Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Effektiv vaskularisering av njurorganoider genom intracelomisk transplantation i kycklingembryon

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/65090
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2,4, 1,2,4
1Department of Internal Medicine - Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory of Vascular and Regenerative Medicine, Leiden University Medical Center, 3IBPS, CNRS UMR7622, Developmental Biology Laboratory, Sorbonne Université, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center

Summary

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för transplantation av njurorganoider i celomhålan hos kycklingembryon. Denna metod inducerar vaskularisering och förbättrad mognad av organoiderna inom 8 dagar och kan användas för att studera dessa processer på ett effektivt sätt.

Abstract

Njurorganoider härrörande från humaninducerade pluripotenta stamceller innehåller nefronliknande strukturer som liknar dem i den vuxna njuren till en viss grad. Tyvärr hämmas deras kliniska tillämplighet av bristen på funktionell vaskulatur och följaktligen begränsad mognad in vitro. Transplantationen av njurorganoider i den celomiska håligheten hos kycklingembryon inducerar vaskularisering genom perfuserade blodkärl, inklusive bildandet av glomerulära kapillärer, och förbättrar deras mognad. Denna teknik är mycket effektiv, vilket möjliggör transplantation och analys av ett stort antal organoider. Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för intracelomisk transplantation av njurorganoider i kycklingembryon, följt av injektion av fluorescerande märkt lektin för att färga den perfuserade vaskulaturen och samlingen av transplanterade organoider för avbildningsanalys. Denna metod kan användas för att inducera och studera organoid vaskularisering och mognad för att hitta ledtrådar för att förbättra dessa processer in vitro och förbättra sjukdomsmodellering.

Introduction

Humant inducerade pluripotenta stamcellsbaserade njurorganoider (hiPSC) har visat sig ha potential för utvecklingsstudier 1,2,3,4, toxicitetsscreening 5,6 och sjukdomsmodellering5,7,8,9,10,11,12,13. Deras tillämplighet för dessa och eventuella kliniska transplantationsändamål begränsas dock av avsaknaden av ett vaskulärt nätverk. Under embryonal njurutveckling interagerar podocyter, mesangiala celler och vaskulära endotelceller (EC) för att bilda glomerulus invecklade struktur. Utan denna interaktion kan den glomerulära filtreringsbarriären, bestående av podocyter, det glomerulära basalmembranet (GBM) och EC, inte utvecklas ordentligt14,15,16. Även om njurorganoider in vitro innehåller vissa EC, misslyckas dessa med att bilda ett ordentligt vaskulärt nätverk och minskar med tiden17. Det är därför inte förvånande att organoiderna förblir omogna. Transplantation hos möss inducerar vaskularisering och mognad av njurorganoiderna 18,19,20,21. Tyvärr är detta en arbetsintensiv process som är olämplig för analys av ett stort antal organoider.

Kycklingembryon har använts för att studera vaskularisering och utveckling i över ett sekel22. De är lättillgängliga, kräver lågt underhåll, saknar ett fullt fungerande immunförsvar och kan utvecklas normalt efter att äggskalet 23,24,25,26 har öppnats. Transplantation av organoider på deras korioallantoiska membran (CAM) har visat sig leda till vaskularisering27. Varaktigheten av transplantation på CAM, liksom mognadsnivån för transplantatet, begränsas emellertid av CAM-bildning, vilket tar fram till embryonal dag 7 att slutföra. Därför utvecklades nyligen en metod för att effektivt vaskularisera och mogna njurorganoider genom intracelomisk transplantation i kycklingembryon28. Celomhålan hos kycklingembryon har varit känd sedan 1930-talet för att vara en gynnsam miljö för differentiering av embryonala vävnader29,30. Det kan nås tidigt i embryonal utveckling och möjliggör relativt obegränsad expansion av transplantatet i alla riktningar.

