Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Effektiv vaskularisering av nyreorganoider gjennom intracelomisk transplantasjon i kyllingembryoer

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/65090
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2,4, 1,2,4
1Department of Internal Medicine - Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory of Vascular and Regenerative Medicine, Leiden University Medical Center, 3IBPS, CNRS UMR7622, Developmental Biology Laboratory, Sorbonne Université, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center

Summary

Her presenterer vi en detaljert protokoll for transplantasjon av nyreorganoider i det celomiske hulrommet av kyllingembryoer. Denne metoden induserer vaskularisering og forbedret modning av organoider innen 8 dager og kan brukes til å studere disse prosessene på en effektiv måte.

Abstract

Nyreorganoider avledet fra humane induserte pluripotente stamceller inneholder nefronlignende strukturer som ligner de i den voksne nyren til en viss grad. Dessverre hemmes deres kliniske anvendelighet av mangelen på en funksjonell vaskulatur og følgelig begrenset modning in vitro. Transplantasjonen av nyreorganoider i det celomiske hulrommet av kyllingembryoer induserer vaskularisering av perfuserte blodkar, inkludert dannelsen av glomerulære kapillærer, og forbedrer modningen. Denne teknikken er svært effektiv, noe som muliggjør transplantasjon og analyse av et stort antall organoider. Dette papiret beskriver en detaljert protokoll for intracelomisk transplantasjon av nyreorganoider i kyllingembryoer, etterfulgt av injeksjon av fluorescerende merket lektin for å flekke den perfuserte vaskulaturen, og samlingen av transplanterte organoider for avbildningsanalyse. Denne metoden kan brukes til å indusere og studere organoid vaskularisering og modning for å finne ledetråder for å forbedre disse prosessene in vitro og forbedre sykdomsmodellering.

Introduction

Humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSC)-avledede nyreorganoider har vist seg å ha potensial for utviklingsstudier 1,2,3,4, toksisitetsscreening 5,6 og sykdomsmodellering 5,7,8,9,10,11,12,13 . Imidlertid er deres anvendelighet for disse og eventuelle kliniske transplantasjonsformål begrenset av mangelen på et vaskulært nettverk. Under embryonal nyreutvikling samhandler podocytter, mesangialceller og vaskulære endotelceller (EC) for å danne den intrikate strukturen til glomerulus. Uten denne interaksjonen kan den glomerulære filtreringsbarrieren, bestående av podocytter, den glomerulære kjellermembranen (GBM) og ECs, ikke utvikle seg riktig14,15,16. Selv om nyreorganoider in vitro inneholder noen EC, klarer disse ikke å danne et skikkelig vaskulært nettverk og avtar over tid17. Det er derfor ikke overraskende at organoidene forblir umodne. Transplantasjon hos mus induserer vaskularisering og modning av nyreorganoider 18,19,20,21. Dessverre er dette en arbeidsintensiv prosess som er uegnet for analyse av et stort antall organoider.

Kyllingembryoer har blitt brukt til å studere vaskularisering og utvikling i over et århundre22. De er lett tilgjengelige, krever lite vedlikehold, mangler et fullt funksjonelt immunsystem, og kan utvikle seg normalt etter åpning av eggeskallet23,24,25,26. Transplantasjon av organoider på deres chorioallantoic membran (CAM) har vist seg å føre til vaskularisering27. Imidlertid er varigheten av transplantasjonen på CAM, så vel som nivået av modning av transplantatet, begrenset av CAM-dannelse, som tar til embryonal dag 7 for å fullføre. Derfor ble det nylig utviklet en metode for effektivt å vaskularisere og modne nyreorganoider gjennom intracelomisk transplantasjon i kyllingembryoer28. Det celomiske hulrommet av kyllingembryoer har vært kjent siden 1930-tallet for å være et gunstig miljø for differensiering av embryonale vev 29,30. Det kan nås tidlig i embryonal utvikling og muliggjør relativt ubegrenset utvidelse av transplantatet i alle retninger.

