Summary
Denna artikel presenterar en reproducerbar metod med nya fynd om förekomsten av epitelceller i normalt humant och musblod och benmärg med hjälp av flödescytometri och immunofluorescensmikroskopi. Krt1-14;mTmG transgena möss användes som en in vivo-metod för att bekräfta dessa fynd.
Abstract
Epitelceller har identifierats i blod och benmärg hos patienter med cancer och andra sjukdomar. Förekomsten av normala epitelceller i blod och benmärg hos friska individer har dock ännu inte identifierats på ett konsekvent sätt. Här presenteras en reproducerbar metod för att isolera epitelceller från friskt humant och murint blod och benmärg (BM) med hjälp av flödescytometri och immunofluorescens (IF) mikroskopi. Epitelceller hos friska individer identifierades och isolerades först via flödescytometri med hjälp av epitelcelladhesionsmolekyl (EpCAM). Dessa EpCAM+-celler bekräftades uttrycka keratin med hjälp av immunofluorescensmikroskopi i Krt1-14;mTmG transgena möss. Humana blodprover hade 0,18% ± 0,0004 EpCAM+ celler (SEM; n = 7 biologiska replikat, 4 experimentella replikat). I human BM var 3,53% ± 0,006 (SEM; n = 3 biologiska replikat, 4 experimentella replikat) av mononukleära celler EpCAM+. I musblod utgjorde EpCAM+-celler 0,45 % ± 0,0006 (SEM; n=2 biologiska replikat, 4 experimentella replikat) och i mus BM var 5,17 % ± 0,001 (SEM; n=3 biologiska replikat, 4 experimentella replikat) EpCAM+. Hos möss var alla EpCAM+-celler immunreaktiva mot pan-cytokeratin, vilket bestämdes genom IF-mikroskopi. Resultaten bekräftades med Krt1-14; mTmG transgena möss, med låga (8,6 ursprungliga GFP + -celler per 106 analyserade celler; 0,085% av livskraftiga celler), men signifikant antal (p < 0,0005) GFP + -celler närvarande i normal murin BM, som inte var resultatet av slumpmässighet jämfört med flera negativa kontroller. Vidare var EpCAM+-celler i musblod mer heterogena än CD45+-celler (0,58% i BM; 0,13% i blod). Dessa observationer drar slutsatsen att celler som uttrycker cytokeratinproteiner är reproducerbara detekterbara bland mononukleära celler från humant och murint blod och BM. Vi demonstrerar en metod för vävnadsskörd, flödescytometri och immunfärgning som kan användas för att identifiera och bestämma funktionen hos dessa pan-cytokeratinepitelceller hos friska individer.
Introduction
Epitelceller finns i de fysiska barriärerna mellan våra kroppar och miljön och kan känna igen och reagera på förändringar i deras mikromiljö1. De har en växande stamcellsnisch som ger ett sätt att vända ny vävnad och reparera skador2. Vårt laboratorium studerar stamceller i hårsäckarna i huden; Hud är en bra modell för att studera epitelvävnad och stamcellsproliferation eftersom det är lätt synligt och det finns en konstant omsättning av celler. Epitelcancer är den vanligaste formen av cancer, möjligen på grund av epitelvävnader, såsom huden, som är den första försvarslinjen mot miljöcancerframkallande ämnen, vilket leder till höga omsättningshastigheter och spridning av epitelceller3. Det mesta av hudens epidermis, det övre skyddande skiktet, består av keratinocyter, som uttrycker olika typer av keratiner för att ge stöd och struktur4. Patienter med epitelcancer har ofta epitelceller närvarande i blodet och benmärgen som också uttrycker keratiner. Flytande biopsier är ett icke-invasivt sätt att upptäcka och övervaka dessa epitelceller i olika kroppsvätskor5. Cirkulerande epitelceller, även kallade cirkulerande tumörceller (CTC), finns i perifert blod och kan vara biomarkörer för cancerprognos, samt vägleda individualiserade terapibehandlingar. CTC kan också indikera sjukdomsprogression, behandlingseffekt och total patientöverlevnad 5,6.
Epitelial cell adhesion molecule (EpCAM) är en kliniskt använd markör för CTC och kan identifiera tumörer av epitelialt ursprung hos cancerpatienter. EpCAM spelar en roll i celladhesion, migration, signalering, proliferation och differentiering6. För att en cirkulerande epitelcell ska klassificeras som CTC måste den vara positiv för cytokeratiner 8, 18 och 19 och negativ för CD45, en vanlig leukocytmarkör6. CTC identifieras vanligtvis genom att först tömma CD45 med magnetiska mikrokulor, följt av testning för EpCAM och cytokeratin 19 med användning av immunofluorescensmikroskopi7. Den huvudsakliga begränsningen vid detektering av CTC är deras sällsynthet; De utgör mindre än 0,01% av alla celler i blodet, och mycket få överlever i omlopp för att nå avlägsna organ 8,9,10. Hänsyn måste tas vid utformning av experiment och tekniker för att isolera och identifiera dessa celler på grund av deras sällsynta natur. För närvarande finns det bara en Food and Drug Administration (FDA) -godkänd automatiserad encellssorterare som används för att identifiera CTC, och den använder EpCAM som biomarkör. Andra metoder inkluderar magnetisk pärlseparation och flödescytometri, eller en kombination av dessa metoder. Det finns ett behov av nya tekniker som har högre känslighet och specificitet för detektion av sällsynta CTC11.