Detta dokument beskriver ett protokoll för transplantation av hiPSC-härledda njurorganoider i celomikhålan hos dag 4 kycklingembryon. Denna metod inducerar vaskularisering och förbättrad mognad av organoiderna inom 8 dagar. Injektion av fluorescerande märkt lins culinaris agglutinin (LCA) före uppoffring av embryon möjliggör visualisering av perfuserade blodkärl i organoiderna genom konfokalmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I enlighet med nederländsk lag krävdes inte godkännande av djurskyddskommittén för denna forskning.

1. Beredning av hiPSC-härledda njurorganoider för transplantation

  1. Differentiera hiPSC till njurorganoider med hjälp av protokollet som utvecklats av Takasato et al.4,18,31. Odla organoiderna enligt detta protokoll på polyestercellodlingsinsatser med 0,4 μm porer (cellodlingsinsatser) fram till dag 7 + 12 av differentieringen. Varje cellodlingsinsats kommer att innehålla tre organoider.
  2. Ta bort organoiderna från cellodlingsinsatsen.
    1. Gör ett hål i mitten av cellodlingsinsatsens membran med ett par dissekerande pincett. Använd dissekeringssax och gör tre snitt i membranet från hålet i mitten till kanten av cellodlingsinsatsen och skär mellan organoiderna. Detta kommer att resultera i tre bitar av membran, var och en med en organoid fäst, som fortfarande är anslutna till cellodlingsinsatsen vid deras ytterkant.
    2. Ta tag i en av membranbitarna nära dess ytterkant med en pincett och riv loss den från cellodlingsinsatsen. Placera membranbiten med den bifogade organoiden i en petriskål. Tillsätt några droppar Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) utan kalcium och magnesium (DPBS - / -) till organoiden för att undvika uttorkning. Upprepa för de andra två organoiderna.
  3. Skär organoiderna genom att hålla membranet på plats med pincett och skära dem på mitten med ett dubbelkantigt rakblad i rostfritt stål (en hel organoid är för stor för att celom ska rymma i detta utvecklingsstadium). Tryck försiktigt bort de två organoidhalvorna från membranet med en duradissektor. Kassera membranet och lämna organoiderna i DPBS -/- tills transplantation.
    OBS: Förbered högst tre organoider åt gången för transplantation för att undvika stress på organoiderna före transplantation. Helst förbereder en person organoiderna medan en annan utför transplantationen.

2. Förbereda kycklingembryon för transplantation

  1. Inkubera befruktade vita benhornägg. Börja inkubationen av äggen på njurorganoiddifferentieringsdag 7 + 8 för att säkerställa korrekt tidpunkt för transplantationen.
    1. Placera de befruktade vita benhornsäggen (Gallus domesticus) horisontellt på en hållare (figur 1A; dag 0), markera mitten av den uppåtvända sidan med en penna.
      OBS: Antingen skräddarsydda plasthållare eller äggkartonger kan användas som hållare för att inkubera äggen.
    2. Placera hållaren med äggen i en fuktad inkubator vid 38 ± 1 °C (figur 1A; dag 0).
    3. Inkubera ägget i 3 dagar, håll vattenbassängen i inkubatorn fylld.
  2. Skapa ett fönster i äggskalet på inkubationens dag 3.
    1. På dag 3 av inkubationen, placera en liten bit (~ 1 cm x 0,5 cm) transparent tejp på äggets spetsiga spets (liten ände). Gör ett litet hål i äggskalet i mitten av det transparenta tejpen genom att knacka på det med den skarpa änden av en dissekeringssax.
    2. Sätt in en 19 G nål på en 5 ml spruta i hålet i 45 ° vinkel, undvik skador på äggula sac och aspirera 2-3 ml albumen från ägget för att sänka embryot inuti ägget. Försegla hålet med en andra bit (~ 1 cm x 0,5 cm) transparent tejp.
    3. Lägg en stor bit (~ 5 cm x 5 cm) transparent tejp på den pennmärkta, uppåtvända sidan av ägget. Gör ett hål i äggskalet i mitten av det transparenta tejpen genom att knacka på det med den skarpa änden av en dissekeringssax (figur 1A; dag 3).
    4. Börja från detta hål, skär ett litet cirkulärt fönster i äggskalet med böjd dissekeringssax. Titta genom detta fönster för att hitta embryot och förstora sedan fönstret för att optimera tillgången till embryot (Figur 1A; dag 3).
    5. Ta bort alla stora bitar äggskal som kan ha fallit ovanpå embryot med pincett. Ta bort mindre bitar genom att placera några droppar DPBS med kalcium och magnesium (DPBS +/+) på embryot med en plastöverföringspipett och sedan aspirera DPBS +/+ med äggskalet i pipetten.
    6. Tillsätt tre droppar DPBS +/+ kompletterat med 0,5% penicillin / streptomycin till ägget med en plastöverföringspipett.
    7. Försegla försiktigt fönstret med en stor bit (~ 5 cm x 5 cm) transparent tejp innan du lägger tillbaka ägget i inkubatorn till dag 4 av inkubationen, när embryot är i Hamburger-Hamilton stadium 23-24 (HH 23-24)32.
      OBS: Tätning av fönstret är mycket viktigt för att undvika uttorkning och död av embryot.
    8. Kontrollera embryon dagligen för livskraft genom att titta på dem genom tejpen (ta inte bort tejpen för att undvika uttorkning). Under dessa första inkubationsdagar ändras äggulafärgen från ljus till matt gul vid embryodöd. Kassera avlidna embryon.
    9. Håll vattenbassängen i inkubatorn fylld.