Denne artikkelen skisserer en protokoll for transplantasjon av hiPSC-avledede nyreorganoider i det celomiske hulrommet på dag 4 kyllingembryoer. Denne metoden induserer vaskularisering og forbedret modning av organoider innen 8 dager. Injeksjon av fluorescerende merket linse culinaris agglutinin (LCA) før ofring av embryoene muliggjør visualisering av perfuserte blodkar i organoider gjennom konfokal mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I henhold til nederlandsk lov var det ikke nødvendig med godkjenning fra dyrevelferdskomiteen for denne undersøkelsen.

1. Klargjøring av hiPSC-avledede nyreorganoider for transplantasjon

  1. Differensiere hiPSCs til nyreorganoider ved hjelp av protokollen utviklet av Takasato et al.4,18,31. Dyrkning av organoidene som følger denne protokollen på polyestercellekulturinnsatser med 0,4 μm porer (cellekulturinnsatser) til dag 7 + 12 av differensiering. Hver cellekulturinnsats vil inneholde tre organoider.
  2. Fjern organoider fra cellekulturinnsatsen.
    1. Lag et hull i midten av membranen i cellekulturinnsatsen med et par dissekerende tang. Bruk dissekere saks, gjør tre kutt i membranen fra hullet i midten til kanten av cellekulturinnsatsen, kutt mellom organoider. Dette vil resultere i tre stykker membran, hver med en organoid festet, som fortsatt er koblet til cellekulturinnsatsen i ytterkanten.
    2. Ta tak i en av membranbitene nær ytterkanten med en tang og riv den løs fra cellekulturinnsatsen. Legg membranstykket med den vedlagte organoiden i en petriskål. Tilsett noen dråper Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) uten kalsium og magnesium (DPBS-/-) til organoiden for å unngå dehydrering. Gjenta for de to andre organoidene.
  3. Bisect organoidene ved å holde membranen på plass med tang og kutte dem i to med et dobbeltkantet rustfritt stålblad (en hel organoid er for stor for celom å imøtekomme på dette utviklingsstadiet). Skyv forsiktig de to organoidhalvdelene av membranen med en dura dissektor. Kast membranen og la organoidene ligge i DPBS-/- til transplantasjon.
    MERK: Forbered maksimalt tre organoider om gangen for transplantasjon for å unngå stress til organoider før transplantasjon. Ideelt sett forbereder en person organoider mens en annen utfører transplantasjonen.

2. Forbereder kyllingembryoer for transplantasjon

  1. Inkubere befruktede hvite leghornegg. Start inkubasjonen av eggene på nyreorganoid differensiering dag 7 + 8 for å sikre riktig tidspunkt for transplantasjonen.
    1. Legg de befruktede hvite leghorneggene (Gallus domesticus) horisontalt på en holder (figur 1A; dag 0), markerer midten av den oppovervendte siden med en blyant.
      MERK: Enten skreddersydde plastholdere eller eggekartonger kan brukes som holdere for å ruge eggene.
    2. Plasser holderen med eggene i en fuktet inkubator ved 38 ± 1 ºC (figur 1A; Dag 0).
    3. Inkuber eggene i 3 dager, og hold vannbassenget i inkubatoren fylt.
  2. Lag et vindu i eggeskallet på dag 3 av inkubasjon.
    1. På dag 3 av inkubasjonen, legg et lite stykke (~ 1 cm x 0,5 cm) gjennomsiktig tape på den spisse spissen av egget (liten ende). Lag et lite hull i eggeskallet i midten av det gjennomsiktige båndet ved å banke på det med den skarpe enden av en dissekerende saks.
    2. Sett en 19 G kanyle på en 5 ml sprøyte inn i hullet i en 45 ° vinkel, unngå skade på eggeplommesekken, og aspirer 2-3 ml albumen fra egget for å senke embryoet inne i egget. Forsegl hullet med et annet stykke (~ 1 cm x 0,5 cm) gjennomsiktig tape.
    3. Legg et stort stykke (~5 cm x 5 cm) gjennomsiktig tape på den blyantmerkede, oppovervendte siden av egget. Lag et hull i eggeskallet i midten av det gjennomsiktige båndet ved å banke på det med den skarpe enden av en dissekerende saks (figur 1A; Dag 3).
    4. Fra dette hullet, kutt et lite sirkulært vindu i eggeskallet ved hjelp av buet dissekerende saks. Se gjennom dette vinduet for å finne embryoet, og forstørr deretter vinduet for å optimalisere tilgangen til embryoet (figur 1A; Dag 3).
    5. Fjern eventuelle store biter av eggeskall som kan ha falt på toppen av embryoet ved hjelp av tang. Fjern mindre biter ved å plassere noen dråper DPBS med kalsium og magnesium (DPBS +//+) på embryoet med en plastoverføringspipette, og deretter aspirere DPBS +/+ med eggeskallet inn i pipetten.
    6. Tilsett tre dråper DPBS +/+ supplert med 0,5% penicillin / streptomycin til egget ved hjelp av en plastoverføringspipette.
    7. Forsegl vinduet forsiktig med et stort stykke (~5 cm x 5 cm) gjennomsiktig tape før du legger egget tilbake i inkubatoren til dag 4 av inkubasjonen, når embryoet er i Hamburger-Hamilton stadium 23-24 (HH 23-24)32.
      MERK: Forsegling av vinduet er svært viktig for å unngå dehydrering og død av embryoet.
    8. Sjekk embryoene daglig for levedyktighet ved å se på dem gjennom båndet (ikke fjern båndet for å unngå dehydrering). I løpet av disse første dagene av inkubasjonen endres eggeplommefargen fra lys til matt gul ved embryodød. Kast bort avdøde embryoer.
    9. Hold vannbassenget i inkubatoren fylt.

