Summary
Denne artikkelen presenterer en reproduserbar metode med nye funn om tilstedeværelse av epitelceller i normalt humant og musblod og benmarg ved bruk av flowcytometri og immunfluorescensmikroskopi. Krt1-14;mTmG transgene mus ble brukt som en in vivo metode for å bekrefte disse funnene.
Abstract
Epitelceller har blitt identifisert i blod og benmarg hos pasienter med kreft og andre sykdommer. Imidlertid har tilstedeværelsen av normale epitelceller i blod og benmarg hos friske individer ennå ikke blitt identifisert på en konsistent måte. Her presenteres en reproduserbar metode for isolering av epitelceller fra friskt humant og murine blod og benmarg (BM) ved bruk av flowcytometri og immunfluorescens (IF) mikroskopi. Epitelceller hos friske individer ble først identifisert og isolert via flowcytometri ved hjelp av epitelcelleadhesjonsmolekyl (EpCAM). Disse EpCAM+-cellene ble bekreftet å uttrykke keratin ved hjelp av immunfluorescensmikroskopi i Krt1-14;mTmG transgene mus. Humane blodprøver hadde 0,18 % ± 0,0004 EpCAM+-celler (SEM; n=7 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater). I human BM var 3,53 % ± 0,006 (SEM; n=3 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater) av mononukleære celler EpCAM+. I museblod utgjorde EpCAM+-celler 0,45 % ± 0,0006 (SEM; n=2 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater), og i musens BM var 5,17 % ± 0,001 (SEM; n=3 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater) EpCAM+. Hos mus var alle EpCAM+-cellene immunoreaktive mot pancytokeratin, som bestemt ved IF-mikroskopi. Resultatene ble bekreftet ved bruk av Krt1-14; mTmG transgene mus, med lave (8,6 opprinnelige GFP + celler per 106 celler analysert; 0,085% av levedyktige celler), men signifikante tall (p < 0,0005) av GFP + celler tilstede i normal murine BM, som ikke var et resultat av tilfeldighet sammenlignet med flere negative kontroller. Videre var EpCAM+-celler i museblod mer heterogene enn CD45+-celler (0,58 % i BM; 0,13 % i blod). Disse observasjonene konkluderer med at celler som uttrykker cytokeratinproteiner er reproduserbart detekterbare blant mononukleære celler fra humant og murine blod og BM. Vi demonstrerer en metode for vevshøsting, flowcytometri og immunfarging som kan brukes til å identifisere og bestemme funksjonen til disse pan-cytokeratinepitelcellene hos friske individer.
Introduction
Epitelceller finnes i de fysiske barrierene mellom kroppen vår og miljøet og er i stand til å gjenkjenne og reagere på endringer i mikromiljøet1. De har en spredende stamcellenisje som gir en måte å snu nytt vev og reparere skader2. Vårt laboratorium studerer stamceller i hårsekkene i huden; Hud er en god modell for å studere epitelvev og stamcelleproliferasjon fordi det er lett synlig og det er en konstant omsetning av celler. Epitelkreft er den vanligste formen for kreft, muligens på grunn av epitelvev, som huden, som er den første forsvarslinjen mot miljøkreftfremkallende stoffer, noe som fører til høye omsetningshastigheter og spredning av epitelceller3. Det meste av hudepidermis, det øverste beskyttende laget, består av keratinocytter, som uttrykker forskjellige typer keratiner for å gi støtte og struktur4. Pasienter med epitelkreft har ofte epitelceller tilstede i blodet og benmargen som også uttrykker keratiner. Flytende biopsier er en ikke-invasiv måte å oppdage og overvåke disse epitelcellene i forskjellige kroppsvæsker5. Sirkulerende epitelceller, også kalt sirkulerende tumorceller (CTC), finnes i perifert blod og kan være biomarkører for kreftprognose, samt veilede individualiserte terapibehandlinger. CTC kan også indikere sykdomsprogresjon, behandlingseffekt og total pasientoverlevelse 5,6.
Epitelcelleadhesjonsmolekyl (EpCAM) er en klinisk brukt markør for CTC og kan identifisere svulster av epitelial opprinnelse hos kreftpasienter. EpCAM spiller en rolle i celleadhesjon, migrasjon, signalering, spredning og differensiering6. For at en sirkulerende epitelcelle skal klassifiseres som CTC, må den være positiv for cytokeratiner 8, 18 og 19, og negativ for CD45, en vanlig leukocyttmarkør6. CTC identifiseres vanligvis ved først å tømme CD45 med magnetiske mikroperler, etterfulgt av testing for EpCAM og cytokeratin 19 ved bruk av immunfluorescensmikroskopi7. Hovedbegrensningen i påvisning av CTC er deres sjeldenhet; De utgjør mindre enn 0,01% av alle celler i blodet, og svært få overlever i omløp for å nå fjerne organer 8,9,10. Det må tas hensyn til å designe eksperimenter og teknikker for å isolere og identifisere disse cellene på grunn av deres sjeldne natur. For tiden er det bare en Food and Drug Administration (FDA) godkjent automatisert enkeltcellesorterer som brukes til å identifisere CTC, og den bruker EpCAM som biomarkør. Andre metoder inkluderer magnetisk dråpeseparasjon og flowcytometri, eller en kombinasjon av disse metodene. Det er behov for nye teknikker som har høyere sensitivitet og spesifisitet for påvisning av sjeldne CTCer11.