3. Intracelomisk transplantation på inkubationsdag 4

  1. Få tillgång till celomikhålan
    1. Klipp tejpen från fönstret med böjd dissekeringssax.
    2. Placera ägget under ett dissekeringsmikroskop på en gummihållare eller äggkartong.
    3. Kycklingembryot är nu i HH 23-24 och ligger på vänster sida, med höger sida vänd mot betraktaren (figur 1A; Dag 4). Leta reda på embryots högra vinge och benknopp, eftersom celom kommer att nås mellan dessa två lemknoppar. I området mellan höger vinge och benknopp, skapa en öppning i följd i vitellinmembranet, korionen och amnionen genom att hålla dem med två par dissekerande pincett och försiktigt dra dem i motsatta riktningar.
      OBS: Vitellinmembranet är det första membranet som påträffas efter att ägget öppnats och är i vissa fall redan skadat efter att ha gjort fönstret på dag 3. Om embryot roteras, liggande på höger sida med vänster sida vänd mot betraktaren (figur 1A; dag 4), är det nödvändigt att vända det för att möjliggöra transplantation. För att göra detta, gör en stor öppning i vitellin- och korionmembranet och vänd sedan försiktigt embryot med pincett.
    4. Kontrollera om det finns fri tillgång till celomikhålan: ta försiktigt tag i kanten på kroppsväggen mellan vingen och lemknoppen med ett par dissekerande pincett och dra den något mot betraktaren. Celomic håligheten måste vara tydligt synlig. Sätt försiktigt in ett trubbigt men smalt instrument (t.ex. en trubbig volframtråd i en mikroskalpellhållare) i celomikhålan.
      OBS: Om det trubbiga instrumentet inte kan föras in i celomikhålan betyder det att ett eller flera av membranen inte har öppnats ordentligt.
  2. Transplantation
    1. Placera en halv organoid inuti ägget ovanpå allantois med en dura dissektor.
    2. Använd dissekerande pincett, ta försiktigt tag i kanten på kroppsväggen och dra den något mot betraktaren för att göra öppningen till celom synlig.
      OBS: Undvik att skada blodkärlen i kroppsväggen.
    3. Flytta försiktigt organoiden mot och genom öppningen i kroppsväggen in i celom med en trubbig volframtråd i en mikroskalpellhållare. Tryck organoiden något kranialt för att lägga den inuti celom. Den är nu synlig strax bakom vingknoppen (figur 1A; Dag 4).
    4. Tillsätt tre droppar DPBS +/+ till ägget med en plastöverföringspipett.
    5. Försegla försiktigt fönstret med en stor bit (~ 5 cm x 5 cm) transparent tejp innan du lägger ägget tillbaka i inkubatorn till dag 12 av inkubation (8 dagar efter transplantation).
    6. Fortsätt kontrollera embryon dagligen för livskraft genom att titta på dem genom tejpen (ta inte bort tejpen för att undvika uttorkning). Kassera avlidna embryon.
      OBS: När embryona och deras korioallantoiska membran växer blir de tydligare synliga genom tejpen. Brist på rörelse av embryot och kollapsade eller glesa blodkärl är ett tecken på embryodöd.
    7. Kontrollera vattenbassängen i inkubatorn dagligen och håll den fylld.

