角度で挿入します。先端をゆっくりと左右に動かして、針が静脈にあることを確認します。LCAを注入するために、注入システムに穏やかかつ着実に吹き込みます(図1A; 12日目)。
注意: 静脈の針が正しい位置にある場合、それは静脈の境界内にとどまるはずです。 - 卵をインキュベーターに10分間戻し、LCAを循環させます。
注:この間、卵をテープで密封する必要はありません。
5.インキュベーション12日目に移植オルガノイドを採取
- 鶏胚を犠牲にする
- 卵をベンチのゴム製ホルダーに入れます。湾曲した解剖ハサミで窓からテープを切り取ります。次に、湾曲した解剖ハサミで胚を囲む膜を切り取ります。
注:このステップでは、解剖顕微鏡は必要ありません。 - 穴あきスプーンで卵から胚をすくい上げ、すぐにハサミを使って胚を斬首します。胚の体を解剖顕微鏡下のペトリ皿に入れる。
- 卵をベンチのゴム製ホルダーに入れます。湾曲した解剖ハサミで窓からテープを切り取ります。次に、湾曲した解剖ハサミで胚を囲む膜を切り取ります。
- オルガノイドの検索と収集
- 胚をペトリ皿に仰向けに置き、手足を広げます。
- 鉗子を使用して縦軸に沿って胚の腹壁を慎重に開きます。
- 胚の中のオルガノイドを見つけます。オルガノイドは、尾側または胸郭のすぐ下の頭蓋のいずれかで、最も頻繁に右肝葉に付着します(図1A; 12日目)。したがって、これらの場所を調べることから始めることをお勧めします。
- オルガノイドが見つかったら、マイクロハサミで胚の周りを切り取って胚から取り除きます。オルガノイドとそれに必然的に付着しているニワトリ組織を解剖顕微鏡下のペトリ皿に入れる。両刃のステンレス鋼のかみそりの刃でできるだけ多くの鶏の組織を取り除きます。
- 目的の分析に応じてオルガノイドを処理します。
6. ホールマウント免疫蛍光染色
- 移植したオルガノイドを24ウェルプレートに入れ、500 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)に4°Cで24時間固定します。DPBS-/-で3回洗浄します。
- オルガノイドを300 μLのブロッキング溶液(DPBS-/-10%ロバ血清中の0.3%Triton-X を含む)に室温で2時間透過処理してブロックします。
- 一次抗体ミックスを調製します:1つのオルガノイドに対して、一次抗体NPHS1(ヒツジαヒト、1:100希釈)、CD31(マウスαヒト、1:100希釈)、およびLTL(ビオチン結合、1:300希釈)を300 μLのブロッキング溶液で希釈します。抗体ミックスをオルガノイドに加え、4°Cで72時間インキュベートします。
- DPBS-/-で0.3%トリトンXで3回洗浄します。
- 二次抗体ミックスを調製します:1つのオルガノイドに対して、二次抗体ロバαヒツジAlexa Fluor 647(希釈1:500)、ロバαマウスAlexa Fluor 488(希釈1:500)、およびストレプトアビジンAlexa Fluor 405(希釈1:200)を300 μLのブロッキング溶液で希釈します。二次抗体ミックスをオルガノイドに加え、室温で2〜4時間インキュベートします。二次抗体が光にさらされないようにアルミホイルで覆います。
- DPBS-/-で3回洗浄します。
- オルガノイドを35 mmガラス底皿の~30 μLの封入剤に包埋し、アルミホイルで覆った室温で一晩乾燥させます。4°Cで保存してください。
- 共焦点顕微鏡を用いた画像。
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Representative Results
hiPS細胞から腎臓オルガノイドへの分化、ニワトリ受精卵のインキュベーション、腎臓オルガノイドの移植、LCAの注入、およびオルガノイドの収集の方法とタイムラインを 図1Aにまとめます。オルガノイド分化と鶏卵孵化のタイミングを調整し、孵卵の15日前に分化を開始することが重要です。インキュベーションの0、3、4、および12日目のアクションは、タイムラインの下の写真で示されています。オルガノイドは、分化の7日目+12日目に4日目(HH 23-24)ニワトリ胚に移植される。LCAは、移植の8日後に胚の静脈系に注入され、灌流された血管系を染色してから、胚を犠牲にしてオルガノイドを回収します。組み立てられた射出システムを 図1Bに示します。
ニワトリ胚は孵卵の12日目に屠殺される(図1A)。胚を注意深く解剖すると、移植されたオルガノイドは通常肝臓に付着していることがわかります。解剖顕微鏡を通して見ると、血管新生しているように見えます(図1A;12日目;ステップ5.2.3)。LCAを注入し、ネフロン構造とヒトECを染色した移植オルガノイドの共焦点イメージングにより、糸球体構造にも侵入する灌流血管(図2A)による血管新生が確認されました(図2B)。血管系はキメラであり、灌流されたヒトEC(CD31+、LCA+)、灌流されていないヒトEC(CD31+、LCA-)、および灌流されたニワトリ由来のEC(CD31-、LCA+)を区別することができます(図2A、パネルIII、IV、V)。