Flowcytometri er en foretrukket metode for påvisning av sjeldne cellepopulasjoner i blod, benmarg og andre vevsprøver. Disse sjeldne cellene kan inkludere stamceller, sirkulerende endotelceller, CTC og gjenværende sykdomsceller. Flowcytometri muliggjør kvantitative målinger av hver celletype og sorterer disse cellene for videre testing 7,9. Inkrementelle tellinger ble utført for å sikre en nøyaktig vurdering av disse sjeldne cellene. Evnen til å bruke gating for å ekskludere celler fra videre analyse er en måte å øke spesifisiteten ved analyse av celler. Begrensningene ved flowcytometri er tiden som kreves for analyse av store prøver og mangelen på visuell bekreftelse for celleidentitet. For å overvinne dette ble immunfluorescensmikroskopi utført på de sorterte cellene for å bekrefte deres identiteter.
Tidligere har vårt laboratorium vist at hos mus rekrutteres benmargscellene og bidrar til hudsvulster12. Disse benmargsavledede cellene er positive for pan-cytokeratin og epidermal cytokeratin. For ytterligere å belyse rollen til epiteliale stamceller, benmargsavledede celler og cytokeratinuttrykkende celler i tumorprogresjon, ble EpCAM+ cytokeratin-positive celler i normale murine og humane blod- og benmargsprøver søkt etter. Som med de fleste eksperimenter ble denne metoden utviklet gjennom flere iterasjoner. Tidligere ble transgene mus brukt sammen med inkrementelle tellinger for å lete etter K14GFP-uttrykkende celler i beinmargen12. Etter hvert som flere celler ble talt, kunne en representativ populasjon av sjeldne celler identifiseres, som vist i figur 1 i den representative resultatdelen. Begrunnelsen for å undersøke epitelceller i normalt blod og benmarg var basert på tidlig litteratur om CTC, der normale friske donorer hadde bakgrunnsnivå av EpCAM+-celler13. Som nevnt tidligere begynner EpCAM-karakterisering ofte med uttømming av CD45. Dette trinnet ble utelatt fordi noen hematopoietiske celler har EpCAM og cytokeratinuttrykk av ukjente årsaker som må undersøkes nærmere. Derfor ble cellene sortert basert på tilstedeværelse eller fravær av EpCAM, uavhengig av cellelinje, og deretter immunfarget for cytokeratin. Protokollen nedenfor og arbeidsflyten vist i figur 2 beskriver en teknikk som bruker flowcytometri med kompensasjon og kontroller, statistiske metoder og immunfluorescensavbildning for å isolere og identifisere disse sjeldne populasjonene av epitelceller.
Protocol
Alle dyreprotokoller ble godkjent av University of Minnesota Institutional Animal Care and Use Committee i samsvar med NIH og føderale retningslinjer. Ferskt menneskeblod og benmarg ble kjøpt fra kommersielle kilder. Prøver ble samlet inn av selskapet under en godkjent IRB-protokoll fra givere som var negative for HIV, hepatitt B, hepatitt C og screenet for COVID-19. Alle prøver ble først avidentifisert og anonymisert før de ble sendt av selskapet. Siden disse var kommersielt innhentet, var det ikke nødvendig med IRB-godkjenning.
1. Forberedelse av løsninger
MERK: Alle løsninger må tilberedes i en biologisk hette med et sterilt miljø. Få biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) sertifisering for arbeid med humant blod og benmarg.
- Forbered benmargshøstingsløsning ved å tilsette 1 ml gentamicin og 5 ml føtal bovint serum (FBS) til 500 ml Hanks balansesaltløsning (HBSS).
- Forbered fargebufferløsningen ved å tilsette 50 ml FBS til 500 ml HBSS.
- Forbered 1x lysisbuffer ved å kombinere 10 ml 10x lysisbuffer med 90 ml sterilt vann.
2. Klargjøre hetten
- Slå på hetten og la den gå i noen minutter for å oppnå riktig luftstrøm.
- Samle alle materialene for å utføre benmargshøst. Spray dem inne i hetten med 70% etanol for å opprettholde et sterilt miljø. Spray hendene hver gang før de tas inn i hetten.
- Plasser det autoklavede brettet i hetten sammen med autoklavert saks, en montert skalpell, pinsett og buet tang i en liten kopp fylt med 70% etanol for å holde dem sterile.
- Tilsett 10 ml benmargshøstingsløsning til ett 50 ml sentrifugerør og merk det "Lemmer". Merk et annet 50 ml sentrifugerør som "benmarg".
- Trekk opp 10 ml benmargshøstingsoppløsning i en sprøyte og fest deretter en 26 G kanyle.
3. Høsting av benmarg fra mus
- Avlive musen ved hjelp av CO2 -kvelning. Døden bekreftes av fravær av hjerteslag og klemming av føttene for å sikre at det ikke er noen reaksjon. Cervikal dislokasjon kan utføres som et sekundært middel for fullstendig eutanasi.
- Plasser musen i en 500 ml beholder og tilsett nok jod til å dekke halvparten av musen. Rist forsiktig og virvle beholderen for å sikre grundig dekning. Skyll med avionisert vann. Utfør en jodvask til, og deretter to vasker med 70% etanol etter de samme trinnene.