4. Injektion av fluorescerande märkt lektin

  1. Förberedelser för injektion
    1. Gör mikroinjektionsnålar av glas genom att dra glasmikrokapillärer i en mikropipettavdragare med följande inställningar: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200. Medan du tittar igenom dissekeringsmikroskopet, bryt försiktigt spetsarna från mikroinjektionsnålarna med dissekerande pincett för att skapa en öppning.
      OBS: De nödvändiga inställningarna för mikropipettavdragaren kan variera beroende på maskinen.
    2. Montera injektionssystemet. Ta två stycken 38 cm silikonslangar och anslut dem till varandra genom att placera ett 0,2 μm filter mellan dem. Sätt in ett munstycke i rörets ände som är anslutet till filterutloppet (silikonrör 1) och en kontakt till rörets ände som är ansluten till filterinloppet (silikonrör 2). För slutligen in mikroinjektionsnålen i kontakten (bild 1B).
    3. Späd fluorescerande märkt lins culinaris agglutinin (LCA) med DPBS - / - till en koncentration av 2,5 mg ml-1 i ett 0,5 ml rör och snurra ner i ~ 30 s i en mikrocentrifug för att flytta aggregaten till botten av röret.
    4. Pipettera 20 μL LCA på en bit parafilm.
    5. Aspirera 20 μL LCA från parafilmen till mikrokapillärnålen i det monterade injektionssystemet.
  2. Injektion
    1. Klipp tejpen från fönstret med böjd dissekeringssax. Placera ägget under ett dissekeringsmikroskop i en gummihållare.
    2. Utvärdera vaskulaturen och lokalisera venerna, som kan särskiljas från artärerna med sin något ljusare röda färg (Figur 1A; dag 12). För att förbättra tillgången till vaskulaturen, förstora försiktigt fönstret genom att klippa med böjd dissekeringssax. Välj en ven för injektion baserat på tillgänglighet och storlek.
    3. För in spetsen på mikrokapillärnålen i den valda venen i en vinkel på 0 ° -20 °. Se till att nålen är i venen genom att försiktigt flytta spetsen från sida till sida. Blås försiktigt och stadigt in i insprutningssystemet för att injicera LCA (figur 1A; dag 12).
      OBS: Om nålen i venen är i rätt läge ska den hålla sig inom venens gränser.
    4. Lägg tillbaka ägget i inkubatorn i 10 minuter för att låta LCA cirkulera.
      OBS: Det är inte nödvändigt att försegla ägget med tejp under denna tid.

5. Samla transplanterade organoider på inkubationsdag 12

  1. Offrar kycklingembryot
    1. Lägg ägget i en gummihållare på bänken. Klipp tejpen från fönstret med böjd dissekeringssax. Skär sedan genom membranen som omger embryot med krökt dissekeringssax.
      OBS: Ett dissekerande mikroskop krävs inte för detta steg.
    2. Skopa embryot upp från ägget med en perforerad sked och halshugg omedelbart embryot med sax. Placera embryonets kropp i en petriskål under dissektionsmikroskopet.
  2. Lokalisera och samla organoider
    1. Placera embryot på ryggen i petriskålen och sprid dess lemmar.
    2. Öppna försiktigt embryonets bukvägg längs längdaxeln med pincett.
    3. Leta reda på organoid inuti embryot. Organoiden fästs oftast vid höger leverlob, antingen vid stjärtspetsen eller kranialt strax under bröstkorgen (figur 1A; dag 12). Det rekommenderas därför att börja med att titta på dessa platser.
    4. När organoiden är belägen, ta bort den från embryot genom att klippa runt den med mikrosax. Placera organoiden och kycklingvävnaden som oundvikligen är fäst vid den i en petriskål under dissekeringsmikroskopet. Ta bort så mycket kycklingvävnad som möjligt med ett dubbelkantigt rakblad i rostfritt stål.
    5. Bearbeta organoiden beroende på önskad analys.