図1:イントラトローム移植法 。 (A)hiPS細胞の腎臓オルガノイドへの分化、ニワトリ受精卵のインキュベーション、腎臓オルガノイドの細胞内移植のタイムライン。ニワトリ卵の孵卵開始の15日前(分化0日目=孵卵-15日目)にhiPS細胞から腎臓オルガノイドへの分化を開始し、孵卵4日目のニワトリ胚の分化の7日目+12日目に腎臓オルガノイドの移植を可能にします。インキュベーション日数: 0日目: 受精鶏卵をホルダーに水平に配置し(ステップ2.1.1)、ホルダーを38°C±1°Cのインキュベーターに入れます(プロトコルステップ2.1.2)。3日目:湾曲した解剖はさみの鋭い端で卵の上向きの側に小さな穴を開け(ステップ2.2.3)、この穴から始まる円形の窓を切り取ることによって、各卵に窓が作成されます(ステップ2.2.4)。卵をインキュベーターに戻す前に、窓を透明なテープで密封します。4日目:分化の7日目+ 12日目に腎臓オルガノイドのイントラノミック移植が行われます。胚はHH 23-24にあり、左側にあり、右側が視聴者に面しています(ステップ3.1.3)。翼と脚のつぼみの間には、セロミック腔へのアクセスを得るために卵子膜、絨毛膜、羊膜に開口部が作られ、オルガノイドがこれらの開口部からセロムに挿入されます。移植後、オルガノイドは翼芽のすぐ後ろに位置する白い構造として見えます。開いた卵子膜と羊膜の端が見えます(ステップ3.2.3および3.2.3-ズーム)。場合によっては、胚は回転し、左側ではなく右側に横たわり(3.1.3注)、移植前に向きを変える必要があります。12日目:蛍光標識レクチンを静脈内注射します。静脈は色によって動脈と区別されます。静脈の血液は酸素が豊富で、CAMから来ているので、胚から来る動脈よりもわずかに明るい赤です(ステップ4.2.2、4.2.2-ズーム、および4.2.3)。胚を屠殺し、オルガノイドを回収する。オルガノイド(丸で囲んだ部分)が鶏レバーに付着し、血管新生しているように見えます(ステップ5.2.3)。スケールバー= 1 mm。トップパネルの細胞内移植画像を描いた模式画像は、Koningらの許可を得て転載されました28。(B)マウスピース、38cmシリコンチューブ2本、0.2μmフィルター、コネクター、マイクロピペットプーラーでガラスマイクロキャピラリーを引っ張って生成したガラスマイクロインジェクションニードルからなる組み立て式注入システムの画像。略語:A =アラントワ;アム=羊膜;C =セロム;CC =絨毛膜をカットします。CHIR = CHIR99021;FGF9 =線維芽細胞成長因子9;hiPSC = ヒト人工多能性幹細胞;IM =中間中胚葉;lb =脚のつぼみ。O =オルガノイド;PS =プリミティブストリーク。U =臍帯;V =硝子体膜;Wb =翼のつぼみ。Y = 卵黄の茎。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:血管新生移植腎臓オルガノイド 。 (A)(I)未移植腎オルガノイドおよび(II)移植腎オルガノイドの免疫蛍光画像。どちらの条件でも、糸球体(NPHS1 +、シアン)および管状(LTL +、黄色)の構造が見られます。移植されていないオルガノイドには、いくつかのヒトEC(CD31+、緑色)が存在します。移植されたオルガノイドでは、灌流された血管網(CD31+、緑色、注入されたローダミン標識LCA+、白色)がオルガノイド全体に見られます。パネルIII、IV、およびVでは、移植オルガノイドで区別できる3種類のECを示すために、パネルIIのボックス化された領域の倍率が示されています。パネルIIIには、矢印でマークされた灌流されたヒトEC(CD31+、LCA+)が含まれています。パネルIVには、矢印でマークされた灌流されていないヒトEC(CD31+、LCA-)が含まれています。パネルVには、矢印でマークされた灌流ニワトリ由来のEC(CD31-、LCA+)が含まれています。スケールバー = 200 μm。 (B)未移植オルガノイド(I)では、EC(CD31+、緑色)が糸球体構造(NPHS1+、シアン)を取り囲んでいますが、侵入しません。移植されたオルガノイド(II)では、糸球体構造(NPHS1+、青色)は灌流された毛細血管(LCA +、白色;CD31+、緑)。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この原稿では、ニワトリ胚におけるhiPS細胞由来腎臓オルガノイドの細胞内移植のためのプロトコルが実証されています。移植時に、オルガノイドは、ヒトオルガノイド由来ECとニワトリ由来ECの組み合わせからなる灌流血管によって血管新生されます。これらはオルガノイド全体に広がり、糸球体構造に侵入し、ECと足細胞間の相互作用を可能にします。これがオルガノイド糸球体および管状構造の成熟の増強をもたらすことが以前に示された28。移植は非常に効率的で、胚あたり~5分かかり、胚が必要とする唯一のメンテナンスは、インキュベーター内の水盤の定期的な補充です。したがって、この方法は多数のオルガノイドの分析に非常に適しています。
腎臓オルガノイドの血管新生および成熟は、マウスへの移植を通じて以前に実証されている18,20。これらの労働集約型マウスモデルでは、オルガノイドを2〜最大12週間移植しました。ここに示すセロム内移植実験では、移植期間は8日間に制限されていました。これにより、孵卵の13日目の前に胚を犠牲にすることができ、胚は痛みを経験し始めると考えられています33,34。ニワトリ胚は21日目に孵化するので、移植期間は15日に延長され、孵化を避けるために19日目に胚を犠牲にすることができます。ただし、これには麻酔薬の使用が必要になります。このモデルでは移植期間が比較的短いにもかかわらず、オルガノイドポドサイトと侵入ECとの間のGBMの形成を含む、in vitroオルガノイドと比較してオルガノイドネフロンの広範な血管新生および有意な成熟を誘導する28。
セロム内移植実験を行う際には、すべてのニワトリ胚が正常に発育して生き残るわけではないことを考慮することが重要です。通常、0日目にインキュベーターに入れられた胚の~65%が実験の終点に到達します。これは、移植中の血管損傷によって引き起こされる急性出血(私たちの手の5%-10%)と、ウィンドウおよび移植手順によって引き起こされるストレスの組み合わせによるものです。胚がHH 23-24よりも早い段階または遅い段階にある場合、移植は限られたスペースとより広範な血管系のためにそれぞれ複雑になります。胚が予想される時間に正しい段階にない場合、これは孵卵の温度が原因である可能性があります、より高い温度は一般的により速い発達につながるので。
さらに、受精卵を孵卵前に長期間室温に保つと、発育のばらつきが大きくなります。これを避けるためには、実験の間および実験間でインキュベーターの温度を安定させなければならず、受精卵の分娩後3日以内にインキュベーションを開始する必要があります。手順間の胚死の予想外に高い割合は、脱水によって引き起こされる可能性があります。これを避けるためには、開封後と移植後に各卵にDPBS+/+ を2〜3滴加え、テープで卵を慎重に密封し、テープのしわをできるだけ滑らかにすることが不可欠です。ウィンドウと移植の手順を組み合わせて卵を開く回数を減らすことは、4日目のウィンドウ化が胚の死を大幅に増加させるため、お勧めしません。これは、この段階で卵殻に頻繁に付着するようになった血管の損傷の結果です。
結論として、この方法は、血管新生を誘導し、腎臓オルガノイドの成熟を促進するための効率的で強力なツールを提供します。これらのプロセスを多数のオルガノイドで研究するために使用でき、現在 in vitroで取得できるよりも高いレベルの成熟を必要とする腎疾患のモデリングの可能性を秘めています。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
ジョージ・ガラリス(LUMC、ライデン、オランダ)の鶏胚注入に協力してくれたことに感謝します。Saskia van der Wal-Maas(LUMC、ライデン、オランダ、解剖学および発生学部門)、Conny van Munsteren(LUMC、ライデン、オランダ)、Manon Zuurmond(LUMC、ライデン、オランダ)、およびAnnemarie de Graaf(LUMC、ライデン、オランダ)の支援に感謝します。M. Koning is supported by 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'.この研究の一部は、ライデン大学基金「Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund」GWF2019-02の支援を受けました。この研究は、Regenerative Medicine Crossing Borders(RegMedXB)とHealth Holland、Top Sector Life Sciences & Healthのパートナーによってサポートされています。C.W. van den BergとT.J. Rabelinkは、ノボ ノルディスク財団幹細胞医学センター(reNEW)の支援を受けており、ノボ ノルディスク財団幹細胞医学センターは、ノボ ノルディスク財団の助成金(NNF21CC0073729)の支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
References
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