3. Intracelomisk transplantasjon på dag 4 av inkubasjonen

  1. Å få tilgang til det celomiske hulrommet
    1. Klipp båndet fra vinduet med buet dissekerende saks.
    2. Legg egget under et dissekerende mikroskop på en gummiholder eller eggekartong.
    3. Kyllingembryoet er nå i HH 23-24 og ligger på venstre side, med høyre side mot betrakteren (figur 1A; Dag 4). Finn høyre vinge og benknopp av embryoet, da celom vil bli tilgjengelig mellom disse to lemknoppene. I området mellom høyre vinge og benknopp, lag en åpning etter hverandre i vitellinemembranen, korionen og amnionen, ved å holde dem med to par dissekerende tang og forsiktig trekke dem i motsatte retninger.
      MERK: Vitellinemembranen er den første membranen som oppstår etter åpning av egget, og i noen tilfeller er den allerede skadet etter å ha laget vinduet på dag 3. Hvis embryoet roteres, ligger det på høyre side med venstre side mot betrakteren (figur 1A; dag 4), er det nødvendig å snu det rundt for å muliggjøre transplantasjon. For å gjøre dette, lag en stor åpning i vitellin- og chorionmembranen, og skru deretter embryoet forsiktig rundt med tang.
    4. Sjekk om det er uhindret tilgang til det celomiske hulrommet: Ta forsiktig tak i kanten av kroppsveggen mellom vingen og lemknoppen med et par dissekerende tang og trekk den litt mot betrakteren. Det celomiske hulrommet må være tydelig synlig. Sett forsiktig et sløvt, men slankt instrument (f.eks. En stump wolframtråd i en mikroskalpellholder) inn i det celomiske hulrommet.
      MERK: Hvis det ikke er mulig å sette inn det stumpe instrumentet i det celomiske hulrommet, betyr det at en eller flere av membranene ikke er ordentlig åpnet.
  2. Transplantasjon
    1. Legg en halv organoid inne i egget på toppen av allantois ved hjelp av en dura dissektor.
    2. Bruk dissekerende tang, ta forsiktig tak i kanten av kroppsveggen og trekk den litt mot betrakteren for å gjøre åpningen til celom synlig.
      MERK: Unngå å skade blodårene i kroppsveggen.
    3. Beveg organoiden forsiktig mot og gjennom åpningen i kroppsveggen inn i celom med en stump wolframtråd i en mikroskalpellholder. Skyv organoiden litt kranialt for å legge den inn i celom. Den er nå synlig like bak vingeknoppen (figur 1A; Dag 4).
    4. Tilsett tre dråper DPBS +/+ til egget ved hjelp av en plastoverføringspipette.
    5. Forsegl forsiktig vinduet med et stort stykke (~ 5 cm x 5 cm) gjennomsiktig tape før du legger egget tilbake i inkubatoren til dag 12 av inkubasjonen (8 dager etter transplantasjon).
    6. Fortsett å sjekke embryoene daglig for levedyktighet ved å se på dem gjennom båndet (ikke fjern båndet for å unngå dehydrering). Kast bort avdøde embryoer.
      MERK: Etter hvert som embryoene og deres chorioallantoiske membraner vokser, blir de tydeligere synlige gjennom båndet. Mangel på bevegelse av embryoet og kollapsede eller sparsomme blodkar er et tegn på embryodød.
    7. Kontroller vannbassenget i inkubatoren daglig og hold det fylt.