6. Helmonterad immunofluorescensfärgning

  1. Placera en transplanterad organoid i en platta med 24 brunnar och fixera i 500 μL 4% paraformaldehyd (PFA) vid 4 °C i 24 timmar. Tvätta 3x med DPBS-/-.
  2. Permeabilisera och blockera organoiden i 300 μL blockerande lösning (0,3% Triton-X i DPBS -/- innehållande 10% åsneserum) i 2 timmar vid rumstemperatur.
  3. Bered den primära antikroppsblandningen: för en organoid, utspädda primära antikroppar NPHS1 (får-α-människa, utspädning av 1:100), CD31 (mus-α-människa, utspädning av 1:100) och LTL (biotinkonjugerad, utspädning av 1:300) i 300 μL blockerande lösning. Tillsätt antikroppsblandningen till organoiden och inkubera i 72 timmar vid 4 °C.
  4. Tvätta 3x med 0,3% TritonX i DPBS-/-.
  5. Förbered den sekundära antikroppsblandningen: för en organoid, utspädd sekundär antikroppar åsna-α-får Alexa Fluor 647 (utspädning av 1:500), åsna-α-mus Alexa Fluor 488 (utspädning av 1:500) och streptavidin Alexa Fluor 405 (utspädning av 1:200) i 300 μL blockerande lösning. Tillsätt den sekundära antikroppsblandningen till organoiden och inkubera i 2-4 timmar vid rumstemperatur. Täck med aluminiumfolie för att undvika exponering av sekundära antikroppar för ljus.
  6. Tvätta 3x med DPBS-/-.
  7. Bädda in organoiden i ~ 30 μL monteringsmedium i en 35 mm glasbottenskål och låt torka över natten vid rumstemperatur, täckt med aluminiumfolie. Förvaras vid 4 °C.
  8. Bild med hjälp av ett konfokalmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metoden och tidslinjen för differentiering av hiPSC till njurorganoider, inkubation av befruktade kycklingägg, transplantation av njurorganoider, injektion av LCA och insamling av organoiderna sammanfattas i figur 1A. Det är viktigt att samordna tidpunkten för organoiddifferentiering och kycklingägginkubation, som börjar differentiering 15 dagar före inkubation. Åtgärderna på dag 0, 3, 4 och 12 av inkubationen illustreras av fotografier under tidslinjen. Organoider transplanteras vid dag 7 + 12 av differentiering till dag 4 (HH 23-24) kycklingembryon. LCA injiceras i embryonets venösa system 8 dagar efter transplantation för att färga den perfuserade vaskulaturen, innan embryot offras och organoiden hämtas. Det monterade insprutningssystemet visas i figur 1B.

Kycklingembryon offras på inkubationsdag 12 (figur 1A). Vid noggrann dissektion av embryot kan den transplanterade organoiden vanligtvis hittas fäst vid levern. Om man tittar genom ett dissektionsmikroskop verkar det vaskulariserat (figur 1A; dag 12; steg 5.2.3). Konfokal avbildning av transplanterade organoider injicerade med LCA och färgade för nefronstrukturer och humana ECs bekräftar vaskularisering av perfuserade blodkärl (figur 2A), som också invaderar glomerulära strukturer (figur 2B). Kärlen är chimär: perfuserade humana ECs (CD31+, LCA+), operfuserade humana ECs (CD31+, LCA-) och perfuserade kyckling-härledda ECs (CD31-, LCA+) kan särskiljas (Figur 2A, paneler III, IV, V).