- Plasser musen i hetten og legg den på ryggen på brettet. Ta tak i bakbenene og trekk dem fra hverandre til en pop er følt; Dette er for å skille bena fra ryggraden.
- Lag et 1 cm snitt på musens hud nær lyskeområdet. Sett inn en lukket saks i snittet og åpne deretter saksen under huden for å skille den fra bukhinnen.
- Klipp huden på benet rundt låret, og kutt deretter huden ned i beinet for å avsløre muskler og bein.
- Fjern bakbenene ved å kutte rundt hofteleddet, pass på at du ikke skjærer gjennom lårbenet. Plasser lemmer i røret merket som "Lemmer" Når begge bena er fjernet, legg musen i en kadaverpose og sett den i fryseren.
MERK: Hoftebenet bør kjennes først før du kutter for å lede saksen og unngå å kutte lårbenet, da det meste av benmargen er hentet fra lårbenet. - Begynn å kutte bort muskler, vev og fett langs en av lemmer ved hjelp av saksen. Skjær parallelt med beinet. Bruk deretter skalpellen og fjern det gjenværende fettet eller muskelen, ved hjelp av en vinkelrett skrapebevegelse mot beinet.
- Når beinet er rengjort ordentlig, skille lårbenet og tibia ved kneet. Bruk skalpellen til å lage kutt i begge ender av lårbenet og tibia der det ikke er synlig benmarg.
- Sett den klargjorte sprøyten og kanylen inn i beinet. Hvis det er motstand, kutt litt mer av enden av beinet til det ikke er mer motstand.
- Mens du holder benet over røret merket som "benmarg", utvise benmarg høsting løsning gjennom beinet for å skylle benmargen inn i røret. Gjenta på den andre enden av benet for å få resten av benmargen, til benet vises helt hvitt eller tomt.
- Gjenta trinn 7-9 for alle gjenværende bein og lemmer; All marg vil bli skyllet inn i samme koniske rør.
- Bruk en tom 10 ml sprøyte og en 20 G kanyle til å bryte opp benmargsklumpene i slangen ved å trekke benmargen opp og ned i sprøyten 5-10 ganger.
- Tilsett et sterilt 40 μm filter til et rent 50 ml sentrifugerør og skyll det med 1 ml benmargshøstingsløsning. Deretter filtrerer benmargen for å fjerne eventuelle gjenværende klumper. Merk dette røret "Filtrert benmarg".
- Oppbevar den filtrerte benmargen i kjøleskap eller på is til bruk. Den skal brukes samme dag som høsting. Hvis de ikke brukes samme dag, frys cellene ved hjelp av et kryokonserveringsmiddel, for eksempel dimetylsulfoksid (DMSO).
FORSIKTIG: Alt avfall fra disse forsøkene skal kastes på riktig måte i en beholder for biologisk farlig avfall. Alle skarpe gjenstander skal gå i en riktig merket biohazard skarpe beholder.
4. Røde blodlegemer lyse av benmarg
- Sentrifuger benmargscellene ved 170 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Vakuum og kast supernatanten. Resuspender cellene i 10 ml 1x lysisbuffer for røde blodlegemer og inkuber i 4 minutter.
- Tilsett 30 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) for å stoppe reaksjonen av lysisbufferen. Sentrifuger cellene i 8 minutter ved 170 x g ved romtemperatur. Vakuum og kast supernatanten. Suspender i 10-20 ml fargebuffer.
5. Antall celler
- Kombiner 500 μl celler med 9,5 ml benmargshøstingsløsning for å oppnå en 1:20 fortynning.
MERK: Dette vil bli brukt til celletellinger og trenger ikke å holdes sterilt. - Trekk ut 200 μL celler fra 1:20-fortynningen, tilsett dem til 200 μL trypanblått, og bland godt.
- Legg blandingen til et hemocytometer og telle levende og døde celler på begge sider. Beregn den opprinnelige cellesuspensjonen ved hjelp av denne tabellen (vist i tilleggsfil 1) og ligninger:
Celler per milliliter:
Totalt antall celler:
- Spinn ned cellene ved 170 x g i 10 minutter ved 4 °C og resuspender til en konsentrasjon på 10 x 10 6 per 1 ml (1 x 106 celler per 100 μL), basert på produsentens forslag til antistofffortynninger.
- Gå videre til flowcytometri (trinn 8).
6. Høsting av blod fra mus
- Euthanize musen ved hjelp av CO2 gass eller cervical dislokasjon.
- Utfør et hjerteblodtrekk i 45° vinkel med en 26 G kanyle festet til en 1 ml sprøyte belagt med 0,5 M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA).
- Spinn ned blodet og resuspender i media eller flekkbuffer.
MERK: Cellene vil bli spunnet ned og resuspendert til endelig konsentrasjon i fargebuffer etter røde blodlegemer lyse og celletall. - Utfør lyseringen av røde blodceller (trinn 4).
- Utfør celletellingen (trinn 5).
- Gå videre til flowcytometri (trinn 8).
7. Behandling av humant blod og benmargsprøver
- Utfør alle prosedyrer under en BSL2-sertifisert hette mens du bruker personlig verneutstyr.
- Samle prøvene forrige natt og utføre røde blodlegemer lyse. Sørg for at prøvene er avidentifisert og anonymisert før de mononukleære prøvene sendes over natten på is.
- Ved ankomst, sentrifugering av de levende cellene ved 170 x g ved 4 °C i 10 minutter.
MERK: Dette er BSL2-prøver som må følge lokale retningslinjer. - Suspender cellene på nytt i medier eller fargebuffer.
MERK: Cellene skal spinnes ned og resuspenderes til den endelige konsentrasjonen etter celletelling med fargebuffer. - Utfør celletellingen (trinn 5).
- Gå videre til flowcytometri (trinn 8).
8. Flowcytometri
- Flekker
- Del cellene i individuelt merkede rør basert på fargepanelet som brukes, inkludert kompensasjonskontroller (ufarget, isotypekontroller, enkeltfarget og fluorescens minus de [FMO]). Frys eventuelle gjenværende celler eller bruk dem til fluorescensaktivert cellesortering. Se tabell 1 for et eksempel på et fargepanel med antistofffortynningene som ble brukt.
MERK: For hver ekstra fluorofor som tilsettes, må FMOer i kombinasjon med gjenværende fluoroforer tilsettes sammen med en enkelt flekk av den fluoroforen. Isotypekontroller kan brukes til å blokkere ikke-spesifikk farging. Hvert nytt antistoff som brukes, titreres med prøvene for optimal fortynning. - Tilsett antistoffer i henhold til produsentens anbefalte fortynninger og bland godt ved å bla på bunnen av rørene. Antistoffkonsentrasjoner angis vanligvis som 1 x 106 celler per 100 μL. Fortynninger med antistoffer og kontroller er vist i tabell 1. Antistoffer er konjugert med fluoroforer og må beskyttes mot lys.
MERK: Det er best å bruke EpCAM konjugert til phycoerythrin (PE) for å muliggjøre visualisering av lave populasjoner av celler (titrat ved 3-5 μL per 1 million celler, som angitt i tabell 1). PE-CD49f ble brukt som en enkelt flekk PE-kontroll (20 μL per 1 million celler), siden disse cellene er mer utbredt enn PE-EpCAM og dermed lettere å bruke for kompensasjon. - Rug i 30 minutter ved 4 °C i mørket.
- Etter inkubering, ta rørene tilbake til BSL2-hetten og tilsett 1 ml fargebuffer til hvert rør.
- Deretter sentrifugerer du rørene ved 170 x g ved 4 °C i 5-10 minutter.
- Etter sentrifugering, ta de kappede rørene med cellene tilbake til BSL2-hetten og aspirer ut supernatanten. Pass på å bytte spissene på aspirasjonspipetten mellom hvert rør for å forhindre krysskontaminering.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml fargebuffer og flikk bunnen av rørene for å blande.
- Vask cellene to ganger til ved å gjenta trinn 8.1.4-8.1.7.
MERK: Ikke bruk pipetter til å resuspendere, for å unngå å miste celler. - Resuspender i 500 mikrol fargebuffer for endelig resuspensjon før flowcytometri. Tilsett 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) eller død celle diskriminator, i henhold til produsentens anbefalinger.
- Del cellene i individuelt merkede rør basert på fargepanelet som brukes, inkludert kompensasjonskontroller (ufarget, isotypekontroller, enkeltfarget og fluorescens minus de [FMO]). Frys eventuelle gjenværende celler eller bruk dem til fluorescensaktivert cellesortering. Se tabell 1 for et eksempel på et fargepanel med antistofffortynningene som ble brukt.
- Flow cytometer
- Etter å ha satt opp maskinen, bruk kontrollene og FMOene til å stille inn kompensasjon og porter. Bruk Hanks balanserte saltløsning (HBSS) som skivevæske for å støtte de skjøre cellene. Bruk PBS hvis HBSS ikke er tilgjengelig.
MERK: Flowcytometeret som brukes og programvaren er oppført i materialfortegnelsen. - Last inn eksemplene én om gangen, og samle inn datapunkter for 50 000, 100 000, 500 000 og én million hendelser. Oppbevar tubene på is eller i kjøleskap til bruk.
MERK: En tidsbegrensning kan settes ved innsamling for å sikre prøvens levedyktighet. - Samle cellene i 3 ml RPMI med 10% FBS i 15 ml sentrifugerør.
- Hvis du utfører immunfluorescens på EpCAM+-celler, bruk flowcytometeret til å sortere 800 til 1000 celler i hver brønn i et 8-brønns lysbilde.
- Sorter ut EpCAM-cellepopulasjonen på separate lysbilder som en negativ kontroll som skal brukes ved farging for immunfluorescens.
MERK: Cellene kan også sorteres i 15 ml rør som inneholder FBS og spunnet på et lysbilde ved hjelp av cytosentrifugen eller en pipette for å forhindre at celler popper. - Fest lysbildene i en 50 % metanol/50 % acetonblanding ved -20 °C i 10 minutter. Oppbevar lysbildene ved -20 °C til farging med immunfluorescens.
- Etter å ha satt opp maskinen, bruk kontrollene og FMOene til å stille inn kompensasjon og porter. Bruk Hanks balanserte saltløsning (HBSS) som skivevæske for å støtte de skjøre cellene. Bruk PBS hvis HBSS ikke er tilgjengelig.
- Analyse av flowcytometri
- Åpne den lisensierte programvaren for flowcytometrianalyse.
- Load flow cytometry standard (FCS) filer hentet fra flowcytometeret med kontroller og prøver.
- Klikk Opprett gruppe, og bruk nøkkelord til å plassere eksempler og kontroller i en gruppe.
MERK: Bruk "ingen flekk"-kontrollen til å gate i programvaren for flowcytometrianalyse, som vist i figur 3. - Dobbeltklikk på eksemplet uten flekkkontroll for å åpne en ungert graf.
- Sett grafen y-aksen til SSC-A og x-aksen til FSC-A (sidespredningsområde med fremoverspredningsområde), som indikerer cellestørrelse og intern kompleksitet.
- Klikk på polygonformen øverst til venstre og opprett en port rundt cellene. Sørg for å utelukke cellene i periferien, da disse mest sannsynlig er rusk. Merk denne porten "Celler", som vist i figur 3A.
- Når cellene er gated, dobbeltklikker du inne i polygonformen for å åpne en annen graf i et nytt vindu.
- Sett y-aksen til den nye grafen til SSC-A og x-aksen til SSC-W for dublettdiskriminering. Klikk mangekantfiguren, og opprett et rektangel rundt enkeltcellene. Merk dette "Single Cells", som vist i figur 3B.
- Når cellene er gated, dobbeltklikker du inne i polygonformen for å åpne en annen graf i et nytt vindu.
- Sett y-aksen til FSC-A og x-aksen til DAPI-A (eller den døde cellediskriminatoren som brukes).
- Opprett en mangekantport rundt de negative DAPI-cellene på venstre side av grafen. Merk disse "levende celler", som vist i figur 3C.
- Når cellene er gated, dobbeltklikker du inne i polygonformen for å åpne en annen graf i et nytt vindu.
- Sett y-aksen til SSC-A og x-aksen til EpCAM-PE (eller hvilken fluorofor som brukes til å identifisere EpCAM-cellene). Celler til venstre er EpCAM-negative. Hvis noen celler vises til høyre, er de EpCAM-positive.
- Bruk EpCAM-PE-grafen til å lage en polygonport, som ekskluderer cellene til venstre og bare inkluderer det tomme rommet til høyre. Merk det tomme området til høyre inne i polygonen "EpCAM", som vist i figur 3D.
MERK: Dette er ingen flekkkontroll, så det bør ikke være EpCAM-uttrykk. Bruk kontrollen ingen flekk for å bestemme hvilke celler som er EpCAM-positive. Dette fullfører gating-strategien for kompensasjon, slik at alle grafer kan være stengt på dette tidspunktet. - På arbeidsområdesiden markerer du linjen uten flekk med "Celler", "Enkeltceller", "Levende celler" og "EpCAM". Høyreklikk og velg kopier analyse til gruppe. Dette kopierer gating-strategien til alle andre innlastede prøver i den tidligere opprettede gruppen. Hvis en gruppe ikke ble opprettet i utgangspunktet, kan den opprettes nå ved å velge Opprett gruppe øverst til venstre.
- Gå gjennom prøvene i gruppen og sjekk polygonportene som er tegnet tidligere for å sikre at de passer til alle prøvene og kontrollene. Dette gir prosentvis antall og antall celler.
- Klikk på layoutredigeringsknappen L øverst til venstre over "Arbeidsområde". Disse grafene kan deretter ordnes og eksporteres ved hjelp av layoutredigereren.
- Fremstilling av immunfluorescensreagenser
- Forbered antistofffortynningsvæsken ved å kombinere 1 g bovint serumalbumin (BSA), 2 g ikke-fet melk, 10 ml 10x trisbufret saltvann (TBS), 100 μL Tween og 90 ml destillert vann.
- Forbered TBST ved å kombinere 50 ml 20x TBS, 950 ml destillert vann og 200 μL tween.
- Forbered 10% Normal Horse Serum (NHS) ved å kombinere 1 ml NHS med 9 ml antistofffortynningsmiddel (trinn 8.4.1).
- Forbered 1% NHS ved å kombinere 1 ml 10% NHS med 9 ml TBST.
- Farging av immunfluorescens
- Fjern lysbildene fra -20 °C og la dem varmes opp til romtemperatur.
- Vask lysbildene tre ganger i destillert vann i 5 min hver.
- Blokker lysbildene i 1 time ved romtemperatur i 10% NHS i antistofffortynningsmiddel (trinn 8.4.3).
- Fortynn det primære antistoffet (pan-cytokeratin) til 1:750 i 1% NHS i TBST (trinn 8.4.4). Inkuber lysbilder i det fortynnede primære antistoffet over natten ved 4 °C.
- Neste dag vasker du lysbildene tre ganger med en 1x vaskebuffer (PBS eller TBST) i 5 minutter hver.
- Fortynn det sekundære antistoffet til 1: 1000 i 1% NHS i TBST (trinn 8.4.4). Inkuber lysbildene i det fortynnede sekundære antistoffet i 1 time ved romtemperatur.
- Vask lysbildene tre ganger med 1x vaskebuffer i 5 min hver. Monter og dekk til lysbildene med hardsettmonteringsmedier med DAPI. Bruk en bomullspinne til å rulle forsiktig ut eventuelle bobler under dekselet.
Representative Results
Ved hjelp av disse metodene ble sjeldne populasjoner av epitelceller i blod og benmarg hos normale mennesker og mus visualisert. Med riktig kompensasjon og kontroller som beskrevet, var resultatene konsekvent som viste 4%-5% av cellene i murine benmarg EpCAM+, uavhengig av hvor mange celler som ble talt, som vist i figur 4 og figur 5. I murine blodprøver var mindre enn 0,5 % av cellene EpCAM+, som vist i figur 6. I humane benmargsprøver var 2%-5% av cellene EpCAM+, som vist i figur 7 og figur 8. Mens 2% -5% er et stort utvalg, var prosentandelene innen hver enkelt donor konsistente da trinnvis flere celler ble talt. I humane blodprøver var rundt 0,3 % av cellene EpCAM+, som vist i figur 9. Våre kontrollprøver (ingen flekk, isotypekontroll og FMO) ga svært få falske positive EpCAM+-resultater, som vist i figur 4 og figur 7. Celler fra EpCAM+- og EpCAM-gruppene som ble sortert på lysbilder, viste positiv farging for pan-cytokeratin i EpCAM+-prøver, og var negative for pan-cytokeratin i EpCAM-prøver, som vist i figur 10. Disse resultatene indikerer at eksperimentene var hensiktsmessig utformet og reproduserbare.
Figur 1: Krt14Cre;mTmG transgene mus med inkrementelle tellinger av benmarg. Benmargen til Krt1-14;mTmG-mus ble talt trinnvis. GFP-positive celler indikerer keratin 14-ekspresjon og ble identifisert ved hjelp av flowcytometri. Etter hvert som flere benmargceller ble talt, var denne keratin 14 positive cellepopulasjonen lettere identifiserbar. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsflyt for EpCAM+- og cytokeratin+-celler. Benmargen og blodcellene ble først sortert ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for å skille EpCAM+ og EpCAM-celler. Disse cellene ble sortert i to forskjellige reagensrør, samt på to forskjellige lysbilder. Cellene sortert i reagensrør ble spunnet på lysbilder ved hjelp av en cytosentrifuge. Lysbildene ble deretter farget med et pan-cytokeratin primært antistoff, deretter farget med et sekundært antistoff. Lysbildene ble analysert ved hjelp av fluorescensmikroskopi for å observere pan-cytokeratinuttrykk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Programvare for flowcytometrianalyse. Ved analyse av flowcytometridata ved hjelp av analyseprogramvare brukes ingen flekkkontroll til å velge cellene av interesse. Celler velges først med SSC-A og FSC-A, som viser cellens indre kompleksitet og størrelse. (A) En polygonport tegnes rundt cellene. (B) Enkeltceller er anskaffet ved å gating SSC-A av SSC-W. (C) Levende celler er anskaffet ved gating FSC-A versus DAPI. (D) EpCAM-negative celler ekskluderes ved å gå til høyre for de EpCAM-negative cellene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Flowcytometrisk analyse av EpCAM+-celler i benmarg hos mus. Kontroller uten flekker, isotype og FMO-er vises i topppanelet, med det trinnvise antallet på 50 000, 100 000 og 500 000 celler vist i bunnpanelet. Disse diagrammene visualiserer konsistensen i prosenter på tvers av tellinger, til tross for den generelle økningen i totale celler som telles. Panelene til høyre angir gatingstrategien, som diskutert tidligere i avsnittet om flowcytometrianalyse og som vist i figur 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: EpCAM+ celler i benmarg fra mus utgjør 5,17 % ± 0,001 % av befolkningen. Benmargcellene til tre individuelle mus ble analysert. De riktige kontrollene ble inkludert for riktig vitenskapelig strenghet. Prosentandelen positive celler forble konsistent over prøvene, på grunn av at musene var genetisk identiske. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: EpCAM+ celler i museblod utgjør 0,45% ± 0,0006% av befolkningen. Blodcellene til to individuelle mus ble analysert. Kontroller ble inkludert for å vise at riktig prosedyre ble fulgt for å gi avgjørende resultater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Flowcytometrisk analyse på EpCAM+ human benmarg. Kontroller uten flekk, isotype og FMO-er vises i topppanelet, og det trinnvise antallet på 50 000, 100 000 og 500 000 celler vises i bunnpanelet. Disse diagrammene visualiserer konsistensen i prosenter på tvers av tellinger, til tross for den generelle økningen av totale celler som telles. Panelene til høyre angir gatingstrategien, som diskutert tidligere i avsnittet om flowcytometrianalyse og som vist i figur 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: EpCAM+-celler i human benmarg utgjør 3,53 % ± 0,006 % av befolkningen. Tre forskjellige humane benmargsprøver ble analysert. Passende kontroller for vitenskapelig strenghet ble inkludert. Andelen positive celler varierer på grunn av genetisk heterogenitet blant mennesker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: EpCAM+-celler av humant blod utgjør 0,18 % ± 0,0004 % av befolkningen. Tre forskjellige humane blodprøver ble analysert. Passende kontroller for vitenskapelig strenghet ble inkludert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Immunfluorescens av EpCAM+ og EpCAM- lysbilder. FACS ble brukt til å skille EpCAM+ og EpCAM-celler. Pan-cytokeratin ble farget for bruk av DAKO pan-cytokeratin antistoff. Det ble ikke brukt primær antistoffkontroll i normalt serum, da pancytokeratin er et polyklonalt antistoff. Disse resultatene bekrefter nøyaktigheten av FACS. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Menneskelig benmarg eller blod | |||
| Antistoff | Rør # | # av celler | AB Conc |
| Ubeiset | 1 | 1x106 | X |
| Bare DAPI | 2 | 1x106 | 1uL/ml |
| PE isotype kontroll | 3 | 1x106 | 1 uL |
| CD49f-PE enkel flekkkontroll | 4 | 1x106 | 20 uL i 100uL per 1x106 |
| EpCAM-PE lav titrering | 5 | 1x106 | 3 ul i 100uL per 1x106 |
| EpCAM-PE medium titrering | 6 | 1x106 | 4 ul i 100uL per 1x106 |
| EpCAM-PE høy titrering | 7 | 1x106 | 5 ul i 100uL per 1x106 |
| EpCAM-PE høy sortering på lysbilder | 8 | 10x106 | 50 uL i 1 ml |
Tabell 1: Fargepanel for flowcytometri. Et eksempel på et flowcytometrifargepanel for mononukleære celler i blod eller benmarg. Kontroller inkludert er DAPI bare, unstained kontroll, og PE enkelt flekk kontroll (PE-CD49f ble brukt som en bedre positiv kontroll). Fluorescens minus en er ikke inkludert i dette panelet, da det bare er en enkelt farge (PE). Ved tilsetning av flere fluoroforfarger, som fluoresceinisotiocyanat (FITC) eller allofykocyanin (APC), bør FMO inkluderes ved å utelukke én fluorofor for hver FMO-kontroll.
Tilleggsfil 1: Telling av levende celler ved hjelp av hematocytometer. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Det er noen bevis i litteraturen på tilstedeværelsen av epitelceller i benmargen. Tidligere har papirer typisk undersøkt epitelcellers rolle i sammenheng med sykdom og skade, for eksempel i leveren, lungen, mage-tarmkanalen (GI), thymus og hud14,15,16,17. Imidlertid er det ikke mye kjent om tilstedeværelsen av disse epitelcellene i beinmarg hos friske individer. Denne artikkelen søker å etablere en reproduserbar metode, med sikte på å identifisere og isolere epitelceller fra normalt blod og benmarg. Denne metoden vil drive feltet fremover for å identifisere hvorfor epitelceller er tilstede og hva deres rolle er i blod og benmarg i fravær av sykdom; Kanskje disse cellene er en del av normalt vev vedlikehold eller aktivert i tider med skade. Benmargen er et lager av stamceller; Det er imidlertid uklart hva avstamningen til disse epitelcellene kan være. En nylig artikkel diskuterer benmargsavledede epitelceller i thymus, som først uttrykker EpCAM og den hematopoietiske markøren CD45, og deretter mister CD45-uttrykket over tid etter skade15. Forskning fra laboratoriet vårt har også bekreftet tilstedeværelsen av CD45+ EpCAM+-celler i sunt blod og benmarg i fravær av skade12. Imidlertid er rollen til disse cellene ennå ikke bestemt.
Det var behov for en reproduserbar metode for å undersøke epitelceller i den friske benmargen. Den beskrevne metoden vil bidra til å karakterisere disse cellene videre i sin normale tilstand. Det er viktige trinn i denne metoden for å opprettholde reproduserbarhet. Et av de mest kritiske trinnene i denne protokollen er å opprettholde et sterilt miljø i hetten mens du høster benmargen fra mus. Ved høsting fra flere mus unngås krysskontaminering mellom prøvene ved å bruke nye nåler og sprøyter for hver mus. Dette sikrer også at prøven er ren og fri for forurensninger som kan påvirke resultatene. I tillegg bør antall forberedte sprøyter og merkede koniske rør for hver ekstra mus økes. Et annet viktig skritt innebærer å skylle beinene til en ren hvit farge er tydelig for å sikre at de fleste benmargcellene er fjernet; Sjansene for å oppdage sjeldne celler øker i en renere prøve. En modifikasjon ble gjort for å optimalisere lysisprotokollen for røde blodlegemer; Flere lysisbuffere ble testet for å finne den rette som ga konsekvent høy levedyktighet, da nesten halvparten av cellene gikk tapt i løpet av dette trinnet. Ulike reagenser og inkubasjonsperioder må kanskje optimaliseres for bedre resultater i andre innstillinger.
Den viktigste begrensningen i denne protokollen er å bruke flowcytometri for å finne sjeldne cellepopulasjoner. Som diskutert tidligere, bidrar tillegg av kontroller og inkrementelle tellinger til å øke spesifisiteten og nøyaktigheten av analysen. En annen begrensning er at hensiktsmessige markører for populasjonen av interesse må identifiseres på forhånd. Dermed må man vite om nøkkelmarkører, antistoffer for flowcytometri og antistoffer som er kompatible med målartene.
Disse metodene er en forbedring i forhold til eksisterende metoder, da de tillater enkeltcelleanalyse til en brøkdel av kostnaden for den eksisterende automatiske CTC-isolatoren og enkeltcelle RNA-sekvensering. I tillegg er flowcytometri lettere tilgjengelig. FACS opprettholdt høyere levedyktighet for cellene sammenlignet med tidligere rapporterte resultater ved bruk av magnetisk mikroperleseparasjon. Til slutt tillater disse teknikkene separasjon av celler for nedstrømsanalyser, for eksempel bulk RNA-sekvensering, scRNA-sekvensering eller cellekultur.
Disclosures
Det er ingen kjente interessekonflikter.
Acknowledgments
Josh Monts, Core Facility Flow Cytometer tekniker, The Hormel Institute
Todd Schuster, leder for kjernefasiliteter, Hormel-instituttet
Derek Gordon, statistiker, Rutgers University
Vi takker Karen Klein fra Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM for redaksjonell hjelp.
Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under tildelingsnummer R21 AR075281, og et stipend til hjelp for forskning, artisteri og stipend, kontoret til visepresidenten for forskning, University of Minnesota (forslag # 324240). Vi takker for støtten fra The Hormel Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes used for flow cytometry |
| 500 mL jar with lid | Nalgene | 11-823-32 | Used to wash the mouse |
| 190 proof Ethanol | Decon laboratories Inc | 2801 | Diluted to 70% with dH2O |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | Dilution: 1:1000 |
| Brightline Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-10 | Used to count alive cells |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Component of antibody diluent |
| Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Component of staining buffer and harvesting solution |
| Curity gauze sponges | Covidien | 2187 | Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow |
| Curved Forceps | Miltex | 18-784 | Used during harvest |
| Cytokeratin, Wide Spectrum Screening | Dako | Z0622 | Dilution 1:750 *Now discontinued |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) | Gibco | 14190-144 500mL | Used to stop the red blood cell lysis reaction |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E9884-100G | Used at 0.5 M |
| Gentamicin sulfate | Lonza | 17-518Z | Component of harvesting solution |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) | Gibco | 14175-095 500mL | Component of harvesting solution and staining buffer solution |
| Luer-Lok tip 10 mL syringe | Becton, Dickinson and Co | 309604 | Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps |
| Magic touch 2 ice bucket | BelArt | M16807-2001 | Used to store the specimens on ice |
| Nonfat dry milk | Apex | 20-241 | Component of Antibody Diluent |
| Normal horse serum | Vector | ZE0122 | Component of Antibody Diluent |
| PE anti-human CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 324206 | Dilution: 5 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 118205 | Dilution: 3 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE mouse IgG2b, κ isotype control | Biolegend | 400313 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat anti-human CD49f | BD Biosciences | 555763 | Dilution: 20 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat IgG2am, κ Isotype control | Biolegend | 400508 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Basix | 14-955-240 | Used in the centrifuge |
| Povidone-Iodine Scrub | Aplicare | 82-227 | Antiseptic used to sterilize the mice |
| PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305176 | 20G needle used to break up bone marrow clumps |
| PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305111 | 26G needle used to flush bone marrow from bones |
| PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Services | 63422-06 | 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence |
| RBC Lysis buffer 10X | Invitrogen | 00-4300-54 | Dilution 1:10 using sterile deionized water |
| Scissors | Roboz | RS-6762 | Used during harvest |
| Stainless steel surgical blade #4 | Bard-Parker | 371222 | Used during harvest |
| Sterile tray | Polar ware | 10F | Used during harvest |
| StretchEase Powder-free nitrile examination gloves | Denville Scientific | G4161 | Used during harvest |
| Surgical Scalpel handle #4 | Fischer | 12-000-164 | Used with surgical blade |
| TBS 20x | Thermo | Component of TBST, used at 1X | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Used to count dead cells. Filtered with .45 µm |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-500mL | Component of TBST |
| Tweezers | Miltex | 6-8 | Used during harvest |
| Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1800 | Nuclear stain for immunofluorescence |
References
- Larsen, S. B., Cowley, C. J., Fuchs, E.
- Blanpain, C., Fuchs, E. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration. Science. 344 (6189), 1242281 (2014).
- Coradini, D., Casarsa, C., Oriana, S. Epithelial cell polarity and tumorigenesis: New perspectives for cancer detection and treatment. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (5), 552-564 (2011).
- Dmello, C., et al. Multifaceted role of keratins in epithelial cell differentiation and transformation. Journal of Biosciences. 44 (2), 33 (2019).
- Poulet, G., Massias, J., Taly, V.
- Eslami-S, Z., Cortés-Hernández, L. E., Alix-Panabières, C. Epithelial cell adhesion molecule: an anchor to isolate clinically relevant circulating tumor cells. Cells. 9 (8), 1836 (2020).
- Morris, R. J. Circulating tumor cells: quintessential precision oncology presenting challenges for biology. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 16 (2017).
- Lin, D., et al. Circulating tumor cells: biology and clinical significance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 404 (2021).
- Spence, M., Adai, S., Landon, T., Richter, G. Few and far between: Tools and strategies for rare-event detection using flow cytometry. BioprobesJournal of Cell Biology. 71, 14-18 (2015).
- Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. Journal of Cell Biology. 192 (3), 373-382 (2011).
- Ye, Q., Ling, S., Zheng, S., Xu, X. Liquid biopsy in hepatocellular carcinoma: circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Molecular Cancer. 18 (1), 114 (2019).
- Park, H., et al. marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
- Marsman, W. A., et al. Epithelial cells in bone marrow: do they matter. Gut. 54 (12), 1821-1822 (2005).
- Borue, X., et al. marrow-derived cells contribute to epithelial engraftment during wound healing. The American Journal of Pathology. 165 (5), 1767-1772 (2004).
- Chakrabarti, S., et al. marrow-derived cells contribute to the maintenance of thymic stroma including TECs. Journal of Immunology Research. 2022, 6061746 (2022).
- Krause, D. S., et al. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell. 105 (3), 369-377 (2001).
- Wong, A. P., et al. Targeted cell replacement with bone marrow cells for airway epithelial regeneration. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L740-L752 (2007).