4. Injeksjon av fluorescerende merket lektin

  1. Forberedelse til injeksjon
    1. Lag mikroinjeksjonsnåler i glass ved å trekke glassmikrokapillærene i en mikropipettetrekker med følgende innstillinger: Varme 533, Trekk 60, Hastighet 150, Tid 200. Mens du ser gjennom dissekere mikroskopet, forsiktig bryte tipsene av microinjection nåler ved hjelp dissekere tang for å skape en åpning.
      MERK: De nødvendige innstillingene for mikropipettetrekkeren kan variere avhengig av maskinen.
    2. Monter injeksjonssystemet. Ta to stykker 38 cm silikonrør og koble dem til hverandre ved å plassere et 0,2 μm filter mellom dem. Sett et munnstykke inn i enden av røret som er koblet til filterutløpet (silikonrør 1), og en kontakt til enden av røret som er koblet til filterinntaket (silikonrør 2). Til slutt stikker mikroinjeksjonskanylen inn i koblingen (figur 1B).
    3. Fortynn fluorescerende merket linse culinaris agglutinin (LCA) med DPBS-/ - til en konsentrasjon på 2,5 mg ml-1 i et 0,5 ml rør og spinn ned for ~ 30 s i en mikrosentrifuge for å flytte aggregatene til bunnen av røret.
    4. Pipett 20 μL LCA på et stykke parafilm.
    5. Aspirer 20 mikroliter LCA fra parafilmen inn i mikrokapillærnålen i det monterte injeksjonssystemet.
  2. Innsprøytning
    1. Klipp båndet fra vinduet med buet dissekerende saks. Legg egget under et dissekerende mikroskop i en gummiholder.
    2. Vurder vaskulaturen og finn venene, som kan skilles fra arteriene ved sin litt lysere røde farge (figur 1A; Dag 12). For å forbedre tilgangen til vaskulaturen, forstørre vinduet forsiktig ved å kutte med buet dissekerende saks. Velg en blodåre for injeksjon basert på tilgjengelighet og størrelse.
    3. Stikk spissen av mikrokapillærnålen inn i den valgte venen i en vinkel på 0°-20º. Forsikre deg om at nålen er i venen ved å bevege spissen forsiktig fra side til side. Blås forsiktig og jevnt inn i injeksjonssystemet for å injisere livsløpsanalysen (figur 1A; Dag 12).
      MERK: Hvis nålen i venen er i riktig posisjon, bør den holde seg innenfor grensene til venen.
    4. Legg egget tilbake i inkubatoren i 10 minutter for å la LCA sirkulere.
      NOTAT: Det er ikke nødvendig å forsegle egget med tape i løpet av denne tiden.