Flödescytometri är en föredragen metod för detektion av sällsynta cellpopulationer i blod, benmärg och andra vävnadsprover. Dessa sällsynta celler kan inkludera stamceller, cirkulerande endotelceller, CTC och kvarvarande sjukdomsceller. Flödescytometri möjliggör kvantitativa mätningar av varje celltyp och sorterar dessa celler för vidare testning 7,9. Inkrementella räkningar utfördes för att säkerställa en korrekt bedömning av dessa sällsynta celler. Möjligheten att använda grind för att utesluta celler från vidare analys är ett sätt att öka specificiteten vid analys av celler. Begränsningarna för flödescytometri är den tid som krävs för analys av stora prover och bristen på visuell bekräftelse för cellidentitet. För att övervinna detta utfördes immunofluorescensmikroskopi på de sorterade cellerna för att bekräfta deras identitet.
Tidigare har vårt labb visat att benmärgscellerna rekryteras hos möss och bidrar till hudtumörer12. Dessa benmärgshärledda celler är positiva för pan-cytokeratin och epidermalt cytokeratin. För att ytterligare belysa rollen av epiteliala stamceller, benmärgshärledda celler och cytokeratinuttryckande celler i tumörprogression letades EpCAM+ cytokeratinpositiva celler i normala murina och humana blod- och benmärgsprover. Som med de flesta experiment utvecklades denna metod genom flera iterationer. Tidigare användes transgena möss tillsammans med inkrementella räkningar för att leta efter K14GFP-uttryckande celler i benmärgen12. När fler celler räknades kunde en representativ population av sällsynta celler identifieras, vilket visas i figur 1 i avsnittet representativa resultat. Motiveringen för att undersöka epitelceller i normalt blod och benmärg baserades på tidig litteratur om CTC, där normala friska donatorer hade bakgrundsnivåer av EpCAM+ celler13. Som tidigare nämnts börjar EpCAM-karakterisering ofta med utarmningen av CD45. Detta steg utelämnades eftersom vissa hematopoetiska celler har EpCAM och cytokeratinuttryck av okända skäl som behöver undersökas ytterligare. Därför sorterades celler baserat på närvaro eller frånvaro av EpCAM, oavsett cellinje, och immunfärgades sedan för cytokeratin. Protokollet nedan och arbetsflödet som visas i figur 2 beskriver en teknik som använder flödescytometri med kompensation och kontroller, statistiska metoder och immunofluorescensavbildning för att isolera och identifiera dessa sällsynta populationer av epitelceller.
Protocol
Alla djurprotokoll godkändes av University of Minnesota Institutional Animal Care and Use Committee i enlighet med NIH och federala riktlinjer. Färskt humant blod och benmärg köptes från kommersiella källor. Prover samlades in av företaget enligt ett godkänt IRB-protokoll från givare som var negativa för HIV, hepatit B, hepatit C och screenades för COVID-19. Alla prover avidentifierades först och anonymiserades innan de skickades av företaget. Eftersom dessa erhölls kommersiellt krävdes inget IRB-godkännande.
1. Beredning av lösningar
OBS: Alla lösningar måste beredas i en biologisk huva med en steril miljö. Få biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) certifiering för arbete med humant blod och benmärg.
- Förbered benmärgsskördlösningen genom att tillsätta 1 ml gentamicin och 5 ml fetalt bovint serum (FBS) till 500 ml Hanks balanssaltlösning (HBSS).
- Förbered färgningsbuffertlösningen genom att tillsätta 50 ml FBS till 500 ml HBSS.
- Förbered 1x lysbuffert genom att kombinera 10 ml 10x lysbuffert med 90 ml sterilt vatten.
2. Förbereda huven
- Slå på huven och låt den gå i några minuter för att få rätt luftflöde.
- Samla allt material för att utföra benmärgsskörd. Spraya dem inuti huven med 70% etanol för att bibehålla en steril miljö. Spraya händerna varje gång innan de tas in i huven.
- Placera den autoklaverade brickan i huven tillsammans med autoklaverad sax, en monterad skalpell, pincett och böjda pincett i en liten kopp fylld med 70% etanol för att hålla dem sterila.
- Tillsätt 10 ml benmärgsskördlösning till ett 50 ml centrifugrör och märk det "Limbs". Märk ytterligare 50 ml centrifugrör som "Bone Marrow".
- Dra upp 10 ml benmärgsskördlösning i en spruta och fäst sedan en 26 G nål.
3. Skörda benmärg från möss
- Avliva musen med CO 2-kvävning. Döden bekräftas genom frånvaro av hjärtslag och klämmer fötterna för att säkerställa att det inte finns någon reaktion. Cervikal dislokation kan utföras som ett sekundärt medel för fullständig eutanasi.
- Placera musen i en 500 ml behållare och tillsätt tillräckligt med jod för att täcka hälften av musen. Skaka försiktigt och snurra behållaren för att säkerställa noggrann täckning. Skölj med avjoniserat vatten. Utför ytterligare en jodtvätt och sedan två tvättar med 70% etanol enligt samma steg.
- Placera musen i huven och lägg den på ryggen på facket. Ta tag i bakbenen och dra isär dem tills en pop känns; Detta för att skilja benen från ryggraden.
- Gör ett snitt på 1 cm på musens hud nära ljumskområdet. Sätt in en sluten sax i snittet och öppna sedan saxen under huden för att skilja den från bukhinnan.
- Skär huden på benet runt låret och skär sedan huden ner i benet för att exponera musklerna och benen.
- Ta bort bakbenen genom att skära runt höftledet, var noga med att inte skära igenom lårbenet. Placera lemmarna i röret märkt som "Limbs" När båda benen tas bort, placera musen i en slaktkropp och lägg den i frysen.
OBS: Höftbenet bör kännas först innan du skär för att styra saxen och undvika att skära lårbenet, eftersom det mesta av benmärgen erhålls från lårbenet. - Börja klippa bort muskler, vävnad och fett längs en av lemmarna med saxen. Skär parallellt med benet. Använd sedan skalpellen och ta bort det återstående fettet eller muskeln med en vinkelrät skraprörelse mot benet.
- När benet har rengjorts ordentligt, separera lårbenet och skenbenet vid knäet. Använd skalpellen för att göra snitt på båda ändarna av lårbenet och skenbenet där det inte finns någon synlig benmärg.
- Sätt in den förberedda sprutan och nålen i benet. Om det finns motstånd, skär lite mer av benets ände tills det inte finns mer motstånd.
- Medan du håller benet ovanför röret märkt som "Bone Marrow", utvisa benmärgsskördlösningen genom benet för att spola benmärgen in i röret. Upprepa i den andra änden av benet för att få resten av benmärgen, tills benet verkar helt vitt eller tomt.
- Upprepa steg 7-9 för alla återstående ben och lemmar; All märg spolas i samma koniska rör.
- Använd en tom 10 ml spruta och en 20 G nål, bryt upp klumparna av benmärg i röret genom att dra benmärgen upp och ner i sprutan 5-10 gånger.
- Tillsätt ett sterilt 40 μm filter till ett rent 50 ml centrifugrör och skölj det med 1 ml benmärgsskördlösning. Filtrera sedan benmärgen för att ta bort eventuella kvarvarande klumpar. Märk detta rör "Filtrerad benmärg".
- Förvara den filtrerade benmärgen i kylskåp eller på is tills den används. Den ska användas samma skördedag. Om de inte används samma dag, frys cellerna med ett kryokonserveringsmedel, såsom dimetylsulfoxid (DMSO).
VARNING: Allt avfall från dessa experiment ska kasseras ordentligt i en behållare för biologiskt farligt avfall. Alla vassa föremål ska placeras i en korrekt märkt behållare för vassa föremål för biologisk fara.
4. Röd blodkroppslys av benmärgen
- Centrifugera benmärgscellerna vid 170 x g i 10 minuter vid rumstemperatur. Dammsug och kassera supernatanten. Resuspendera cellerna i 10 ml 1x röd blodkroppslysbuffert och inkubera i 4 minuter.
- Tillsätt 30 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) för att stoppa reaktionen av lysbufferten. Centrifugera cellerna i 8 minuter vid 170 x g vid rumstemperatur. Dammsug och kassera supernatanten. Återsuspendera i 10-20 ml färgningsbuffert.
5. Antal celler
- Kombinera 500 μl celler med 9,5 ml benmärgsskördlösning för att erhålla en spädning på 1:20.
OBS: Detta kommer att användas för cellräkning och behöver inte hållas sterilt. - Dra ut 200 μL celler från spädningen 1:20, tillsätt dem till 200 μL trypanblått och blanda väl.
- Tillsätt blandningen till en hemocytometer och räkna levande och döda celler på båda sidor. Beräkna den ursprungliga cellsuspensionen med hjälp av denna tabell (visas i kompletterande fil 1) och ekvationer:
Celler per milliliter:
Totalt antal celler:
- Snurra ner cellerna vid 170 x g i 10 minuter vid 4 °C och suspendera igen till en koncentration av 10 x 10 6 per 1 ml (1 x 106 celler per 100 μl), baserat på tillverkarens förslag till antikroppsutspädningar.
- Fortsätt till flödescytometri (steg 8).
6. Skörda blod från möss
- Avliva musen med CO2-gas eller cervikal dislokation.
- Utför ett hjärtblodprov i 45 ° vinkel med en 26 G nål fäst vid en 1 ml spruta belagd med 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA).
- Snurra ner blodet och återsuspendera i media eller färgningsbuffert.
OBS: Cellerna kommer att spinnas ner och återsuspenderas till slutlig koncentration i färgningsbuffert efter rödblodkroppslys och cellantal. - Utför den röda blodkroppslysen (steg 4).
- Utför cellantalet (steg 5).
- Fortsätt till flödescytometri (steg 8).
7. Bearbetning av humanblod och benmärgsprover
- Utför alla procedurer under en BSL2-certifierad huva medan du bär personlig skyddsutrustning.
- Samla proverna föregående natt och utför röda blodkroppar. Se till att proverna avidentifieras och anonymiseras innan du skickar de mononukleära proverna över natten på is.
- Vid ankomsten, snurra ner de levande cellerna vid 170 x g vid 4 ° C i 10 minuter.
OBS: Det här är BSL2-prover som måste följa lokala riktlinjer. - Återsuspendera cellerna i media eller färgningsbuffert.
OBS: Cellerna ska spinnas ner och återsuspenderas till den slutliga koncentrationen efter cellräkning med färgningsbuffert. - Utför cellantalet (steg 5).
- Fortsätt till flödescytometri (steg 8).
8. Flödescytometri
- Färgning
- Dela cellerna i individuellt märkta rör baserat på den använda färgningspanelen, inklusive kompensationskontroller (ofärgade, isotypkontroller, enkelfärgade och fluorescens minus sådana [FMO]). Frys eventuella kvarvarande celler eller använd dem för fluorescensaktiverad cellsortering. Se tabell 1 för ett exempel på en färgningspanel med de antikroppsutspädningar som använts.
OBS: För varje ytterligare fluorofor som tillsätts måste FMO i kombination med återstående fluoroforer tillsättas tillsammans med en enda fläck av den fluoroforen. Isotypkontroller kan användas för att blockera ospecifik färgning. Varje ny antikropp som används bör titreras med proverna för optimal utspädning. - Tillsätt antikroppar enligt tillverkarens rekommenderade utspädningar och blanda väl genom att knäppa botten av rören. Antikroppskoncentrationer anges vanligen som 1 x 106 celler per 100 μl. Spädningar med antikroppar och kontroller visas i tabell 1. Antikroppar är konjugerade med fluoroforer och måste skyddas mot ljus.
OBS: Det är bäst att använda EpCAM konjugerat till fykoerytrin (PE) för att möjliggöra visualisering av låga populationer av celler (titrera vid 3-5 μL per 1 miljon celler, som anges i tabell 1). PE-CD49f användes som en enda fläck PE-kontroll (20 μL per 1 miljon celler), eftersom dessa celler är vanligare än PE-EpCAM och därmed lättare att använda för kompensation. - Inkubera i 30 minuter vid 4 °C i mörker.
- Efter inkubation, för tillbaka rören till BSL2-huven och tillsätt 1 ml färgningsbuffert till varje rör.
- Centrifugera sedan rören vid 170 x g vid 4 °C i 5–10 minuter.
- Efter centrifugering, för tillbaka de täckta rören med cellerna till BSL2-huven och aspirera ut supernatanten. Var noga med att byta spetsarna på aspirationspipetten mellan varje rör för att förhindra korskontaminering.
- Återsuspendera cellpelleten i 1 ml färgningsbuffert och vrid botten av rören för att blanda.
- Tvätta cellerna ytterligare två gånger genom att upprepa steg 8.1.4-8.1.7.
OBS: Använd inte pipetter för att återsuspendera, för att undvika att förlora celler. - Resuspendera i 500 μl färgningsbuffert för slutlig resuspension före flödescytometri. Tillsätt 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) eller död cell diskriminator, enligt tillverkarens rekommendationer.
- Dela cellerna i individuellt märkta rör baserat på den använda färgningspanelen, inklusive kompensationskontroller (ofärgade, isotypkontroller, enkelfärgade och fluorescens minus sådana [FMO]). Frys eventuella kvarvarande celler eller använd dem för fluorescensaktiverad cellsortering. Se tabell 1 för ett exempel på en färgningspanel med de antikroppsutspädningar som använts.
- Flödescytometer
- När du har ställt in maskinen använder du kontrollerna och FMO: erna för att ställa in kompensation och grindar. Använd Hanks balanserade saltlösning (HBSS) som mantelvätska för att stödja de ömtåliga cellerna. Använd PBS om HBSS inte är tillgängligt.
OBS: Den använda flödescytometern och programvaran listas i materialtabellen. - Läs in proverna ett i taget och samla in datapunkter för 50 000, 100 000, 500 000 och en miljon händelser. Förvara rören på is eller kyl tills de används.
OBS: En tidsgräns kan fastställas vid insamling för att säkerställa provets livskraft. - Samla cellerna i 3 ml RPMI med 10% FBS i 15 ml centrifugrör.
- Om du utför immunofluorescens på EpCAM+ -celler, använd flödescytometern för att sortera 800 till 1000 celler i varje brunn i en 8-brunnsglas.
- Sortera ut EpCAM-cellpopulationen på separata objektglas som en negativ kontroll att använda vid färgning för immunofluorescens.
OBS: Cellerna kan också sorteras i 15 ml rör som innehåller FBS och snurras på en bild med cytocentrifug eller en pipett för att förhindra att celler poppar. - Fixera objektglasen i en 50-procentig metanol/50-procentig acetonblandning vid -20 °C i 10 minuter. Förvara glasen vid -20 °C tills de färgas med immunofluorescens.
- När du har ställt in maskinen använder du kontrollerna och FMO: erna för att ställa in kompensation och grindar. Använd Hanks balanserade saltlösning (HBSS) som mantelvätska för att stödja de ömtåliga cellerna. Använd PBS om HBSS inte är tillgängligt.
- Analys av flödescytometri
- Öppna den licensierade programvaran för flödescytometrianalys.
- Load flow cytometry standard (FCS) filer som förvärvats från flödescytometern med kontroller och prover.
- Klicka på Skapa grupp och använd nyckelord för att placera exempel och kontroller i en grupp .
Använd kontrollen "ingen fläck" för att grinda i analysprogramvaran för flödescytometri, som visas i figur 3. - Dubbelklicka på kontrollprovet utan fläck för att öppna ett okontrollerat diagram.
- Ställ in diagrammets y-axel på SSC-A och x-axeln på FSC-A (sidospridningsområde efter spridningsområde framåt), vilket indikerar cellstorlek och intern komplexitet.
- Klicka på polygonformen i den övre vänstra panelen och skapa en grind runt cellerna. Se till att utesluta cellerna i periferin, eftersom dessa troligen är skräp. Märk denna grind "Celler", som visas i figur 3A.
- När cellerna är gated dubbelklickar du inuti polygonformen för att öppna en annan graf i ett nytt fönster.
- Ställ in y-axeln i den nya grafen till SSC-A och x-axeln till SSC-W för dubblettdiskriminering. Klicka på polygonformen och skapa en rektangel runt de enskilda cellerna. Märk detta "Enstaka celler", som visas i figur 3B.
- När cellerna är gated dubbelklickar du inuti polygonformen för att öppna en annan graf i ett nytt fönster.
- Ställ in y-axeln på FSC-A och x-axeln på DAPI-A (eller vilken dödcellsdiskriminator som används).
- Skapa en polygongrind runt de DAPI-negativa cellerna till vänster i diagrammet. Märk dessa "levande celler", som visas i figur 3C.
- När cellerna är gated dubbelklickar du inuti polygonformen för att öppna en annan graf i ett nytt fönster.
- Ställ in y-axeln på SSC-A och x-axeln på EpCAM-PE (eller vilken fluorofor som används för att identifiera EpCAM-cellerna). Cellerna till vänster är EpCAM-negativa. Om några celler visas till höger är de EpCAM-positiva.
- Använd EpCAM-PE-grafen för att skapa en polygongrind, som utesluter cellerna till vänster och endast inkluderar det tomma utrymmet till höger. Märk det tomma området till höger inuti polygonen "EpCAM", som visas i figur 3D.
OBS: Detta är en ingen fläckkontroll, så det bör inte finnas EpCAM-uttryck. Använd kontrollen ingen fläck för att avgöra vilka celler som är EpCAM-positiva. Detta slutför grindstrategin för kompensation, så alla grafer kan stängas just nu. - På arbetsytans sida markerar du ingen fläcklinje med "Celler", "Enstaka celler", "Levande celler" och "EpCAM". Högerklicka och välj kopiera analys för att gruppera. Då kopieras grindstrategin till alla andra inlästa exempel i den tidigare skapade gruppen. Om en grupp inte skapades från början kan den skapas nu genom att välja Skapa grupp längst upp till vänster.
- Gå igenom proverna inom gruppen och kontrollera polygongrindarna som dragits tidigare för att se till att de passar med alla prover och kontroller. Detta ger procentantalet och antalet celler.
- Klicka på layoutredigeringsknappen L i det övre vänstra hörnet ovanför "Arbetsyta". Dessa grafer kan sedan ordnas och exporteras med hjälp av layoutredigeraren.
- Beredning av immunofluorescensreagens
- Bered antikroppsspädningsmedlet genom att kombinera 1 g bovint serumalbumin (BSA), 2 g fettfri mjölk, 10 ml 10x trisbuffrad saltlösning (TBS), 100 μL Tween och 90 ml destillerat vatten.
- Förbered TBST genom att kombinera 50 ml 20x TBS, 950 ml destillerat vatten och 200 μL Tween.
- Bered 10 % normalt hästserum (NHS) genom att kombinera 1 ml NHS med 9 ml antikroppsspädningsvätska (steg 8.4.1).
- Förbered 1% NHS genom att kombinera 1 ml 10% NHS med 9 ml TBST.
- Immunofluorescens färgning
- Ta bort objektglasen från -20 °C och låt dem värmas upp till rumstemperatur.
- Tvätta glasen tre gånger i destillerat vatten i 5 min vardera.
- Blockera objektglasen i 1 h vid rumstemperatur i 10% NHS i antikroppsspädningsmedel (steg 8.4.3).
- Späd den primära antikroppen (pan-cytokeratin) till 1:750 i 1% NHS vid TBST (steg 8.4.4). Inkubera objektglas i den utspädda primära antikroppen över natten vid 4 °C.
- Nästa dag, tvätta glasen tre gånger med en 1x tvättbuffert (PBS eller TBST) i 5 minuter vardera.
- Späd den sekundära antikroppen till 1:1 000 i 1 % NHS vid TBST (steg 8.4.4). Inkubera objektglasen i den utspädda sekundära antikroppen i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta glasen tre gånger med 1x tvättbuffert i 5 min vardera. Montera och täckglid glasen med hårda monteringsmedier med DAPI. Använd en bomullspinne för att försiktigt rulla ut eventuella bubblor under täckglaset.
Representative Results
Med hjälp av dessa metoder visualiserades sällsynta populationer av epitelceller i blod och benmärg hos normala människor och möss. Med rätt kompensationer och kontroller som beskrivits var resultaten som visade att 4% -5% av cellerna i murin benmärg EpCAM+, oavsett hur många celler som räknades, som visas i figur 4 och figur 5. I murina blodprover var mindre än 0,5 % av cellerna EpCAM+, vilket visas i figur 6. I humana benmärgsprover var 2%-5% av cellerna EpCAM+, som visas i figur 7 och figur 8. Medan 2% -5% är ett stort intervall, var procentsatserna inom varje enskild givare konsekventa eftersom stegvis fler celler räknades. I humana blodprover var cirka 0,3 % av cellerna EpCAM+, vilket visas i figur 9. Våra kontrollprover (ingen fläck, isotypkontroll och FMO) gav mycket få falskt positiva EpCAM+-resultat, som visas i figur 4 och figur 7. Celler från EpCAM+- och EpCAM-grupperna som sorterades på objektglas visade positiv färgning för pan-cytokeratin i EpCAM+-prover och var negativa för pan-cytokeratin i EpCAM-prover, som visas i figur 10. Dessa resultat indikerar att experimenten var lämpligt utformade och reproducerbara.
Figur 1: Krt14Cre;mTmG transgena möss med inkrementella räkningar av benmärg. Benmärgen hos Krt1-14;mTmG-möss räknades stegvis. GFP-positiva celler indikerar keratin 14-uttryck och identifierades med hjälp av flödescytometri. När fler benmärgsceller räknades var denna keratin 14-positiva cellpopulation lättare att identifiera. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Arbetsflöde för EpCAM+ och cytokeratin+-celler. Benmärgen och blodcellerna sorterades först med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att separera EpCAM+ och EpCAM-celler. Dessa celler sorterades i två olika provrör, samt på två olika objektglas. Cellerna sorterade i provrör snurrades på objektglas med hjälp av en cytocentrifug. Objektglasen färgades sedan med hjälp av en primär antikropp av pan-cytokeratin och färgades sedan med en sekundär antikropp. Objektglasen analyserades med hjälp av fluorescensmikroskopi för att observera pan-cytokeratinuttryck. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Programvara för analys av flödescytometri. Vid analys av flödescytometridata med hjälp av analysprogramvara används ingen fläckkontroll för att välja cellerna av intresse. Celler väljs först med SSC-A och FSC-A, som visar cellernas interna komplexitet och storlek. (A) En polygongrind dras runt cellerna. (B) Enstaka celler förvärvas genom grindning av SSC-A av SSC-W. (C) Levande celler förvärvas genom grindning av FSC-A kontra DAPI. (D) EpCAM-negativa celler utesluts genom grind till höger om de EpCAM-negativa cellerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Flödescytometrisk analys av EpCAM+-celler i benmärg från möss. Kontroller av ingen fläck, isotyp och FMO visas i den övre panelen, med det inkrementella antalet 50 000, 100 000 och 500 000 celler som visas i den nedre panelen. Dessa diagram visualiserar konsekvensen i procentsatser över räkningar, trots den totala ökningen av totalt antal räknade celler. Panelerna till höger indikerar grindstrategin, som diskuterats tidigare i avsnittet flödescytometrianalys och som visas i figur 3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: EpCAM+-celler i benmärg från möss utgör 5,17 % ± 0,001 % av befolkningen. Benmärgscellerna hos tre enskilda möss analyserades. Lämpliga kontroller inkluderades för korrekt vetenskaplig noggrannhet. Andelen positiva celler förblev konsekvent över proverna, på grund av att mössen var genetiskt identiska. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: EpCAM+-celler i musblod utgör 0,45 % ± 0,0006 % av befolkningen. Blodkropparna hos två enskilda möss analyserades. Kontroller inkluderades för att visa att rätt procedur följdes för att ge avgörande resultat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Flödescytometrisk analys på EpCAM+ human benmärg. Kontroller av ingen fläck, isotyp och FMO visas i den övre panelen och det inkrementella antalet 50 000, 100 000 och 500 000 celler visas i den nedre panelen. Dessa diagram visualiserar konsekvensen i procentsatser över räkningar, trots den totala ökningen av totala räknade celler. Panelerna till höger indikerar grindstrategin, som diskuterats tidigare i avsnittet flödescytometrianalys och som visas i figur 3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: EpCAM+-celler i human benmärg utgör 3,53 % ± 0,006 % av befolkningen. Tre olika humana benmärgsprover analyserades. Lämpliga kontroller för vetenskaplig noggrannhet inkluderades. Andelen positiva celler varierar beroende på genetisk heterogenitet bland människor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: EpCAM+ celler av humant blod utgör 0,18% ± 0,0004% av befolkningen. Tre olika humana blodprover analyserades. Lämpliga kontroller för vetenskaplig noggrannhet inkluderades. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Immunofluorescens av EpCAM+ och EpCAM-objektglas. FACS användes för att separera EpCAM+ och EpCAM-celler. Pan-cytokeratin färgades för användning av DAKO-pan-cytokeratinantikroppen. Ingen primär antikroppskontroll i normalt serum användes, eftersom pan-cytokeratinet är en polyklonal antikropp. Dessa resultat bekräftar noggrannheten hos FACS. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Mänsklig benmärg eller blod | |||
| Antikropp | Rör # | # av celler | AB Conc |
| Ofärgad | 1 | 1x106 | X |
| Endast DAPI | 2 | 1x106 | 1uL/ml |
| Kontroll av PE-isotyp | 3 | 1x106 | 1 uL |
| CD49f-PE Enkel fläckkontroll | 4 | 1x106 | 20 uL i 100uL per 1x106 |
| EpCAM-PE låg titrering | 5 | 1x106 | 3 uL i 100uL per 1x106 |
| EpCAM-PE medelhög titrering | 6 | 1x106 | 4 uL i 100uL per 1x106 |
| EpCAM-PE hög titrering | 7 | 1x106 | 5 uL i 100uL per 1x106 |
| EpCAM-PE hög sortering på bilder | 8 | 10x106 | 50 uL i 1 ml |
Tabell 1: Färgningspanel för flödescytometri. Ett exempel på en färgningspanel för flödescytometri för mononukleära celler i blod eller benmärg. Kontroller som ingår är endast DAPI, ofärgad kontroll och PE-kontroll med en enda fläck (PE-CD49f användes som en bättre positiv kontroll). Fluorescens minus en ingår inte i denna panel eftersom det bara är en enda färg (PE). Vid tillsats av fler fluoroforfärger, såsom fluoresceinisotiocyanat (FITC) eller allofykocyanin (APC), bör FMO inkluderas genom att utesluta en fluorofor för varje FMO-kontroll.
Kompletterande fil 1: Levande cellräkning med hematocytometer. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Det finns vissa bevis i litteraturen på närvaron av epitelceller i benmärgen. Tidigare har artiklar vanligtvis undersökt epitelcellernas roll i samband med sjukdom och skada, såsom i lever, lunga, mag-tarmkanalen (GI), bräss och hud14,15,16,17. Emellertid är inte mycket känt om närvaron av dessa epitelceller i benmärgen hos friska individer. Detta dokument syftar till att etablera en reproducerbar metod i syfte att identifiera och isolera epitelceller från normalt blod och benmärg. Denna metod kommer att driva fältet framåt för att identifiera varför epitelceller är närvarande och vad deras roll är i blodet och benmärgen i frånvaro av sjukdom; Kanske är dessa celler en del av normalt vävnadsunderhåll eller aktiverade vid skada. Benmärgen är ett förråd av stamceller; Det är emellertid oklart vad härstamningen av dessa epitelceller kan vara. Ett nyligen papper diskuterar benmärgshärledda epitelceller i tymus, som först uttrycker EpCAM och den hematopoetiska markören CD45 och sedan förlorar sitt CD45-uttryck över tiden efter skada15. Forskning från vårt laboratorium har också bekräftat förekomsten av CD45 + EpCAM+ -celler i friskt blod och benmärg i frånvaro av skada12. Dessa cellers roll är dock ännu inte bestämd.
Det fanns ett behov av en reproducerbar metod för att undersöka epitelceller i den friska benmärgen. Den beskrivna metoden hjälper till att karakterisera dessa celler ytterligare i sitt normala tillstånd. Det finns viktiga steg i denna metod för att upprätthålla reproducerbarheten. Ett av de mest kritiska stegen i detta protokoll är att upprätthålla en steril miljö i huven medan benmärgen skördas från möss. Vid skörd från flera möss undviks korskontaminering mellan proverna genom att använda nya nålar och sprutor för varje mus. Detta säkerställer också att provet är rent och fritt från föroreningar som kan påverka resultaten. Dessutom bör antalet beredda sprutor och märkta koniska rör för varje ytterligare mus ökas. Ett annat viktigt steg innebär att spola benen tills en ren vit färg är uppenbar för att säkerställa att de flesta benmärgscellerna har tagits bort; Chanserna att upptäcka sällsynta celler ökar i ett renare prov. En modifiering gjordes för att optimera det röda blodkroppslysprotokollet; Flera lysbuffertar testades för att hitta den rätta som gav genomgående hög livskraft, eftersom nästan hälften av cellerna förlorades under detta steg. Olika reagens och inkubationsperioder kan behöva optimeras för bättre resultat i andra inställningar.
Den mest signifikanta begränsningen av detta protokoll är att använda flödescytometri för att hitta sällsynta cellpopulationer. Som diskuterats tidigare bidrar tillägget av kontroller och inkrementella räkningar till att öka analysens specificitet och noggrannhet. En annan begränsning är att lämpliga markörer för populationen av intresse måste identifieras i förväg. Således behöver man veta om nyckelmarkörer, antikroppar för flödescytometri och antikroppar som är kompatibla med målarten.
Dessa metoder är en förbättring jämfört med befintliga metoder eftersom de möjliggör encellsanalys till en bråkdel av kostnaden för den befintliga automatiska CTC-isolatorn och encells-RNA-sekvensering. Dessutom är flödescytometri mer lättillgänglig. FACS bibehöll högre livskraft för cellerna jämfört med tidigare rapporterade resultat med magnetisk mikropärlseparation. Slutligen möjliggör dessa tekniker separation av celler för nedströmsanalyser, såsom bulk-RNA-sekvensering, scRNA-sekvensering eller cellodling.
Disclosures
Det finns inga kända intressekonflikter.
Acknowledgments
Josh Monts, flödescytometertekniker för kärnanläggningar, Hormelinstitutet
Todd Schuster, Core Facility Manager, The Hormel Institute
Derek Gordon, statistiker, Rutgers University
Vi vill tacka Karen Klein från Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM för hennes redaktionella hjälp.
Detta arbete stöddes delvis av National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases vid National Institutes of Health under Award Number R21 AR075281, och ett bidrag till stöd för forskning, konstnärskap och stipendium, Office of the Vice President for Research, University of Minnesota (förslag # 324240). Vi erkänner tacksamt stöd från The Hormel Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes used for flow cytometry |
| 500 mL jar with lid | Nalgene | 11-823-32 | Used to wash the mouse |
| 190 proof Ethanol | Decon laboratories Inc | 2801 | Diluted to 70% with dH2O |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | Dilution: 1:1000 |
| Brightline Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-10 | Used to count alive cells |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Component of antibody diluent |
| Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Component of staining buffer and harvesting solution |
| Curity gauze sponges | Covidien | 2187 | Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow |
| Curved Forceps | Miltex | 18-784 | Used during harvest |
| Cytokeratin, Wide Spectrum Screening | Dako | Z0622 | Dilution 1:750 *Now discontinued |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) | Gibco | 14190-144 500mL | Used to stop the red blood cell lysis reaction |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E9884-100G | Used at 0.5 M |
| Gentamicin sulfate | Lonza | 17-518Z | Component of harvesting solution |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) | Gibco | 14175-095 500mL | Component of harvesting solution and staining buffer solution |
| Luer-Lok tip 10 mL syringe | Becton, Dickinson and Co | 309604 | Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps |
| Magic touch 2 ice bucket | BelArt | M16807-2001 | Used to store the specimens on ice |
| Nonfat dry milk | Apex | 20-241 | Component of Antibody Diluent |
| Normal horse serum | Vector | ZE0122 | Component of Antibody Diluent |
| PE anti-human CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 324206 | Dilution: 5 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 118205 | Dilution: 3 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE mouse IgG2b, κ isotype control | Biolegend | 400313 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat anti-human CD49f | BD Biosciences | 555763 | Dilution: 20 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat IgG2am, κ Isotype control | Biolegend | 400508 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Basix | 14-955-240 | Used in the centrifuge |
| Povidone-Iodine Scrub | Aplicare | 82-227 | Antiseptic used to sterilize the mice |
| PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305176 | 20G needle used to break up bone marrow clumps |
| PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305111 | 26G needle used to flush bone marrow from bones |
| PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Services | 63422-06 | 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence |
| RBC Lysis buffer 10X | Invitrogen | 00-4300-54 | Dilution 1:10 using sterile deionized water |
| Scissors | Roboz | RS-6762 | Used during harvest |
| Stainless steel surgical blade #4 | Bard-Parker | 371222 | Used during harvest |
| Sterile tray | Polar ware | 10F | Used during harvest |
| StretchEase Powder-free nitrile examination gloves | Denville Scientific | G4161 | Used during harvest |
| Surgical Scalpel handle #4 | Fischer | 12-000-164 | Used with surgical blade |
| TBS 20x | Thermo | Component of TBST, used at 1X | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Used to count dead cells. Filtered with .45 µm |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-500mL | Component of TBST |
| Tweezers | Miltex | 6-8 | Used during harvest |
| Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1800 | Nuclear stain for immunofluorescence |
References
- Larsen, S. B., Cowley, C. J., Fuchs, E.
- Blanpain, C., Fuchs, E. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration. Science. 344 (6189), 1242281 (2014).
- Coradini, D., Casarsa, C., Oriana, S. Epithelial cell polarity and tumorigenesis: New perspectives for cancer detection and treatment. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (5), 552-564 (2011).
- Dmello, C., et al. Multifaceted role of keratins in epithelial cell differentiation and transformation. Journal of Biosciences. 44 (2), 33 (2019).
- Poulet, G., Massias, J., Taly, V.
- Eslami-S, Z., Cortés-Hernández, L. E., Alix-Panabières, C. Epithelial cell adhesion molecule: an anchor to isolate clinically relevant circulating tumor cells. Cells. 9 (8), 1836 (2020).
- Morris, R. J. Circulating tumor cells: quintessential precision oncology presenting challenges for biology. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 16 (2017).
- Lin, D., et al. Circulating tumor cells: biology and clinical significance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 404 (2021).
- Spence, M., Adai, S., Landon, T., Richter, G. Few and far between: Tools and strategies for rare-event detection using flow cytometry. BioprobesJournal of Cell Biology. 71, 14-18 (2015).
- Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. Journal of Cell Biology. 192 (3), 373-382 (2011).
- Ye, Q., Ling, S., Zheng, S., Xu, X. Liquid biopsy in hepatocellular carcinoma: circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Molecular Cancer. 18 (1), 114 (2019).
- Park, H., et al. marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
- Marsman, W. A., et al. Epithelial cells in bone marrow: do they matter. Gut. 54 (12), 1821-1822 (2005).
- Borue, X., et al. marrow-derived cells contribute to epithelial engraftment during wound healing. The American Journal of Pathology. 165 (5), 1767-1772 (2004).
- Chakrabarti, S., et al. marrow-derived cells contribute to the maintenance of thymic stroma including TECs. Journal of Immunology Research. 2022, 6061746 (2022).
- Krause, D. S., et al. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell. 105 (3), 369-377 (2001).
- Wong, A. P., et al. Targeted cell replacement with bone marrow cells for airway epithelial regeneration. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L740-L752 (2007).
