Summary
Burada, tavuk embriyolarının selomik boşluğunda böbrek organoidlerinin transplantasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, 8 gün içinde organoidlerin vaskülarizasyonunu ve gelişmiş olgunlaşmasını indükler ve bu süreçleri verimli bir şekilde incelemek için kullanılabilir.
Abstract
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden elde edilen böbrek organoidleri, yetişkin böbrektekine belirli bir dereceye kadar benzeyen nefron benzeri yapılar içerir. Ne yazık ki, klinik uygulanabilirlikleri fonksiyonel bir vaskülatür eksikliği ve sonuç olarak in vitro olgunlaşmanın sınırlı olması nedeniyle engellenmektedir. Tavuk embriyolarının selomik boşluğundaki böbrek organoidlerinin transplantasyonu, glomerüler kılcal damarların oluşumu da dahil olmak üzere perfüze edilmiş kan damarları tarafından vaskülarizasyonu indükler ve olgunlaşmalarını arttırır. Bu teknik çok etkilidir ve çok sayıda organoidin transplantasyonuna ve analizine izin verir. Bu yazıda, tavuk embriyolarında böbrek organoidlerinin intrasemik transplantasyonu için ayrıntılı bir protokol, ardından perfüze edilen vaskülatürü boyamak için floresan olarak etiketlenmiş lektin enjeksiyonu ve görüntüleme analizi için nakledilen organoidlerin toplanması açıklanmaktadır. Bu yöntem, in vitro olarak bu süreçleri geliştirmek ve hastalık modellemesini geliştirmek için ipuçları bulmak üzere organoid vaskülarizasyon ve olgunlaşmayı indüklemek ve incelemek için kullanılabilir.
Introduction
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kaynaklı böbrek organoidlerinin gelişimsel çalışmalariçin potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir 1,2,3,4, toksisite taraması 5,6 ve hastalık modelleme 5,7,8,9,10,11,12,13 . Bununla birlikte, bunlar ve nihai klinik transplantasyon amaçları için uygulanabilirlikleri, vasküler bir ağın olmaması nedeniyle sınırlıdır. Embriyonik böbrek gelişimi sırasında, podositler, mezangial hücreler ve vasküler endotel hücreleri (ECs), glomerulusun karmaşık yapısını oluşturmak için etkileşime girer. Bu etkileşim olmadan, podositler, glomerüler bazal membran (GBM) ve ECs'den oluşan glomerüler filtrasyon bariyeri düzgün bir şekilde gelişemez14,15,16. İn vitro böbrek organoidleri bazı EC'ler içermesine rağmen, bunlar uygun bir vasküler ağ oluşturamaz ve zamanla azalır17. Bu nedenle organoidlerin olgunlaşmamış kalması şaşırtıcı değildir. Farelerde transplantasyon, böbrek organoidlerinin vaskülarizasyonunu ve olgunlaşmasını indükler 18,19,20,21. Ne yazık ki, bu, çok sayıda organoidin analizi için uygun olmayan emek yoğun bir süreçtir.
Tavuk embriyoları, bir yüzyıldan fazla bir süredir vaskülarizasyon ve gelişimi incelemek için kullanılmıştır22. Kolayca erişilebilirler, düşük bakım gerektirirler, tamamen işlevsel bir bağışıklık sisteminden yoksundurlar ve yumurta kabuğunu açtıktan sonra normal olarak gelişebilirler23,24,25,26. Organoidlerin koryoallantoik membran (CAM) transplantasyonunun vaskülarizasyona yol açtığı gösterilmiştir27. Bununla birlikte, CAM üzerindeki transplantasyon süresi ve greftin olgunlaşma seviyesi, tamamlanması embriyonik gün 7'ye kadar süren CAM oluşumu ile sınırlıdır. Bu nedenle, son zamanlarda tavuk embriyolarında intrasemik transplantasyon yoluyla böbrek organoidlerini etkili bir şekilde vaskülarize etmek ve olgunlaştırmak için bir yöntem geliştirilmiştir28. Tavuk embriyolarının selomik boşluğunun 1930'lardan beri embriyonik dokuların farklılaşması için elverişli bir ortam olduğu bilinmektedir29,30. Embriyonik gelişimin erken dönemlerinde erişilebilir ve greftin her yöne nispeten sınırsız genişlemesine izin verir.
Bu yazıda, hiPSC türevi böbrek organoidlerinin 4. gün tavuk embriyolarının selomik boşluğunda transplantasyonu için bir protokol özetlenmiştir. Bu yöntem, 8 gün içinde organoidlerin vaskülarizasyonunu ve gelişmiş olgunlaşmasını indükler. Embriyoları feda etmeden önce floresan etiketli lens culinaris aglutinin (LCA) enjeksiyonu, konfokal mikroskopi ile organoidler içindeki perfüze kan damarlarının görüntülenmesini sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hollanda yasalarına göre, bu araştırma için hayvan refahı komitesinin onayı gerekli değildi.
1. HiPSC türevi böbrek organoidlerinin transplantasyon için hazırlanması
- Takasato ve ark.4,18,31 tarafından geliştirilen protokolü kullanarak hiPSC'leri böbrek organoidlerine ayırt edin. Polyester hücre kültürü ekleri üzerindeki bu protokolü takip eden organoidlerin kültürlenmesi, farklılaşmanın 7 + 12. gününe kadar 0.4 μm gözenekli (hücre kültürü ekleri). Her hücre kültürü eki üç organoid içerecektir.
- Organoidleri hücre kültürü ekinden çıkarın.
- Hücre kültürü ekinin zarının ortasında, bir çift diseksiyon forseps ile bir delik açın. Diseksiyon makası kullanarak, membranda ortadaki delikten hücre kültürü ekinin kenarına kadar üç kesim yapın ve organoidler arasında kesim yapın. Bu, her biri bir organoid eklenmiş olan ve hala dış kenarlarındaki hücre kültürü ekine bağlı olan üç parça membran ile sonuçlanacaktır.
- Dış kenarına yakın membran parçalarından birini bir çift forseps ile tutun ve hücre kültürü ekinden gevşetin. Membran parçasını ekli organoid ile bir Petri kabına yerleştirin. Dehidrasyonu önlemek için organoide kalsiyum ve magnezyum (DPBS-/-) içermeyen birkaç damla Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ekleyin. Diğer iki organoid için tekrarlayın.
- Organoidleri, zarlarını forseps ile yerinde tutarak ve çift kenarlı paslanmaz çelik bir tıraş bıçağı ile ikiye bölerek ikiye bölün (bütün bir organoid, celomun gelişimin bu aşamasında uyum sağlaması için çok büyüktür). İki organoid yarıyı bir dura dissektörü ile membrandan yavaşça itin. Zarı atın ve organoidleri transplantasyona kadar DPBS-/- içinde bırakın.
NOT: Transplantasyondan önce organoidlere stresi önlemek için transplantasyon için bir seferde en fazla üç organoid hazırlayın. İdeal olarak, bir kişi organoidleri hazırlarken, diğeri nakli gerçekleştirir.
2. Tavuk embriyolarının nakil için hazırlanması
- Döllenmiş beyaz bacak boynuzu yumurtalarını kuluçkaya yatırın. Transplantasyonun doğru zamanlamasını sağlamak için yumurtaların böbrek organoid farklılaşma günü 7 + 8'de kuluçkalanmasına başlayın.
- Döllenmiş beyaz bacak boynuzu yumurtalarını (Gallus domesticus) yatay olarak bir tutucu üzerine yerleştirin (Şekil 1A; gün 0), yukarı bakan tarafın ortasını bir kalemle işaretlemek.
NOT: Ismarlama plastik tutucular veya yumurta kartonları, yumurtaları kuluçkaya yatırmak için tutucu olarak kullanılabilir. - Tutucuyu yumurtalarla birlikte 38 ± 1 ºC'de nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin (Şekil 1A; gün 0).
- Yumurtaları 3 gün boyunca inkübe edin, inkübatördeki su havzasını dolu tutun.
- Döllenmiş beyaz bacak boynuzu yumurtalarını (Gallus domesticus) yatay olarak bir tutucu üzerine yerleştirin (Şekil 1A; gün 0), yukarı bakan tarafın ortasını bir kalemle işaretlemek.
- Kuluçkanın 3. gününde yumurta kabuğunda bir pencere oluşturun.
- Kuluçkanın 3. gününde, yumurtanın sivri ucuna (küçük uç) küçük bir parça (~ 1 cm x 0,5 cm) şeffaf bant yerleştirin. Şeffaf bandın ortasındaki yumurta kabuğunda, bir çift diseksiyon makasın keskin ucuyla dokunarak küçük bir delik açın.
- 5 mL'lik bir şırınga üzerine 19 G'lik bir iğneyi 45 ° 'lik bir açıyla deliğe yerleştirin, yumurta sarısı kesesine zarar vermekten kaçının ve yumurtanın içindeki embriyoyu indirmek için yumurtadan 2-3 mL albümin aspire edin. Deliği ikinci bir parça (~ 1 cm x 0,5 cm) şeffaf bantla kapatın.
- Yumurtanın kurşun kalemle işaretlenmiş, yukarı bakan tarafına büyük bir parça (~ 5 cm x 5 cm) şeffaf bant yerleştirin. Şeffaf bandın ortasındaki yumurta kabuğunda, bir çift diseksiyon makasının keskin ucuyla dokunarak bir delik açın (Şekil 1A; 3. gün).
- Bu delikten başlayarak, kavisli diseksiyon makası kullanarak yumurta kabuğunda küçük bir dairesel pencere kesin. Embriyoyu bulmak için bu pencereden bakın, ardından embriyoya erişimi optimize etmek için pencereyi genişletin (Şekil 1A; 3. gün).
- Forseps kullanarak embriyonun üstüne düşmüş olabilecek büyük yumurta kabuğu parçalarını çıkarın. Plastik bir transfer pipeti ile embriyonun üzerine kalsiyum ve magnezyum (DPBS+/+) içeren birkaç damla DPBS damlatarak ve ardından DPBS+/+'ı yumurta kabuğu ile pipete aspire ederek daha küçük parçaları çıkarın.
- Plastik bir transfer pipeti kullanarak yumurtaya% 0.5 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş üç damla DPBS+/+ ekleyin.
- Embriyo Hamburger-Hamilton aşaması 23-24 (HH 23-24)32'de olduğunda, yumurtayı inkübatörün 4. gününe kadar inkübatöre geri yerleştirmeden önce pencereyi büyük bir parça (~ 5 cm x 5 cm) şeffaf bantla dikkatlice kapatın.
NOT: Embriyonun dehidrasyonunu ve ölümünü önlemek için pencerenin kapatılması çok önemlidir. - Embriyolara günlük olarak banttan bakarak canlılık açısından kontrol edin (dehidrasyonu önlemek için bandı çıkarmayın). Kuluçkanın bu ilk günlerinde, yumurta sarısı rengi embriyo ölümü üzerine parlaktan mat sarıya dönüşür. Ölen embriyoları atın.
- İnkübatördeki su havzasını dolu tutun.
3. İnkübasyonun 4. gününde intrakomomik transplantasyon
- Çimento boşluğuna erişim kazanma
- Kavisli disseksiyon makası ile bandı pencereden kesin.
- Yumurtayı bir lastik tutucu veya yumurta kartonu üzerine diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.
- Tavuk embriyosu şu anda HH 23-24 aralığındadır ve sağ tarafı izleyiciye bakacak şekilde sol tarafında yatmaktadır (Şekil 1A; 4. gün). Embriyonun sağ kanadını ve bacak tomurcuğunu bulun, çünkü celom bu iki uzuv tomurcuğu arasında erişilecektir. Sağ kanat ve bacak tomurcuğu arasındaki alanda, vitelin zarında, koryonda ve amniyonda, iki çift diseksiyon forseps ile tutarak ve yavaşça zıt yönlere çekerek ardışık olarak bir açıklık oluşturun.
NOT: Vitelin membranı, yumurtayı açtıktan sonra karşılaşılan ilk zardır ve bazı durumlarda 3. günde pencereyi yaptıktan sonra zaten hasar görmüştür. Eğer embriyo döndürülmüşse, sol tarafı izleyiciye bakacak şekilde sağ tarafında yatmaktadır (Şekil 1A; 4. gün), transplantasyonu sağlamak için onu tersine çevirmek gerekir. Bunu yapmak için, vitelin ve koryon zarında büyük bir açıklık açın, ardından forseps kullanarak embriyoyu dikkatlice çevirin. - Selomik boşluğa engelsiz erişim olup olmadığını kontrol edin: bir çift diseksiyon forseps ile kanat ve uzuv tomurcuğu arasındaki vücut duvarının kenarını yavaşça tutun ve izleyiciye doğru hafifçe çekin. Çimento boşluğu açıkça görülebilmelidir. Çimento boşluğuna künt ama ince bir alet (örneğin, bir mikroneşter tutucusunda künt bir tungsten teli) dikkatlice yerleştirin.
NOT: Künt aletin selomik boşluğa sokulması mümkün değilse, bu, membranlardan bir veya daha fazlasının düzgün açılmadığı anlamına gelir.
- Ekimi
- Bir dura dissektörü kullanarak allantozun üzerine yumurtanın içine yarım organoid yerleştirin.
- Diseksiyon forsepsleri kullanarak, vücut duvarının kenarını dikkatlice tutun ve celom açıklığını görünür kılmak için izleyiciye doğru hafifçe çekin.
NOT: Vücut duvarındaki kan damarlarına zarar vermekten kaçının. - Organoidi, vücut duvarındaki açıklığa doğru ve içinden yavaşça bir mikroneşter tutucuda künt bir Tungsten teli ile celom içine doğru hareket ettirin. Organoidi celomun içine yerleştirmek için hafifçe kraniyal olarak itin. Artık kanat tomurcuğunun hemen arkasında görülebilir (Şekil 1A; 4. gün).
- Plastik bir transfer pipeti kullanarak yumurtaya üç damla DPBS+/+ ekleyin.
- Yumurtayı inkübasyonun 12. gününe kadar (transplantasyondan 8 gün sonra) inkübatöre geri yerleştirmeden önce pencereyi büyük bir parça (~ 5 cm x 5 cm) şeffaf bantla dikkatlice kapatın.
- Embriyolara banttan bakarak canlılık açısından günlük olarak kontrol etmeye devam edin (dehidrasyonu önlemek için bandı çıkarmayın). Ölen embriyoları atın.
NOT: Embriyolar ve koryoallantoik zarları büyüdükçe, banttan daha net görünür hale gelirler. Embriyo tarafından hareket eksikliği ve çökmüş veya seyrek kan damarları embriyo ölümünün bir işaretidir. - İnkübatördeki su havzasını günlük olarak kontrol edin ve dolu tutun.
4. Floresan etiketli lektin enjeksiyonu
- Enjeksiyon için hazırlık
- Aşağıdaki ayarlarla bir mikropipet çektirici içinde cam mikro kılcal damarları çekerek cam mikroenjeksiyon iğneleri yapın: Isı 533, Çekme 60, Hız 150, Zaman 200. Diseksiyon mikroskobuna bakarken, bir açıklık oluşturmak için diseksiyon forsepsleri kullanarak mikroenjeksiyon iğnelerinin uçlarını dikkatlice kırın.
NOT: Mikropipet çektirici için gerekli ayarlar makineye bağlı olarak farklılık gösterebilir. - Enjeksiyon sistemini monte edin. İki parça 38 cm'lik silikon boru alın ve aralarına 0,2 μm'lik bir filtre yerleştirerek birbirine bağlayın. Filtre çıkışına bağlı tüpün ucuna (silikon tüp 1) bir ağızlık ve filtre girişine bağlı tüpün ucuna bir konektör (silikon tüp 2) yerleştirin. Son olarak, mikroenjeksiyon iğnesini konektöre yerleştirin (Şekil 1B).
- Floresan olarak etiketlenmiş lens culinaris aglutinin (LCA) ile DPBS-/- ile 0,5 mL'lik bir tüpte 2,5 mg mL-1 konsantrasyonuna kadar seyreltin ve agregaları tüpün dibine taşımak için bir mikrosantrifüjde ~ 30 s aşağı döndürün.
- Bir parça parafilm üzerine 20 μL LCA pipet edin.
- 20 μL LCA'yı parafilmden monte edilmiş enjeksiyon sisteminin mikrokapiller iğnesine aspire edin.
- Aşağıdaki ayarlarla bir mikropipet çektirici içinde cam mikro kılcal damarları çekerek cam mikroenjeksiyon iğneleri yapın: Isı 533, Çekme 60, Hız 150, Zaman 200. Diseksiyon mikroskobuna bakarken, bir açıklık oluşturmak için diseksiyon forsepsleri kullanarak mikroenjeksiyon iğnelerinin uçlarını dikkatlice kırın.
- Enjeksiyon
- Kavisli disseksiyon makası ile bandı pencereden kesin. Yumurtayı bir lastik tutucuda diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.
- Vaskülatürü değerlendirin ve arterlerden biraz daha parlak kırmızı renkleriyle ayırt edilebilen damarları bulun (Şekil 1A; 12. gün). Vaskülatüre erişimi iyileştirmek için, kavisli diseksiyon makası ile keserek pencereyi dikkatlice büyütün. Erişilebilirliğe ve boyuta göre enjeksiyon için bir damar seçin.
- Mikrokapiler iğnenin ucunu seçilen damara 0°-20º açıyla yerleştirin. Ucu yavaşça bir yandan diğer yana hareket ettirerek iğnenin damarda olduğundan emin olun. LCA'yı enjekte etmek için enjeksiyon sistemine nazikçe ve istikrarlı bir şekilde üfleyin (Şekil 1A; 12. gün).
NOT: Damar içindeki iğne doğru pozisyonda ise damar sınırları içerisinde kalmalıdır. - LCA'nın dolaşmasına izin vermek için yumurtayı inkübatöre 10 dakika boyunca geri yerleştirin.
NOT: Bu süre zarfında yumurtanın bantla kapatılması gerekli değildir.
5. İnkübasyonun 12. gününde nakledilen organoidlerin toplanması
- Tavuk embriyosunu feda etmek
- Yumurtayı banktaki lastik bir tutucuya yerleştirin. Kavisli disseksiyon makası ile bandı pencereden kesin. Ardından, embriyoyu çevreleyen zarları kavisli diseksiyon makası ile kesin.
NOT: Bu adım için diseksiyon mikroskobu gerekli değildir. - Embriyoyu delikli bir kaşıkla yumurtadan çıkarın ve hemen makas kullanarak embriyonun kafasını kesin. Embriyonun vücudunu diseksiyon mikroskobu altında bir Petri kabına yerleştirin.
- Yumurtayı banktaki lastik bir tutucuya yerleştirin. Kavisli disseksiyon makası ile bandı pencereden kesin. Ardından, embriyoyu çevreleyen zarları kavisli diseksiyon makası ile kesin.
- Organoidlerin bulunması ve toplanması
- Embriyoyu Petri kabına sırt üstü yerleştirin ve uzuvlarını yayın.
- Forseps kullanarak embriyonun karın duvarını uzunlamasına eksen boyunca dikkatlice açın.
- Embriyonun içindeki organoidi bulun. Organoid en sık sağ karaciğer lobuna kaudal uçta veya kraniyal olarak göğüs kafesinin hemen altında bağlanır (Şekil 1A; 12. gün). Bu nedenle, bu konumlara bakarak başlamanız önerilir.
- Organoid yerleştirildikten sonra, mikro makasla etrafını keserek embriyodan çıkarın. Organoidi ve kaçınılmaz olarak ona bağlı olan tavuk dokusunu, diseksiyon mikroskobunun altındaki bir Petri kabına yerleştirin. Çift kenarlı paslanmaz çelik tıraş bıçağı ile mümkün olduğunca fazla tavuk dokusunu çıkarın.
- İstenilen analize bağlı olarak organoidi işleyin.
6. Tam montajlı immünofloresan boyama
- Nakledilen bir organoidi 24 delikli bir plakaya yerleştirin ve 24 saat boyunca 4 ° C'de 500 μL% 4 paraformaldehit (PFA) içine sabitleyin. DPBS-/- ile 3 kez yıkayın.
- Organoidi oda sıcaklığında 2 saat boyunca 300 μL bloke edici çözelti (DPBS-/-% 10 eşek serumu içeren% 0.3 Triton-X ) içinde geçirgen hale getirin ve bloke edin.
- Birincil antikor karışımını hazırlayın: bir organoid için, birincil antikorlar NPHS1 (koyun-α-insan, 1:100 seyreltme), CD31 (fare-α-insan, 1:100 seyreltme) ve LTL (biyotin konjuge edilmiş, 1:300 seyreltme) 300 μL bloke çözeltisi içinde seyreltin. Antikor karışımını organoide ekleyin ve 4 ° C'de 72 saat inkübe edin.
- DPBS-/-'de %0,3 TritonX ile 3 kat yıkayın.
- İkincil antikor karışımını hazırlayın: bir organoid için, ikincil antikorları eşek-α-koyun Alexa Fluor 647 (1:500'ün seyreltilmesi), eşek α fare Alexa Fluor 488'i (1:500'ün seyreltilmesi) ve streptavidin Alexa Fluor 405'i (1:200'ün seyreltilmesi) 300 μL blokaj çözeltisinde seyreltin. İkincil antikor karışımını organoide ekleyin ve oda sıcaklığında 2-4 saat inkübe edin. İkincil antikorların ışığa maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo ile örtün.
- DPBS-/- ile 3 kez yıkayın.
- Organoidi ~ 30 μL montaj ortamına 35 mm'lik bir cam tabanlı bir kaba yerleştirin ve alüminyum folyo ile kaplanmış oda sıcaklığında gece boyunca kurumaya bırakın. 4 °C'de saklayın.
- Konfokal mikroskop kullanarak görüntü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HiPSC'lerin böbrek organoidlerine farklılaşması, döllenmiş tavuk yumurtasının inkübasyonu, böbrek organoidlerinin transplantasyonu, LCA enjeksiyonu ve organoidlerin toplanması için yöntem ve zaman çizelgesi Şekil 1A'da özetlenmiştir. Organoid farklılaşma ve tavuk yumurtası inkübasyonunun zamanlamasını koordine etmek, inkübasyondan 15 gün önce farklılaşmaya başlamak önemlidir. Kuluçkanın 0, 3, 4 ve 12. günlerindeki eylemler zaman çizelgesinin altındaki fotoğraflarla gösterilmiştir. Organoidler, 4. gün (HH 23-24) tavuk embriyolarına farklılaşmanın 7 + 12. gününde ekilir. LCA, transplantasyondan 8 gün sonra, perfüze edilen vaskülatürü boyamak için, embriyoyu feda etmeden ve organoidi almadan önce embriyonun venöz sistemine enjekte edilir. Monte edilmiş enjeksiyon sistemi Şekil 1B'de gösterilmiştir.
Tavuk embriyoları inkübasyonun 12. gününde kurban edilir (Şekil 1A). Embriyonun dikkatli bir şekilde diseksiyonu üzerine, nakledilen organoid genellikle karaciğere bağlı olarak bulunabilir. Diseksiyon mikroskobundan bakıldığında vaskülarize görünür (Şekil 1A; gün 12; adım 5.2.3). LCA enjekte edilen ve nefron yapıları ve insan EC'leri için boyanan transplante organoidlerin konfokal görüntülemesi, glomerüler yapıları da invaze eden perfüze kan damarları (Şekil 2A) tarafından vaskülarizasyonu doğrulamaktadır (Şekil 2B). Vaskülatür kimeriktir: perfüze edilmiş insan EC'leri (CD31+, LCA+), perfüzyonsuz insan EC'leri (CD31+, LCA-) ve perfüzyonlu tavuk türevi EC'ler (CD31-, LCA+) ayırt edilebilir (Şekil 2A, paneller III, IV, V).
Şekil 1: İntrasemik transplantasyon yöntemi . (A) HiPSC'lerin böbrek organoidlerine farklılaşmasının, döllenmiş tavuk yumurtasının inkübasyonunun ve böbrek organoidlerinin intrasemik transplantasyonunun zaman çizelgesi. HiPSC'lerin böbrek organoidlerine farklılaşması, tavuk yumurtasının inkübasyonuna başlamadan 15 gün önce (farklılaşma günü 0 = kuluçka günü -15) başlatılarak, inkübasyonun 4. gününde tavuk embriyolarında farklılaşmanın 7 + 12. gününde böbrek organoidlerinin transplantasyonunu sağlar. Kuluçka günleri: Gün 0: Döllenmiş tavuk yumurtası, 38 ºC ± 1 °C'de bir inkübatöre yerleştirilen tutuculara yatay olarak yerleştirilir (adım 2.1.1) (protokol adımı 2.1.2). 3. Gün: Her yumurtada, bir çift kavisli diseksiyon makasının keskin ucu ile yumurtanın yukarı bakan tarafında küçük bir delik açılarak (adım 2.2.3) ve bu delikten başlayan dairesel bir pencere kesilerek (adım 2.2.4) bir pencere oluşturulur. Yumurtayı inkübatöre geri yerleştirmeden önce pencere şeffaf bantla kapatılır. 4. Gün: İntrakomik böbrek organoidlerinin transplantasyonu 7+12. günde farklılaşma yapılır. Embriyo HH 23-24'tedir ve sağ tarafı izleyiciye bakacak şekilde sol tarafında yatmaktadır (adım 3.1.3). Kanat ve bacak tomurcuğu arasında, selomik boşluğa erişim sağlamak için vitelin zarında, koryonda ve amniyonda bir açıklık açılır ve organoid bu açıklıklardan selom içine sokulur. Transplantasyondan sonra, organoid kanat tomurcuğunun hemen arkasında bulunan beyaz bir yapı olarak görülebilir. Açılan vitelin ve amniyon membranlarının kenarları görülebilir (adım 3.2.3 ve 3.2.3-Zoom). Bazı durumlarda, embriyolar sol taraf yerine sağ yatarak döndürülür (3.1.3 NOT) ve transplantasyondan önce döndürülmeleri gerekir. 12. Gün: Floresan olarak etiketlenmiş lektin intravenöz olarak enjekte edilir. Damarlar arterlerden renklerine göre ayırt edilir; damarlardaki kan, CAM'den gelen oksijen bakımından zengindir, bu nedenle embriyodan gelen arterlerden biraz daha parlak bir kırmızıdır (adım 4.2.2., 4.2.2-Zoom ve 4.2.3.). Embriyo kurban edilir ve organoid geri alınır. Organoid (daire içine alınmış) tavuk karaciğerine bağlanmıştır ve vaskülarize olmuş gibi görünmektedir (adım 5.2.3). Ölçek çubuğu = 1 mm. Üst panelde intraplazomik transplantasyon görüntüsünü gösteren şematik görüntü, Koning ve ark.28'in izniyle yeniden basılmıştır. (B) Bir ağızlık, iki adet 38 cm'lik silikon boru, 0,2 μm filtre, bir konektör ve bir mikropipet çektirici içinde cam mikrokapiler çekilerek oluşturulan bir cam mikroenjeksiyon iğnesinden oluşan monte edilmiş enjeksiyon sisteminin görüntüsü. Kısaltmalar: A = allantois; = amniyon; C = celom; CC = kesilmiş koryon membranı; CHIR = CHIR99021; FGF9 = fibroblast büyüme faktörü 9; hiPSC'ler = insan kaynaklı pluripotent kök hücreler; IM = orta mezoderm; Lb = bacak tomurcuğu; O = organoid; PS = ilkel çizgi; U = göbek halkası; V = vitelin membran; Wb = kanat tomurcuğu; Y = yumurta sarısı sapı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Vaskülarize transplante edilmiş böbrek organoidleri . (A) (I) nakledilmemiş bir böbrek organoidinin ve (II) nakledilen bir böbrek organoidinin immünofloresan görüntüleri. Her iki durumda da, glomerüler (NPHS1 +, camgöbeği) ve boru şeklindeki (LTL +, sarı) yapılar görülebilir. Transplante edilmemiş organoidlerde, bazı insan EC'leri (CD31 +, yeşil) bulunur. Nakledilen organoidde, perfüze edilmiş bir vasküler ağ (CD31 +, yeşil; enjekte edilen rodamin etiketli LCA +, beyaz) organoid boyunca görülebilir. Panel III, IV ve V'de, nakledilen organoidlerde ayırt edilebilen üç tip EC'yi göstermek için panel II'deki kutulu alanların büyütmeleri gösterilmiştir. Panel III, ok uçlarıyla işaretlenmiş perfüze edilmiş insan EC'lerini (CD31+, LCA+) içerir. Panel IV, ok uçlarıyla işaretlenmiş geçirgen olmayan insan EC'leri (CD31+, LCA-) içerir. Panel V, ok uçlarıyla işaretlenmiş perfüze edilmiş tavuk türevi EC'ler (CD31-, LCA+) içerir. Ölçek çubuğu = 200 μm. (B) Nakledilmemiş organoidlerde (I), EC'ler (CD31+, yeşil) glomerüler yapıları (NPHS1+, camgöbeği) çevreler, ancak onları istila etmezler. Transplante edilen organoidlerde (II), glomerüler yapılar (NPHS1+, mavi) perfüze kılcal damarlar (LCA +, beyaz; CD31+, yeşil). Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, tavuk embriyolarında hiPSC türevi böbrek organoidlerinin intrasemik transplantasyonu için bir protokol gösterilmiştir. Transplantasyon üzerine, organoidler, insan organoid kaynaklı ve tavuk kaynaklı ECs'nin bir kombinasyonundan oluşan perfüze kan damarları tarafından vaskülarize edilir. Bunlar organoid boyunca yayılır ve glomerüler yapıları istila ederek ECs ve podositler arasında etkileşimi sağlar. Daha önce bunun organoid glomerüler ve tübüler yapıların olgunlaşmasının artmasına yol açtığı gösterilmiştir28. Transplantasyon çok verimlidir, embriyo başına ~ 5 dakika sürer ve embriyoların ihtiyaç duyduğu tek bakım, inkübatördeki su havzasının düzenli olarak doldurulmasıdır. Bu nedenle bu yöntem çok sayıda organoidin analizi için çok uygundur.
Böbrek organoidlerinin vaskülarizasyonu ve olgunlaşması daha önce farelerde transplantasyon yoluyla gösterilmiştir18,20. Bu emek yoğun fare modellerinde, organoidler 2 ila 12 hafta boyunca nakledildi. Burada gösterilen intrasemik transplantasyon deneylerinde nakil süresi 8 gün ile sınırlandırılmıştır. Bu, embriyoların inkübasyonun 13. gününden önce, ağrı yaşamaya başladıkları düşünüldüğünde kurban edilmesine izin verir33,34. Tavuk embriyoları 21. günde yumurtadan çıktığı için, nakil süresi 15 güne kadar uzatılabilir ve yumurtadan çıkmayı önlemek için embriyoları 19. günde feda edebilir. Bununla birlikte, bu, anesteziklerin kullanılmasını gerektirecektir. Bu modeldeki nispeten kısa transplantasyon süresine rağmen, organoid podositler ve istilacı ECs28 arasında GBM oluşumu da dahil olmak üzere, in vitro organoidlere kıyasla organoid nefronların yaygın vaskülarizasyonuna ve belirgin olgunlaşmasına neden olur.
İntrasemik transplantasyon deneyleri yaparken, tüm tavuk embriyolarının normal şekilde gelişmediğini ve hayatta kalmadığını göz önünde bulundurmak önemlidir. Genellikle, 0. günde inkübatöre yerleştirilen embriyoların ~% 65'i deneyin bitiş noktasına ulaşır. Bunun nedeni, nakil sırasında damar hasarının neden olduğu akut kanamanın (ellerimizde% 5-10) ve pencereleme ve transplantasyon prosedürlerinin neden olduğu stresin bir kombinasyonudur. Embriyolar HH 23-24'ten daha erken veya geç bir aşamada olduğunda, sırasıyla sınırlı alan ve daha geniş vaskülatür nedeniyle transplantasyon karmaşıklaşır. Embriyolar beklenen zamanda doğru aşamada değilse, bunun nedeni inkübasyonun sıcaklığı olabilir, çünkü daha yüksek bir sıcaklık genellikle daha hızlı gelişmeye yol açar.
Ayrıca, döllenmiş yumurtaların inkübasyondan önce uzun süre oda sıcaklığında tutulması, gelişimde daha fazla değişkenliğe neden olur. Bunu önlemek için, inkübatörün sıcaklığı deneyler boyunca ve arasında sabit tutulmalı ve döllenmiş yumurtaların tesliminden sonraki 3 gün içinde inkübasyona başlanmalıdır. İşlemler arasında beklenmedik şekilde yüksek embriyo ölümü yüzdeleri dehidrasyondan kaynaklanabilir. Bunu önlemek için, açıldıktan sonra ve nakledildikten sonra her yumurtaya iki veya üç damla DPBS + / + eklemek ve yumurtayı bantla çok dikkatli bir şekilde kapatmak, banttaki kırışıklıkları mümkün olduğunca düzeltmek önemlidir. Yumurtaların açılma sayısını azaltmak için pencereleme ve transplantasyon adımlarının birleştirilmesi önerilmez, çünkü 4. günde pencereleme embriyo ölümünü önemli ölçüde artırır. Bu, bu aşamada sıklıkla yumurta kabuğuna bağlanan kan damarlarına verilen hasarın sonucudur.
Sonuç olarak, bu yöntem vaskülarizasyonu indüklemek ve böbrek organoidlerinde olgunlaşmayı arttırmak için etkili ve güçlü bir araç sağlar. Bu süreçleri çok sayıda organoidde incelemek için kullanılabilir ve şu anda in vitro olarak edinilenden daha yüksek bir olgunlaşma seviyesi gerektiren böbrek hastalıklarının modellenmesi için potansiyele sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
George Galaris'e (LUMC, Leiden, Hollanda) tavuk embriyosu enjeksiyonu konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Saskia van der Wal-Maas (Anatomi ve Embriyoloji Bölümü, LUMC, Leiden, Hollanda), Conny van Munsteren (Anatomi ve Embriyoloji Bölümü, LUMC, Leiden, Hollanda), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Hollanda) ve Annemarie de Graaf'ın (LUMC, Leiden, Hollanda) desteklerini kabul ediyoruz. M. Koning, 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC' tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma kısmen Leiden Üniversitesi Fonu "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fonu" GWF2019-02 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Rejeneratif Tıp Sınırları Aşan (RegMedXB) ve Health Holland, Top Sector Life Sciences &; Health ortakları tarafından desteklenmektedir. C.W. van den Berg ve T.J. Rabelink, Novo Nordisk Vakfı Kök Hücre Tıbbı Merkezi (reNEW), Novo Nordisk Vakfı Kök Hücre Tıbbı Merkezi, Novo Nordisk Vakfı hibeleri (NNF21CC0073729) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
References
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
- Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
- Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
- Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
- Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
- Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
- Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
- Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
- Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
- vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
- Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
- vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
- Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
- Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
- Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
- Rawles, M. E.
- Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
- Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
- Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
- Dossel, W. E.
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