5. Innsamling av transplanterte organoider på dag 12 av inkubasjonen

  1. Ofrer kyllingembryoet
    1. Legg egget i en gummiholder på benken. Klipp båndet fra vinduet med buet dissekerende saks. Deretter skjærer du gjennom membranene som omgir embryoet med buet dissekerende saks.
      MERK: Et dissekerende mikroskop er ikke nødvendig for dette trinnet.
    2. Øs embryoet opp fra egget med en perforert skje og halshugg embryoet umiddelbart ved hjelp av saks. Plasser embryoets kropp i en petriskål under disseksjonsmikroskopet.
  2. Lokalisere og samle organoider
    1. Legg embryoet på ryggen i petriskålen og spre lemmer.
    2. Åpne forsiktig bukveggen av embryoet langs lengdeaksen ved hjelp av tang.
    3. Finn organoid inne i embryoet. Organoiden fester seg oftest til høyre leverlapp, enten i halespissen eller kranialt like under brystkassen (figur 1A; Dag 12). Det anbefales derfor å starte med å se på disse stedene.
    4. Når organoiden er lokalisert, fjern den fra embryoet ved å kutte rundt den med mikrosaks. Plasser organoid og kyllingvev som uunngåelig er festet til det i en petriskål under dissekeringsmikroskopet. Fjern så mye kyllingvev som mulig med et dobbeltkantet barberblad i rustfritt stål.
    5. Behandle organoid avhengig av ønsket analyse.

6. Helmontert immunfluorescensfarging

  1. Legg en transplantert organoid i en 24-brønns plate og fikser i 500 μL 4% paraformaldehyd (PFA) ved 4 ° C i 24 timer. Vask 3x med DPBS-/-.
  2. Permeabiliser og blokker organoid i 300 μL blokkeringsløsning (0,3% Triton-X i DPBS-/- inneholdende 10% eselserum) i 2 timer ved romtemperatur.
  3. Forbered den primære antistoffblandingen: for en organoid, fortynnet primære antistoffer NPHS1 (sau-α-human, fortynning av 1:100), CD31 (mus-α-human, fortynning av 1:100) og LTL (biotinkonjugert, fortynning av 1:300) i 300 μL blokkeringsløsning. Tilsett antistoffblandingen til organoiden og inkuber i 72 timer ved 4 °C.
  4. Vask 3x med 0,3% TritonX i DPBS-/-.
  5. Forbered den sekundære antistoffblandingen: for en organoid, fortynnede sekundære antistoffer esel-α-sau Alexa Fluor 647 (fortynning av 1:500), esel-α-mus Alexa Fluor 488 (fortynning av 1:500) og streptapavidin Alexa Fluor 405 (fortynning av 1:200) i 300 μL blokkeringsløsning. Tilsett den sekundære antistoffblandingen til organoid og inkuber i 2-4 timer ved romtemperatur. Dekk til med aluminiumsfolie for å unngå eksponering av sekundære antistoffer mot lys.
  6. Vask 3x med DPBS-/-.
  7. Legg organoiden i ~ 30 μL monteringsmedium i en 35 mm glassbunnskål og la tørke over natten ved romtemperatur, dekket med aluminiumsfolie. Oppbevares ved 4 °C.
  8. Bilde ved hjelp av et konfokalmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metode og tidslinje for differensiering av hiPSC til nyreorganoider, inkubasjon av befruktede kyllingegg, transplantasjon av nyreorganoider, injeksjon av LCA og innsamling av organoider er oppsummert i figur 1A. Det er viktig å koordinere tidspunktet for organoid differensiering og kyllingegginkubasjon, og starte differensiering 15 dager før inkubasjon. Handlingene på dag 0, 3, 4 og 12 av inkubasjonen er illustrert med fotografier under tidslinjen. Organoider transplanteres på dag 7 + 12 av differensiering til dag 4 (HH 23-24) kyllingembryoer. LCA injiseres i embryoets venøse system 8 dager etter transplantasjon for å flekke den perfuserte vaskulaturen, før man ofrer embryoet og henter organoidet. Det sammensatte injeksjonssystemet er vist i figur 1B.

Kyllingembryoer ofres på dag 12 av inkubasjonen (figur 1A). Ved forsiktig disseksjon av embryoet, kan den transplanterte organoid vanligvis bli funnet festet til leveren. Når man ser gjennom et disseksjonsmikroskop, virker det vaskularisert (figur 1A; dag 12; trinn 5.2.3). Konfokal avbildning av transplanterte organoider injisert med LCA og farget for nefron strukturer og humane ECs bekrefter vaskularisering av perfuserte blodkar (figur 2A), som også invaderer glomerulære strukturer (figur 2B). Vaskulaturen er kimær: perfuserte humane ECs (CD31+, LCA+), ikke-perfuserte humane ECs (CD31+, LCA-) og perfuserte kyllingavledede ECs (CD31-, LCA+) kan skilles (figur 2A, panel III, IV, V).

Figure 1
Figur 1 Intracelomisk transplantasjonsmetode. (A) Tidslinje for differensiering av hissc til nyreorganoider, inkubasjon av befruktede kyllingegg og intracelomisk transplantasjon av nyreorganoider. Differensiering av hissc til nyreorganoider initieres 15 dager før inkubasjon av kyllingeggene startes (differensieringsdag 0 = inkubasjonsdag -15) for å muliggjøre transplantasjon av nyreorganoidene på dag 7 + 12 av differensiering i kyllingembryoer på dag 4 av inkubasjonen. Inkubasjonsdager: Dag 0: Befruktede kyllingegg plasseres horisontalt på holdere (trinn 2.1.1), som plasseres i en inkubator ved 38 ºC ± 1 °C (protokolltrinn 2.1.2). Dag 3: Et vindu opprettes i hvert egg ved å lage et lite hull i den oppovervendte siden av egget med den skarpe enden av et par buede dissekerende saks (trinn 2.2.3) og kutte et sirkulært vindu med utgangspunkt i dette hullet (trinn 2.2.4). Vinduet er forseglet med gjennomsiktig tape før egget legges tilbake i inkubatoren. Dag 4: Intracelomisk transplantasjon av nyreorganoider på dag 7 + 12 av differensiering utføres. Embryoet er i HH 23-24 og ligger på venstre side, med høyre side mot betrakteren (trinn 3.1.3). Mellom vingen og benknoppen er det laget en åpning i vitellinemembranen, korionen og amnion for å få tilgang til det celomiske hulrommet, og organoiden settes inn gjennom disse åpningene i celom. Etter transplantasjon er organoiden synlig som en hvit struktur som ligger like bak vingeknoppen. Kantene på den åpnede vitelline og amnion membraner er synlige (trinn 3.2.3 og 3.2.3-Zoom). I noen tilfeller roteres embryoene, liggende på høyre side i stedet for venstre side (3.1.3 MERK), og må snus før transplantasjon. Dag 12: Fluorescerende merket lektin injiseres intravenøst. Vener skiller seg fra arterier av deres farge; blodet i venene er oksygenrikt, kommer fra CAM, så de er litt lysere røde enn arteriene som kommer fra embryoet (trinn 4.2.2., 4.2.2-Zoom og 4.2.3.). Embryoet ofres og organoiden hentes. Organoiden (sirklet) har festet seg til kyllingelever og ser ut til å være vaskularisert (trinn 5.2.3). Skala bar = 1 mm. Det skjematiske bildet som viser det intracelomiske transplantasjonsbildet i topppanelet ble gjengitt med tillatelse fra Koning et al.28. (B) Bilde av det sammensatte injeksjonssystemet, bestående av et munnstykke, to stykker 38 cm silikonslange, et 0,2 μm filter, en kontakt og en mikroinjeksjonsnål i glass som ble generert ved å trekke glassmikrokapillærer i en mikropipettetrekker. Forkortelser: A = allantois; Am = amnion; C = celom; CC = kuttet korionmembran; CHIR = CHIR99021; FGF9 = fibroblast vekstfaktor 9; hiPSCs = humane induserte pluripotente stamceller; IM = mellomliggende mesoderm; Lb = benknopp; O = organoid; PS = primitiv strek; U = navlestreng; V = vitelline membran; Wb = vingeknopp; Y = eggeplomme stilk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Vaskulariserte transplanterte nyreorganoider. (A) Immunfluorescerende bilder av (I) en utransplantert nyreorganoid og (II) en transplantert nyreorganoid. Ved begge forhold er glomerulære (NPHS1+, cyan) og rørformede (LTL+, gule) strukturer synlige. I de utransplanterte organoidene er noen humane ECs (CD31+, grønne) til stede. I det transplanterte organoidet er et perfundert vaskulært nettverk (CD31+, grønt; injisert rhodaminmerket LCA+, hvitt) synlig i hele organoiden. I panelene III, IV og V vises forstørrelser av de boksede områdene i panel II for å demonstrere de tre typene EC som kan skilles i transplanterte organoider. Panel III inneholder perfuserte humane EC-er (CD31+, LCA+), merket med pilspisser. Panel IV inneholder uperfuserte humane EC-er (CD31+, LCA-), merket med pilspisser. Panel V inneholder perfuserte EC-er fra kylling (CD31-, LCA+), merket med pilspisser. Skalastang = 200 μm. (B) I utransplanterte organoider (I) omgir ECs (CD31+, grønn) glomerulære strukturer (NPHS1+, cyan), men invaderer dem ikke. I transplanterte organoider (II) vaskulariseres glomerulære strukturer (NPHS1+, blå) av perfuserte kapillærer (LCA+, hvit; CD31+, grønn). Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette manuskriptet er det vist en protokoll for intracelomisk transplantasjon av hiPSC-deriverte nyreorganoider i kyllingembryoer. Ved transplantasjon vaskulariseres organoider av perfuserte blodkar som består av en kombinasjon av humane organoidavledede og kyllingavledede ECer. Disse er spredt over hele organoid og invaderer glomerulære strukturer, noe som muliggjør interaksjon mellom ECs og podocytter. Det er tidligere vist at dette fører til økt modning av organoide, glomerulære og rørformede strukturer28. Transplantasjonen er svært effektiv, tar ~ 5 min per embryo, og det eneste vedlikeholdet som embryoene krever er en regelmessig påfylling av vannbassenget i inkubatoren. Denne metoden er derfor svært egnet for analyse av et stort antall organoider.

Vaskularisering og modning av nyreorganoider har tidligere blitt demonstrert gjennom transplantasjon hos mus18,20. I disse arbeidsintensive musemodellene ble organoider transplantert i 2 til opptil 12 uker. I de intracelomiske transplantasjonsforsøkene som er vist her, var transplantasjonsvarigheten begrenset til 8 dager. Dette gjør det mulig å ofre embryoene før dag 13 av inkubasjonen, når de antas å begynne å oppleve smerte33,34. Siden kyllingembryoer klekkes på dag 21, kan varigheten av transplantasjonen forlenges til 15 dager, og ofre embryoene på dag 19 for å unngå klekking. Dette vil imidlertid kreve bruk av bedøvelsesmidler. Til tross for den relativt korte transplantasjonsvarigheten i denne modellen, induserer den omfattende vaskularisering og signifikant modning av organoide nefroner sammenlignet med in vitro-organoider, inkludert dannelsen av en GBM mellom organoide podocytter og de invaderende ECene28.

Når du utfører intracelomiske transplantasjonseksperimenter, er det viktig å vurdere at ikke alle kyllingembryoer utvikler seg normalt og overlever. Vanligvis når ~ 65% av embryoene plassert i inkubatoren på dag 0 sluttpunktet for forsøket. Dette skyldes en kombinasjon av akutt blødning forårsaket av karskade under transplantasjon (5% -10% i våre hender) og stresset som er indusert av vindus- og transplantasjonsprosedyrene. Når embryoer er i et tidligere eller senere stadium enn HH 23-24, blir transplantasjonen komplisert på grunn av henholdsvis begrenset plass og mer omfattende vaskulatur. Hvis embryoer ikke er i riktig stadium til forventet tid, kan dette skyldes temperaturen på inkubasjonen, da en høyere temperatur generelt fører til raskere utvikling.

Videre holder befruktede egg ved romtemperatur i en lengre periode før inkubasjon induserer mer variasjon i utviklingen. For å unngå dette må temperaturen på inkubatoren holdes stabil gjennom og mellom eksperimenter, og inkubasjonen skal startes innen 3 dager etter levering av de befruktede eggene. Uventet høye prosentandeler av embryodød mellom prosedyrer kan skyldes dehydrering. For å unngå dette er det viktig å tilsette to eller tre dråper DPBS +/+ til hvert egg etter åpning og etter transplantasjon og forsegle egget veldig forsiktig med tape, og glatte ut bretter i båndet så mye som mulig. Det anbefales ikke å kombinere vindus- og transplantasjonstrinnene for å redusere antall ganger eggene åpnes, da vinduer på dag 4 øker embryodøden betydelig. Dette er et resultat av skade på blodkar som ofte har blitt festet til eggeskallet på dette stadiet.

Avslutningsvis gir denne metoden et effektivt og kraftig verktøy for å indusere vaskularisering og forbedre modningen i nyreorganoider. Det kan brukes til å studere disse prosessene i et stort antall organoider og har potensial for modellering av nyresykdommer som krever et høyere modningsnivå enn det som for tiden kan erverves in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Vi takker George Galaris (LUMC, Leiden, Nederland) for hans hjelp med kyllingembryoinjeksjon. Vi takker støtten fra Saskia van der Wal-Maas (Institutt for anatomi og embryologi, LUMC, Leiden, Nederland), Conny van Munsteren (Institutt for anatomi og embryologi, LUMC, Leiden, Nederland), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Nederland) og Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Nederland). M. Koning støttes av 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'. Dette arbeidet ble delvis støttet av Leiden University Fund "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. Dette arbeidet støttes av partnerne til Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) og Health Holland, Top Sector Life Sciences &; Health. C.W. van den Berg og T.J. Rabelink støttes av The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine støttes av tilskudd fra Novo Nordisk Foundation (NNF21CC0073729).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm Whatman 10462200
35 mm glass bottom dishes  MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177-5EA Contains silicone tubes, mouth piece and connector
Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope  Leica TCS SP8
Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips Hammacher Karl HAMMHTC091-10
Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips Hammacher Karl HAMMHTC090-11
Dissecting microscope  Wild Heerbrugg 355110
Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp Hammacher Karl HAMMHSB391-10
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-212-02 dilution 1:500
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 ThermoFisher Scientific A-21448 dilution 1:500
Double edged stainless steel razor blades Electron Microsopy Sciences 72000
DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) ThermoFisher Scientific 14040133
DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) ThermoFisher Scientific 14190094
Egg cartons or custom made egg holders  NA NA
Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)  Drost Loosdrecht B.V. NA
Incubator Elbanton BV ET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated Vector Laboratories B-1325 dilution 1:300
Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm Hammacher Karl HAMMHSB500-09
Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament World Precision Instruments TW150F-3
Micropipette puller Sutter Instrument Company Model P-97 We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. Euronexia L-120
Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant  ThermoFisher Scientific P36930
Olivecrona dura dissector 18 cm  Reda 41146-18
Parafilm  Heathrow Scientific HS234526B
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL ThermoFisher Scientific 15070063
Perforated spoon  Euronexia S-20-P
Petri dish 60 x 15 mm  CELLSTAR 628160
Plastic transfer pipettes  ThermoFisher Scientific PP89SB
Purified mouse anti-human CD31 antibody BD Biosciences 555444 dilution 1:100
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) Vector Laboratories RL-1042 This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)
Sheep anti-human NPHS1 antibody R&D systems AF4269 dilution 1:100
Sterile hypodermic needles, 19 G BD microlance 301500
Streptavidin Alexa Fluor 405 ThermoFisher Scientific S32351 dilution 1:200
Syringe 5 mL BD Emerald 307731
Transparent tape  Tesa 4124 Available at most hardware stores
Triton X Sigma-Aldrich T9284
Tungsten wire, 0.25 mm dia  ThermoFisher Scientific 010404.H2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
  2. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  3. Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
  4. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  5. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
  6. Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
  7. Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
  8. Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
  9. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
  10. Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
  11. Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
  12. Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
  13. Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
  14. Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
  15. Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
  16. Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
  17. Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
  18. vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
  19. Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
  20. Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
  21. vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
  22. Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
  23. Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
  24. Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
  25. Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
  26. Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
  27. Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
  28. Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
  29. Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
  30. Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
  31. Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
  32. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  33. Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
  34. ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , Available from: https://www.cpp.edu/research/research-compliance/iacuc/docs/iacuc-guidelines-on-euthanasia-of-chicken-and-embryos.pdf (2012).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 192
Effektiv vaskularisering av nyreorganoider gjennom intracelomisk transplantasjon i kyllingembryoer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koning, M., Lievers, E., Jaffredo,… More

Koning, M., Lievers, E., Jaffredo, T., van den Berg, C. W., Rabelink, T. J. Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (192), e65090, doi:10.3791/65090 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter