Summary
Dette papir præsenterer en reproducerbar metode med nye fund om tilstedeværelsen af epitelceller i normalt humant og museblod og knoglemarv ved hjælp af flowcytometri og immunofluorescensmikroskopi. Krt1-14;mTmG transgene mus blev brugt som en in vivo metode til at bekræfte disse fund.
Abstract
Epitelceller er blevet identificeret i blod og knoglemarv hos patienter med kræft og andre sygdomme. Imidlertid er tilstedeværelsen af normale epitelceller i blod og knoglemarv hos raske individer endnu ikke identificeret på en konsekvent måde. Her præsenteres en reproducerbar metode til isolering af epitelceller fra sundt humant og murin blod og knoglemarv (BM) ved hjælp af flowcytometri og immunofluorescens (IF) mikroskopi. Epitelceller hos raske individer blev først identificeret og isoleret via flowcytometri ved hjælp af epitelcelleadhæsionsmolekyle (EpCAM). Disse EpCAM+ celler blev bekræftet at udtrykke keratin ved hjælp af immunofluorescensmikroskopi i Krt1-14;mTmG transgene mus. Humane blodprøver havde 0,18% ± 0,0004 EpCAM+ celler (SEM; n = 7 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater). I human BM var 3,53% ± 0,006 (SEM; n = 3 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater) af mononukleære celler EpCAM+. I museblod udgjorde EpCAM+ celler 0,45% ± 0,0006 (SEM; n=2 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater), og i mus BM var 5,17% ± 0,001 (SEM; n=3 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater) EpCAM+. Hos mus var alle EpCAM+ cellerne immunreaktive over for pan-cytokeratin, bestemt ved IF-mikroskopi. Resultaterne blev bekræftet ved hjælp af Krt1-14;mTmG transgene mus med lave (8,6 native GFP+ celler pr. 106 analyserede celler; 0,085% af levedygtige celler), men et signifikant antal (p < 0,0005) GFP+ celler til stede i normal murine BM, der ikke var resultatet af tilfældighed sammenlignet med flere negative kontroller. Desuden var EpCAM+ celler i museblod mere heterogene end CD45+ celler (0,58% i BM; 0,13% i blod). Disse observationer konkluderer, at celler, der udtrykker cytokeratinproteiner, kan påvises reproducerbart blandt mononukleære celler fra humant og murinblod og BM. Vi demonstrerer en metode til vævshøstning, flowcytometri og immunfarvning, der kan bruges til at identificere og bestemme funktionen af disse pan-cytokeratinepitelceller hos raske individer.
Introduction
Epitelceller findes i de fysiske barrierer mellem vores kroppe og miljøet og er i stand til at genkende og reagere på ændringer i deres mikromiljø1. De har en voksende stamcelleniche, som giver en måde at vende nyt væv og reparere skader2. Vores laboratorium studerer stamceller i hudens hårsække; Hud er en god model til at studere epitelvæv og stamcellespredning, fordi det er let synligt, og der er en konstant omsætning af celler. Epitelkræft er den mest almindelige form for kræft, muligvis på grund af epitelvæv, såsom huden, der er den første forsvarslinje mod kræftfremkaldende stoffer i miljøet, hvilket fører til høje omsætningshastigheder og spredning af epitelceller3. Det meste af hudens epidermis, det øverste beskyttende lag, består af keratinocytter, som udtrykker forskellige typer keratiner for at give støtte og struktur4. Patienter med epitelkræft har ofte epitelceller til stede i deres blod og knoglemarv, der også udtrykker keratiner. Flydende biopsier er en ikke-invasiv måde at detektere og overvåge disse epitelceller i forskellige kropsvæsker5. Cirkulerende epitelceller, også kaldet cirkulerende tumorceller (CTC'er), findes i perifert blod og kan være biomarkører for kræftprognose samt guide individualiserede terapibehandlinger. CTC'er kan også indikere sygdomsprogression, behandlingseffektivitet og samlet patientoverlevelse 5,6.
Epitelcelleadhæsionsmolekyle (EpCAM) er en klinisk anvendt markør for CTC'er og kan identificere tumorer af epiteloprindelse hos kræftpatienter. EpCAM spiller en rolle i celleadhæsion, migration, signalering, spredning og differentiering6. For at en cirkulerende epitelcelle skal klassificeres som en CTC, skal den være positiv for cytokeratiner 8, 18 og 19 og negativ for CD45, en almindelig leukocytmarkør6. CTC'er identificeres normalt ved først at nedbryde CD45 med magnetiske mikroperler efterfulgt af test for EpCAM og cytokeratin 19 ved anvendelse af immunofluorescensmikroskopi7. Den største begrænsning i påvisning af CTC'er er deres sjældenhed; De udgør mindre end 0,01% af alle celler i blodet, og meget få overlever i omløb for at nå fjerne organer 8,9,10. Der skal tages hensyn til design af eksperimenter og teknikker til isolering og identifikation af disse celler på grund af deres sjældne natur. I øjeblikket er der kun en Food and Drug Administration (FDA) -godkendt automatiseret enkeltcellesorterer, der bruges til at identificere CTC'er, og den bruger EpCAM som biomarkør. Andre metoder omfatter magnetisk perleseparation og flowcytometri eller en kombination af disse metoder. Der er behov for nye teknikker, der har større følsomhed og specificitet til påvisning af sjældne CTC'er11.
Flowcytometri er en foretrukken metode til påvisning af sjældne cellepopulationer i blod, knoglemarv og andre vævsprøver. Disse sjældne celler kan omfatte stamceller, cirkulerende endotelceller, CTC'er og resterende sygdomsceller. Flowcytometri muliggør kvantitative målinger af hver celletype og sorterer disse celler til yderligere test 7,9. Der blev udført trinvise tællinger for at sikre en nøjagtig vurdering af disse sjældne celler. Evnen til at bruge gating til at udelukke celler fra yderligere analyse er en måde at øge specificiteten på, når man analyserer celler. Begrænsningerne ved flowcytometri er den tid, der kræves til analyse af store prøver og manglen på visuel bekræftelse for celleidentitet. For at overvinde dette blev immunofluorescensmikroskopi udført på de sorterede celler for at bekræfte deres identiteter.
Tidligere har vores laboratorium vist, at knoglemarvscellerne rekrutteres hos mus og bidrager til hudtumorer12. Disse knoglemarvsafledte celler er positive for pan-cytokeratin og epidermal cytokeratin. For yderligere at belyse rollen af epitelstamceller, knoglemarvsafledte celler og cytokeratinekspressive celler i tumorprogression blev EpCAM+ cytokeratinpositive celler i normale murin og humane blod- og knoglemarvsprøver ledt efter. Som med de fleste eksperimenter blev denne metode udviklet gennem flere iterationer. Tidligere blev transgene mus brugt sammen med inkrementelle tællinger til at lede efter K14GFP-ekspressive celler i knoglemarven12. Efterhånden som flere celler blev talt, kunne en repræsentativ population af sjældne celler identificeres, som vist i figur 1 i afsnittet om repræsentative resultater. Begrundelsen for at undersøge epitelceller i normalt blod og knoglemarv var baseret på tidlig litteratur om CTC'er, hvor normale raske donorer havde baggrundsniveauer af EpCAM+ celler13. Som tidligere nævnt begynder EpCAM-karakterisering ofte med udtømningen af CD45. Dette trin blev udeladt, fordi nogle hæmatopoietiske celler har EpCAM og cytokeratinekspression af ukendte årsager, der skal undersøges yderligere. Derfor blev celler sorteret baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af EpCAM, uanset celleafstamning, og derefter immunfarvet for cytokeratin. Protokollen nedenfor og arbejdsgangen vist i figur 2 beskriver en teknik, der bruger flowcytometri med kompensation og kontrol, statistiske metoder og immunfluorescensbilleddannelse til at isolere og identificere disse sjældne populationer af epitelceller.
Protocol
Alle dyreprotokoller blev godkendt af University of Minnesota Institutional Animal Care and Use Committee i overensstemmelse med NIH og føderale retningslinjer. Frisk humant blod og knoglemarv blev købt fra kommercielle kilder. Prøver blev indsamlet af virksomheden under en godkendt IRB-protokol fra donorer, der var negative for hiv, hepatitis B, hepatitis C og screenet for COVID-19. Alle prøver blev først afidentificeret og anonymiseret, før de blev sendt af virksomheden. Da disse blev opnået kommercielt, var der ikke behov for IRB-godkendelse.
1. Fremstilling af opløsninger
BEMÆRK: Alle opløsninger skal fremstilles i en biologisk hætte med et sterilt miljø. Få certificering af biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) for arbejde med humant blod og knoglemarv.
- Forbered knoglemarvshøstopløsning ved at tilsætte 1 ml gentamicin og 5 ml føtalt bovint serum (FBS) til 500 ml Hanks balancesaltopløsning (HBSS).
- Forbered farvningsbufferopløsningen ved at tilsætte 50 ml FBS til 500 ml HBSS.
- Forbered 1x lysisbuffer ved at kombinere 10 ml 10x lysisbuffer med 90 ml sterilt vand.
2. Klargøring af emhætten
- Tænd emhætten, og lad den køre i et par minutter for at opnå korrekt luftstrøm.
- Saml alle materialer til at udføre knoglemarvshøst. Sprøjt dem inde i emhætten med 70% ethanol for at opretholde et sterilt miljø. Spray hænderne hver gang, før de tages inde i emhætten.
- Placer den autoklaverede bakke i emhætten sammen med en saks, en samlet skalpel, pincet og buet tang i en lille kop fyldt med 70% ethanol for at holde dem sterile.
- Tilsæt 10 ml knoglemarvshøstopløsning til et 50 ml centrifugerør og mærk det "Lemmer". Mærk et andet 50 ml centrifugerør som "Bone Marrow".
- Træk 10 ml knoglemarvshøstopløsning op i en sprøjte, og sæt derefter en 26 G kanyle på.
3. Høstning af knoglemarv fra mus
- Aflive musen ved hjælp af CO2 kvælning. Døden bekræftes ved fravær af hjerteslag og klemmer fødderne for at sikre, at der ikke er nogen reaktion. Cervikal dislokation kan udføres som et sekundært middel til fuldstændig eutanasi.
- Placer musen i en 500 ml beholder og tilsæt nok jod til at dække halvdelen af musen. Ryst og hvirvl forsigtigt beholderen for at sikre grundig dækning. Skyl med deioniseret vand. Udfør endnu en jodvask, og derefter to vaske med 70% ethanol efter de samme trin.
- Placer musen i emhætten og læg den på ryggen på bakken. Tag fat i bagbenene og træk dem fra hinanden, indtil der mærkes et spring; Dette er for at adskille benene fra rygsøjlen.
- Lav et snit på 1 cm på musens hud nær lyskeområdet. Indsæt en lukket saks i snittet, og åbn derefter saksen under huden for at adskille den fra bughinden.
- Skær huden på benet omkring låret, og skær derefter huden ned ad benet for at udsætte muskler og knogler.
- Fjern bagbenene ved at skære rundt om hofteleddet, og sørg for ikke at skære gennem lårbenet. Placer lemmerne i røret mærket som "Lemmer" Når begge ben fjernes, skal du placere musen i en slagtekroppe og lægge den i fryseren.
BEMÆRK: Hoftebenet skal mærkes først, før du skærer for at styre saksen og undgå at skære lårbensknoglen, da det meste af knoglemarven opnås fra lårbenet. - Begynd at skære muskler, væv og fedt langs en af lemmerne ved hjælp af saksen. Skær parallelt med knoglen. Brug derefter skalpellen og fjern det resterende fedt eller muskler ved hjælp af en vinkelret skrabebevægelse mod knoglen.
- Når knoglen er renset ordentligt, adskilles lårbenet og skinnebenet ved knæet. Brug skalpellen til at lave snit i begge ender af lårbenet og skinnebenet, hvor der ikke er noget synligt knoglemarv.
- Indsæt den forberedte sprøjte og nål i knoglen. Hvis der er modstand, skal du skære lidt mere af enden af knoglen, indtil der ikke er mere modstand.
- Mens du holder knoglen over røret mærket som "Bone Marrow", udvise knoglemarvshøstningsopløsning gennem knoglen for at skylle knoglemarven ind i røret. Gentag i den anden ende af knoglen for at få resten af knoglemarven, indtil knoglen ser helt hvid eller tom ud.
- Gentag trin 7-9 for alle resterende knogler og lemmer; Alt marv skylles ind i det samme koniske rør.
- Brug en tom 10 ml sprøjte og en 20 G kanyle til at bryde knoglemarvsklumperne i tuben op ved at trække knoglemarven op og ned i sprøjten 5-10 gange.
- Tilsæt et sterilt 40 μm filter til et rent 50 ml centrifugerør og skyl det med 1 ml knoglemarvshøstopløsning. Derefter filtreres knoglemarven for at fjerne eventuelle resterende klumper. Mærk dette rør "Filtreret knoglemarv".
- Opbevar det filtrerede knoglemarv i køleskabet eller på is indtil brug. Den skal bruges samme høstdag. Hvis det ikke anvendes samme dag, fryses cellerne ved hjælp af et kryokonserveringsmiddel, såsom dimethylsulfoxid (DMSO).
FORSIGTIG: Alt affald fra disse forsøg skal bortskaffes korrekt i en biohazard affaldsbeholder. Alle skarpe genstande skal gå i en korrekt mærket beholder til biohazard sharps.
4. Lyse af røde blodlegemer i knoglemarv
- Centrifuger knoglemarvscellerne ved 170 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten støvsuges og bortskaffes. Resuspender cellerne i 10 ml 1x røde blodlegemer lysisbuffer og inkuber i 4 min.
- Tilsæt 30 ml Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) for at stoppe reaktionen af lysisbufferen. Centrifuger cellerne i 8 min ved 170 x g ved stuetemperatur. Supernatanten støvsuges og bortskaffes. Resuspender i 10-20 ml farvningsbuffer.
5. Celletal
- Kombiner 500 μl celler med 9,5 ml knoglemarvshøstopløsning for at opnå en 1:20 fortynding.
BEMÆRK: Dette vil blive brugt til celletællinger og behøver ikke holdes sterilt. - Træk 200 μL celler ud af 1:20 fortyndingen, tilsæt dem til 200 μL trypanblåt og bland godt.
- Tilsæt blandingen til et hæmocytometer og tæl de levende og døde celler på begge sider. Beregn den oprindelige cellesuspension ved hjælp af denne tabel (vist i supplerende fil 1) og ligninger:
Celler pr. milliliter:
Celler i alt:
- Centrifuger cellerne ned ved 170 x g i 10 minutter ved 4 °C og resuspender til en koncentration på 10 x 10 6 pr. 1 ml (1 x 106 celler pr. 100 μL) baseret på producentens forslag til antistoffortyndinger.
- Fortsæt til flowcytometri (trin 8).
6. Høstning af blod fra mus
- Aflive musen ved hjælp af CO2 gas eller cervikal dislokation.
- Udfør en hjerteblodtrækning i en vinkel på 45° med en 26 G kanyle fastgjort til en 1 ml sprøjte belagt med 0,5 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA).
- Spin ned blodet og resuspender i medier eller farvning buffer.
BEMÆRK: Cellerne vil blive spundet ned og resuspenderet til endelig koncentration i farvningsbuffer efter lyse af røde blodlegemer og celletal. - Udfør lyse af røde blodlegemer (trin 4).
- Udfør celletællingen (trin 5).
- Fortsæt til flowcytometri (trin 8).
7. Behandling af humane blod- og knoglemarvsprøver
- Udfør alle procedurer under en BSL2-certificeret hætte, mens du bærer personlige værnemidler.
- Saml prøverne den foregående nat og udfør lyse af røde blodlegemer. Sørg for, at prøverne afidentificeres og anonymiseres, inden de mononukleare prøver sendes natten over på is.
- Ved ankomsten drejes de levende celler ned ved 170 x g ved 4 °C i 10 minutter.
BEMÆRK: Dette er BSL2-prøver, der skal følge lokale retningslinjer. - Ophæv cellerne i medie- eller farvningsbufferen igen.
BEMÆRK: Cellerne skal spindes ned og resuspenderes til den endelige koncentration efter celletælling med farvningsbuffer. - Udfør celletællingen (trin 5).
- Fortsæt til flowcytometri (trin 8).
8. Flowcytometri
- Farvning
- Opdel cellerne i individuelt mærkede rør baseret på det anvendte farvningspanel, herunder kompensationskontroller (ufarvede, isotypekontroller, enkeltfarvede og fluorescens minus dem [FMO'er]). Frys eventuelle resterende celler, eller brug dem til fluorescensaktiveret cellesortering. Se tabel 1 for et eksempel på et farvningspanel med de anvendte antistoffortyndinger.
BEMÆRK: For hver ekstra fluorofor, der tilsættes, skal FMO'er i kombination med resterende fluoroforer tilsættes sammen med en enkelt plet af den fluorofor. Isotypekontroller kan bruges til at blokere ikke-specifik farvning. Hvert nyt antistof, der anvendes, skal titreres med prøverne for optimal fortynding. - Tilsæt antistoffer i henhold til producentens anbefalede fortyndinger og bland godt ved at svirpe bunden af rørene. Antistofkoncentrationer angives normalt som 1 x 106 celler pr. 100 μL. Fortyndinger med antistoffer og kontroller er vist i tabel 1. Antistoffer konjugeres med fluoroforer og skal beskyttes mod lys.
BEMÆRK: Det er bedst at bruge EpCAM konjugeret til phycoerythrin (PE) for at muliggøre visualisering af lave populationer af celler (titrer ved 3-5 μL pr. 1 million celler, som angivet i tabel 1). PE-CD49f blev brugt som en enkelt plet PE-kontrol (20 μL pr. 1 million celler), da disse celler er mere udbredte end PE-EpCAM og dermed lettere at bruge til kompensation. - Der inkuberes i 30 minutter ved 4 °C i mørke.
- Efter inkubation bringes rørene tilbage til BSL2-hætten og tilsættes 1 ml farvningsbuffer til hvert rør.
- Derefter centrifugeres glassene ved 170 x g ved 4 °C i 5-10 minutter.
- Efter centrifugeringen føres glassene med låg med cellerne tilbage til BSL2-hætten, og supernatanten suges ud. Sørg for at skifte spidserne af aspirationspipetten mellem hvert rør for at forhindre krydskontaminering.
- Resuspender cellepillen i 1 ml farvningsbuffer og svip bunden af rørene for at blande.
- Cellerne vaskes yderligere to gange ved at gentage trin 8.1.4-8.1.7.
BEMÆRK: Brug ikke pipetter til at resuspendere for at undgå at miste celler. - Resuspender i 500 μL farvningsbuffer til den endelige resuspension før flowcytometri. Tilsæt 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) eller døde cellediskriminator i henhold til producentens anbefalinger.
- Opdel cellerne i individuelt mærkede rør baseret på det anvendte farvningspanel, herunder kompensationskontroller (ufarvede, isotypekontroller, enkeltfarvede og fluorescens minus dem [FMO'er]). Frys eventuelle resterende celler, eller brug dem til fluorescensaktiveret cellesortering. Se tabel 1 for et eksempel på et farvningspanel med de anvendte antistoffortyndinger.
- Flow cytometer
- Når du har konfigureret maskinen, skal du bruge kontrollerne og FMO'erne til at indstille kompensation og porte. Brug Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) som kappevæske til at hjælpe med at understøtte de skrøbelige celler. Brug PBS, hvis HBSS ikke er tilgængelig.
BEMÆRK: Det anvendte flowcytometer og softwaren er angivet i materialetabellen. - Indlæs eksemplerne ét ad gangen, og indsaml datapunkter for 50.000, 100.000, 500.000 og en million hændelser. Opbevar rørene på is eller nedkølet indtil brug.
BEMÆRK: Der kan indstilles en tidsbegrænsning ved indsamling for at sikre prøvens levedygtighed. - Saml cellerne i 3 ml RPMI med 10% FBS i 15 ml centrifugerør.
- Hvis du udfører immunfluorescens på EpCAM+ celler, skal du bruge flowcytometeret til at sortere 800 til 1.000 celler i hver brønd i et 8-brønds dias.
- Sorter EpCAM-cellepopulationen på separate dias som en negativ kontrol, der skal bruges ved farvning til immunfluorescens.
BEMÆRK: Cellerne kan også sorteres i 15 ml rør indeholdende FBS og spindes på et dias ved hjælp af cytocentrifugen eller en pipette for at forhindre celler i at poppe. - Fastgør objektglassene i en 50% methanol/50% acetoneblanding ved -20 °C i 10 min. Objektglassene opbevares ved -20 °C, indtil de farves med immunfluorescens.
- Når du har konfigureret maskinen, skal du bruge kontrollerne og FMO'erne til at indstille kompensation og porte. Brug Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) som kappevæske til at hjælpe med at understøtte de skrøbelige celler. Brug PBS, hvis HBSS ikke er tilgængelig.
- Flow cytometri analyse
- Åbn den licenserede flowcytometrianalysesoftware.
- Load flow cytometri standard (FCS) filer hentet fra flowcytometeret med kontroller og prøver.
- Klik på Opret gruppe, og brug nøgleord til at placere eksempler og kontrolelementer i en gruppe .
BEMÆRK: Brug kontrollen "ingen plet" til at lukke flowcytometrianalysesoftwaren ind, som vist i figur 3. - Dobbeltklik på prøven uden pletkontrol for at åbne en ungated graf.
- Indstil grafens y-akse til SSC-A og x-aksen til FSC-A (sidespredningsområde ved fremadrettet spredningsområde), hvilket angiver cellestørrelse og intern kompleksitet.
- Klik på polygonformen øverst til venstre og opret en port omkring cellerne. Sørg for at udelukke cellerne i periferien, da disse sandsynligvis er affald. Mærk denne port "Celler", som vist i figur 3A.
- Når cellerne er gated, skal du dobbeltklikke inde i polygonformen for at åbne en anden graf i et nyt vindue.
- Indstil y-aksen for den nye graf til SSC-A og x-aksen til SSC-W for dobbelt diskrimination. Klik på polygonformen, og opret et rektangel omkring de enkelte celler. Mærk dette "Enkeltceller" som vist i figur 3B.
- Når cellerne er gated, skal du dobbeltklikke inde i polygonformen for at åbne en anden graf i et nyt vindue.
- Indstil y-aksen til FSC-A og x-aksen til DAPI-A (eller hvilken som helst død cellediskriminator, der bruges).
- Opret en polygonport omkring de DAPI-negative celler i venstre side af grafen. Mærk disse "levende celler" som vist i figur 3C.
- Når cellerne er gated, skal du dobbeltklikke inde i polygonformen for at åbne en anden graf i et nyt vindue.
- Indstil y-aksen til SSC-A og x-aksen til EpCAM-PE (eller hvilken fluorofor der bruges til at identificere EpCAM-cellerne). Celler til venstre er EpCAM-negative. Hvis der vises celler til højre, er de EpCAM-positive.
- Brug EpCAM-PE-grafen til at oprette en polygonport, som udelukker cellerne til venstre og kun inkluderer den tomme plads til højre. Mærk det tomme område til højre inde i polygonen "EpCAM", som vist i figur 3D.
BEMÆRK: Dette er en ingen pletkontrol, så der bør ikke være EpCAM-udtryk. Brug ingen pletkontrol til at bestemme, hvilke celler der er EpCAM-positive. Dette fuldender gating-strategien for kompensation, så alle grafer kan lukkes på nuværende tidspunkt. - På arbejdsområdesiden skal du fremhæve linjen uden pletter med "Celler", "Enkeltceller", "Levende celler" og "EpCAM". Højreklik og vælg kopianalyse for at gruppere. Dette kopierer gating-strategien til alle andre indlæste eksempler i den tidligere oprettede gruppe. Hvis en gruppe ikke blev oprettet oprindeligt, kan den oprettes nu ved at vælge Opret gruppe øverst til venstre.
- Gå gennem prøverne i gruppen, og kontroller de polygonporte, der er tegnet tidligere, for at sikre, at de passer til alle prøver og kontroller. Dette giver procentvis antal og antal celler.
- Klik på layouteditorknappen L i øverste venstre hjørne over "Workspace". Disse grafer kan derefter arrangeres og eksporteres ved hjælp af layouteditoren.
- Fremstilling af immunofluorescensreagensmidler
- Antistoffortyndingsvæsken fremstilles ved at kombinere 1 g bovin serumalbumin (BSA), 2 g fedtfri mælk, 10 ml 10x tris-bufret saltvand (TBS), 100 μL Tween og 90 ml destilleret vand.
- Forbered TBST ved at kombinere 50 ml 20x TBS, 950 ml destilleret vand og 200 μL Tween.
- Forbered 10% Normal Horse Serum (NHS) ved at kombinere 1 ml NHS med 9 ml antistoffortyndingsmiddel (trin 8.4.1).
- Forbered 1% NHS ved at kombinere 1 ml 10% NHS med 9 ml TBST.
- Immunofluorescens farvning
- Fjern objektglassene fra -20 °C, og lad dem varme op til stuetemperatur.
- Vask diasene tre gange i destilleret vand i 5 minutter hver.
- Bloker objektglassene i 1 time ved stuetemperatur i 10% NHS i antistoffortyndingsmiddel (trin 8.4.3).
- Fortynd det primære antistof (pan-cytokeratin) til 1:750 i 1% NHS i TBST (trin 8.4.4). Der inkuberes dias i det fortyndede primære antistof natten over ved 4 °C.
- Næste dag vaskes diasene tre gange med en 1x vaskebuffer (PBS eller TBST) i 5 minutter hver.
- Fortynd det sekundære antistof til 1:1.000 i 1% NHS i TBST (trin 8.4.4). Inkuber objektglassene i det fortyndede sekundære antistof i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask lysbillederne tre gange med 1x vaskebuffer i 5 min hver. Monter og dæksel diasene med hardset monteringsmedier med DAPI. Brug en vatpind til forsigtigt at rulle eventuelle bobler ud under dæksedlen.
Representative Results
Ved hjælp af disse metoder blev sjældne populationer af epitelceller i blodet og knoglemarven hos normale mennesker og mus visualiseret. Med de korrekte kompensationer og kontroller som beskrevet var resultaterne konsekvent, der viste, at 4% -5% af cellerne i murine knoglemarv var EpCAM+, uanset hvor mange celler der blev talt, som vist i figur 4 og figur 5. I murine blodprøver var mindre end 0,5% af cellerne EpCAM+, som vist i figur 6. I humane knoglemarvsprøver var 2%-5% af cellerne EpCAM+, som vist i figur 7 og figur 8. Mens 2% -5% er et stort interval, var procentdelene inden for hver enkelt donor konsistente, da gradvist flere celler blev talt. I humane blodprøver var omkring 0,3 % af cellerne EpCAM+, som vist i figur 9. Vores kontrolprøver (ingen pletter, isotypekontrol og FMO'er) gav meget få falsk-positive EpCAM+ resultater, som vist i figur 4 og figur 7. Celler fra EpCAM+- og EpCAM-grupperne, der blev sorteret på dias, viste positiv farvning for pan-cytokeratin i EpCAM+-prøver og var negative for pan-cytokeratin i EpCAM-prøver, som vist i figur 10. Disse resultater indikerer, at eksperimenterne var hensigtsmæssigt designet og reproducerbare.
Figur 1: Krt14Cre;mTmG transgene mus med trinvise tællinger af knoglemarv. Knoglemarven hos Krt1-14;mTmG-mus blev talt trinvist. GFP-positive celler indikerer keratin 14-ekspression og blev identificeret ved anvendelse af flowcytometri. Da flere knoglemarvsceller blev talt, var denne keratin 14 positive cellepopulation lettere identificerbar. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Arbejdsproces for EpCAM+ og cytokeratin+ celler. Knoglemarven og blodcellerne blev først sorteret ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for at adskille EpCAM+ og EpCAM-celler. Disse celler blev sorteret i to forskellige reagensglas samt på to forskellige dias. Cellerne sorteret i reagensglas blev spundet på dias ved hjælp af en cytocentrifuge. Gliderne blev derefter farvet ved hjælp af et pan-cytokeratin primært antistof og derefter farvet med et sekundært antistof. Objektglassene blev analyseret ved hjælp af fluorescensmikroskopi for at observere pan-cytokeratinekspression. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Software til analyse af flowcytometri. Ved analyse af flowcytometridata ved hjælp af analysesoftware bruges ingen pletkontrol til at vælge de interessante celler. Celler vælges først med SSC-A og FSC-A, som viser cellernes interne kompleksitet og størrelse. (A) En polygonport trækkes rundt om cellerne. (B) Enkeltceller erhverves ved gating SSC-A af SSC-W. (C) Levende celler erhverves ved at gating FSC-A versus DAPI. (D) EpCAM-negative celler udelukkes ved at gating til højre for de EpCAM-negative celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Flowcytometrisk analyse af EpCAM+ celler i museknoglemarven. Kontrolelementer uden pletter, isotype og FMO'er vises i toppanelet med det trinvise antal på 50.000, 100.000 og 500.000 celler vist i bundpanelet. Disse diagrammer visualiserer konsistensen i procenter på tværs af antal på trods af den samlede stigning i det samlede antal celler, der tælles. Panelerne til højre angiver gating-strategien, som diskuteret tidligere i afsnittet flowcytometrianalyse og som vist i figur 3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: EpCAM+ celler i museknoglemarven udgør 5,17% ± 0,001% af befolkningen. Knoglemarvscellerne hos tre individuelle mus blev analyseret. De relevante kontroller blev inkluderet for korrekt videnskabelig stringens. Procentdelen af positive celler forblev konsistent på tværs af prøverne, fordi musene var genetisk identiske. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: EpCAM+ celler i museblod udgør 0,45% ± 0,0006% af befolkningen. Blodcellerne fra to individuelle mus blev analyseret. Kontrol blev inkluderet for at vise, at den korrekte procedure blev fulgt for at producere afgørende resultater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Flowcytometrisk analyse af EpCAM+ human knoglemarv. Kontrolelementer uden pletter, isotype og FMO'er vises i toppanelet, og det trinvise antal på 50.000, 100.000 og 500.000 celler vises i bundpanelet. Disse diagrammer visualiserer konsistensen i procenter på tværs af antal på trods af den samlede stigning i det samlede antal celler, der tælles. Panelerne til højre angiver gating-strategien, som diskuteret tidligere i afsnittet flowcytometrianalyse og som vist i figur 3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: EpCAM+ celler i human knoglemarv udgør 3,53% ± 0,006% af befolkningen. Tre forskellige humane knoglemarvsprøver blev analyseret. Passende kontroller for videnskabelig stringens blev inkluderet. Procentdelen af positive celler varierer på grund af genetisk heterogenitet blandt mennesker. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: EpCAM+ celler i humant blod udgør 0,18% ± 0,0004% af befolkningen. Tre forskellige humane blodprøver blev analyseret. Passende kontroller for videnskabelig stringens blev inkluderet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Immunofluorescens af EpCAM+ og EpCAM- dias. FACS blev brugt til at adskille EpCAM+ og EpCAM-celler. Pan-cytokeratin blev farvet til anvendelse af DAKO pan-cytokeratin-antistoffet. Der blev ikke anvendt primær antistofkontrol i normalt serum, da pancytokeratin er et polyklonalt antistof. Disse resultater bekræfter nøjagtigheden af FACS. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Humant knoglemarv eller blod | |||
| Antistof | Rør # | # af celler | AB Conc |
| Ufarvet | 1 | 1x106 | X |
| Kun DAPI | 2 | 1x106 | 1uL/ml |
| PE-isotypekontrol | 3 | 1x106 | 1 uL |
| CD49f-PE kontrol af enkelt plet | 4 | 1x106 | 20 uL i 100uL pr. 1x106 |
| EpCAM-PE lav titrering | 5 | 1x106 | 3 uL i 100uL pr. 1x106 |
| EpCAM-PE medium titrering | 6 | 1x106 | 4 uL i 100uL pr. 1x106 |
| EpCAM-PE høj titrering | 7 | 1x106 | 5 uL i 100uL pr. 1x106 |
| EpCAM-PE høj sortering på dias | 8 | 10x106 | 50 uL i 1 ml |
Tabel 1: Farvepanel til flowcytometri. Et eksempel på et flowcytometrifarvningspanel til mononukleære celler i blod eller knoglemarv. De inkluderede kontroller er kun DAPI, pletfri kontrol og PE-enkeltpletkontrol (PE-CD49f blev brugt som en bedre positiv kontrol). Fluorescens minus en er ikke inkluderet i dette panel, da det kun er en enkelt farve (PE). Når der tilføjes flere fluoroforfarver, såsom fluoresceinisothiocyanat (FITC) eller allophycocyanin (APC), bør FMO'er inkluderes ved at udelukke en fluorofor for hver FMO-kontrol.
Supplerende fil 1: Levende celletælling ved hjælp af hæmatocytometer. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Der er nogle beviser i litteraturen for tilstedeværelsen af epitelceller i knoglemarven. Tidligere har papirer typisk undersøgt epitelcellernes rolle i forbindelse med sygdom og skade, såsom i leveren, lungen, mave-tarmkanalen (GI), thymus og hud14,15,16,17. Imidlertid er der ikke meget kendt om tilstedeværelsen af disse epitelceller i knoglemarven hos raske individer. Dette papir søger at etablere en reproducerbar metode med det formål at identificere og isolere epitelceller fra normalt blod og knoglemarv. Denne metode vil drive feltet fremad for at identificere, hvorfor epitelceller er til stede, og hvad deres rolle er i blodet og knoglemarven i fravær af sygdom; Måske er disse celler en del af normal vævsvedligeholdelse eller aktiveres i tider med skade. Knoglemarven er et lager af stamceller; Det er imidlertid uklart, hvad afstamningen af disse epitelceller kan være. Et nyligt papir diskuterer knoglemarvsafledte epitelceller i thymus, der først udtrykker EpCAM og den hæmatopoietiske markør CD45 og derefter mister sit CD45-udtryk over tid efter skade15. Forskning fra vores laboratorium har også bekræftet tilstedeværelsen af CD45+ EpCAM+ celler i sundt blod og knoglemarv i fravær af skade12. Imidlertid er disse cellers rolle endnu ikke bestemt.
Der var behov for en reproducerbar metode til at undersøge epitelceller i den raske knoglemarv. Den beskrevne metode hjælper med at karakterisere disse celler yderligere i deres normale tilstand. Der er vigtige trin i denne metode for at opretholde reproducerbarhed. Et af de mest kritiske trin i denne protokol er at opretholde et sterilt miljø i emhætten, mens knoglemarven høstes fra mus. Ved udtagning fra flere mus undgås krydskontaminering mellem prøver ved brug af nye nåle og sprøjter til hver mus. Dette sikrer også, at prøven er ren og fri for forurenende stoffer, der kan påvirke resultaterne. Derudover bør antallet af forberedte sprøjter og mærkede koniske rør for hver ekstra mus øges. Et andet vigtigt skridt indebærer skylning af knoglerne, indtil en ren hvid farve er tydelig for at sikre, at de fleste knoglemarvsceller er fjernet; Chancerne for at detektere sjældne celler øges i en renere prøve. Der blev foretaget en ændring for at optimere protokollen for lyse af røde blodlegemer; Flere lysisbuffere blev testet for at finde den rigtige, der gav konsekvent høj levedygtighed, da næsten halvdelen af cellerne gik tabt under dette trin. Forskellige reagenser og inkubationsperioder skal muligvis optimeres for forbedrede resultater i andre indstillinger.
Den væsentligste begrænsning af denne protokol er at bruge flowcytometri til at finde sjældne cellepopulationer. Som tidligere nævnt hjælper tilføjelsen af kontroller og trinvise tællinger med at øge analysens specificitet og nøjagtighed. En anden begrænsning er, at passende markører for den relevante population skal identificeres på forhånd. Således skal man vide om nøglemarkører, antistoffer til flowcytometri og antistoffer, der er kompatible med målarterne.
Disse metoder er en forbedring i forhold til eksisterende metoder, da de giver mulighed for enkeltcelleanalyse til en brøkdel af omkostningerne ved den eksisterende automatiske CTC-isolator og enkeltcelle RNA-sekventering. Derudover er flowcytometri lettere tilgængelig. FACS opretholdt højere levedygtighed for cellerne sammenlignet med tidligere rapporterede resultater ved hjælp af magnetisk mikroperleseparation. Endelig muliggør disse teknikker adskillelse af celler til downstream-analyser, såsom bulk-RNA-sekventering, scRNA-sekventering eller cellekultur.
Disclosures
Der er ingen kendte interessekonflikter.
Acknowledgments
Josh Monts, tekniker inden for flowcytometer til kernefaciliteter, Hormel Institute
Todd Schuster, Core Facility Manager, The Hormel Institute
Derek Gordon, statistiker, Rutgers University
Vi vil gerne takke Karen Klein fra Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM for hendes redaktionelle assistance.
Dette arbejde blev delvist støttet af National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under tildelingsnummer R21 AR075281 og et tilskud til forskning, kunst og stipendium, vicepræsidentens kontor for forskning, University of Minnesota (forslag # 324240). Vi takker for støtten fra The Hormel Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes used for flow cytometry |
| 500 mL jar with lid | Nalgene | 11-823-32 | Used to wash the mouse |
| 190 proof Ethanol | Decon laboratories Inc | 2801 | Diluted to 70% with dH2O |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | Dilution: 1:1000 |
| Brightline Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-10 | Used to count alive cells |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Component of antibody diluent |
| Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Component of staining buffer and harvesting solution |
| Curity gauze sponges | Covidien | 2187 | Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow |
| Curved Forceps | Miltex | 18-784 | Used during harvest |
| Cytokeratin, Wide Spectrum Screening | Dako | Z0622 | Dilution 1:750 *Now discontinued |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) | Gibco | 14190-144 500mL | Used to stop the red blood cell lysis reaction |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E9884-100G | Used at 0.5 M |
| Gentamicin sulfate | Lonza | 17-518Z | Component of harvesting solution |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) | Gibco | 14175-095 500mL | Component of harvesting solution and staining buffer solution |
| Luer-Lok tip 10 mL syringe | Becton, Dickinson and Co | 309604 | Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps |
| Magic touch 2 ice bucket | BelArt | M16807-2001 | Used to store the specimens on ice |
| Nonfat dry milk | Apex | 20-241 | Component of Antibody Diluent |
| Normal horse serum | Vector | ZE0122 | Component of Antibody Diluent |
| PE anti-human CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 324206 | Dilution: 5 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 118205 | Dilution: 3 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE mouse IgG2b, κ isotype control | Biolegend | 400313 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat anti-human CD49f | BD Biosciences | 555763 | Dilution: 20 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat IgG2am, κ Isotype control | Biolegend | 400508 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Basix | 14-955-240 | Used in the centrifuge |
| Povidone-Iodine Scrub | Aplicare | 82-227 | Antiseptic used to sterilize the mice |
| PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305176 | 20G needle used to break up bone marrow clumps |
| PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305111 | 26G needle used to flush bone marrow from bones |
| PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Services | 63422-06 | 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence |
| RBC Lysis buffer 10X | Invitrogen | 00-4300-54 | Dilution 1:10 using sterile deionized water |
| Scissors | Roboz | RS-6762 | Used during harvest |
| Stainless steel surgical blade #4 | Bard-Parker | 371222 | Used during harvest |
| Sterile tray | Polar ware | 10F | Used during harvest |
| StretchEase Powder-free nitrile examination gloves | Denville Scientific | G4161 | Used during harvest |
| Surgical Scalpel handle #4 | Fischer | 12-000-164 | Used with surgical blade |
| TBS 20x | Thermo | Component of TBST, used at 1X | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Used to count dead cells. Filtered with .45 µm |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-500mL | Component of TBST |
| Tweezers | Miltex | 6-8 | Used during harvest |
| Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1800 | Nuclear stain for immunofluorescence |
References
- Larsen, S. B., Cowley, C. J., Fuchs, E.
- Blanpain, C., Fuchs, E. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration. Science. 344 (6189), 1242281 (2014).
- Coradini, D., Casarsa, C., Oriana, S. Epithelial cell polarity and tumorigenesis: New perspectives for cancer detection and treatment. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (5), 552-564 (2011).
- Dmello, C., et al. Multifaceted role of keratins in epithelial cell differentiation and transformation. Journal of Biosciences. 44 (2), 33 (2019).
- Poulet, G., Massias, J., Taly, V.
- Eslami-S, Z., Cortés-Hernández, L. E., Alix-Panabières, C. Epithelial cell adhesion molecule: an anchor to isolate clinically relevant circulating tumor cells. Cells. 9 (8), 1836 (2020).
- Morris, R. J. Circulating tumor cells: quintessential precision oncology presenting challenges for biology. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 16 (2017).
- Lin, D., et al. Circulating tumor cells: biology and clinical significance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 404 (2021).
- Spence, M., Adai, S., Landon, T., Richter, G. Few and far between: Tools and strategies for rare-event detection using flow cytometry. BioprobesJournal of Cell Biology. 71, 14-18 (2015).
- Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. Journal of Cell Biology. 192 (3), 373-382 (2011).
- Ye, Q., Ling, S., Zheng, S., Xu, X. Liquid biopsy in hepatocellular carcinoma: circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Molecular Cancer. 18 (1), 114 (2019).
- Park, H., et al. marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
- Marsman, W. A., et al. Epithelial cells in bone marrow: do they matter. Gut. 54 (12), 1821-1822 (2005).
- Borue, X., et al. marrow-derived cells contribute to epithelial engraftment during wound healing. The American Journal of Pathology. 165 (5), 1767-1772 (2004).
- Chakrabarti, S., et al. marrow-derived cells contribute to the maintenance of thymic stroma including TECs. Journal of Immunology Research. 2022, 6061746 (2022).
- Krause, D. S., et al. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell. 105 (3), 369-377 (2001).
- Wong, A. P., et al. Targeted cell replacement with bone marrow cells for airway epithelial regeneration. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L740-L752 (2007).