Figure 1
Figur 1: Intracelomisk transplantationsmetod . (A) Tidslinje för differentiering av hiPSC till njurorganoider, inkubation av befruktade kycklingägg och intracelomisk transplantation av njurorganoider. Differentiering av hiPSC till njurorganoider initieras 15 dagar innan inkubation av kycklingägg påbörjas (differentieringsdag 0 = inkubationsdag -15) för att möjliggöra transplantation av njurorganoiderna på dag 7 + 12 av differentiering i kycklingembryon på dag 4 av inkubationen. Ruvningsdagar: Dag 0: Befruktade kycklingägg placeras horisontellt på hållarna (steg 2.1.1) som placeras i en inkubator vid 38 °C ± 1 °C (protokollsteg 2.1.2). Dag 3: Ett fönster skapas i varje ägg genom att göra ett litet hål i äggets uppåtvända sida med den skarpa änden av en böjd dissekeringssax (steg 2.2.3) och klippa ett cirkulärt fönster med början från detta hål (steg 2.2.4). Fönstret är förseglat med transparent tejp innan ägget placeras tillbaka i inkubatorn. Dag 4: Intracelomisk transplantation av njurorganoider på dag 7 + 12 av differentiering utförs. Embryot är i HH 23-24 och ligger på vänster sida, med höger sida vänd mot betraktaren (steg 3.1.3). Mellan vingen och benknoppen görs en öppning i vitellinmembranet, korionen och amnionen för att få tillgång till celomhålan, och organoiden sätts in genom dessa öppningar i celomet. Efter transplantation är organoiden synlig som en vit struktur som ligger strax bakom vingknoppen. Kanterna på de öppnade vitellin- och amnionmembranen är synliga (steg 3.2.3 och 3.2.3-Zoom). I vissa fall roteras embryona, liggande på höger sida istället för vänster sida (3.1.3 OBS), och måste vändas före transplantation. Dag 12: Fluorescerande märkt lektin injiceras intravenöst. Vener skiljer sig från artärer genom sin färg; blodet i venerna är syrerikt och kommer från CAM, så de är något ljusare röda än artärerna som kommer från embryot (steg 4.2.2., 4.2.2-Zoom och 4.2.3.). Embryot offras och organoiden hämtas. Organoiden (inringad) har fastnat i kycklinglevern och verkar vara vaskulariserad (steg 5.2.3). Skalstång = 1 mm. Den schematiska bilden som visar den intracelomiska transplantationsbilden i den övre panelen trycktes om med tillstånd från Koning et al.28. (B) Bild av det monterade insprutningssystemet, bestående av ett munstycke, två stycken 38 cm silikonslang, ett 0,2 μm filter, en anslutningsdon och en mikroinjektionsnål av glas som genererades genom att dra glasmikrokapillärer i en mikropipettavdragare. Förkortningar: A = allantois; Am = amnion; C = celom; CC = skuret korionmembran; CHIR = CHIR99021; FGF9 = fibroblasttillväxtfaktor 9, hiPSC = pluripotenta stamceller orsakade av människa, IM = mellanliggande mesoderm; Lb = benknopp; O = organoid; PS = primitiv strimma; U = navelring; V = vitellinmembran; Wb = vingknopp; Y = äggula stjälk. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Vaskulariserade transplanterade njurorganoider . (A) Immunofluorescerande bilder av (I) en otransplanterad njurorganoid och (II) en transplanterad njurorganoid. Under båda förhållandena är glomerulära (NPHS1+, cyan) och rörformiga (LTL+, gula) strukturer synliga. I de otransplanterade organoiderna finns vissa humana ECs (CD31 +, grön) närvarande. I den transplanterade organoiden är ett perfuserat vaskulärt nätverk (CD31+, grönt; injicerat rodaminmärkt LCA+, vitt) synligt i hela organoiden. I panelerna III, IV och V visas förstoringar av de boxade områdena i panel II för att demonstrera de tre typerna av ECs som kan särskiljas i transplanterade organoider. Panel III innehåller perfuserade humana ECs (CD31+, LCA+), märkta med pilspetsar. Panel IV innehåller operfuserade humana ECs (CD31+, LCA-), märkta med pilspetsar. Panel V innehåller perfuserade kycklingbaserade ECs (CD31-, LCA+), märkta med pilspetsar. Skalstapel = 200 μm. (B) I otransplanterade organoider (I) omger ECs (CD31+, grön) glomerulära strukturer (NPHS1+, cyan) men invaderar dem inte. I transplanterade organoider (II) vaskulariseras glomerulära strukturer (NPHS1+, blå) av perfuserade kapillärer (LCA+, vit; CD31+, grön). Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta manuskript demonstreras ett protokoll för intracelomisk transplantation av hiPSC-härledda njurorganoider i kycklingembryon. Vid transplantation vaskuliseras organoider av perfuserade blodkärl som består av en kombination av humana organoid-härledda och kyckling-härledda ECs. Dessa sprids över hela organoiden och invaderar de glomerulära strukturerna, vilket möjliggör interaktion mellan ECs och podocyter. Det har tidigare visats att detta leder till ökad mognad av de organoida glomerulära och rörformiga strukturerna,28. Transplantationen är mycket effektiv, tar ~ 5 min per embryo, och det enda underhåll som embryon kräver är en regelbunden påfyllning av vattenbassängen i inkubatorn. Denna metod är därför mycket lämplig för analys av ett stort antal organoider.

Vaskularisering och mognad av njurorganoider har tidigare visats genom transplantation hos möss18,20. I dessa arbetsintensiva musmodeller transplanterades organoider i 2 till upp till 12 veckor. I de intracelomiska transplantationsexperimenten som visas här var transplantationstiden begränsad till 8 dagar. Detta möjliggör offring av embryon före dag 13 av inkubation, när de tros börja uppleva smärta33,34. Eftersom kycklingembryon kläcks på dag 21 kan transplantationstiden förlängas till 15 dagar och offra embryona på dag 19 för att undvika kläckning. Detta skulle dock kräva användning av bedövningsmedel. Trots den relativt korta transplantationstiden i denna modell inducerar den omfattande vaskularisering och signifikant mognad av organoidnefroner jämfört med in vitro-organoider, inklusive bildandet av en GBM mellan organoidpodocyter och de invaderande ECs28.

Vid utförande av intracelomiska transplantationsexperiment är det viktigt att överväga att inte alla kycklingembryon utvecklas normalt och överlever. Vanligtvis når ~ 65% av embryon som placeras i inkubatorn vid dag 0 slutpunkten för experimentet. Detta beror på en kombination av akut blödning orsakad av kärlskador under transplantation (5% -10% i våra händer) och den stress som induceras av fönster- och transplantationsprocedurerna. När embryon befinner sig i ett tidigare eller senare stadium än HH 23-24 blir transplantationen komplicerad på grund av begränsat utrymme respektive mer omfattande vaskulatur. Om embryon inte är i rätt stadium vid den förväntade tiden kan detta bero på inkubationens temperatur, eftersom en högre temperatur i allmänhet leder till snabbare utveckling.

Att hålla befruktade ägg vid rumstemperatur under en längre period före inkubation inducerar dessutom mer variation i utvecklingen. För att undvika detta måste inkubatorns temperatur hållas stabil under och mellan experiment, och inkubation bör startas inom 3 dagar efter leverans av de befruktade äggen. Oväntat höga procentandelar av embryodöd mellan procedurer kan orsakas av uttorkning. För att undvika detta är det viktigt att tillsätta två eller tre droppar DPBS +/+ till varje ägg efter att det har öppnats och efter transplantation och försegla ägget mycket försiktigt med tejp och jämna ut veck i tejpen så mycket som möjligt. Att kombinera fönster- och transplantationsstegen för att minska antalet gånger äggen öppnas rekommenderas inte, eftersom fönsterning på dag 4 ökar embryodöden avsevärt. Detta är resultatet av skador på blodkärl som ofta har fastnat på äggskalet i detta skede.

Sammanfattningsvis ger denna metod ett effektivt och kraftfullt verktyg för att inducera vaskularisering och förbättra mognad i njurorganoider. Det kan användas för att studera dessa processer i ett stort antal organoider och har potential för modellering av njursjukdomar som kräver en högre mognadsnivå än vad som för närvarande kan förvärvas in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar George Galaris (LUMC, Leiden, Nederländerna) för hans hjälp med injektion av kycklingembryon. Vi erkänner stödet från Saskia van der Wal-Maas (Institutionen för anatomi och embryologi, LUMC, Leiden, Nederländerna), Conny van Munsteren (Institutionen för anatomi och embryologi, LUMC, Leiden, Nederländerna), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Nederländerna) och Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Nederländerna). M. Koning stöds av "Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC". Detta arbete stöddes delvis av Leiden University Fund "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. Detta arbete stöds av partnerna Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) och Health Holland, Top Sector Life Sciences &; Health. C.W. van den Berg och T.J. Rabelink stöds av Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine stöds av Novo Nordisk Foundation bidrag (NNF21CC0073729).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm Whatman 10462200
35 mm glass bottom dishes  MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177-5EA Contains silicone tubes, mouth piece and connector
Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope  Leica TCS SP8
Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips Hammacher Karl HAMMHTC091-10
Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips Hammacher Karl HAMMHTC090-11
Dissecting microscope  Wild Heerbrugg 355110
Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp Hammacher Karl HAMMHSB391-10
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-212-02 dilution 1:500
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 ThermoFisher Scientific A-21448 dilution 1:500
Double edged stainless steel razor blades Electron Microsopy Sciences 72000
DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) ThermoFisher Scientific 14040133
DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) ThermoFisher Scientific 14190094
Egg cartons or custom made egg holders  NA NA
Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)  Drost Loosdrecht B.V. NA
Incubator Elbanton BV ET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated Vector Laboratories B-1325 dilution 1:300
Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm Hammacher Karl HAMMHSB500-09
Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament World Precision Instruments TW150F-3
Micropipette puller Sutter Instrument Company Model P-97 We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. Euronexia L-120
Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant  ThermoFisher Scientific P36930
Olivecrona dura dissector 18 cm  Reda 41146-18
Parafilm  Heathrow Scientific HS234526B
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL ThermoFisher Scientific 15070063
Perforated spoon  Euronexia S-20-P
Petri dish 60 x 15 mm  CELLSTAR 628160
Plastic transfer pipettes  ThermoFisher Scientific PP89SB
Purified mouse anti-human CD31 antibody BD Biosciences 555444 dilution 1:100
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) Vector Laboratories RL-1042 This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)
Sheep anti-human NPHS1 antibody R&D systems AF4269 dilution 1:100
Sterile hypodermic needles, 19 G BD microlance 301500
Streptavidin Alexa Fluor 405 ThermoFisher Scientific S32351 dilution 1:200
Syringe 5 mL BD Emerald 307731
Transparent tape  Tesa 4124 Available at most hardware stores
Triton X Sigma-Aldrich T9284
Tungsten wire, 0.25 mm dia  ThermoFisher Scientific 010404.H2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
  2. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  3. Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
  4. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  5. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
  6. Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
  7. Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
  8. Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
  9. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
  10. Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
  11. Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
  12. Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
  13. Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
  14. Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
  15. Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
  16. Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
  17. Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
  18. vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
  19. Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
  20. Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
  21. vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
  22. Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
  23. Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
  24. Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
  25. Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
  26. Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
  27. Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
  28. Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
  29. Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
  30. Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
  31. Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
  32. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  33. Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
  34. ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , Available from: https://www.cpp.edu/research/research-compliance/iacuc/docs/iacuc-guidelines-on-euthanasia-of-chicken-and-embryos.pdf (2012).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 192
Effektiv vaskularisering av njurorganoider genom intracelomisk transplantation i kycklingembryon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koning, M., Lievers, E., Jaffredo,… More

Koning, M., Lievers, E., Jaffredo, T., van den Berg, C. W., Rabelink, T. J. Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (192), e65090, doi:10.3791/65090 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter